UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA FACULTAD DE INGENIERIA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL

ILO-MOGUEGUA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA

FACULTAD DE INGENIERIA

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA

AMBIENTAL

TAREA Nº8:

PRACTICA DE BIOTECNOLOGIA

VIRTUALIZADO

ELECTROFORESIS Y ANALISIS DE

SECUENCIAS DE ADN

DOCENTE:

Dr. HÉBERT HERNAN SOTO

GONZALES

ESTUDIANTE: YAMILET MEDALYN YUCRA

OQUENDO

FECHA DE ENTREGA:

22/06/2021

CURSO: BIOTECNOLOGIA

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Contenido

3.6 ANALISIS DE SECUENCIA DE ADN: ... 5

3.7 ELECTROFORESIS ... 5

4. MARCO METODOLOGICO ... 6

5. RESULTADOS ... 11

6. CONCLUSIONES... 13

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1. INTRODUCCION

Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN circular muy comunes en bacterias que se replican de modo autónomo e independiente del cromosoma de la célula. Constituyen una herramienta fundamental en Biología Molecular e Ingeniería Genética ya que se pueden usar como “vectores” para introducir en ellos cualquier fragmento de ADN de interés y de esta forma amplificarlo (es lo que se llama “clonar” un fragmento de DNA). La obtención de grandes cantidades de ADN puro de estos “vectores” es fundamental en aplicaciones posteriores. En esta práctica se realizará el aislamiento y purificación de un ADN plasmídico mediante la utilización de un “kit” de uso rutinario en laboratorios de Biología Molecular. Posteriormente se visualizará mediante electroforesis en gel de agarosa. (Delgadillo Lopez,

Gonzalez Ramirez, Prieto Garcia, Villagomez Ibarra, & Acevedo Sandoval, 2011)

La obtención de altas cantidades de ADN plasmídico puro es fundamental a la hora de analizarlo o utilizar a éste como vector en aplicaciones posteriores. El avance de la ingeniería genética y de las técnicas de ADN recombinante ha supuesto un aumento del número y variedad de técnicas de purificación de ADN. En comparación con métodos tradicionales (que utilizan fenol u otros reactivos tóxicos), los nuevos métodos utilizan reactivos no peligrosos, mientras que mantienen un alto rendimiento y pureza del producto final. El objetivo de esta práctica es el aislamiento y purificación de un ADN plasmídico que contiene un fragmento de cDNA correspondiente a un gen que se expresa en el proceso de maduración del fruto de fresa. Este paso es previo y necesario para la caracterización posterior del gen. Se utilizará un “kit” de aislamiento y purificación de plásmidos que se usa de modo rutinario en laborator ios de Biología Molecular. Posteriormente, se visualizará, mediante electroforesis en gel de agarosa.

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2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GENERAL:

Desarrollar en el programa “SnapGene” la electroforesis y el análisis de secuencias de ADN escogiendo 15 nucleótidos de la página web NCBI.

2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS:

• Analizar las secuencias de las 15 bandas de nucleótidos de la página web NCBI con la asimilación del gen agarosa en el programa “SnapGene”.

• Identificar y seleccionar las enzimas de restricción de cada muestra

• Realizar en el grafico las separaciones de las enzimas de restricción para cada secuencia.

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3. MARCO TEORICO 3.1 BIOTECNOLOGIA:

(Thieman & Palladino, 2010, pág. 2) La biotecnología se define comúnmente como el uso de organismos vivos, o los productos de los mismos, para el beneficio humano (o el beneficio de su entorno) con el fin de desarrollar un producto o resolver un problema 3.2 GEL DE AGAROSA:

(Padilla Peña, Diez Dapena, Martinez Galisteo, Bárcena Ruiz, & Garcia Alonso, 2017, pág. 1) La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Además, si en dicha electroforesis se aplican marcadores de peso molecular (fragmentos de DNA de tamaño conocido) se puede calcular el tamaño aproximado del DNA en estudio.

3.3 PROCESO DE PCR:

(Perez de Castro, 2011) La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (siglas de su nombre en inglés Polymerase Chain Reaction) permite generar una gran cantidad de copias de un fragmento de DNA (ácido desoxirribonulceico). El requisito fundamental para poder llevar a cabo la reacción es disponer de fragmentos cortos de DNA de cadena sencilla complementarios a los extremos del fragmento a amplificar. Estos fragmentos servirán como cebadores para que una enzima polimerasa sea capaz de incorporar nucleótidos complementarios a la cadena molde. Una vez completada la reacción la cantidad fragmento amplificado se puede visualizar mediante técnicas sencillas de separación de fragmentos de DNA.

3.4 SNAPGENE

(MEDICALEXPO, s.f.) Aprovechen el eficiente manejo de datos de SnapGene para escanear grandes secuencias de ADN con miles de características anotadas. Visualización de la proteína Vea las múltiples vistas de una secuencia de proteínas. Personaliza la visualización de regiones, sitios, enlaces y colores de secuencia. Edición de secuencia intuitiva Edita fácilmente las secuencias de ADN y proteínas. Hacer inserciones, supresiones, sustituciones y cambios de caso. Cuando se copia y se pega una secuencia, los rasgos se transfieren automáticamente. Codificación de color de la

5 secuencia Poner una secuencia seleccionada de ADN o aminoácidos en uno de diez colores. Colorear las dos cadenas de ADN o la secuencia de proteínas. Los colores son visibles en las vistas del mapa y de la secuencia. Anotación de características Anota las características comunes automáticamente, o anota las características novedosas manualmente. Encuentra características comunes en tu secuencia de ADN usando la extensa base de datos de SnapGene. Se pueden añadir características adicionales de su elección a una base de datos personalizada.

3.5 NUCLEOTIDO:

(Thieman & Palladino, 2010, pág. 390) Bloque estructural de ácidos nucleicos. Consiste en una molécula de azúcar (ribosa o desoxirribosa) de cinco carbonos (denominada pentosa), un grupo fosfato y las bases adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) o uracilo (U).

3.6 ANALISIS DE SECUENCIA DE ADN:

(Meneses Escobar, Rozo Murillo, & Franco Soto, pág. 2) El análisis de la secuencia de ADN, es el descubrimiento de similitudes funcionales y estructurales, y las diferencias entre múltiples secuencias biológicas. Esto puede hacerse comparando las nuevas (desconocidas) con las bien-estudiadas y anotadas (conocidas) secuencias. Este análisis incluye la alineación de secuencias, la búsqueda en la base de datos de secuencias, el descubrimiento de patrones, la reconstrucción de las relaciones evolutivas, y la formación y la comparación del genoma.

3.7 ELECTROFORESIS

Es una técnica para separar el ADN, el ARN, o moléculas o proteínas en bas e a su tamaño y carga eléctrica. Se realiza generalmente en una especie de caja que tiene una carga positiva en un extremo y una carga negativa en el otro (Austin, s.f.).

(Thieman & Palladino, 2010, pág. 76) La separación del DNA mediante electroforesis se basa en el hecho de que el DNA migra por el gel según su carga y tamaño (en pares de bases). El eje azúcar fosfato produce DNA cargado negativamente; por lo tanto, cuando el DNA se coloca en un campo eléctrico, migra hacia el ánodo (el polo positivo) y es repelido por el cátodo (el polo negativo). Como todo el DNA tiene carga negativa, independientemente de la longitud o del origen, la tasa de migración y separación del DNA por el gel de agarosa depende del tamaño de la molécula. Dado que la distancia de migración es inversamente proporcional al tamaño de un fragmento de DNA, los fragmentos largos de DNA se desplazan distancias cortas por el gel y los fragmentos cortos de DNA se mueven más rápidamente por el gel.

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4. MARCO METODOLOGICO

4.1. Entrar a la página de NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, y colocar nucleotide en la primer box y luego poner 16s en la segunda.

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4.2.Por defecto saldrá ejemplos para seleccionar, en este caso solo se tomará 15 secuencias. Como

ejemplo: Enterococcus faecalis 16S rRNA, se consideró al primero debido a la cantidad mayor de pares de bases (bp), entre todos los resultados.

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4.3. Se selecciona FASTA y se copia la secuencia de lo cual se traslada a un block de notas

que se guarda con el nombre del nucleótido como referencia para la simulación del gel Agarosa en el programa “SnapGen”, donde nos dirigimos a tools < simulate agarose gel.

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4.5. Para dar a conocer las enzimas de restricción se cambió en la parte inferior del formato mapa al

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4.6.Historial de todas las separaciones de al menos 2 enzimas de restricción para cada

secuencia. Resultando en la separación debido al movimiento del ADN debido a la simulación que en laboratorio se origina por que el ADN al ser una carga negativa al entrar en contacto con el líquido fluorescente de la alícuota este buscara el polo positivo.

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5. RESULTADOS

En el grafico se muestra el comportamiento de los diferentes nucleótidos en la electroforesis con la simulación del gel agarosa en el programa “SNAPGENE”.

En el grafico se muestra todas las separaciones de al menos 2 enzimas de restricción para cada secuencia.

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6. CONCLUSIONES

En el programa SnapGene fue fácil de manipular con las respectivas indicaciones, en el cual el total de muestras escogidas permitió dar a conocer el grafico de las bandas sin ningún inconveniente, la asimilación de gel agarosa permitió la separación de cadenas en tamaños pequeños en el grafico en unidad de kb, también se pudo reconocer las secuencias de genes específicas con las enzimas de restricción identificadas en el proceso final. Conocer los términos para esta práctica fue crucial para entablar los objetivos, el procedimiento y por ende las conclusiones finales de la práctica de electroforesis. Las 15 secuencias proporcionaban un buen número de ER (enzimas de restricción), por el cual solo se escogió dos como mínimo para demostrar la calidad.

Se reviso una de las técnicas principales y a la vez complementarias de la mayoría de marcadores, la electroforesis en gel. Ésta se ha convertido en la principal técnica para separar moléculas de ácidos nucleicos y proteínas. Se describen diferentes protocolos para llevarla a cabo, tales como electroforesis de agarosa, de camp

Cuando una molécula de ADN es cortada con una enzima de restricción y los fragm entos generados se separan por electroforesis en un gel de agarosa, se puede determinar el número de sitios de restricción y la distancia entre ellos a partir del número y la posición de las bandas en el gel. Cabe distinguir entre moléculas de ADN lineal y ADN circular.

14 1. ¿Qué es un gel de agarosa y cómo influye la concentración en la migración de los

fragmentos de ADN?

Es un polisacárido natural provenientes de las algas. Su función es la separación de cadenas en tamaños pequeños hasta un rango de kb (kilo bases). El gel suele correrse de manera horizontal y. con buffer de manera TBE (Tris, Borato, EDTA) y TAE (Tris, Ácido Acético, EDTA) (Ortiz Casas, 2018).

Para la migración de los fragmentos de ADN, se separa por tamaño en un gel de agarosa en un patrón tal que la distancia recorrida es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular, ya que es sabido que el ADN tiene una uniforme relación masa / carga.

15 3. ¿Dibuje a mano el proceso de la electroforesis?

17 4. ¿En el primer video mostrado por el profesor por que las muestras de ADN son

mescladas con un colorante azul? ¿Cómo se llama?

A mi parecer son mescladas para poder cargar las muestras en el gel, como también tener una mejor visualización de ella su nombre es Bromuro de etidio.

5. ¿Qué es el bromuro de etídio (BrEt), como lo podemos remplazar, existe otros El bromuro de etidio (BrEt) es un colorante fluorescente que se usa en técnicas de biología molecular como la electroforesis en gel de agarosa de productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) hace muchos años, con medidas fluorimétricas sensibles debido al (1)rango dinámico de fluorocromos disponibles Se puede reemplazar con otros colorantes como: GelRed™ y GelGreen™.

6. ¿Por qué se utilizaron dos marcadores de peso molecular?

Un marcador es un carácter o un gen que debido al ligamiento puede usarse para indicar la presencia de otro gen; es decir, cualquier característica A (sea un gen, una proteína, tipo de hoja, etc.) que esté asociada a la presencia o expresión de una característica B (como vigor, altura, resistencia

a enfermedades, etc.) puede considerarse como un marcador, pues la presencia de A necesariamente implica la de B.

La importancia de los marcadores radica en que ofrecen la posibilidad de estudiar poblaciones de organismos y seleccionar aquellos que presentan rasgos de interés para el hombre. En ocasiones, el uso de marcadores permite seleccionar los individuos aun antes de que expresen el rasgo de interés.

7. ¿Cuál es tamaño molecular de cada gen obtenido por usted, en caso que se sea de diferentes tamaños como justifica?

En el caso del peso molecular ya está determinado en el cuadro que no s presenta el resultado, por ejemplo si nosotros colocamos el click en una de las bandas ahí nos indica los pares de bast que tiene cada una, y los números que salen a la izquierda de los datos de las bandas serian el peso molecular pero en KB, los tamaños se justifica por las secuencias escogidas, es decir a mayor secuencia como 4000 pb y otro de 1500 pb, el peso molecular de la de 4000pb se colocaría primera en nuestros resultados, indicando su peso molecular mas alto.

18 8. ¿Tipos de electroforesis y cómo funciona en gel de agarosa para segmentos de ADN?

1. Electroforesis de frente móvil o libre

• o En papel

• o En acetato de celulosa

• o En gel (agarosa, poliacrilamida y almidón)

2. Electroforesis de zona: (convencional)

3. Electroforesis capilar

4. Electroforesis de ADN.

5. Zimografía o zimogramas

6. Extracción en gel.

19 La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Además, si en dicha elec troforesis se aplican marcadores de peso molecular (fragmentos de DNA de tamaño conocido) se puede calcular el tamaño aproximado del DNA en estudio.

9. ¿Es posible recuperar un fragmento de ADN del gel de agarosa para clonar en un plásmido y mantener en un organismo? Fundamente.

Esta simple técnica se puede aplicar a varias muestras simultáneamente, teniendo como resultado el ADN de manera altamente pura.

Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN circular muy comunes en bacterias que se replican de modo autónomo e independiente del cromosoma de la célula. Constituyen una herramienta fundamental en Biología Molecular e Ingeniería Genética ya que se pueden usar como “vectores” para introducir en ellos cualquier fragmento de ADN de interés y de esta forma amplificarlo (es lo que se llama “clonar” un fragmento de DNA).

10. ¿Qué son las enzimas de restricción, mencione 10?

Las enzimas de restricción son aquellas que presentan actividad endonucleasa, son de origen bacteriano y cortan los enlaces fosfodiéster del ADN en una secuencia específica denominada secuencia diana.

Entre las cuales se encuentran: EcorI, EcorII, HindII, HindIII, HaeIII, HaeIII, Hpall, Pstl, Mayi y BgIII.

20 Austin, C. P. (s.f.). Electroforesis. Obtenido de

https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Electroforesis

Delgadillo Lopez, A. E., Gonzalez Ramirez, C. A., Prieto Garcia, F., Villagomez Ibarra, J. R., & Acevedo Sandoval, O. (2011). FITORREMEDIACIÓN: UNA ALTERNATIVA PARA ELIMINAR LA CONTAMINACION. Mexico: Tropical and Subtropical

Agroecosystems.

Guitierrez Espinoza, Alarcon Herrera, Prado Tarango, Cedillo Alcantara, Melgoza Castillo, & Ortega Gutierrez. (2010). Germinación del girasol (Helianthus annuus) bajo

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https://www.researchgate.net/publication/324888633_fitirremediacion_con_girasol Ortiz Casas, B. (24 de Agosto de 2018). Electroforesis de ADN: Conceptos Básicos.

Obtenido de https://www.youtube.com/watch?v=KGZBRfHQU_Y

Padilla Peña, C. A., Diez Dapena, J., Martinez Galisteo, E., Bárcena Ruiz, J. A., & Garcia Alonso, C. (2017). Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y caracterización electroforética de DNA plasmídico . Cordova: Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales.

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