Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

LGN 5799 - SEMINÁRIOS EM

GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

Departamento de Genética

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EXPRESSÃO GÊNICA E DIAGNÓSTICOS. APLICAÇÕES DO PCR EM TEMPO REAL

Aluna: Fabiana Bombonato Mingossi Orientador: Daniel Scherer de Moura

SUMÁRIO

1. Introdução ao PCR convencional

2. PCR convencional vs. PCR em tempo real 3. PCR em tempo real 4. Química da detecção 4. Química da detecção 5. Aplicações Sybr Green TaqMan Molecular Beacon

Introdução ao PCR

• PCR

(Polymerase

Chain

Reaction) =

reação em cadeia da polimerase;

• Inventada por Kary Mullis em 1983;

• Posteriormente, em 1993, foi atribuído a

ele o Prêmio Nobel da Química pelo seu

trabalho.

PCR - consiste em amplificar cópias de DNA “in vitro”, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA.

É o método para rápida amplificação de seqüências específicas de DNA.

Componentes da PCR

DNA polimerase = termoestável, isolada de Thermus aquaticus dCTP Mg2+ ₌ cofator da Taq Iniciadores = pequenas seq. complementares ao DNA alvo dCTP dGTP dATP dTTP Nucleotídeos utilizados para confecção da nova fita

Qualquer seqüência alvo de DNA pode ser amplificada por PCR

• A localização da seqüência alvo é feita pelos iniciadores. Oligonucleotídeos com 20-24 bases são usualmente seletivos o suficiente para localizar um sítio único em um genoma de alta complexidade.

• O pareamento dos iniciadores com a seqüência alvo se faz pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio, segundo o pareamento convencional descrito por Watson e Crick:

A = T C = G

Após ciclos sucessivos...

• São utilizados dois iniciadores que delimitam o segmento amplificado.

• Cada uma das novas fitas de DNA extendidas a partir dos iniciadores serve como molde para a síntese de uma nova fita. Isso garante o aumento exponencial do número de novas fitas; • Depois de terminada a reação, a confirmação é obtida através da eletroforese em gel de agarose:

Qual o problema com os géis de

agarose?

• Precisão ruim;

• Baixa sensibilidade;

• Baixa resolução;

• Não-automotizado;

• Discriminação apenas pelo tamanho;

• Resultados não são numéricos;

PCR EM TEMPO REAL

- PCR QUANTITATIVO

- um dos métodos atuais de aferir o nível de expressão de genes;

- técnica descrita como quantitativa porque consegue realizar a avaliação do n° de moléculas produzidas realizar a avaliação do n° de moléculas produzidas ciclo a ciclo.

Por que o PCR em tempo real foi desenvolvido?

• necessidade de quantificar diferenças na expressão de mRNA.

Natureza do PCR em tempo real

Quantificação em tempo real (quantidade de DNA teoricamente dobra a cada ciclo)

CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA 0 1 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 7 128 8 256 9 512 10 1,024 11 2,048 12 4,096 13 8,192 14 16,384 15 32,768 16 65,536 0 200000000 400000000 600000000 800000000 1000000000 1200000000 1400000000 1600000000 0 5 10 15 20 25 30 35 Q u a n ti d a d e d e D N A Número de ciclos de PCR Número de ciclos Quantidade de DNA

17 131,072 18 262,144 19 524,288 20 1,048,576 21 2,097,152 22 4,194,304 23 8,388,608 24 16,777,216 25 33,554,432 26 67,108,864 27 134,217,728 28 268,435,456 29 536,870,912 30 1,073,741,824 31 1,400,000,000 32 1,500,000,000 33 1,550,000,000 34 1,580,000,000 1 10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000 1000000000 10000000000 0 5 10 15 20 25 30 35 Q u a n ti d a d e d e D N A Número de ciclos de PCR

Máquinas de PCR em tempo real

Fases do PCR em tempo real:

Fase exponencial Fase platô Limiar Sem molde Linha base

• Linha basal: não houve produtos de PCR suficiente para detectar a fluorescência;

• Fase Exponencial ou Log: a quantidade de produtos de PCR dobra a cada ciclo;

• Fase platô: não há mais aumento no n° de produtos.

Características relevantes do PCR em

tempo real:

1. RAPIDEZ

- Duração da corrida: 20 min a 2 h;

- Resultado obtido no final da reação, não é - Resultado obtido no final da reação, não é necessário pós-processamento.

2. ESPECIFICIDADE

3. SENSIBILIDADE

- Alta sensibilidade para detecção de DNA ou cDNA;

- Importantes para quantidades limitadas de material;

material;

- Detecção baseada pela mensuração da

fluorescência emitida pelos agentes intercalantes ou sondas fluorogênicas.

4. QUANTIFICAÇÃO

Como utilizar o PCR em tempo real para quantificar a quantidade de DNA - Característica mais importante.

para quantificar a quantidade de DNA ou cDNA?

Equivalente aos cálculos utilizados no Northen



Gene de controle interno,

controle experimento

NORTHERN

Gene de controle interno, actina, GAPDH, RPLPO, etc

Aumento correto de vezes = 10/2 = 5

Razão do gene alvo diferença de vezes no gene alvo (experimento/controle) =

PADRÕES (Referência)

• mesmo número de cópias em todas as células; • expresso em todas as células;

• possuir o mínimo de variação nos diferentes • possuir o mínimo de variação nos diferentes processo biológicos.

PADRÕES

• padrões normalmente utilizados: - GAPDH e beta-actina

- MHC I (principal complexo de histocompatibilidade I) - mRNAs de certas proteína ribossomais, ex. RPLPO - mRNAs de certas proteína ribossomais, ex. RPLPO - rRNA: 28S ou 18S

28S é mais representativo pois o 18S pode se manter intacto em amostras mesmo com mRNA degradado

A. Fluoróforos ligados ao DNA B. Sondas de hibridização

4 oligo 3 oligo

2 primers 2 sondas

1 primer 2 sondas

C. Sondas de hidrólise D. Molecular beacons

QUÍMICA

DA

E. Scorpions F. Iniciadores Sunrise

G. Iniciadores LUX _{Fluoróforo quencher}

Fluoróforo repórter Fluoróforo receptor Fluoróforo doador Fluoróforo quencher DNA polimerase

Bloqueador DNA polimerase Fluoróforo fluorescente emitindo luz

DA

Detecção não-específica utilizando fluoróforo

ligado ao DNA

- repórteres fluorescentes;

- fluoróforo se liga ao DNA fita-dupla;

- emissão de fluorescência a cada ciclo; - emissão de fluorescência a cada ciclo;

- monitoramento durante fase exponencial;

- técnica muito flexível/ reações múltiplas não são possíveis.

A. Desnaturação

Esquema do Sybr Green:

B. Anelamento

- Fluoróforo não ligado baixa fluorescência - Técnica mais simples e barata

- Desvantagem produtos específicos e não

Como verificar o que é amplificado?

- Gel de agarose:

Observar se o tamanho da banda apresenta o mesmo tamanho da seqüência-alvo!

- Curva de melting:

• Depende da composição de bases (%CG) e tamanho do fragmento;

• Todos os produtos de PCR para um par de iniciador particular deve ter a mesma temperatura de melting.

PROBLEMAS:

• “mispriming”

• Dímeros de iniciadores • Contaminação

Detecção específica utilizando sondas

específicas ao alvo

Estrutura da sonda TaqMan

(sondas de hidrólise):

Fluoróforo “quencher” Fluoróforo Repórter

Também conhecida por 5’ nuclease, pois a geração da fluorescência é dependente da atividade da nuclease 5’-3’ para clivar o fluoróforo repórter da sonda linear.

Iniciador

Nucleotídeos da TaqMan Fita complementar

1 - Desnaturação iniciador sonda repórter “quencher” 2 - Anelamento do iniciador/ Hibridização da sonda Taq 3 - Extensão 3 - Extensão

MOLECULAR

BEACON

Nucleotídeos específicos ao produto de PCR

Estrutura do Molecular Beacon (sondas de “hairpin”):

• alça: 18-30 pb complementares ao alvo • tronco: ~5-7 pb e são complentares

• 5‘ fluoróforo: fluoresce na presença seq. alvo • 3‘”quencher”: impede a emissão de

Fluoróforo

repórter Fluoróforo _{“quencher”}

• 3‘”quencher”: impede a emissão de fluorescência na ausência da seq. alvo

- Sondas de hibridização de oligonucleotídeos fita simples

- Alvo presente híbrido mais longo e estável - Mais específicas do que as sondas lineares

- Altamente específico - distingue substituição de um único nucleotídeo

Molecular

Beacon Alvo Híbrido

Produto de PCR

Iniciador 1

Iniciador 2 Detecção do produto de PCR

pela molecular beacon

- Análises mútiplas

- Sondas com fluoróforos de cores diferentes

- Ex: Diagnóstico de doenças fúngicas em plantas Detectar diferentes

patógenos numa mesma amostra

Homozigoto selvagem Heterozigoto Homizigoto Mutante

Determinação do genótipo em um locus particular

F lu o re scê n ci a Ciclo

APLICAÇÕES:

1. Genética de transgênicos

2. Resistência à fungicida

3. Contaminação de alimentos

3. Contaminação de alimentos

4. Identificação de organismos geneticamente

modificados (OGM)

1. Genética de transgênicos

• Quando novas plantas transgênicas são obtidas, o primeiro e essencial passo é sua caracterização molecular;

• Inserção de DNA ao acaso no genoma da planta; • Inserção de DNA ao acaso no genoma da planta; • Múltiplas cópias de transgênicos integradas em 1 ou mais regiões cromossômicas podem resultar em silenciamento gênico.

Como plantas com 1 ou 2 eventos de integração normalmente apresentam alto nível de expressão de

gene exógeno, a avaliação do n° de cópias de transgênicos

Avaliação do número de cópias de

transgênicos em arroz transformado

Yang et al. 2005. Plant Cell Rep 23: 759-763

transgênicos

Essencial para seleção e cultivo de plantas GM O número de cópias pode influenciar o nível de

Neste estudo, o PCR em tempo real (TaqMan) foi utilizado para uma detecção rápida e precisa do n° de cópias dos genes exógenos GUS e HPT em arroz transformado.

HPT GUS Rearranjo ZCM-1 ZCM-2 ZCM-3 ZCM-13 ZCM-14 ZCM-15 ZCM-16 ZCM-22 ZCM-23 ZCM-25 ZCM-27 ZCM-33 1 4 3 1 1 1 1 2 1 1 4 1 1 4 3 2 2 1 1 4 2-3 1 5 1 Não Não Não Sim Sim Não Não Sim Sim Não Sim Não ZCM-33 ZCM-36 ZCM-40 ZCM-46 ZCM-61 ZCM-65 ZCM-72 ZCM-73 ZCM-78 ZCM-80 ZCM-81 ZCM-87 ZCM-90 1 2 1 1 1 3 5 4 1 3 1 2 1 1 1 2 4 2 3 5 4 2 3 2 2 1 Não Sim Sim Sim Sim Não Não Não Sim Não Sim Não Não

Rearranjos dos genes GUS e HPT

11 amostras mostraram rearranjo

(n°cópias do GUS ≠ n°cópias do HPT)

durante o processo de integração

cromossomal

45,8% rearranjo indicou que

rearranjos T-DNA são mais

comuns do que se pensa!

O RT-PCR obteve sucesso na quantificação de transgênicos, e útil para posterior seleção e cultivo de plantas GM!

2. Resistência à fungicida

• O sucesso de um fungicida pode ser perdido se o patógeno desenvolver resistência a ele;

• Para obter o melhor uso dos fungicidas, o estado de resistência das populações de patógenos deve de resistência das populações de patógenos deve ser conhecido;

• Testes que avaliam a freqüência de alelos

resistentes são de grande importância para o manejo de cultivares.

Quantificação do alelo E198A da beta-tubulina que confere resistência a benzimidazole em Monilinia

fructicola utilizando PCR em tempo real.

• Resistência à fungicidas de benzimidazole tem sido detectada em algumas espécies de fungos;

Luo et al. 2007. Pest Manag Sci 63: 1178-1184.

• Na maioria dos casos, esta resistência tem sido associada com mutações pontuais no gene ß-tubulina;

• Isto resulta numa alteração da seqüência de aa no sítio de ligação da benzimidazole.

• O objetivo deste estudo foi desenvolver um método rápido e preciso para quantificar o alelo E198A que confere resistência a benzimidazole em populações de M. fructicola;

• O PCR em tempo real foi desenvolvido

Resultados

• O PCR em tempo real demonstrou uma potencial e efetiva ferramenta para quantificar a freqüência do alelo E198A;

• Ele foi capaz de detectar freqüências muito baixas do alelo E198A que os métodos convencionais não conseguem detectar.

O PCR em tempo real pode ser usado para detecção precoce de resistência à fungicida, tendo um importante papel na avaliação e manejo desse risco em populações no campo!

3. Contaminação de alimentos

• Com a introdução de regulamentos de segurança,

métodos capazes de quantificar precisamente

contaminantes de alimento foram requeridos;

• Nível tolerável de contaminação: • Nível tolerável de contaminação:

quantificação precisa é de importância crucial

companhias de agronegócio!

Aplicação da tecnologia do PCR em tempo real – molecular beacon para detectar espécies de

Salmonella contaminando frutas e vegetais

Liming & Bhagwat, 2004. Int J Food Microbiol 95: 117-187.

• A incidência de intoxicação alimentar causada por • A incidência de intoxicação alimentar causada por

espécies de Salmonella continua sendo um

problema;

• Novos métodos baseados no PCR têm sido usados crescentemente para uma detecção rápida, sensível e específica de patógenos de alimentos.

• A fluorescência da sonda MB aumenta com o acúmulo do DNA alvo no final de cada ciclo de amplificação.

Detecção de espécies de Salmonella:

U n id a d e d e f lu o re s c ê n c ia r e la ti v a ( R F U ) U n id a d e d e f lu o re s c ê n c ia r e la ti v a ( R F U ) Ciclo

• MB foi capaz de detectar espécies de Salmonella de variedades de produtos frescos com níveis muito baixos de contaminação (1-3 UFC/25g de produto).

Avaliação das sondas MB:

Conclusão:

Conclusão:

Este estudo ilustrou pela primeira vez a possibilidade do uso de MB para detecção e/ou fiscalização de Salmonella contaminando frutas e vegetais!

4. Identificação de OGM

1. Os consumidores devem poder decidir se querem

A detecção de OGM em alimentos,

ingredientes e aditivos é necessária por duas razões principais:

1. Os consumidores devem poder decidir se querem ou não consumir alimentos e ingredientes GM, o que levou a adoção de legislação impondo a rotulagem dos alimentos GM;

2. Se existe legislação, é necessário implementar as medidas que garantem que a mesma seja cumprida.

Métodos de detecção para algodão

transgênico MON 15985 e MON 88913 pelo

PCR

Lee et al. 2007. J Agric Food Chem 55: 3351-3357.

• O algodão é um cultivar muito importante

economicamente; economicamente;

• Características dos trangênicos estudados:

MON 15985: expressa duas proteínas altamente seletivas que são ativas contra insetos lepidópteros;

MON 88913: expressa dois genes que permitem o uso do glifosato (ingrediente ativo de alguns herbicidas).

• O método de detecção é um elemento essencial para o sistema de rotulagem. Alguns países têm estabelecido limites próprios para rotulagem.

• Limites de tolerância para contaminação dos

alimentos biológicos com OGM: - União européia: 0,9%

- Brasil: O,9% - Brasil: O,9%

- Coréia do Sul: 3% - Japão: 5%

Neste estudo, foi relatado a utilização do PCR em tempo real para quantificação do algodão GM, e confirmar sua aplicabilidade para uso rotineiro.

Resultados:

• Os limites de quantificação foram todos 0,1%

O PCR em tempo real pode ser aplicado por sistemas de rotulagem de OGM por todo o mundo!

Conclusão:

O PCR quantitativo foi validado e confirmado como um método para monitoramento prático para algodão transgênico!

5. Detecção e quantificação de

patógenos

• O método de PCR em tempo real para quantificar o nível de infecção de plantas tem aumentado o nível de infecção de plantas tem aumentado nos últimos anos, desde o primeiro relato por Böhm et al. (1999);

• Ele está sendo amplamente utilizado para

diagnósticos de doenças e para finalidades aplicadas.

Detecção melhorada do vírus do

amarelamento foliar de cana-de-açúcar

usando o PCR em tempo real (Taq Man)

Korimbocus et al. 2002. J Virol Methods 103: 109-120.

• A propagação vegetativa de cultivares de cana-de-açúcar pode levar ao desenvolvimento de infecção açúcar pode levar ao desenvolvimento de infecção viral nos clones selecionados

Destacando a importância de

estoques de cana livre de vírus para propagação e cultivo.

• Este artigo descreve o desenvolvimento de um

método que oferece melhor sensibilidade e

especificidade para detecção do vírus.

• O PCR em tempo real utilizando a sonda TaqMan foi avaliado e comparado ao método de PCR convencional.

Resultados:

• Maior sensibilidade do PCR em tempo real, detectando quantidades muito menores do vírus (105) comparado ao PCR convencional (103).

• O uso apropriado do PCR quantitativo pode ajudar a diminuir a incidência do vírus do amarelamento foliar, pela prevenção de sua extensão a níveis muito baixos em materiais de propagação.

Conclusão:

• A detecção de patógenos utilizando TaqMan pode ser aplicado a produção de plantas livres de

infecção, e evitar sua extensão através da

Perspectivas:

• Diagnósticos baseados no DNA estão em enorme crescimento no estudo de plantas;

• Especificidade e sensibilidade abrirão novas oportunidades para pesquisa sobre interações oportunidades para pesquisa sobre interações patógeno-hospedeiro, OGM, diagnósticos pré-sintomáticos, etc;

• Limitações devido ao alto custo devem ser minimizadas com a utilização rotineira.

Referências:

• Böhm J, Hahn A, Schubert R, Bahnweg G, Adler N, Nechwatal J, Oehlmann R, Osswald W, 1999. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. J Phytopathol 147: 409-416. • Gachon C, Mingam A, Charrier B, 2004. Real – time PCR: what

relevance to plant studies? J Exp Bot 55:1445-1454.

• Korimbocus J, Coates D, Barker I, Boonham N, 2002. Improved • Korimbocus J, Coates D, Barker I, Boonham N, 2002. Improved detection of Sugarcane yellow leaf virus using a real – time fluorescent (TaqMan) RT – PCR assay. J Virol Methods 103: 109-120. • Lee SH, Kim JK, Yi BY, 2007. Detection methods for biotech cotton MON 15985 e MON 88913 by PCR. J Agric Food Chem 55: 3351-3357.

• Liming SM & Bhagwat AA, 2004. Application of a molecular beacon - real time PCR tecnology to detect Salmonella species contaminating fruits and vegetable. Int J Food Microbiol 95: 177-187.

• Luo Y, Ma Z, Michailides TJ, 2007. Quantification of allele E198A in beta-tubulin conferring benzimidazole resistance in Monilinia fructicola using real-time PCR. Pest Manag Sci 63: 1178-1184.

•McCartney HA, Foster SJ, Fraaije BA, Ward E, 2003. Molecular diagnostics for fungal palnt pathogens. Pest Manag Sci 59: 129-142. • Schaad NW, Frederick RD, 2002. Real-time PCR and its application for rapid plant disease diagnostics. J Plant Pathol 24: 250-258.

• Yang L, Ding J, Zhang C, Jia J, Weng H, Liu W, Zhang D, 2005. Estimating the copy number of transgenes in transformed rice by real-time quantitative PCR. Plant Cell Rep 23: 759-763.

• Wong ML & Medrano JF, 2005. Real – time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques 39: 75-85.