UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA
MÉDICA
ANA CAROLINA MATIAS DINELLY PINTO
EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO SISTÊMICO E
IMUNOMODULADOR DE UM EXTRATO DE
Coccidioides posadasii
EM ARTRITE EXPERIMENTAL
ANA CAROLINA MATIAS DINELLY PINTO
EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO SISTÊMICO E
IMUNOMODULADOR DE UM EXTRATO DE
Coccidioides posadasii
EM ARTRITE EXPERIMENTAL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós - Graduação em Microbiologia Médica da Universidade Federal Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Microbiologia Médica.
Área de Concentração: Microbiologia humana e animal.
Linha de Pesquisa: Resposta inflamatória de bioprodutos de microorganismos patogênicos.
Orientador: Prof. Dr. Francisco Airton Castro da Rocha.
ANA CAROLINA MATIAS DINELLY PINTO
EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO SISTÊMICO E
IMUNOMODULADOR DE UM EXTRATO DE
Coccidioides posadasii
EM ARTRITE EXPERIMENTAL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
- Graduação em Microbiologia Médica da
Universidade Federal Ceará, como requisito
parcial para a obtenção do grau de Mestre em
Microbiologia Médica.
Aprovada em: ____ /____ /____
BANCA EXAMINADORA
________________________________ Prof. Dr. Francisco Airton Castro da Rocha
Universidade Federal do Ceará Orientador
________________________________ Prof.ª Dr.ª Lília Maria Carneiro Câmara
Universidade Federal do Ceará Examinador
___________________________________ Profª. Dr.ª Ana Karine Rocha de Melo Leite
Faculdades INTA Examinador
________________________________ Prof.ª Dr.ª Maria Fátima da Silva Texeira
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal do Ceará - UFC e ao Programa de Pós - Graduação em Microbiologia Médica que propiciou a realização do projeto.
Ao Centro de Especializado em Micologia Médica – CEMM, pela colaboração na execução desse trabalho.
À CAPES pelo apoio financeiro tornando capaz a realização desse projeto
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, que sempre me deu força nos momentos mais difíceis.
À minha mãe Heloisa Dinelly (in memorian) pelo exemplo de mulher e que sempre esteve
ao meu lado como um anjo da guarda.
Ao meu pai Raul Dinelly por seu incansável apoio e incentivo sendo ele o responsável pela pessoa que sou hoje.
Aos meus irmãos David Dinelly, Erika Dinelly e Juan Dinelly, pelo apoio e carinho.
À minha prima Karina Pinto Vasconcelos, pelo exemplo de luta.
Ao meu noivo Vinícius Martins Gomes, pelo imenso companheirismo, amor e paciência.
Aos meus sogros Carlos Gomes e Anita Gomes, que me acolheram como filha.
Às minhas primas amigas, que sempre estiveram comigo trazendo alegria, independente do momento.
Ao meu orientador Dr. Francisco Airton Castro da Rocha, pelas lições e orientações ensinadas e por ter acreditado em mim.
À minha amiga Ana Caroline Leite, que sempre me acalmou e me apoiou em toda essa jornada, obrigada por sua constante orientação.
À Dra. Virgínia Claudia Girão, pela ajuda nas avaliações histopatológicas.
À Dra. Ana Lourdes Camurça Fernandes Vasconcelos, que esteve comigo passando coragem para iniciar o mestrado.
Ao professor Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha, pelo incentivo inicial.
À professora Dra. Rossana de Aguiar Cordeiro pelas orientações e constante disponibilidade.
Aos professores Dr. Júlio Sidrim e Dra. Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante, pelos ensinamentos recebidos.
À Kharla Rabelo que participou prontamente na execução do projeto e me ajudou durante todo o curso.
A todos os professores do programa, por terem compartilhado seus conhecimentos e pela colaboração na minha formação científica.
Aos integrantes do Centro Especializado em Micologia Médica (CEMM), pelo auxílio na parte micológica do projeto.
À Carolina Vilma Soares de Oliveira, secretária do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Médica, pela prontidão prestada.
Ao Biotério Central da Universidade Federal do Ceará, pela gentileza na doação dos animais para a execução desse trabalho.
RESUMO
Peptídeos bioativos naturais são substâncias encontradas em diversas espécies que podem alterar a resposta imune contra patógenos, seja de forma prejudicial ou proteção para o hospedeiro. Há um crescente interesse na utilização de produtos naturais para a modulação de processos inflamatórios, alguns deles derivados de fungos não patogênicos. Fungos patogênicos, no entanto, também apresentam componentes imunomoduladores. Estudos prévios mostraram que extratos obtidos de nematódeos modularam a resposta imune em modelo experimental. Seguindo a mesma linha de pesquisa, foi investigado o efeito de um extrato obtido do fungo Coccidioides posadasii em modelo de artrite induzida por zymosan
(AZy). Ratos e camundongos receberam 1 mg e 0,1 mg de zymosan intra-articular (i.a.), respectivamente. Grupos receberam o extrato de C. posadasii por via oral (v.o.) ou
intraperitoneal (i.p.) 30 min antes do zymosan i.a. Grupos-controle receberam apenas solução salina. A hipernocicepção foi medida utilizando o teste de incapacitação articular e o von Frey eletrônico. O influxo celular agudo e crônico, bem como os níveis de nitrito e citocinas, foram avaliados no exudato sinovial. A sinóvia foi utilizada para exame histopatológico. O dano na cartilagem foi avaliado mediante determinação de conteúdo de glicosaminoglicanos (GAG). O pré-tratamento com o extrato de C. posadasii, seja i.p. ou
v.o., inibiu significativamente e de forma dose-dependente, o influxo de células tanto na fase aguda como na fase crônica, bem como a hipernocicepção, acompanhada por uma ligeira redução na perda de GAG e uma melhora significativa da sinovite crônica. Redução e alquilação do extrato reverteram os efeitos protetores observados anteriormente. A administração do extrato de C. posadasii não alterou os níveis i.a. de NO, IL-1 , TNF- ,
IFN- e IL-17 em ratos e camundongos submetidos à AZy, enquanto níveis de IL-10 foram significativamente reduzidos. Os dados revelam que um extrato de C. posadasii reduz a
expressão de iNOS, que está associado com a inibição da apoptose sinovial e diminuição dos níveis de IL-10 liberados. Esses dados mostram um papel anti-inflamatório sistêmico e imunomodulador para o extrato de C. posadasii em AZy. Uma abordagem preliminar,
utilizando técnicas eletroforéticas, para caracterizar componentes ativos excluiu carboidratos carregados enquanto aponta para frações proteicas ou polipeptídeo como responsáveis pela atividade biológica. O efeito do extrato de C. posadasii é
espécie-independente. Caracterização adicional dos componentes ativos no extrato pode revelar mecanismos relevantes para compreender a resposta do hospedeiro contra os componentes fúngicos. Além disso, o efeito anti-inflamatório do extrato ilustra a importância da realização de estudos, uma vez que a atividade oral pode também ser relevante para o tratamento de doenças inflamatórias.
ABSTRACT
Bioactive Natural Peptides are substances found in diverse species and may alter the immune response against pathogens, being either protective or harmful to the host. There is a growing interest in using natural products for the modulation of inflammatory processes, some of them derived from non-pathogenic fungi. However, pathogenic fungi also have immunomodulatory components. Previous studies showed that extracts of nematodes modulate the immune response in experimental model. Following the same line of research, it was investigated the effect of a protein-rich extract from Coccidioides posadasii in model of zymosan-induced arthritis (ZYA). Rats and mice received 1 mg and
0.1 mg zymosan intra-articularly (i.a.), respectively. Test groups received C. posadasii
extract either per os or intraperitoneally (i.p.) 30 min prior to zymosan i.a. Controls
received saline. Hypernociception was measured using the articular incapacitation test and the von Frey electronic test. Cell influx, nitrite, and cytokines levels were assessed in joint exudates. The synovia was used for histopathology. Cartilage damage was assessed through determining glycosaminoglycan (GAG) content. Pretreatment with the C. posadasii extract, either i.p. or per os, significantly and dose-dependently inhibited both
acute and chronic cell influx as well as hypernociception, with a mild reduction of GAG loss and significant amelioration of the chronic synovitis. Reduction and alkylation of the extract abrogated protector effects seen previously. Administration of the C. posadasii
extract did not alter i.a. levels of NO, IL-1 , and TNF- in rats subjected to ZYA, whereas intra-articularly levels of IL-10 were significantly reduced. Data reveal that a C. posadasii
extract reduces iNOS expression that is associated to inhibition of synovial apoptosis and decrease of IL-10 levels released into zymosan-inflamed joints.These data show a systemic anti-inflammatory and immunomodulatory role for the C. posadasii extract in ZYA. A
preliminary approach, using electrophoresis, to characterize active components excluded the presence of carbohydrates while pointing to a protein or polypeptide present in extract as responsible for the biological activity. The protective effect of the C. posadasii extract is
species-independent. Further characterization of the active components in this extract may unravel mechanistic effects relevant to understand the host response against fungal components. In addition, the anti-inflammatory effect of the extract illustrates the relevance of pursuing studies, since the oral activity may also be of relevance to the treatment of inflammatory diseases.
LISTA DE FIGURAS
Revisão de Literatura
Figura 1. Distribuição geográfica da coccidioidomicose. Áreas demarcadas de amarelo-claro correspondem às zonas endêmicas da coccidioidomicose. Áreas mostradas em amarelo-escuro correspondem às zonas com menor foco endêmico. Figura modificada de Hector, 2005.
Figura 2. Ciclo biológico de Coccidioides spp., indicando as fases filamentosa e
parasitária. Figura modificada de Ruddy et al.; 2011.
Capítulo I
Fig. 1 Effect of the parenteral and oral administration of the C. posadasii (C.p.) extract on
the cell influx in acute and chronic zymosan-induced arthritis (ZYA) in rats and mice. Rats (a, b) and mice (c, d, e) received the C.p. extract or saline (-) either i.p. or p.o. 30 min prior
to 1 mg or 0.1 mg zymosan i.a, respectively. (e) Mice received the reduced / alkylated C.p.
extract (R/A) i.p. 30 min prior to 0.1 mg zymosan i.a. Naive rats or mice received saline i.a. or saline i.a. plus C.p. extract i.p. Cell infiltration into joint cavities was assessed 6 h (a,
c, e) or 7 days (b, d) after injection of zymosan. Results show means ± SEM of total leukocytes (n= 6 animals for each group); !P < 0.05 compared to naive.*P < 0.05 compared
to control (-) rats and mice; #P < 0.05 compared to C.p. 30 µg
Fig. 2 Effect of the parenteral and oral administration of the C.p. extract on the
hypernociception in acute (a) or chronic (b) ZYA in rats. (a) Rats received the C.p. extract
or saline (-) either i.p. or p.o. 30 min prior to 1 mg zymosan. Naive rats received saline i.a. Articular incapacitation was measured hourly over 4 h as the increase in PET using the rat knee joint incapacitation test. Results show means ± SEM of maximal PET between 3 and 4 h of arthritis. n= 6 animals for each group; !P < 0.05 compared to naive rats;*P < 0.05
compared to control (-) rats; (b) Rats received the C.p. extract or saline (Zy) i.p 30 min
prior to 1 mg zymosan. Naive rats received saline i.a. The flexion - elicited hypernociception withdrawal threshold (g) was evaluated 3 h, 5 h and then daily for 7 days after injection of the zymosan. Results show means ± SEM of nociceptive threshold; n= 6 animals for each group. *P < 0.05 compared to control (Zy) rats
Fig. 3 Representative illustration of the synovial histopathology of mice subjected to ZYA and treated with the C.p. extract. Mice received 30 µg of C.p. extract (c) or saline (b) given
were sacrificed at 7 days. The synovia of animals that received just the zymosan display intense and diffuse mononuclear cell infiltration (b) that is clearly reduced in the mice that received the C.p. extract prior to zymosan (c). H & E staining. (Original magnification x
400)
Fig. 4 Representative illustration of the effect of C.p. extract on cell death in the zymosan-inflamed synovial detected by TUNEL method. Mice received 30 µg of C.p. extract (c) or
saline (b) given i.p. 30 min prior to 0.1 mg zymosan i.a. Naive mice (a) received saline i.a. All animals were sacrificed at 6 hours.The results are expressed as the average number of TUNEL- positive cells. P < 0.05 when compared to zymosan.
Fig. 5 Representative illustration of the immunoexpression of iNOS in the synovia. Mice received 30 µg of C.p. extract (d) or saline (c) given i.p. 30 min prior to 0.1 mg zymosan
i.a. Naive mice (b) received saline i.a.; negative control (a). All animals were sacrificed at 6 hours. There is a marked reduction of iNOS staining in the group that received C.p. extract (d) as compared to the group treated with saline (c). (Original magnification x 400).
Fig. 6 Effect of the administration of C.p. extract on the release of inflammatory mediators
in ZYA. Mice received 30 µg of the C.p. extract or saline (-) i.p. 30 min prior to 0.1 mg
zymosan i.a. Naive mice received saline i.a. IL-1 (a), TNF- (b), -IFN (c), IL-17 (d), and IL-10 (e) levels were assessed using ELISA (see text for details). Results represent means ± SEM, measured at 6 h (n = 6 animals for each group); !P < 0.05 compared to naive mice; *P < 0.05 compared to control (-) mice
Fig. 7 Effect of the administration of C.p. extract on the release of inflammatory mediators
in ZYA. Rats received 100 µg of the C.p. extract or saline (-) i.p. 30 min prior to 0.1 mg
h (n = 6 animals for each group); !P < 0.05 compared to naive rats; *P < 0.05 compared to control (-) rats
Fig. 8 Partial identification of proteins and carbohydrates present in C.p. extract.
Silver-stained 12 % polyacrylamide electrophoresis gel of C.p. extract (a) and a toluidine
blue-stained 6 % polyacrylamide electrophoresis gel for carbohydrate staining (b). (a) Lane 1, (Bio-rad™ standards), lane 2; 8µg C.p. extract; (b) Lane 1, chondroitin-4-sulfate; lane 2,
LISTA DE TABELAS
Capítulo I
Table 1. Effect of the C. posadasii extract on joint damage by histopathology in ZYA.
Mice received 30 µg of C.p. extract (Zy + C.p.), a reduced/alkylated (R/A) C.p. extract or
saline given i.p. (Zy), 30 min prior to 0.1 mg zymosan i.a. Naive mice received saline i.a. All animals were sacrificed at 7 days. Results represent medians of synovial histopathology scores. *P < 0.05 compared to control (Zy) mice (n= 6 animals for each
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AZy Artrite induzida por zymosan BSA Albumina sérica bovina CAM Moléculas de adesão celular
CEMM Centro Especializado em Micologia Médica ConA Concavalina A
COX-2 Ciclooxigenase-2
DNA Ácido desoxirribonucleico DTT Dithiothreitol
ELISA Ensaio imunoenzimático (Enzyme-linked immunosorbent assay) FIPs Proteinas fungicas imunomoduladoras
FIP-fve Proteína isolada do fungo Flammulina velutipes
GAG Glicosaminoglicano
gp43 Glicoproteína isolada a partir de Paracoccidioides brasiliensis
H&E Hematoxilina e Eosina
HTA Hipersensibilidade do tipo tardia i.a. Intra-articular
IA Incapacitação articular
ICAM Moléculas de adesão intercelular IL Interleucina
IFN- Interferon-gama i.p. Intraperitoneal
JAM Molécula de adesão juncional kDa Kilodaltons
LPS Lipopolissacarídeos
MADCAM-1 Molécula de adesão celular adressina das mucosas MHC Complexo maior de histocompatibilidade
mRNA Ácido ribonucleico mensageiro NF- B Fator nuclear-kappa B
NK Célula natural killer NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
PET Tempo de suspensão da pata (paw elevation time) PMN Células polimorfonucleares
PN Peroxinitrito
PSGL-1 Glicoproteína ligante de P-selectina
rGel1 Proteína recombinante isolada a partir de Coccidioides
rpm Rotações por minuto
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio spp. Espécies indeterminadas; o conjunto de formas em estudo comporta
representantes de várias espécies que, por qualquer razão não se considerou necessário explicitá-las.
TGF- Fator de transformação do crescimento TLRs Receptores Toll-like
TNF- Fator de necrose tumoral- alfa
VCAM-1 Molécula de adesão celular vascular-1
SUMÁRIO
REVISÃO DE LITERATURA 18
1. Coccidioides spp. 18
1.1. Caracterização do microorganismo 18
1.2. Patogenia 20
1.3. Fatores de virulência 22 1.4. Resposta imunológica 22 2. Imunomodulação por bioprodutos 25
3. Processo inflamatório 27
3.1. Migração celular 28 3.2. Mediadores inflamatórios 31 3.3. Dor inflamatória 33
4. Modelo experimental 34
4.1. Artrite induzida por zymosan (AZy) 34 4.2. Mecanismos envolvidos na AZy 34
JUSTIFICATIVA 38
HIPÓTESE CIENTÍFICA 39
OBJETIVOS 40
Objetivos Gerais 40
Objetivos Específicos 40
CAPÍTULO I 41
CONCLUSÕES 73
PERSPECTIVAS 74
REVISÃO DE LITERATURA
1.
Coccidioides
spp.
1.1.Caracterização do microorganismo
A taxonomia do patógeno Coccidioides spp. inclui o reino Fungi, filo Ascomycota,
classe Eurotiomycetes, ordem Onygenales e família Onygenaceae. Há décadas, estudos mostram uma variabilidade morfológica do fungo, o que acarretou uma divisão do fungo
Coccidioides immitis em duas espécies geneticamente diferentes, Coccidioides immitis e Coccidioides posadasii (FISHER et al., 2002). Além da diferença no genótipo, foram
encontradas pequenas diferenças em sequências de aminoácidos de proteínas (KOUFOPANOU et al.; 1997, PENG et al.; 1999) e, além disso, C. posadasii exibe uma
cinética de crescimento mais lenta que C. immitis em meios contendo elevadas
concentrações de sal (FISHER et al., 2002). Embora as diferenças nas taxas de crescimento sejam significativas, diferenças fenotípicas não são notáveis, bem como a morfologia, virulência e antigenicidade entre os grupos. Por este motivo, alguns autores questionam a separação das espécies, utilizando o argumento de que ambas demonstram processos infecciosos e quadro clínico semelhantes, além da ausência de estudos que indiquem relevância biológica e variabilidade genética convincente.
C. immitis e C. posadasii são fungos dimórficos térmicos, agentes etiológicos da
coccidioidomicose, uma micose sistêmica caracterizada por uma infecção respiratória iniciada pela inalação de estruturas infecciosas denominadas artroconídeos. A infecção pode mostrar-se em diversas formas clínicas, variando da forma assintomática a uma micose disseminada. A coccidioidomicose é uma doença infecciosa, mas não contagiosa. Foi considerada uma doença reemergente em virtude do aumento dramático no número de casos (COX & MAGEE, 2004; DICAUDO, 2006). É importante ressaltar que ambas as espécies são classificadas como agentes de bioterrorismo, sendo necessária a utilização de normas rígidas de biossegurança, transporte e estocagem para a manipulação segura de suas culturas (SUTTON, 2007; WARNOCK, 2007).
Embora a coccidioidomicose ocorra em muitos países, Coccidioides spp. expressa
uma evidente distribuição geográfica. Considerando que a prevalência C. immitis é
tem uma distribuição mais dos Estados Unidos, bem c No Brasil, C. posadasii est
Maranhão, onde a prátic
Euphractus sexcinctus) exp
facilidade de dispersão da a
FIGURA 1. Distribuição ge claro correspondem às zo amarelo-escuro correspond Hector, 2005.
is ampla, estando associada à coccidioidomico como no México, América Central e América está limitado a regiões do Nordeste, como Pia tica desprotegida de caça a tatus (Dasypu
xpõe seres humanos e cães à infecção por artroconídios presentes no solo (CORDEIRO
geográfica da coccidioidomicose. Áreas dema zonas endêmicas da coccidioidomicose. Ár ndem às zonas com menor foco endêmico. Fig
icose em outras áreas ica do Sul (Figura 1). Piauí, Bahia, Ceará e
pus novemcinctus e
C. posadasii, pela
et al.; 2010).
1.2. Patogenia
C. immitis e C. posadasii são encontrados no solo de regiões semiáridas quando não
estão infectando o hospedeiro. O micélio fúngico encontra-se no solo em fase saprofítica na sua forma filamentosa, composto por hifas hialinas, septadas, formadas por artroconídeos intercalados por células desprovidas de material citoplasmático, denominadas de células disjuntoras, as quais facilitam a desarticulação da hifa com a consequente dispersão das estruturas infecciosas no ar - os artroconídeos. Após a inalação, é iniciada a infecção. Os artroconídeos apresentam um crescimento isotrópico e são convertidos em esférulas, que se diferenciam e produzem endósporos em seu interior, caracterizando a fase parasitária do fungo. Estas esférulas, após o amadurecimento, são rompidas, liberando em torno de 800 endósporos, que, por sua vez, são capazes de se desenvolver, originando uma nova geração de esférulas, atingindo uma reprodução exponencial. Endosporos são capazes de propagar e reiniciar o ciclo de esporulação no hospedeiro com formação de granuloma (figura 2) (COX & MAGEE, 2004).
FIGURA 2. Ciclo biológico de Coccidioides spp., indicando as fases filamentosa e
parasitária. Figura modificada de Ruddy et al. 2011.
A fase filamentosa desse fungo, quando semeado em Agar-Sabouraud e incubado a 25°C, tem um aspecto macroscópico caracterizado por colônias membranosas, de coloração branca ou creme, quase glabrosas ou aveludadas, com o desenvolvimento de um discreto micélio aéreo. O fungo atinge um crescimento ideal em cultura em um período aproximado de cinco a dez dias. A obtenção in vitro da fase parasitária é mais difícil, pois
1.3.Fatores de virulência
Os fungos C. posadasii e C. immitis são altamente virulentos, porém, pouco se sabe
sobre os mecanismos de virulência. Com avanços em projetos de sequenciamento do genoma de Coccidioides spp., no entanto, contribui para a descoberta de um conjunto de
genes que expressam os fatores de virulência e a determinação precisa da função biológica no curso da doença (HUNG et al., 2007).
No crescimento isotrópico da esférula, uma camada membranosa, composta por polissacarídeos, lipídeos e proteínas, é depositada na superfície da célula. Foi mostrado que, em cultura, produtos da parede externa de esférulas são liberados para o meio, na fase de crescimento esferular, e que esses produtos são caracterizados por demonstrarem altos níveis de imunorreatividade em ensaios, envolvendo imunidade celular e humoral (COLE et al., 1988-A; COLE et al., 1988-B). O componente responsável por essa imunorreatividade é uma glicoproteína denominada SOWgp, atuando como antígeno imunodominante provocando ambas as respostas imune celular e mediada por anticorpos em pacientes com coccidioidomicose (HUNG et al., 2000). Hung e colaboradores (2007) demonstraram que títulos elevados de anticorpo anti-SOWgp contribui para o aumento da opsonização, fagocitose e lise das células. Além disso, SOWgp estimula uma resposta proliferativa de células T CD4+ in vitro, sugerindo que esse antígeno pode estimular
células Th2 a secretar citocinas que induzem as células B a produzir anticorpos.
1.4. Resposta Imunológica
Ante a infecção por Coccidoides spp., células PMN compreendem o primeiro
com esférulas e endósporos, porém, ainda não estão bem esclarecidos (BORCHERS, 2010).
Estudos são realizados para desvendar receptores envolvidos no reconhecimento de
Coccidioides spp. Foi mostrado que o receptor de manose promove a ligação de alguns
elementos fúngicos a monócitos e células dendríticas (AMPEL et al. 2005; DIONNE et al. 2006). Em macrófagos peritoneais, os receptores Toll-like do tipo 2 (TLR-2) e dectin-1 mostraram-se necessários para a produção de citocinas e quimiocinas quando em contato com esférulas (VIRIYAKOSOL et al.; 2005).
Na década de 1940, Smith et al. (1948) desenvolveram um antígeno denominado coccidioidina, um filtrado obtido com base no micélio de Coccidioides, utilizado para
realizar o teste cutâneo de hipersensibilidade do tipo tardia (HTA). Uma vez que métodos de cultura da fase parasitária foram desenvolvidos, um lisado de esférulas, denominado esferulina, mostrou-se mais sensível na detecção de reatividade cutânea (AMPEL et al.; 2002). Aproximadamente 80% dos pacientes com coccidioidomicose não disseminada manifestam reatividade no teste cutâneo para antígenos coccidióidico. Quando a reatividade ao teste é baixa ou ausente, o prognóstico é frequentemente ruim, enquanto que reações positivas no teste de HTA estão associadas com a recuperação. Uma vez que as reações de HTA constituem uma medida da imunidade celular, a correlação observada entre a presença de uma forte reação cutânea com antígenos coccidióidicos e um prognóstico favorável sugere que a imunidade celular desempenha papel central na defesa do hospedeiro.
Preparações antigênicas a partir de esférulas ou do micélio são usadas no estudo da imunidade celular in vitro. Foi observado como resposta a várias preparações o
envolvimento de várias citocinas, como, o aumento significativo dos níveis de interferon- (IFN- ), interleucina (IL)-2, IL-12 e fator de necrose tumoral (TNF- ), bem como, baixos níveis de IL-10 e IL-4 em células mononucleares do sangue periférico de indivíduos saudáveis (BORCHERS, 2010).
A imunidade adaptativa para Coccidioides spp. é extensivamente estudada. Nas
este patógeno. A este respeito, células mononucleares do sangue periférico humano foram capazes de liberar TNF- , em resposta à estimulação in vitro com artroconídeos e esférulas
de C. immitis (AMPEL, 1994). TNF- é uma citocina produzida por uma grande variedade
de células, necessária para o controle da infecção aguda e formação de granulomas, por outro lado, é implicada como um importante componente no hospedeiro, contribuindo com a destruição do tecido pulmonar (COX & MAGEE, 2004).
Nos últimos anos, houve maior esforço na identificação de proteínas antigênicas como candidatas para vacinas contra coccidioidmicose. Dada a importância da imunidade mediada por células na defesa do hospedeiro contra a infecção por Coccidioides spp,. o
foco é em antígenos para células T, capazes de induzir uma resposta Th1. Xue et al. (2005) estudaram o comportamento de uma proteína recombinante (rGel1) isolada de C. posadasii
na proteção contra coccidioidomicose e observou o aumento da produção de citocinas Th1, IL-12 e IFN- , e a redução da liberação de IL-5 e IL-10 (Th2) em camundongos. Considerando que a persistência de elevados níveis de IL-10 contribui para a disseminação da coccidioidomicose, o estudo concluiu que a proteção foi obtida com envolvimento de citocinas Th1.
2.
Imunomodulação por bioprodutos
Níveis moderados de mediadores inflamatórios são importantes para a sobrevivência do hospedeiro ante uma infecção e necessários para a reparação de lesões dos tecidos. No entanto, o desequilíbrio, com a consequente superprodução desses mediadores inflamatórios, está envolvido no desenvolvimento de uma variedade de doenças inflamatórias e autoimunes, como artrite reumatoide e doença de Crohn (RAO, 2007).
Há um crescente interesse na utilização de produtos naturais para modular respostas imunes e neutralizar processos inflamatórios (NAM, 2006). Vários estudos demonstraram o potencial anti-inflamatório e imunomodulador de componentes fúngicos, como polissacarídeos, proteínas, lipídeos, bem como metabólitos secundários, descritos como moléculas com propriedades imunomoduladoras (LULL et al., 2005). Embora o mecanismo exato de ação dos componentes bioativos de fungos ainda seja desconhecido, uma via comum envolve a ativação dos linfócitos T e macrófagos, alterando assim o repertório de citocinas liberado na resposta inflamatória (WASSER, 2002).
Com o interesse de utilização de extratos fúngicos em modular processos inflamatórios, KO et al. (1995) relatam a atividade biológica de uma proteína fúngica imunomoduladora isolada de Flammulina velutipes (FIP-fve), um cogumelo comestível
popular na Ásia. FIPs são grupos de proteínas fúngicas definidas por indicarem uma similaridade na sequência de aminoácidos e em suas ações imunomoduladoras. Nesse estudo, o tratamento sistêmico com essa proteína foi capaz de suprimir completamente a anafilaxia promovida por albumina sérica bovina (BSA) e reduzir edema de pata em camundongos, quando comparado com grupo-controle. Em um estudo mais recente, utilizando extratos de F. velutipes compostos basicamente de FIPs e lectinas, foi observada
uma atividade imunomoduladora in vitro, mediante a redução na produção de citocinas
como IL-4 e IFN- em células mononucleares do sangue periférico estimuladas com concavalina A (ConA), uma lectina indutora de mitose e produção de IFN- (JEURINK et al.; 2008).
Extratos dos fungos Antrodia camphorata e Cordyceps sinensis, já utilizados na
e IL-12, bem como a produção de NO por macrófagos peritoneais estimulados com LPS ou IFN- . Embora os mecanismos responsáveis pela inibição das respostas pró-inflamatórias não tenham sido elucidados, muitas vias importantes foram identificadas e uma dessas é o fator de transcrição NF- B, que, por sua vez, controla a expressão de genes pró-inflamatórios (RAO, 2007).
Em 2011, Hanaoka e colaboradores estudaram o efeito anti-inflamatório de produtos do fungo Gonoderma lucidum em modelo de colite, com o objetivo de buscar
opções terapêuticas para a doença de Crohn, uma patologia inflamatória caracterizada por ciclos de inflamação aguda, ulceração e sangramento da mucosa intestinal. Gonoderma lucidum é utilizado tradicionalmente como alimento na China e Japão e contêm várias
substâncias bioativas como polissacarídeos, proteínas, nucleotídeos, ácidos graxos e terpenoides. Nesse estudo, foi observado que polissacarídeos de Gonoderma lucidum,
administrados oralmente, diminuem, de maneira dose-dependente, a inflamação em modelo de colite induzida por ácido trinitrobenzenosulfônico em camundongos. O efeito anti-inflamatório foi observado por intermédio da redução da intensidade da colite em parâmetros histopatológicos, e, in vitro, observou a redução da liberação de IFN- por
linfócitos. Estudos anteriores relatam atividade antitumoral de Gonoderma lucidum
atribuída a -glucanos, relacionadas principalmente com seus efeitos sobre células imunológicas efetoras, como macrófagos e neutrófilos. (OKA, 2010). Dessa forma, acredita-se que a atividade anti-inflamatória de polissacarídeos de Gonoderma lucidum
também seja atribuída a partir de moléculas como -glucanos.
Diferentemente dos estudos supracitados, que relatam atividade biológica de fungos não patogênicos, um grupo de pesquisadores brasileiros estuda a atividade anti-inflamatória e imunomoduladora de produtos de Paracoccidioides brasiliensis, um fungo
patogênico. Trata-se de um fungo dimórfico térmico, pertencente à mesma família do C. posadasii, agente causador da paracoccidioidomicose, uma doença granulomatosa
sistêmica prevalente na América Latina, adquirida pela inalação de propágulos fúngicos que, uma vez nos pulmões, converte-se em formas de levedura patogênicas, tal como observado na coccidioidomicose. Foi isolada e definida como principal componente antigênico deste fungo uma glicoproteína rica em manose de 43 kDa, denomindada de gp43, que desempenha diferentes funções na patogênese do P. brasiliensis, como
paracoccidioidomicose, sendo reconhecida por 100% de soros de pacientes infectados (PUCCIA, 1991).
Foi observado que peptídeos derivados da molécula gp43 apresentaram atividade anti-inflamatória, inibindo significativamente o edema de pata promovido por injeção de
Micobacterium bovis, tanto em camundongos como em ratos, mantendo o efeito durante
sete dias de avaliação. In vitro, peptídeos inibiram a produção de NO por macrófagos
estimulados com zymosan, bem como aumentaram a expressão de IL-10. Com efeito, notaram que peptídeos, componentes da molécula gp43 de P. brasiliensis, é capaz de
modular a produção de importantes mediadores inflamatórios e esse efeito biológico parece estar relacionado com a interação com TLRs (KONNO et al.; 2009; KONNO et al.; 2012).
3.
Processo Inflamatório
A resposta inflamatória é a primeira linha de defesa do organismo ao dano tecidual, um processo biológico complexo que envolve componentes vasculares e celulares, bem como uma variedade de substâncias solúveis, exprimindo características como eritema, calor, edema, dor e incapacidade funcional. A resposta inflamatória acarreta uma cascata de eventos, incluindo a produção de citocinas pró-inflamatórias, ativação do sistema complemento, aumento do influxo celular, produção de mediadores inflamatórios, ativação da cascata de coagulação, fibrinólise e alterações nos parâmetros hemodinâmicos e permeabilidade vascular (MOORE et al., 2001; CRUVINEL et al., 2010).
local da infecção ou lesão do tecido é essencial para uma resposta eficaz do sistema imune inato. Dessa forma, uma deficiência no processo de migração celular poderá acarretar infecções graves, muitas vezes letais. Componentes importantes para o desenvolvimento da imunidade inata são também os monócitos, que constituem 3-8% de leucócitos circulantes e dão origem a macrófagos. Ao contrário dos neutrófilos, os macrófagos podem permanecer no tecido durante meses ou anos, atuando como verdadeiros sentinelas. Além de ter um papel na imunidade inata, os macrófagos processam e exibem antígenos, estimulando a resposta mediada por linfócitos T (SCHMIDT et al., 2011).
Outro evento importante presente no processo inflamatório é a ativação do sistema complemento, constituído por uma família de cerca de 20 glicoproteínas plasmáticas e cada componente ativado adquire atividade proteolítica, ativando os próximos elementos em cascata. Ao longo do processo, existe a produção de vários mediadores que alteram a permeabilidade vascular e contribuem para o desenvolvimento da resposta inflamatória. Existem três formas de ativação do sistema complemento, pela via clássica, via alternativa e pela via da lectina, e a ativação destas vias contribuem para a interação de mecanismos efetores da imunidade inata e adaptativa (CRUVINEL et al., 2010).
3.1. Migração celular
A migração de células é dirigida pelo gradiente de substâncias quimiotáticas no sítio inflamatório. Quando estas células estão presentes no tecido, promovem a fagocitose de patógeno, permitindo a reparação (CRUVINEL et al., 2010). Na inflamação aguda, as principais células envolvidas são os neutrófilos e macrófagos; já a inflamação crônica é caracterizada por um infiltrado composto principalmente de células mononucleares como monócitos e linfócitos. Em decorrência da vasodilatação promovida pela inflamação, a velocidade do fluxo de sangue diminui e as células circulantes colidem com maior frequência com as células endoteliais, que, por sua vez, expressam moléculas de superfície capazes de se ligar a leucócitos, promovendo a migração celular, como visto na figura 3 (SCHMIDT et al., 2011).
ligam-se a moléculas glicosiladas, promovendo a adesão de baixa afinidade entre os leucócitos e células endoteliais. Estas ligações têm rápida dissociação, o que promove o rolamento na parede do vaso impulsionado pelo fluxo de sangue, expondo os leucócitos a fatores quimiotáticos. Portanto, o rolamento está relacionado com a capacidade de captura das selectinas e formação de ligações antes que as antigas sejam quebradas. Se o leucócito não for ativado, se desprende do endotélio e retorna à circulação venosa. A PSGL-1 é expressa em quase todos os leucócitos e tem papel dominante, atuando como ligante para as três selectinas (LEY et al., 2007; CHOI et al., 2010; CRUVINEL et al., 2010).
Em virtude da redução da velocidade de rolamento dos leucócitos, as quimiocinas, um grupo de pequenas citocinas, promovem uma ligação com seu receptor específico presente no leucócito, bem como a ligação com o grupo de carboidratos, como heparan sulfato, condroitin sulfato e ácido hialurônico, ativando a célula. Os receptores de quimiocinas são seletivamente expressos em determinadas populações de leucócitos e o perfil destes receptores depende do tipo de célula e seu estado de diferenciação. O endotélio ativado é capaz de liberar quimiocinas que atraem outras células, como a ativação de monócitos que, por sua vez, liberam IL-8, induzindo a quimiotaxia de neutrófilos e basófilos. Desta mesma forma, a ativação de macrófagos aumenta a liberação de leucotrieno B4, outro agente quimiotático para neutrófilos (CRUVINEL et al., 2010).
As quimiocinas induzem mudanças em outro conjunto de adesinas, as integrinas, presente na superfície de muitas células, inclusive leucócitos. Integrinas são moléculas de adesão compostas por subunidades e , ambas com função de adesão e sinalização. A maioria dos leucócitos circulantes mantem suas integrinas em estado de afinidade muito baixa para moléculas de adesão celular (CAMs) no endotélio, no entanto, durante o processo inflamatório, as integrinas são moduladas para desenvolver uma ligação de alta avidez, promovendo a imobilização dos leucócitos e aderência na parede do vaso. As CAMs são membros da família das imunoglobulinas, e incluem as moléculas de adesão intercelular (ICAM), molécula de adesão celular vascular-1 (VCAM-1) e a molécula de adesão celular adressina das mucosas (MADCAM-1) (ROSE, 2007).
células endoteliais. Para a adesão ricas em actina, faz que são projeções que envo uma cúpula em volta do leu transmigração leucocitária é superfície de células end transmigração mais eficien Depois de atravessar o end quimiocinas que medeiam a
FIGURA 3. Migração leuco mediado por selectinas, seg adesão ao epitélio, incentiv chave envolvidas em cada p P-selectina; VLA4 – moléc adesão intercelular; VCAM molécula de adesão celular
a migração transcelular, os leucócitos proje azendo com que células endoteliais formem o volvem a célula migratória. Em seguida, a célu leucócito, promovendo a transmigração. A sel ia é dependente da exibição de moléculas espec
endoteliais servindo de sinalização para i iente para o tipo específico de leucócito na
ndotélio, a célula é capaz de responder a um a migração através do tecido (SCHMIDT et a
cocitária. A migração celular é iniciada pela ca seguidas da ativação por quimiocinas. As integ tivando a transmigração transcelular ou parac passo são indicadas em caixas. PSGL1 - glico lécula de adesão de reconhecimento tardio; ICA
AM1 - molécula de adesão celular vascular ar adressina das mucosas. Figura modificada de
ojetam estruturas de o “copo migratório”, lula endotelial forma eleção do modelo de ecíficas expressas na indicar a rota de naquelas condições. m novo conjunto de t al., 2011).
captura e rolamentos tegrinas promovem a racelular. Moléculas-icoproteína ligante de
3.2. Mediadores inflamatórios
Mediadores pró-inflamatórios, como bradicinina, fragmentos de clivagem do sistema complemento, prostaglandinas, leucotrienos etc, estão envolvidos na resposta inflamatória. Estudos mostram que uma cascata de citocinas é liberada antes do envolvimento desses mediadores inflamatórios (CUNHA et al., 2005).
Citocinas são pequenas proteínas reguladoras liberadas diante de um estímulo inflamatório, com suporte em uma grande variedade de células que modulam a interação célula-célula, participando de processos como reconhecimento imunológico, sinalização local ou sistêmica da inflamação, bem como na diferenciação, crescimento e metabolismo das células. As citocinas podem desencadear uma grande variedade de respostas celulares, que dependem do tipo de célula, do momento e do ambiente molecular em que se encontram. Podem se ligar a receptores presentes nas células em que foram produzidas (efeito autócrino), bem como em receptores de outras células (efeito parácrino). Muitas vezes, são classificadas de acordo com a sua capacidade funcional de contribuição para a inflamação em citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF- , IL-1 , IL-6, IL-12, IL-17, IL-18 e IFN- ou anti-inflamatórias, como IL-4, IL-10, IL-13 e fator de transformação do crescimento (TGF- ) (CUNHA et al., 2005; VERRI JR. et al., 2006).
Outro mediador importante para o desenvolvimento da resposta imune é o IFN- , agindo contra microorganismos intracelulares e parasitas. Essa citocina é liberada em resposta a um agente patogênico associado a um padrão molecular e age promovendo respostas imunes celulares, ativando células natural killer (NK) e macrófagos, aumentando
a expressão de moléculas MHC e promovendo a migração de leucócitos. Essa citocina é característica da resposta imunológica do tipo Th1 (GEORGE et al., 2012).
Mais recentemente, estudos mostram o envolvimento da IL-17 como citocina pró-inflamatória. É sintetizada por células Th17, caracterizando uma nova população de células T helper que se distingue das populações de células Th1 e Th2, expressando um padrão
único de expressão de citocinas (KARMAKAR, 2010). A IL-17 tem papel regulador na inflamação, estimulando a secreção de citocinas como IL-6 e IL-8, fatores de crescimento associados com inflamação e aumento da expressão de proteínas do complemento, contribuindo para a patogênese de várias doenças inflamatórias, incluindo a artrite reumatoide (YAO et al., 1995; KATZ et al., 2000).
Enquanto muitas citocinas promovem a inflamação, outras inibem esse processo. Uma das principais citocinas anti-inflamatórias descritas é a IL-10, produzida por monócitos, macrófagos, células T e B. Tem a capacidade de inibir a produção de várias citocinas como 1 , TNF- e IFN- , e regulam negativamente a expressão de 17 e IL-22 em macrófagos e células T, o que torna crucial para sua atividade anti-inflamatória. Além de inibir a produção desses efetores da inflamação, a IL-10 também aumenta a expressão de seus antagonistas naturais, como, por exemplo, o antagonista do receptor de IL-1 e TNF- por monócitos ativados (CHOY, 2001; GU et al., 2008).
3.3. Dor Inflamatória
primários, que transmitem a informação nociceptiva para a medula espinhal de onde é transmitida para níveis supraespinhais (JULIUS, 2001).
Em seres humanos, a sensibilização dos nociceptores pode ser definida em duas categorias - hiperalgesia, definida como uma resposta dolorosa aumentada a um estímulo previamente doloroso, e alodínia, dor provocada por um estímulo que normalmente não resulta em dor. Estas características de alterações patológicas das vias de sensação dolorosa não podem ser observadas em modelos experimentais de nocicepção animal. Por esse motivo, o termo hipernocicepção é usado mais adequadamente quando estudos em animais se referem à sensibilização neuronal presente em modelos de inflamação (VERRI JR. et al., 2006).
Com o objetivo de elucidar mecanismos celulares subjacentes à dor inflamatória, estuda-se o envolvimento de estímulos inflamatórios na promoção da dor. Cunha et al. (2005) demonstraram que os estímulos inflamatórios não induzem diretamente a liberação de prostaglandinas e aminas simpáticas e que a liberação de mediadores hipernociceptivos finais é precedida por uma cascata de citocinas e quimiocinas, que, por sua vez, é modulada pela liberação paralela de citocinas anti-inflamatórias.
Células residentes, incluindo as células dendríticas, macrófagos, linfócitos e mastócitos, após o reconhecimento de estímulos inflamatórios, liberam uma cascata de citocinas, que desempenham papel essencial no desenvolvimento da dor inflamatória. As primeiras citocinas envolvidas no desenvolvimento da dor inflamatória ou neuropática descritas foram IL-1 , TNF- , e as quimiocinas IL-8 e quimiocinas derivadas de queratinócitos (VERRI JR. et al., 2006).
quimiocinas no desenvolvimento da hipernocicepção mecânica induzida por carragenina, com a inibição parcial da dor após administração de anti-IL-8 (CUNHA et al., 1991).
Posteriormente foi relatada a participação das citocinas IL-17, IL-18 e IL-12 na hipernocicepção inflamatória. Foi demonstrado que a injeção intraplantar de IL-12 induz hipernocicepção em ratos, via endotelina. Outro estudo, mostou a participação da IL-17 em artrite induzida por antígeno, onde a concentração dessa citocina foi elevada nas articulações que receberam o estímulo, e o tratamento com o anticorpo anti-IL-17 inibiu a hipernocicepção e a migração de neutrófilos (VERRI JR. et al. 2005; VERRI JR. et al., 2006; PINTO et al., 2010).
4.
Modelo experimental
4.1. Artrite induzida por zymosan (AZy) em murino.
O zymosan é um polissacarídeo derivado do fungo Saccharomyces cerevisiae, e é
muito utilizado como agente inflamatório (GADÓ, 1991). A administração intra-articular das partículas de zymosan é capaz de promover intensa reação inflamatória com aumento do influxo celular, edema e distúrbios na marcha (ROCHA, 1999).
Este modelo foi descrito pela primeira vez, em 1977, por Keystone et al. Nesse estudo, foi observada uma artrite inflamatória crônica com infiltração de células mononucleares, hipertrofia sinovial e transformação da membrana sinovial em um tecido inflamatório com propriedades invasivas, definido como pannus. Este quadro é observado
com sete dias após a injeção de zymosan intra-articular (i.a.), comparando com partículas de látex, que por sua vez, produziu apenas leves e transitórias reações inflamatórias.
4.2. Mecanismos envolvidos na AZy
principalmente pelo aumento da permeabilidade vascular e infiltração de leucócitos polimorfonucleares (neutrófilos). Na AZy, a migração de neutrófilos demonstra um pico de seis horas e persiste por até três dias. Estas células são predominantes em várias artropatias inflamatórias e, além de propriedades fagocíticas, liberam mediadores inflamatórios como eicosanoides, citocinas, metaloproteinases e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (SCHORLEMMER, 1977; HAMPTON, 1998). Posteriormente, ocorre uma sinovite progressiva crônica, com infiltração de células mononucleares, havendo formação de células gigantes, neoformação vascular e proliferação de fibroblastos, acompanhada da perda de proteoglicanos com suporte na matriz da cartilagem e invasão do osso subcondral, assemelhando-se ao pannus reumatoide (ROCHA et al., 1999).
Estudos anteriores sugerem que os fatores responsáveis pela hipernocicepção em modelos experimentais podem ser diferentes daqueles envolvidos em fenômenos inflamatórios, tais como alteração na permeabilidade vascular e influxo de células (OTTERNESS, 1993). Originalmente, descrito em outro modelo de artrite, a incapacitação articular (IA), que corresponde à alteração da marcha dos animais, mostrou-se reprodutível na AZy. A IA é um fenômeno tipicamente agudo, que declina após quatro horas de artrite, cessando após 12 horas (ROCHA et al., 2003). A hipernocicepção observada na AZy aguda não está relacionada com a migração de neutrófilos para o exsudato sinovial, originando-se da sensibilização aguda de nociceptores locais no tecido periarticular (ROCHA, 1999, SILVA JR. 2006). Neutrófilos, no entanto, também têm a capacidade de liberar prostaglandinas com pico de seis horas, que, por sua vez, são compostos hiperalgésicos, bem como a liberação de outros mediadores envolvidos na dor inflamatória como leucotrieno B4 (BEZERRA et al., 2007).
Dentro de articulações inflamadas, uma variedade de células, além dos neutrófilos, é fonte potencial desses mediadores, incluindo sinoviócitos, condrócitos, mastócitos e monócitos. A resposta inflamatória desencadeada por zymosan está ligada a um conjunto de receptores, entre eles, o receptor dectin-1, receptor de membrana expresso em macrófagos, células dendríticas e neutrófilos e medeia a ligação de antígenos como
Saccharomyces cerevisiae e Cândida albicans de uma forma -glucano-dependente
zymosan. A ativação desses receptores, por sua vez, induz a liberação de citocinas pró-inflamatórias, como IL-1 e TNF- .
Durante condições inflamatórias, grandes quantidades de óxido nítrico (NO) e ânion superóxido (O2-) são produzidos, levando à formação de forte produto oxidante, o peroxinitrito (PN), o qual foi associado com efeitos lesivos decorrentes da nitrosilação de proteínas, promovendo a desestabilização de membranas e quebras de DNA (BEZERRA et al., 2007). Na AZy, a liberação de NO no líquido sinovial e a geração de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio é máxima na 6ª hora após a injeção do estímulo, e estão diretamente relacionadas com a migração de neutrófilos (ROCHA et al., 1999). Os níveis de nitrito total permanecem elevados no exsudato sinovial durante três semanas, embora o níveis mais elevados sejam observados durante a fase aguda do modelo (BEZERRA et al., 2004).
Ensaio que aborda o papel dual do NO na inflamação por zymosan demonstrou que inibidores de óxido nítrico sintase (NOS) promovem redução do influxo celular e antinocicepção, quando administrado antes da indução da artrite. Em contraste, a administração de doadores de NO, como nitroprussiato de sódio, exibe analgesia em dor contínua de forma dose-dependente. Ainda, a depleção de PN por ácido úrico inibiu a lesão da cartilagem articular (ROCHA et al., 2003).
JUSTIFICATIVA
Vários estudos mostram o potencial anti-inflamatório e imunomodulador de componentes derivados de fungos. A busca pela atividade anti-inflamatória dos constituintes fúngicos geralmente se concentra em espécies não patogênicas. A imunomodulação, no entanto, é também uma estratégia empregada por patógenos para escapar das defesas do hospedeiro como observado no Coccidioides spp., um fungo
causador da coccidioidomicose e altamente virulento que secretam um antígeno imunodominante capaz de modular o sistema imune via Th2 (HUNG et al., 2007).
Coccidioides spp. podem, no entanto, também secretar antígenos que estimulam ou
suprimem a imunidade mediada por células, dependendo do método de preparação de antígeno (BRASS et al., 1982). Como citado há pouco, componentes de fungos patogênicos e/ou seus produtos liberados podem provocar mudanças imunológicas no hospedeiro. Dessa forma, houve interesse em investigar se a administração sistêmica de um extrato proveniente de uma cepa de C. posadasii, isolada por nosso grupo, altera e modula
HIPÓTESE CIENTÍFICA
O extrato originado de Coccicioides posadasii desenvolve uma resposta
OBJETIVO
Objetivo geral
Avaliar a atividade anti-inflamatória e imunomoduladora de um extrato de Coccidioides posadasii em um modelo experimental animal de artrite induzida por zymosan.
Objetivos específicos
• Realizar a caracterização preliminar por meio do perfil eletroforético de proteínas e carboidratos carregados do extrato de C. posadasii.
• Realizar uma curva dose-resposta, de acordo com a concentração proteica do
extrato de C. posadasii, em ratos e camundongos.
• Determinar o influxo celular em ratos e camundongos com artrite induzida por
zymosan, na fase aguda e crônica, pré-tratados com o extrato de C. posadasii,
administrados via intraperitoneal e oral.
• Analisar a hipernocicepção em ratos com artrite induzida por zymosan, na fase
aguda e crônica, pré-tratados com o extrato de C. posadasii por via intraperitoneal e
oral.
• Analisar o dano na cartilagem articular de ratos com artrite induzida por zymosan,
pré-tratados com o extrato de C. posadasii.
• Avaliar as alterações histopatológicas sinoviais em camundongos com artrite induzida por zymosan, pré-tratados com o extrato de C. posadasii.
• Avaliar a proteção contra a morte celular em camundongos com artrite induzida por
zymosan, pré-tratados com o extrato de C. posadasii.
• Determinar o envolvimento da iNOS em camundongos com artrite induzida por
zymosan, pré-tratados com o extrato de C. posadasii.
CAPÍTULO I
Efeito anti-inflamatório sistêmico e imunomodulador de um extrato de Coccidioides posadasii em artrite experimental
Systemic anti - inflammatory and immunomodulatory effect of an extract of Coccidioides posadasii in experimental arthritis
Periódico: Mycopathologia (Aceito em janeiro de 2013)
RESUMO
Tentando superar as defesas do hospedeiro, infecções fúngicas alterar a resposta imune. Componentes presentes em fungos patogênicos apresentam efeitos terapêuticos como atividades anti-inflamatória e imunomoduladora. Este estudo revela que as proteínas presentes no extrato de Coccidioides posadasii proporcionam benefícios
anti-inflamatórios na artrite experimental. Zymosan foi dado intra-articular em ratos e camundongos e grupos foram pré-tratados com extrato de C. posadasii intraperitoneal ou
per se. Os controles receberam o veículo. Hipernocicepção aguda foi avaliada através incapacitação articular e método de von Frey. Influxo celular e níveis de citocinas foram avaliados em exsudatos sinovial. Dano articular foi avaliada por histopatologia e pela determinação do teor de glicosaminoglicanos da cartilagem. Sinóvias foram avaliadas para a morte celular e expressão de óxido nítrico sintase induzível (iNOS), utilizando TUNEL e imunohistoquímica, respectivamente. Pré-tratamento com o extrato de C. posadasii inibiu
significativamente o influxo celular na fase aguda e crônica, e a hipernocicepção e provocou redução de perda de glicosaminoglicanos, reduziu a sinovite crônica, morte celular e expressão iNOS. Redução / alquilação do extrato de C. posadasii revogada esses
efeitos. A administração de C. posadasii não alterou os níveis de TNF- , IL-1 , IL-17 e de
interferon- enquanto que os níveis de IL-10 foi significativamente reduzida. Os dados revelam que um extrato de C. posadasii reduz a expressão de iNOS que está associado com
a inibição da apoptose sinovial e diminuição dos niveis de IL-10 articulações inflamadas por zymosan. Caracterização dos componentes ativos excluíu carboidratos carregados, enquanto que aponta para uma proteína como responsável por estes efeitos. Em resumo, a administração sistémica de componentes a partir de um fungo patogênico proporciona efeitos anti-inflamatórios, sendo independente da espécie, permanecendo ativo quando administrado por via oral. Além de colaborar o entendimento sobre a resposta do hospedeiro contra os fungos, os resultados podem levar a implicações terapêuticas.
Abstract
Trying to surpass host defences, fungal infections alter the immune response. Components from nonpathogenic fungi present therapeutic anti-inflammatory and immunomodulating activities. This study reveals that proteins present in a Coccidioides posadasii extract
provide antiinflammatory benefit in experimental arthritis. Zymosan was given intra-articularly to rats and mice and groups were pretreated with C. posadasii extract either per os or intraperitoneally. Controls received the vehicle. Acute hypernociception was
evaluated using articular incapacitation and von Frey methods. Cell influx and cytokines levels were assessed in joint exudates. Joint damage was evaluated by histopathology and determination of glycosaminoglycan content of the cartilage. Synovia were evaluated for cell death and inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression using TUNEL and immunohistochemistry, respectively. Pretreatment with C. posadasii extract significantly
inhibited acute and chronic cell influx, hypernociception and provoked reduction of glycosaminoglycan loss while reducing chronic synovitis, cell death, and iNOS expression. Reduction/alkylation of C. posadasii extract abrogated these effects. C. posadasii
administration did not alter TNF- , IL-1 , IL-17, and -interferon levels whereas IL-10 levels were significantly reduced. Data reveal that a C. posadasii extract reduces iNOS
expression that is associated to inhibition of synovial apoptosis and decrease of IL-10 levels released into zymosan-inflamed joints. Characterization of active components excluded charged carbohydrates while pointing to a protein as responsible for these effects. In summary, systemic administration of components from a pathogenic fungus provide antiinflammatory effects, being species-independent and orally active. Besides adding to understand host response against fungi, the results may lead to therapeutic implications.
Antiinflammatory and immunomodulatory effect of an extract of Coccidioides posadasii in
experimental arthritis
Ana Carolina Matias Dinelly Pintoa, Rossana de Aguiar Cordeirob, José Julio Costa Sidrimb, Ana Karine Rocha de Melo Leitea, Ana Caroline Rocha de Melo Leitea, Virgínia Cláudia Carneiro Girãoc, Raimunda Sâmia Nogueira Brilhanteb, Marcos Fábio Gadelha Rochab, Fernando de Queiroz Cunhad, Francisco Airton Castro Rochaa*.
aDepartment of Internal Medicine, Faculty of Medicine, Federal University of Ceará, Fortaleza, Brazil.
bSpecialized Medical Mycology Center, Federal University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil.
cDepartament of Morphology, Faculty of Medicine, Federal University of Ceará, Fortaleza, Brazil.
dDepartment of Pharmacology, Faculty of Medicine, University of São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil.
* Corresponding author:
Francisco Airton Castro Rocha
Rua Doutor José Lourenço 1930, 60115-281, Fortaleza, CE, Brasil.
Phone: +55 85 3366 8243; FAX: +55 85 3244 6215.
Introduction
Several studies have shown the antiinflamatory and immunomodulating potential of fungal components. Polysaccharides, proteins, lipids, as well as secondary metabolites, such as triterpenes and phenols, have been described as molecules with immunomodulatory properties [1]. While displaying diverse structure, most fungal polysaccharides belong to -glucans, which can be chemically modified in order to improve their biological potency. Though the exact mechanism of action of bioactive fungal components is unknown a common pathway involves the activation of T-lymphocytes and macrophages, thus altering the cytokine repertoire released in the inflammatory response [2].
Differences in the prevalence of allergic and autoimmune diseases between highly industrialized countries and underdeveloped nations have been associated with a lower prevalence of infections [3]. Less exposure to house dust, high ingestion of industrialized food, diminished breast-feeding, and increased vaccination would decrease stimulation to “real-life” germs [4]. In keeping with this assumption, we have demonstrated that the administration of a nematode (Ascaris suum) extract was protective in arthritis models,
provoking a decrease in the hypernociceptive response, cell migration, structural damage, and histological changes. These effects were coupled to an alteration in the release of cytokines into the joint exudates [5].
Attempts to demonstrate antiinflammatory activity of fungi constituents or released products usually focus on non-pathogenic species. However, immunomodulation is also a strategy employed by pathogens to escape host defenses. The highly virulent fungi
Coccidioides immitis / C. posadasii are the etiological agents of coccidioidomycosis, a
severe disease that occurs in both humans and animals. Coccidioides species secrete an
immunodominant antigen which is able to modulate host immunity in a Th2-biased manner [6]. However, Coccidioides can also secrete endosporulation antigens that stimulate or
suppress cell-mediated immunity, depending on the antigen preparation method [7].
Our group is based in Ceará state (northeast of Brazil) and we have identified and characterized a C. posadasii strain isolated both from the bronchoalveolar lavage of
armadillo (Dasypus novemcinctus and Euphractus sexcinctus) hunting exposes both
humans and dogs to large amounts of dispersed Coccidioides spp. arthroconidia [8].
Zymosan is derived from Saccharomyces cerevisae. When injected into joints,
zymosan promotes a severe and chronic arthritis that resembles rheumatoid arthritis [9, 10]. Coupling to toll – like receptors, Dectin-1 receptors and also mannose binding lectins are involved in zymosan inflammation [11], thus opening the possibility of studying both innate and adaptive in vivo immune mechanisms in this arthritis model.
As said above, components from pathogenic fungi and/or their released products may provoke immunomodulatory changes as they encounter the host immune system. The objective of the present study was to investigate whether the systemic administration of an extract from our C. posadasii strain modifies the inflammatory response induced by
injection of zymosan into rat and mouse joints.
Materials and Methods
Animals
All animal procedures and experimental protocols were approved by the local ethics committee on animal experimentation at the Faculty of Medicine of the Federal University of Ceará, Brazil (protocol number – 90/07). All efforts were made to minimize animal suffering and the number of animals used. The animals were housed in temperature-controlled rooms with 12 h light / dark cycles and free access to water and food. Surgical procedure and animal treatments were conducted in accordance with the
Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Institutes of Health
Publication).
Male Wistar rats (180 - 200 g) or Swiss mice (25 - 30 g) (n = 6 per group) from our own animal facilities were used throughout the experiments. Rats or mice received an intra-articular (i.a.) injection of either 1 mg (0.05 ml total volume) or 0.1 mg (0.025 ml total volume) zymosan (Sigma, St. Louis, MO, USA), respectively, dissolved in sterile saline, into their right knee joints. Control groups received only saline i.a. [5].
Evaluation of joint hypernociception
We used the rat knee joint incapacitation test, as described previously, as one of the measures of the inflammatory joint hypernociception [9]. Briefly, after zymosan injection, rats were put to walk on a steel rotary drum (30 cm wide x 50 cm diameter) that rotates at 3 rpm. Specially designed metal gaiters were wrapped around both hind paws. After placement of the gaiters, the animals were allowed to walk freely for habituation. The right paw was then connected via a simple circuit to a microcomputer data input / output port. The paw elevation time (PET) is the time for which, over a 60 s period, the inflamed hind paw is not in contact with the cylinder. This is directly proportional to the articular incapacitation. The PET was measured at baseline and then hourly, until sacrifice, at 6 h. Results (s / 1 min) are reported as the maximal PET that occurs between 3 and 4 h after injection of the zymosan.
Collection of synovial exudates and analysis of cell influx, cytokines, and nitric oxide (NO) levels in the joint exudates
At 6 h (acute phase) or 7 days (chronic phase) after injection of the zymosan, the animals were anesthetized with chloral hydrate (400 mg / kg intra-peritoneal -i.p.), killed by cervical dislocation, and exsanguinated. The synovial cavity of the knee joints was then washed twice with 0.2 ml (rats) or 0.05 ml (mice) saline containing 10 mM EDTA. The synovial exudates were collected by aspiration and total cell counts were performed using a Neubauer chamber. After centrifugation (500 g / 10 min), the supernatants were stored at - 80 °C and used for determination of cytokine release. The concentrations of tumor necrosis factor (TNF)- , interleukin (IL)- 1 , IL-10, IL-17, and -interferon ( -IFN) were measured in the synovial exudates obtained 6 h after zymosan injection in rats and mice, using a commercially available ELISA kit (R&D Systems, São Paulo, SP, Brasil).
Synovial histopathology
After sacrifice, the synovia were excised, fixed in 10 % buffered formaldehyde, and processed for routine hematoxylin - eosin (HE) staining. Semi quantitative histopathological grading was performed by one independent pathologist blinded to group allocation according to the presence of edema, synovial proliferation, cell infiltration, proliferation of blood vessels, fibrosis and stage of the disease, ranging from 0 to 3 (0, absent; 1, mild; 2, moderate; 3, severe) for each parameter. The maximal total score was 18. Results are expressed as the median (variation) value for each group of six animals [5].
Immunohistochemistry for inducible nitric oxide synthase (iNOS) detection
