COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA PARA A GERMINAÇÃO DE PÓLEN DE VARIEDADES DE LARANJA-DOCE
LEILA APARECIDA SALLES PIO 1, KEIZE PEREIRA JUNQUEIRA4 , JOSÉ DARLAN RAMOS 2, JOSÉ CARLOS MORAIS RUFINI 3 e FABÍOLA VILLA 1
RESUMO
Em programas de melhoramento genético convencio- nal, procura-se procedimentos simples para identificar grãos de pólen viáveis, de modo a dar maior flexibilidade ao traba- lho dos melhoristas. O presente trabalho foi realizado visando- se a obtenção do melhor meio de cultura para grãos de pólen das variedades de laranja doce ‘Natal’, ‘Pêra’ e ‘Valência’, co- letando-se botões florais em estádio “balão”. Foi avaliado o efeito de nitrato de cálcio e ácido bórico, sacarose e pH na composição do meio de cultura para a germinação de grãos de pólen das laranjas ‘Valência’, ‘Natal’ e ‘Pêra’. Para avaliar o efeito do cálcio, empregou-se o meio de cultura contendo 10 g L-1 de ágar, 100 g L-1 de sacarose, acrescido de nitrato de cál- cio, nas concentrações de 400, 800, 1.200 e 1.400 mg L-1, epH ajustado para 6,5. Em seguida, testaram-se várias concentra- ções de ácido bórico (0, 200, 400 e 800 mg L-1 ) com o mesmo meio de cultura. Para verificar o efeito da sacarose, o meio de cultura foi constituído de 10 g L-1 de ágar, 800 mg L-1 de nitrato de cálcio e 200 mg L-1 de ácido bórico, acrescido de sacarose a 0, 50, 100, 150 e 200 g L-1. Para verificação do pH satisfatório, inocularam-se os grãos de pólen em meio de cultura contendo 10 g L-1 de ágar, 800 mg L-1 de nitrato de cálcio, 200 mg L-1 de
1Engenheira Agrônoma, MSc. em Fitotecnia DAG/UFLA. Laboratório de Cultura de Tecidos, DAG/
UFLA, 37200-000 Lavras (MG). E-mail: leilapio@ufla.br
2Professor, Doutor, DAG/UFLA.
3Engenheiro Agrônomo, Doutor em Fitotecnia, DAG/UFLA.
4Acadêmica do curso de Agronomia, UFLA.
ácido bórico,100 g L-1 de sacarose e pH de 3,5; 4,0; 4,5; 5,0;
5,5; 6,0 e 6,5. Os melhores resultados foram obtidos com 800 mg L-1 de nitrato de cálcio, 200 mg L-1 de ácido bórico, 100 g L-1 de sacarose e pH 6,5, para ‘Pêra’ e ‘Natal’. Para ‘Valência’, a melhor germinação ocorreu na ausência de boro.
Termos de indexação: Citrus sinensis, palinologia, melhora- mento genético.
SUMMARY
COMPOSITION OF CULTURE MEDIUM FOR POLLEN GERMINATION OF SWEET ORANGES VARIETIES
Conventional plant breeding programs look for the quick- est and easiest identification procedures to keep the pollen grains viable for enough time to allow more flexibility to the plant breed- ers. The present work was carried out to evaluate the best me- dium for the viability of pollen grain from sweet orange varieties
‘Natal’, ‘Pêra’ and ‘Valencia’ sweet oranges. It was evaluated the effect of calcium nitrate, boric acid, sucrose and pH in composi- tion of culture medium for germination of pollen grains from
‘Valencia Americana’, ‘Natal’ and ‘Pêra Rio Tardia’. To evaluate the effect of calcium, it was used culture medium containing 10 g L-1 agar and 100 g L-1 sucrose, and calcium nitrate in various concentrations (400; 800; 1,200; and 1,400 mg L-1 ) with pH 6.5.
Then, several concentrations of boric acid (0, 200, 400, and 800 mg L-1) were tested with the same culture medium. To verify the sucrose effect, the culture medium (10 g L-1 agar, 800 mg L-1 calcium nitrate, and 200 mg L-1 boric acid) was enriched with sucrose (0, 50, 100, 150, and 200 g L-1). To check for satisfactory pH, pollen grains were inoculated in culture medium with 10 g L-1 agar, 800 mg L-1 calcium nitrate, 200 mg L-1 boric acid, 100 g L-1 sucrose and different pH levels (3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, and 6.5). Best results were obtained with 800 mg L-1 calcium nitrate, 200 mg L-1 boric acid, 100 g L-1 sucrose and pH 6.5, for ‘Pera’
and ‘Natal’. For ‘Valencia’ the best germination was found in the absence of boron.
Index terms: Citrus sinensis, palinology, genetic improvement.
1. INTRODUÇÃO
Vários estudos têm sido desenvolvidos visando determinar qualitativa e quantitativamente os componentes necessários para a melhor composição do meio de cultura para a germinação de grãos de pólen, o qual deve ser constituído basicamente por carboidratos e elementos estimulantes como ácido bórico, ácido cítrico, nitrato de cálcio e reguladores de crescimento, entre outros.
Na germinação de grãos de pólen in vitro, geralmente considera-se que o tubo polínico foi emitido quando seu comprimento for igual ou maior que o diâmetro do grão de pólen. O método consiste em germinar a amostra num meio apropriado e observar em microscópio, depois de determinado período, o número de grãos que emitiram tubo polínico. A composição do meio e o pH estão entre os fatores que afetam a germinação. Os grãos de pólen das angiospermas necessitam de uma fonte de carbono, de boro e, freqüentemente, de outros nutrientes para promover a sua germinação (GALLETA, 1983).
Os principais componentes do meio de cultura para a germinação de pólen têm sido os tipos e concentrações de açúcares e distintas concentra- ções de boro (MIRANDA & CLEMENT, 1990). A sacarose empregada no meio de cultura tem por finalidade proporcionar o equilíbrio osmótico entre o pólen e o meio de germinação e fornecer energia para auxiliar o processo de desenvolvimento do tubo polínico (STANLEY & LINSKENS, 1974).
KOBAYASHI et al. (1991) obtiveram 50% de germinação de grãos de pólen de híbrido de Citrus sinensis x Poncirus trifoliata utilizando meio de cultura contendo 20% de sacarose. Concentrações de glicose foram testadas na germinação de grãos de pólen de variedades cítricas, sendo os melhores resultados obtidos com 150 g L-1 de glicose, apresentando, em média, 59%
de germinação (BUTT et al., 1993).
BOMBEN et al. (1999), estudando a germinação de grãos de pólen em quivi (Actinidia chinensis), utilizaram meio de cultura composto por 100 g L-1 de sacarose, 0,025 g L-1 de ácido bórico e 6 g L-1 de ágar.
OLIVEIRA JÚNIOR et al. (1996), pesquisando emissão de tubos polínicos em limoeiro ‘Cravo’ (Citrus limonia) obtiveram bons resultados
com concentração de 800 mg L-1 de cálcio. BEYOUNG (1965) observou, em 46 espécies hortícolas, que a adição de cálcio promoveu a germinação de pólen e o crescimento do tubo polínico em todas as espécies estudadas.
KWACK & BREWBAKER (1963), trabalhando com 86 espécies e 39 famílias, mostraram que o cálcio e o boro são elementos essenciais para a germinação do tubo polínico in vitro. Em trabalhos com germinação de grãos de pólen de três cultivares de citros após um ano de armazenamento, SAHAR
& SPIEGEL (1980) estimularam a germinação utilizando ácido bórico e ni- trato de cálcio. SILVA (1996) constatou que o melhor meio para a germina- ção de pólen de maracujazeiro (Passiflora edulis) é composto por 50 g L-1 de sacarose, 0,2 g L-1 de ácido bórico e 1,0 g L-1 de nitrato de cálcio.
A germinação de grãos de pólen in vitro é uma ferramenta valiosa empregada por geneticistas e melhoristas que desejam verificar a fertilidade do pólen, o que auxiliará em programas de melhoramento de plantas.
O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito das diferentes concentrações de cálcio, boro e sacarose, bem como o pH do meio de cultura para a germinação in vitro de grãos de pólen das laranjeiras ‘Valência’,
‘Natal’ e ‘Pêra’.
2. MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi desenvolvido em Lavras (MG), em 2002, durante o pe- ríodo de floração, setembro e outubro, dos cultivares Valência, Pêra Rio e Natal [Citrus sinensis (L.) Osbeck]. Utilizaram-se plantas com 6 anos de idade, componentes de uma coleção de cultivares cítricas localizada no po- mar da Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais (EPAMIG), no município de Lavras.
Para esse trabalho, selecionaram-se duas plantas de cada variedade, coletando-se os botões florais em estádio “balão”, eliminando-se aqueles que estavam abertos, de acordo com o método de PASQUAL et al. (1982). Foram coletados aleatoriamente, em todas as partes da planta ao redor da copa, no período da manhã, próximo às 8h, e transportados para o laboratório em pla- cas de Petri fechadas.
As anteras foram separadas das estruturas florais por intermédio de uma pinça e colocadas em placas de Petri forradas com papel-filtro, mantidas destampadas e submetidas à temperatura de 28 ± 1°C por 48 horas para que ocorresse a antese (abertura das anteras) e também para que o pólen tivesse seu teor de umidade reduzido, de acordo com o método descrito por SOUSA (1988).
A viabilidade do pólen in vitro foi estudada mediante a germinação dos grãos de pólen em diferentes meios de cultura, em experimento constituído de 4 etapas. Para avaliar o efeito do cálcio, utilizou-se o meio de cultura contendo 10 g L-1 de ágar, 100 g L-1 de sacarose, acrescido de nitrato de cálcio nas con- centrações de 400, 800, 1.200 e 1.400 mg L-1 e pH ajustado para 6,5. Em seguida, testaram-se várias concentrações de ácido bórico (0, 200, 400 e 800 mg L-1) em meio de cultura contendo 10 g L-1 de ágar, 100 g L-1 de sacarose e pH ajustado para 6,5. Para verificar o efeito da sacarose, o meio de cultura foi constituído de 10 g L-1 de ágar, 800 mg L-1 de nitrato de cálcio e 200 mg L-1 de ácido bórico acrescido de sacarose (0, 50, 100, 150 e 200 g L-1). Para verifica- ção do pH satisfatório, o pólen foi inoculado em meio de cultura contendo 10 g L-1 de ágar e 800 mg L-1 de nitrato de cálcio, 200 mg L-1 de ácido bórico,100 g L-1 de sacarose e pH de 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 e 6,5.
O meio de cultura foi vertido em placas de Petri de plástico (aproxi- madamente 10 mL por placa) e, os grãos de pólen espalhados sobre a super- fície do meio com o auxílio de um pincel, colocando-se as placas de Petri contendo o pólen em BOD à temperatura de 25 ± 2°C por 12 horas.
Efetuaram-se as avaliações pela porcentagem de grãos de pólen ger- minados, em microscópio óptico com objetiva de aumento de 10x, avaliando quatro campos de visão, que foram equivalentes a quatro repetições. Em cada campo de visão foram contados todos os grãos de pólen germinados ou não.
Na análise da variância, utilizou-se o teste de “F” e para a comparação de médias, o teste de Scott Knott.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A análise da variância dos dados obtidos indicaram efeitos signifi- cativos a 1% de probabilidade na germinação dos grãos de pólen para cálcio
e cultivares, não havendo interação entre fatores estudados. Houve diferença também a 1% entre os cultivares e as diferentes doses de ácido bórico, ocor- rendo interação entre esses dois fatores. Detectou-se diferença no mesmo nível de significância para os diferentes níveis de pH e cultivares, bem como a interação dos fatores estudados. E ainda, efeito a 1% de probabilidade para sacarose e interação, não havendo diferença significativa para o fator cultivares.
A Figura 1A apresenta resultados obtidos utilizando o nitrato de cál- cio, referente à porcentagem de grãos de pólen germinados nos diferentes cultivares. Pode-se observar que a ‘Valência’ mostrou-se superior aos de- mais, com 10,24% de germinação.
Na Figura 1B, observa-se a porcentagem de grãos de pólen germinados em diferentes concentrações de nitrato de cálcio. Melhor resultado foi obtido com a concentração de 800 mg L-1 de nitrato de cálcio, concentração a partir da qual houve um decréscimo acentuado para a variável analisada. Esses resultados concordam com os autores, que afirmam que o cálcio é essencial para a germinação dos grãos de pólen, bem como o desenvolvimento do tubo polínico (KWACK & BREWBAKER, 1963; BEYOUNG, 1965; SAHAR &
SPIEGEL, 1980). OLIVEIRA JUNIOR et al. (1996) também verificaram que a melhor concentração de nitrato de cálcio é de 800 mg L-1 para limoeiro
‘Cravo’. É necessário, portanto, um correto ajuste na concentração de nitrato de cálcio para a germinação de grãos de pólen de citros.
Para o experimento com ácido bórico, pode-se observar que nos grãos de pólen de ‘Pêra’ e ‘Natal’, a germinação ocorreu na presença de ácido bórico no meio de cultura, sendo o melhor tratamento a adição de 200 mg L-1 desse nutriente.
Entretanto, ‘Valência’ apresentou melhor germinação na ausência de ácido bórico, de acordo com a Figura 2.
Diversos autores enfatizam a importância do boro na germinação de grãos de pólen de várias culturas (PFAHLER, 1967; BOMBEN et al, 1999).
A resposta do boro para a germinação e formação do tubo polínico está de acordo com KWACK & BREWBAKER (1963), que sugeriram ser o cálcio e o boro elementos essenciais para o início do prolongamento da intina e formação do tubo polínico in vitro. A alta exigência do boro e sua baixa concentração no interior do pólen conferem a este íon a responsabilidade pelo crescimento do tubo polínico, tanto in vitro quanto in vivo.
Figura 1. Porcentagem de germinação de grãos de pólen (A) em diferentes cultiva- res cítricos e porcentagem de grãos de pólen germinados (B) em diferentes con- centrações de nitrato de cálcio. UFLA, Lavras (MG), 2003.
A
B
Nitrato de cálcio (mg L-1)
Grãos de pólen germinados (%)Grãos de pólen germinados (%)
Variedades
Valência Pêra Natal
Y = 0,5988 + 6,3413x - 1,1439x2 R2 = 0,64
Figura 2. Porcentagem de grãos de pólen de citros germinados em diferentes con- centrações de ácido bórico. UFLA, Lavras (MG), 2003.
A Figura 3 representa a porcentagem de grãos de pólen germinados em diferentes níveis de pH, podendo-se notar que há tendência de cresci- mento linear à medida que o pH sobe até o nível de 6,5 para ‘Valência’ e
‘Natal’. Entretanto, para ‘Pêra’, melhores resultados foram obtidos com pH em torno de 5. A partir desses resultados, verifica-se que o nível de pH esti- mulou marcadamente o processo de germinação de pólen, concordando com as observações de KWACK & BREWBAKER (1963) e STANLEY &
LINSKENS (1974), os quais mostraram que o pH no meio beneficia o pro- cesso de indução de germinação de pólen.
A importância da determinação do pH ideal nos processos fisiológicos que envolvem os grãos de pólen está associada à maior porcentagem de germinação, auxiliando o trabalho de melhoristas que desejam verificar a fertilidade do pólen visando ao melhoramento genético.
Pólen germinado (%)
Concentração de boro (mg/L)
Pêra Valência Natal
YPêra = 6,359 + 0,012x - 0,000038x2 R2 = 72,59 YValência = 12,177 - 0,1999x2 R2 = 71,36 YNatal = 5,9325 - 0,008338x R2 = 87,09
Na avaliação da melhor dose de sacarose, os cultivares apresentaram comportamento semelhante, sendo o melhor resultado obtido na concen- tração de 100 g L-1 de sacarose, a partir da qual houve um decréscimo na porcentagem de grãos de pólen germinados (Figura 4). Esses resultados concordam com a maioria dos autores, ao afirmar que a sacarose é um dos componentes necessários para a germinação de pólen e também exerce a função do equilíbrio osmótico da solução, além de fornecer energia necessá- ria para o crescimento do tubo polínico (STANLEY & LINSKENS, 1974).
Por outro lado, KOBAYASHI et al. (1991) obtiveram melhores índices de germinação quando utilizaram 200 g L-1 de sacarose de grão de pólen de um híbrido de Citrus sinensis vs Poncirus trifoliata. Possivelmente, essa dife- rença de concentração possa ser explicada por se tratar de genótipos diferen- tes. De maneira geral, pode-se dizer que a melhor concentração de sacarose para a germinação de grãos de pólen varia entre 100 e 150 g L-1.
Figura 3. Porcentagem de grãos de pólen de citros germinados em diferentes níveis de pH. UFLA, Lavras (MG), 2003.
YPêra = 3,8,418 + 18,301x - 1,726x2 R2 = 0,76 YNatal = 0,4375 + 1,0411x R2 = 0,69 YValência = 3,5804 + 2,2304x R2 = 0,81
Grãos de pólen germinados (%)
pH
Pêra Natal Valência
Figura 4. Porcentagem de grãos de pólen de citros germinados em diferentes con- centrações de sacarose. UFLA, Lavras (MG), 2003.
YNatal = 0,4457 + 0,1597x - 0,0008x2 R2 = 0,88 YValência = 2,4286 + 0,0727x - 0,0004x2 R2 = 0,80 YPêra = 0,8586 + 0,1407x - 0,0006x2 R2 = 0,70
Grãos de pólen germinados (%)
Sacarose (g/L)
Pêra Valência
Natal
4. CONCLUSÕES
1. A melhor germinação de grãos de pólen foi obtida com 800 mg L-1 de nitrato de cálcio, e 100 g L-1 de sacarose para todos os cultivares e 200 mg L-1 de ácido bórico para ‘Pêra’ e ‘Natal’. Para ‘Valência’, a melhor resposta foi obtida na sua ausência.
2. À medida que se elevou o valor do pH até o nível de 6,5, aumentou a quantidade de grãos de pólen germinados para ‘Natal’ e ‘Valência’.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BEYOUNG, H.K. The effects of calcium on pollen germination. Proceedings of the American Society of Horticultural Science, Alexandria, v. 86, p. 818- 823, 1965.
BOMBEN, C.; MALOSSINI, C.; CIPRIANI, G.; TESTOLIN, R. & RETAMALES, J. Long term storage of kiwifruit pollen. Acta Horticulturae, Amsterdam, v.
498, p. 105-108, 1999.
BUTT, S.J.; YUSUF, A.; ALI, S. & KHAN, M.A. In vitro studies on viability and germination of pollen in various citrus species. Pakistan Journal of Scientific and Industrial Research, Rawalpindi, v.36, n.10, p.432-434, 1993.
GALLETA, G.J. Pollen and seed management. In: MOORE, J.N. & JANICK, J.
Methods in fruits breeding. Indiana, 1983. p.23-47.
KOBAYASHI, S.; OIYAMA, I.; YOSHINAGA, K.; OHGAWARA, T. & ISHII, S.
Fertility in an intergeneric somatic hybrid plant of Rutaceae. HortScience, Alexandria, v.26, n.2, p.207, 1991.
KWACK, B.H. & BREWBAKER, J.L. The essential role of calcium ion pollen germination and pollen tube growth. American Journal of Botany, New York, v.50, n.9, p.859-865, 1963.
MIRANDA, P.A. & CLEMENT, C.R. Germination and storange of pejibaye (Bactris gasipaes), palmae pollen. Revista de Biologia Tropical, San José, v.38, n.1, p.29-33, 1990.
OLIVEIRA JÚNIOR, A.F. de; RAMOS, J.D.; SANÁBIO, D.; RIBEIRO, V.G.&
PASQUAL,M. Efeito do cálcio na germinação de grãos de pólen do limoeiro
‘Cravo’ e do pessegueiro ‘Aurora’. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE FRU- TICULTURA, 14., 1996, Curitiba. Anais... Curitiba: SBF, 1996. p.419.
PASQUAL, M.; PETRI, J. L.; MATTOS, C. S. Polinização da macieira. III. Cultiva- res BR-1 e Mollies Delicious. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v.17, n.10, 1477-1481, 1982.
PFAHLER, P.L. Fertilization ability of maize pollen grains. II. Pollen genotype, female sporophyte and pollen storage interactions. Genetics, v.57, n.3, p.513- 521, 1967.
SAHAR, N. & SPIEGEL, R.P. Citrus pollen storage. HortScience, Alexandria, v.15, n.1, p.81-82, 1980.
SILVA, M.M. da. Influência das abelhas na polinização e de agrotóxicos na ger- minação de pólen do maracujazeiro (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg.).
1996. 59 p. Dissertação (Mestrado em Fitotecnia) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG.
SOUSA, V.A. de. Manejo e viabilidade do pólen de Eucalyptus spp. 1988. 155 p.
Dissertação (Mestrado em Engenharia Florestal) – Escola Superior de Agricul- tura Luiz de Queiroz, Piracicaba.
STANLEY, R. G. & LINSKENS, H.F. Pollen: biology, biochemistry and management.
New York: Springer Verlag, 1974. 172p.
