Universidade Federal do Rio Grande Instituto de Ciências Biológicas
Programa de Pós-graduação em Ciências Fisiológicas:
Fisiologia Animal Comparada
Efeito da exposição ao cobre sobre o estado metabólico do siri-azul Callinectes sapidus submetido ao choque hiposmótico.
Eliana Jaime de Menezes
Rio Grande 2015
1 Universidade Federal do Rio Grande
Instituto de Ciências Biológicas
Programa de Pós-graduação em Ciências Fisiológicas:
Fisiologia Animal Comparada
Efeito da exposição ao cobre sobre o estado metabólico do siri-azul Callinectes sapidus submetido ao choque hiposmótico.
Eliana Jaime de Menezes
Dissertação de mestrado a ser defendida no âmbito do Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas – Fisiologia Animal Comparada como requisito parcial para obtenção do título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Fábio Everton Maciel Co-orientadora: Profª. Drª. Camila Martins
Rio Grande 2015
2 AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Fábio Maciel, pelo aceite da orientação, pela confiança que depositou em mim, pelos ensinamentos e por toda sua compreensão. Obrigada por transmitir tanta serenidade e por me ajudar a matar um dragão de cada vez!
À minha co-orientadora, Profª Camila Martins, que acompanhou minha trajetória desde a graduação, sempre contribuindo para minha formação. Obrigada por tudo!
Aos professores José Monserrat e Ricardo Robaldo, por terem aceitado o convite de participar da banca avaliadora desta dissertação de mestrado.
A toda a minha família maravilhosa! Meus pais e minhas irmãs, obrigada por sempre me apoiarem, por participarem das minhas angústias, preocupações e também de todas as minhas conquistas! Vocês são essenciais na minha vida!
Aos meus avós, Eleonora e Gilmar, Elma e Edmundo, por serem pessoas tão especiais na minha vida, por estarem sempre torcendo e me ajudando da melhor maneira possível! Amo vocês!!!
Ao meu noivo, Saimon, por todo amor, toda paciência2, compreensão, amizade, apoio e por sempre me ajudar a manter a calma nos momentos mais difíceis. Obrigada por tudo!!! Eu te amo!
À minha querida amiga Tarine, que, perto ou longe, sempre participa de tudo! Obrigada pela amizade e por sempre acreditar em mim!
Às minhas amigas Nicole e Raquel, que tornaram as noites de estudo muito mais divertidas!
Obrigada por me ajudarem a superar este desafio.
Aos meus alunos e colegas do Colégio Marista São Francisco, por todo o apoio e compreensão! Obrigada pelas mensagens de carinho e incentivo!
3 Sumário
1 Resumo ... 4
2 Introdução ... 6
3 Objetivos ... 12
3.1 Objetivo geral ... 12
3.2 Objetivos específicos ... 12
4 Artigo científico ... 14
4.1 Abstract ... 16
4.2 Introduction ... 17
4.3 Material and Methods ... 19
4.3.1 Animal Maintenance ... 19
4.3.2 Experimental Design ... 19
4.4 Analytic Techniques ... 20
4.4.1 Oxygen Consumption ... 20
4.4.2 Oxi-hemocyanin and protein ... 21
4.4.3 Hemolymphatic glucose and lactate levels ... 21
4.4.4 Analysis of lactate dehydrogenase (LDH) and citrate synthase enzymes ... 22
4.5 Data analysis ... 22
4.6 Results and discussion ... 22
4.7 Conclusion ... 26
4.8 Acknowledgements ... 26
4.9 References ... 26
4.10 Figure caption ... 33
4.11 Tables caption ... 34
4.12 Tables ... 35
4.13 Figures ... 37
5 Discussão geral ... 41
6 Referências Bibliográficas ... 44
4 1 Resumo
Os estuários são ambientes considerados difíceis para a vida aquática, pois apresentam uma série de variações ambientais que exigem adaptações dos animais para sobrevivência. Eles estão localizados em regiões costeiras e, devido às suas características geomorfológicas, podem ser considerados como receptores de uma variedade de substâncias químicas provenientes de processos naturais, tais como os sistemas terrestre, atmosférico e oceânico, bem como das ações antrópicas, tais como despejo de esgoto, mineração, indústrias de fertilizantes e atividades portuárias. Os contaminantes metálicos, incluindo o cobre, podem provocar alterações em diversos processos metabólicos e fisiológicos nos animais, dependendo da concentração em que se encontram e da salinidade ambiental. O cobre é um micronutriente que está entre os diversos metais essenciais para os organismos aquáticos, sendo importante na atividade e na constituição de várias proteínas. Por este motivo, o objetivo do presente estudo foi o de avaliar se a exposição ao cobre afeta o metabolismo do siri-azul Callinectes sapidus em diferentes condições osmóticas. Exemplares machos de C. sapidus foram coletados no estuário da Lagoa dos Patos e aclimatados em duas salinidades diferentes (30 e 2). Após, os animais foram submetidos à exposição de 1µM de cobre por 96h em suas respectivas salinidades de aclimatação e também em uma condição de choque hiposmótico (animais aclimatados na salinidade 30 transferidos abruptamente para a salinidade de 2). Foram analisado o consumo de oxigênio total e branquial, atividade das enzimas lactato desidrogenase (LDH) e citrato sintase branquial e quantificação de glicose, lactato e oxihemocianina na hemolinfa dos animais experimentais. O estudo demonstrou que baixas salinidades aumentam o consumo de oxigênio global, assim como, a exposição ao cobre. Esse metal praticamente não apresentou efeitos nos parâmetros hemolinfáticos analisados. Contudo, o cobre teve um efeito nas atividades enzimáticas nas brânquias dos animais submetidos ao choque hiposmótico. A atividade da LDH diminuiu ao passo que a atividade da citrato sintase aumentou em relação ao controle. Portanto, podemos concluir que a concentração de cobre empregada (1µM)
5 afeta o metabolismo de C. sapidus, aumentando o consumo de oxigênio e o metabolismo aeróbico branquial e, inibindo o metabolismo anaeróbico branquial. Essa situação indica um estresse extra às mudanças osmóticas ambientais e sugerem que as enzimas LDH e citrato sintase podem ser indicadores sensíveis para estudos toxicológicos aquáticos envolvendo o cobre.
Palavras-chave: Cobre, siri-azul, Callinectes sapidus, metabolismo aeróbico, choque hiposmótico.
6 2 Introdução
Os organismos aquáticos estão sujeitos a variações de diversos fatores ambientais, tais como: salinidade, temperatura, luminosidade, oxigênio dissolvido na água, bem como a presença de contaminantes químicos. Os animais que lidam com estes desafios exigem uma série de adaptações fisiológicas e bioquímicas para manter a homeostasia, que é o equilíbrio constante do meio interno dos organismos, obtido através de mecanismos regulatórios. Os estuários estão entre os ambientes mais estressantes para a vida aquática. Confrontando com salinidades flutuantes, animais estuarinos devem ter mecanismos que lhes permitam manter adequadamente o equilíbrio osmótico e iônico (Lee et al., 2010).
De maneira geral, a mudança de salinidade no ambiente pode levar a alterações no metabolismo dos animais. Tipicamente baixas salinidades levam a um aumento na taxa metabólica de animais hiperosmorreguladores devido ao gasto energético aumentado pelo funcionamento das bombas iônicas (Péqueux e Gilles, 1988; Lucu e Pavieié, 1995; Piller et al., 1995; Brown e Terwillinger, 1999). O siri-azul Callinectes sapidus pode tolerar ampla gama de salinidades, hiperosmorregulando em baixas salinidades e osmoconformando em altas salinidades (Tan & van Engel, 1966; Engel,1971; Tagatz, 1971; Gerard & Gilles, 1972). Já foi visto que nesta espécie o consumo de oxigênio branquial tende a diminuir com o aumento de salinidade, podendo ocorrer diferenças dependendo da estação do ano e do sexo do animal. Engel e Eggert (1974) mostraram em seu trabalho, que no inverno, o consumo de oxigênio diminuiu com o aumento da salinidade. No verão, machos e fêmeas apresentaram diferença no consumo de oxigênio em baixas salinidades, sendo que as fêmeas apresentaram um menor consumo de oxigênio. Paital e Chany (2010) também observaram que o aumento da salinidade causa a diminuição no consumo de oxigênio no siri Scylla serrata.
Os organismos aquáticos podem ser classificados de acordo com a tolerância de salinidade do meio. Animais estenoalinos são aqueles que toleram uma estreita faixa de salinidade e eurialinos aqueles que suportam uma ampla faixa de salinidade, como é o caso do siri-azul (Mantel & Farmer,
7 1983; Péqueux, 1995). Para assegurar o balanço de água e solutos, os animais utilizam dois mecanismos moleculares básicos: (1) regulação anisosmótica do fluído extracelular (RAFE), que mantém o fluído extracelular constante independente da salinidade do meio circundante; e (2) regulação isosmótica do fluído intracelular (RIFI), que mantém o fluído intracelular isosmótico em relação ao fluído extracelular (Gilles 1982; Péqueux, 1995). Os animais osmorreguladores dependem principalmente da RAFE, enquanto os osmoconformadores dependem, sobretudo, da RIFI (Gilles & Péqueux, 1983).
A toxicidade de poluentes, como os metais, está relacionada com as características físico- químicas da água. Alguns fatores podem influenciar sua biodisponibilidade, como: temperatura, pH, alcalinidade e salinidade. Sendo assim, além de interferir no estado fisiológico dos animais, a flutuação de salinidade dos estuários ainda afeta a biodisponibilidade de metais na água. Isso ocorre porque salinidades mais altas têm mais complexantes e competidores, o que diminui a quantidade disponível do metal para a incorporação pelo animal, ao passo que, em salinidades mais baixas, este metal pode acarretar sérios problemas ao animal, mesmo estando em concentrações menores (Bianchini & Gilles, 2000; Paquin et al., 2000).
A introdução de metais nos sistemas aquáticos ocorre naturalmente através de processos geoquímicos, intemperismos e através do despejo de fontes antropogênicas (Santore et al., 2000). A taxa de reatividade e a distribuição de metais no ambiente podem variar de acordo com o tempo de resistência dos elementos e a hidrodinâmica do local. Nas últimas décadas, os níveis de contaminantes, incluindo o cobre, têm aumentado nos ambientes marinho e estuarino, como consequência de atividades naturais, mas principalmente da atividade humana, como esgoto, mineração, incineração, queima de combustível fóssil, atividades portuárias e indústrias de fertilizantes (Sañudo-Wilhelmy et al., 2004). O sulfato de cobre (CuSO4), por ter ação inibidora do desenvolvimento de microrganismos e proteção contra germes e bactérias, é utilizado como algicida na aquicultura de crustáceos, além de ser utilizado também como fungicida e pesticida, o que
8 muitas vezes acaba contaminando os ambientes aquáticos (Yang et al., 2007). Outra importante fonte de metais nestes ambientes é a atividade portuária.
Diversos metais, como ferro, zinco e cobre são essenciais para os organismos aquáticos, participando de vários processos celulares. Algumas células regulam o transporte destes íons metálicos, estabelecendo níveis adequados para manter uma ótima função biológica e evitando a alta acumulação que os torna tóxicos, podendo causar efeitos patológicos. O cobre, além de ser constituinte do pigmento respiratório hemocianina, atua como cofator de inúmeras enzimas, tais como citocromo C oxidase, superóxido dismutase, álcool desidrogenase, dopamina hidroxilase, tirosinase e lisil oxidase (Suzuki et al., 2002; Ryu et al., 2003; Serafim e Bebianno, 2009), sendo essencial para a respiração em todas as células eucarióticas. No entanto, este metal torna-se tóxico quando presente em elevadas concentrações na água, podendo levar à perda do controle neuromuscular e eventual morte em organismos com excesso do metal no sangue e tecidos (Chavez-Crooker et al., 2003).
Segundo as recomendações do Conselho Nacional do Meio Ambiente (resolução 357, CONAMA, 2005), a concentração máxima tolerada de cobre dissolvido em águas salinas ou salobras (com salinidade entre 0,5‰ e 30‰) é de 5µg/L e em água doce (salinidade igual ou inferior a 0,5‰) é de 9µg/L. Costa et al. (2013) fizeram um estudo para determinar a fração lábil dissolvida, que compreende cátions metálicos livres e alguns pequenos complexos metálicos orgânicos e inorgânicos, de cobre e zinco nas águas do estaleiro Santos (Lagoa dos Patos, Rio Grande, RS), em diferentes épocas do ano. Os resultados mostram que as áreas de estaleiros podem gerar diferentes concentrações de cobre dependendo da estação do ano, variando de 0,22 à 1,05μg L-1 na água estuarina da Lagoa dos Patos. Segundo esse mesmo estudo, várias substâncias e materiais utilizados pelos estaleiros contribuem para a contaminação do meio ambiente, como:
produtos químicos usados na manutenção dos navios, na conservação da madeira e tintas anti- incrustantes. A maior parte destas substâncias é descartada pelos estaleiros no meio aquático.
Metais, tais como cobre (Cu) e zinco (Zn), estão presentes em altas concentrações em tintas anti-
9 incrustantes que são aplicadas aos cascos de navios para inibir a colonização de organismos e incrustação. Embarcações motorizadas podem, cada uma, liberar até 2kg de cobre por ano a partir de tintas anti-incrustantes aplicadas a eles (Boxall et al., 2000). Já foi demonstrado que essas concentrações de cobre no estuário da Lagoa dos Patos, já variaram com o passar dos anos. O trabalho de Barbosa et al., (2012) mostra que em 1997, a concentração de cobre no estuário chegou a 26μg L-1, acontecendo um decréscimo a partir do ano 2000.
Os organismos que estão imersos em um ambiente contaminado por cobre, podem captá-lo, tanto por fontes alimentares quanto por contato com o meio. Geralmente, a absorção de cobre pelos organismos aquáticos ocorre ao longo de superfícies epiteliais, como as membranas das brânquias dos peixes e crustáceos, que estão em contato direto com o ambiente e possuem várias funções, como transporte de íons, trocas gasosas, regulação ácido-base e excreção (MacRae et al., 1999;.
Santore et al., 2001;. Paquin et al., 2002; Grosell et al., 2007). No entanto, quando a absorção é maior do que a capacidade de excretar o metal, pode haver um acúmulo do metal em diferentes tecidos com consequente toxicidade. Alguns estudos sobre a acumulação e toxicidade do cobre no siri-azul, demonstraram que esse metal pode acumular em tecidos como as brânquias, como foi observado no trabalho de Martins et al, (2011). Segundo esse mesmo estudo, a toxicidade aguda de cobre dissolvido é maior na salinidade 2 (LC50 = 5,3µM) do que na salinidade 30 (LC50 = 53µM), devido principalmente às diferenças físico-químicas da água nestas salinidades. Além disso, o cobre também gera distúrbio na iono e osmorregulação (Stagg e Shuttleworth, 1982; Wilson e Taylor, 1993; Grosell et al., 2004a,b; Pinho et al., 2007).
Metalotioneínas (MTs) são uma família de proteínas, de baixo peso molecular, que está relacionada com o controle da concentração de metais traços livres no organismo. Suas funções estão relacionadas à detoxificação de metais não-essenciais como mercúrio e cádmio e de metais essenciais como zinco e cobre, funcionando ainda, como estoques intracelulares destes últimos.
Além disso, podem reagir com espécies reativas de oxigênio, apresentando assim uma ação antioxidante (Klaassen et al., 1999; Viarengo et al, 1999; Viarengo et al., 2000). Os resultados do
10 trabalho de Martins et al. (2009), indicam que em baixas salinidades ocorre um aumento da concentração de MTs branquial, sendo uma resposta adaptativa do siri-azul C. sapidus para o stress hipo-osmótico. Contudo, o aumento de cobre intracelular, sem estar complexado a proteínas ou moléculas protetoras, pode gerar um aumento significante de espécie reativa de oxigênio (ERO), como peróxido de hidrogênio, radical ânion superóxido e radical hidroxila, podendo levar a um estado de estresse oxidativo podendo induzir processos apoptóticos (Winston e Di Giulio, 1991;
Livingstone, 2001; Atli et al., 2006).Isso ocorre, pois os dois estados redox do cobre representam um excelente catalisador do ciclo redox na presença de oxigênio (Rossi et al., 2004) gerando parcialmente as EROs que podem agir como oxidantes de resíduos de aminoácidos (Filomeni et al., 2005). Apesar da presença de um sistema de defesa antioxidante, que pode ser enzimático (catalase e superóxido dismutase, por exemplo) ou não enzimático (tripeptídeo glutationa, vitamina E, entre outros), o dano oxidativo pode ocorrer em organismos expostos a poluentes que promovem uma maior produção de ERO, como por exemplo, os metais (Livingstone, 2001; Ferreira et al., 2005).
Outras perturbações fisiológicas e bioquímicas induzidas pelo cobre em animais aquáticos são: inibição da glicólise (Hansen et al., 1992,. Satyaparameshwar et al., 2006.; Carvalho e Fernandes, 2008), do ciclo de Krebs (Balavenkatasubbaiah et al., 1984; Couture e Kumar, 2003), do equilíbrio ácido-base (Boitel e Truchot,. 1990; Wilson e Taylor, 1993; Skaggs e Henry, 2002;
Bielmyeral et al., 2005;. Blanchard e Grosell, 2006), da excreção de amônia (Larsen et al., 1997;
Grosell et al., 2003; Blanchard e Grosell, 2006), do consumo de oxigênio (Katticaran e Salih, 1992;
Santos et al., 2000; Manyin e Rowe, 2009) e do crescimento (Santos et al., 2000; Manyin e Rowe, 2009).
Os efeitos negativos do cobre podem estar, direta ou indiretamente, associados a uma insuficiente produção de energia para manter o metabolismo celular. De maneira geral, os metais tendem a diminuir o consumo de oxigênio nos animais (Spice e Weber, 1991). Zhang et al. (2014) verificaram que quando o lagostim Exopalaemon carinicauda era mantido em salinidade 10 e exposto à diferentes concentrações de cobre (0,46mg/L à 0,93mg/L) por 24h, resultava em uma
11 diminuição do consumo de oxigênio. Efeito similar também foi encontrado na respiração mitocondrial de fígado do peixe Carassius auratus exposto in vitro ao cobre na concentração de 40µg/g, indicando um efeito mais específico no funcionamento mitocondrial (Garceau et al., 2010).
Com relação ao efeito do cobre na via glicolítica em animais aquáticos, Lauer et al. (2012) realizaram um estudo com o caranguejo Neohelice granulata, onde este foi submetido a duas diferentes salinidades e expostos à concentração subletal correspondente de cobre: salinidade 2, 1mg/L e salinidade 30, 5mg/L, por um período de 96h. Dentre as análises desse trabalho, a atividade das enzimas envolvidas na glicólise e no ciclo de Krebs foi determinada nas brânquias anteriores e posteriores. De acordo com os resultados, foi verificado um aumento na atividade da enzima lactato desidrogenase (LDH) e citrato sintase nas brânquias anteriores e apenas um aumento da atividade da citrato sintase nas brânquias posteriores dos animais expostos ao cobre na salinidade 2. Já na salinidade 30, houve uma inibição da enzima citrato sintase nas brânquias anteriores e um aumento da atividade da enzima LDH nas brânquias posteriores dos animais expostos ao cobre, sugerindo que o cobre afeta a atividade das enzimas envolvidas na glicólise e no ciclo de Krebs, especialmente nas brânquias anteriores. Contrariamente, no trabalho de Teodorescu et al. (2012), foi verificado uma diminuição da atividade de LDH em brânquias, intestino e rins do peixe Auratus gibelio quando exposto a concentrações subletais de cobre (100µg/L e 250µg/L).
A maior parte da informação sobre os efeitos fisiológicos e bioquímicos do cobre em animais aquáticos é derivada de estudos em peixes e crustáceos de água doce, tendo poucos dados em animais de água salobra e salgada. Além disso, os efeitos deste metal no metabolismo em concomitância a variação osmótica aguda (choque osmótico) também são escassos. Neste sentido, o modelo escolhido para este estudo foi o siri-azul Callinectes sapidus. Além de ser considerado um bom modelo experimental, devido as suas características fisiológicas, o siri-azul também possui uma grande importância econômica na região estuarina da Lagoa dos Patos-RS (Ceperg/Ibama, 2002).
12 O siri-azul Callinectes sapidus é um crustáceo decápode encontrado nas águas costeiras do Oceano Atlântico e Golfo do México. Esta espécie é hiperosmorreguladora em baixas salinidades, sendo que, a partir da salinidade 27, na qual o organismo apresenta seu ponto isosmótico, esta espécie passa a ser osmoconformadora (Mantel e Farmer, 1983; Robinson, 1994; Piller et al., 1995).
Essa característica é essencial para o animal tolerar a ampla faixa de variação de salinidade dos estuários em que habita, mantendo, assim, o animal em condições internas homeostásicas estabelecimento e a manutenção do organismo. O siri-azul apresenta oito pares de brânquias, sendo que as anteriores possuem a função de respiração e as posteriores, de iono e osmorregulação.
3 Objetivos 3.1 Objetivo geral
O presente estudo tem como objetivo geral avaliar se a exposição ao cobre afeta o metabolismo aeróbico do siri-azul Callinectes sapidus aclimatados em duas condições de salinidade e quando submetidos ao choque hiposmótico.
3.2 Objetivos específicos
- Analisar o consumo de oxigênio total e branquial de C. sapidus aclimatados a salinidade 2 ou 30 e expostos à 1µM de cobre por 96h;
- Analisar o consumo de oxigênio total e branquial de C. sapidus aclimatados a salinidade 30 e transferidos à salinidade 2 (choque hiposmótico) e expostos à 1µM de cobre por 96h;
- Verificar os níveis de atividade da enzima Citrato sintase e Lactato desidrogenase (LDH) nas brânquias de C. sapidus aclimatados a salinidade 2 ou 30 e expostos à 1µM de cobre por 96h;
- Verificar os níveis de atividade da enzima Citrato sintase e Lactato desidrogenase (LDH) nas brânquias de C. sapidus aclimatados a salinidade 30 e transferidos à salinidade 2 (choque hiposmótico) e expostos à 1µM de cobre por 96h;
- Analisar os níveis de glicose, lactato e oxihemocianina na hemolinfa de C. sapidus aclimatados a salinidade 2 ou 30 e expostos à 1µM de cobre por 96h;
13 - Analisar os níveis de glicose, lactato e oxihemocianina na hemolinfa de C. sapidus aclimatados a salinidade 30 e transferidos à salinidade 2 (choque hiposmótico) e expostos à 1µM de cobre por 96h.
14 4 ARTIGO CIENTÍFICO
Effect of copper on the metabolism of blue crab Callinectes sapidus under different environmental osmotic conditions
Artigo científico preparado para submissão ao periódico “Ecotoxicology and Environmental Safety”.
15 Effect of copper on the metabolism of blue crab Callinectes sapidus under different environmental osmotic conditions
Eliana Jaime de Menezesa, Fábio Everton Maciela,b and Camila Gaspar Martinsa,b
a Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas – Fisiologia Animal Comparada
b Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Rio Grande – FURG, Av. Itália km 8, Campus Carreiros, 96201-900, Rio Grande, RS, Brazil.
Corresponding author: Fabio Everton Maciel
Universidade Federal do Rio Grande (FURG) Instituto de Ciências Fisiológicas (ICB) Av. Itália km 8 – Campus Carreiros 96.201-900 – Rio Grande – RS – Brazil Phone: + 55 53 3293-5193
E-mail: fabioemaciel@ig.com.br
16 4.1 Abstract
Copper, among many metals, is an essential micronutrient to aquatic organisms. Like other metals, copper becomes toxic when present in high concentration in the water. Studies show that copper levels are increasing in estuaries, mainly as a result of human activities and may affect several biochemical and physiological levels. For this reason, the present study aims to evaluate whether exposure to copper affects aerobic metabolism of the blue crab Callinectes sapidus acclimated in two conditions of salinity and when subjected to hyposmotic shock. Males of C.
sapidus were collected in the Patos Lagoon estuary - RS, Brazil, and after10 days of acclimatization in two different salinities (2 and 30), animals were subjected to 1μM of copper for 96h in these salinities conditions (2 and 30) and also under a hyposmotic shock (from 30 to 2). Measurements of animal oxygen consumption, hemolymphatic glucose, lactate and oxyhemocyanin levels and gills oxygen consumption, lactate dehydrogenase (LDH) and citrate synthase activity enzymes were conducted. The results show that low salinities and cooper tend to increase the total oxygen consumption. This metal showed few effects on the haemolymphatic parameters analyzed.
However, copper had a strong effect on gill enzyme activities, decreasing LDH and increasing citrate synthase after hyposmotic shock. Therefore, we conclude that the 1μM of copper concentration used in this study affect the aerobic metabolism of C. sapidus in response to the reduction in salinity.
Keywords: Copper, blue crab, Callinectes sapidus, aerobic metabolism, hyposmotic shock.
17 4.2 Introduction
The aquatic organisms are subject to a series of environmental factors, as salinity, temperature, oxygen dissolved in water, as well as to exposure to chemical contaminants. The animals that deal with these challenges and its variations need a series of physiological and biological adaptations to keep the homeostasis. The estuaries are among the most stressful environments to the aquatic life. Comparing the floating salinities, the estuarine animals must have mechanisms that aim to keep correctly osmotic and ionic equilibrium. (Lee et al, 2010)
In general, the salinity change in the environment can take to alterations in the animal metabolism. Usually low salinity increase the metabolic rate due to an higher energy consumption from active ionic transporters proteins (Péqueux and Gilles, 1988; Lucu and Pavieié, 1995; Piller et al, 1995; Brown and Terwillinger, 1999). The blue crab Callinectes sapidus can tolerate a wide range of salinity, which hyper-regulate in low salinity and osmoconform in high salinity (Tan & van Engel, 1966; Engel, 1971; Tagatz, 1971; Gerard & Gilles, 1972). It was already seen that in this species, the gill oxygen consumption tends to low with the increase of the salinity, and it can have differences depending to the season and to the sex of animal (Engel and Eggert, 1974).
Additionally, the results of Martins et al. (2009), indicate that in low salinities occur an increase in the concentration of gill metallothionein, being an adaptive response of the blue crab C. sapidus to the hyposmotic stress. Paital and Chany (2010) also observed that the increase in the salinity causes the diminution in the oxygen consumption in the crab Scylla serrata.
Several metals as iron, zinc and copper are essential to the aquatic organisms, participating in many cellular processes. Copper, besides being part of the respiratory pigment hemocyanin, acts as a cofactor of several enzymes (Suzuki et al, 2002; Ryu et al, 2003; Serafim and Bebianno, 2009), being essential to the respiration in all eukaryotic cells. However, this metal turns toxic when in high concentrations in the water (Chavez-Crooker et al, 2003). The toxicity of pollutants, as the metals, are related with the physio-chemical characteristics of the water. Therefore, besides
18 interfering in the physiological state of the animals, the salinity floating of the estuaries still affects the bio-availability of metals in the water (Bianchini and Gilles, 2000; Paquin et al, 2000).
Generally, the absorption of copper by the aquatic organisms occurs over the epithelial surfaces, as the gill membranes of the fishes and crustacean (MacRae et al, 1999; Santore et al;
2001; Paquin et al, 2002; Grosell et al, 2007). After the absorption, the copper can be transported by the hemolymph or blood and integrate itself in cellular components, acting in some processes, as in the cellular respiration, in the oxygen transport and in the action of enzymes.
In general, the metals tend to diminish the oxygen consumption in the animals (Spice and Weber, 1991). Zhang et al (2014) verified that when the crayfish Exopalaemon carinicauda was kept in salinity 10 and exposed to different copper concentrations (0.46mg/L to 0.93mg/L) during 24h, resulted in a diminution of oxygen consumption. A similar effect was also found in the mitochondrial respiration of liver cells exposed to copper (40µg/g) in vitro of the fish Carassius auratus (Garceau et al., 2010), indicating a more specific effect in the mitochondrial functioning.
Additionally, it was already seen that this metal also changes the activity of some enzymes of the glycolytic pathway and of Krebs cycle in fishes and crustaceans exposed to different salinities (Lauer et al., 2012; Teodorescu et al., 2012).
The greatest part of the information about the physiological and biochemical effects of copper in aquatic animals are derived from studies in freshwater fishes and crustaceans (Lauer et al., 2012), with few data in brackish and marine water animals. Moreover, the effects of this metal in the aerobic metabolism concomitantly with an acute osmotic variation (osmotic shock) are also scarce. In this sense, the chosen animal model for this study was the blue crab Callinectes sapidus.
Besides being considered a good experimental model, the blue crab also has a great economic importance (Ceperg/Ibama, 2002).This specie hyper-osmoregulate in low salinities, and above its isosmotic point (27) C. sapidus turns to an osmoconformer (Mantel and Farmer, 1983; Robinson, 1994; Piller et al, 1995). This characteristic is essential for the animal to tolerate the wide range of salinity variation of the estuarine it inhabits, maintaining the establishment and the maintenance of
19 the organism. Some studies about the accumulation and toxicity of copper in the blue crab, demonstrated that this metal can accumulate in tissues like gills, as was observed in the study of Martins et al. (2011a). According to this same study, the dissolved copper toxicity is enhanced in salinity 2 (LC50 = 5.3 µM) when compared to salinity 30 (LC50 = 53 µM), mainly due to physic- chemical differences of the water in this salinities. Moreover, Martins et al. (2011b) observed inhibition of some ionic transporters protein expression in gills of C. sapidus exposed to 1µM of copper in low salinity, indicating that this metal is a potential ionoregulatory toxicant. Thus, the present study aims to evaluate if the exposure to copper affects the aerobic metabolism of the blue crab C. sapidus when acclimatized in two salinity conditions (2 and 30) and when submitted to hyposmotic shock.
4.3 Material and Methods
4.3.1 Animal Maintenance
Male juveniles exemplars of blue crab Callinectes sapidus with a mean carapace width size of 6.50 ± 0.67cm and with a mean weight of 41.50 ± 9.23g) were collected nearby Rio Grande city - RS/Brazil, through a bottom trawling net. After the collection, the animals were acclimated in laboratory for a period of ten days in two salinity conditions, 30 and 2, with constant temperature (20°C), photoperiod (12C:12E) and aeration. The crabs were feed with minced fish twice a week ad libitum.
4.3.2 Experimental Design
After the acclimatation, the animals were separated in six groups: CTR30 Group: twelve animals were kept in salinity 30 for 96h;
Cu30 Group: twelve animals were kept in salinity 30 and exposed to1uM of copper for 96h;
20 CTR30-2 Group: twelve animals acclimatized to salinity 30 were transferred to salinity 2 and keep for 96h;
Cu30-2 Group: twelve animals acclimatized to salinity 30 were transferred to salinity 2 with 1uM of copper and kept for 96 hours;
CTR2 Group: twelve animals kept to salinity 2 for 96 hours;
Cu2 Group: twelve animals kept to salinity 2 and exposed to 1uM of cooper for 96 hours.
In the groups with exposure to cooper, the contaminant was added to the experimental environment 24h before the exposure of the animals aiming to stabilization of the metal in the environment. The experimental environment of the six groups was renewed each 24h. At the times 0h and 96h the animals were cryo anaesthetized (n=6) for the withdrawal of previous gills for immediate measure of the consumption of oxygen and further activity of the enzymes citrate synthase and lactate dehydrogenase (a couple of gills by analysis). Additionally, it was collected hemolymph (~200µL) of six animals in the points 0h, 6h, 24h and 96h for further analysis of glucose, lactate and oxi hemocyanin.
A second experiment was conducted in the same conditions described above (six groups, n=6) for the measurement of the consumption of oxygen of the animal only in the points 0h and 96h.
4.4 Analytic Techniques
4.4.1 Oxygen Consumption
The oxygen consumption of each individual animals were measured in glass recipients (1L) with water with its respective salinities (DO-5519, Lutron Electronic Enterprise CO). After the initial oxygen concentration measure, the animals were placed individually in each recipient, which stayed sealed during 20min. After this period, it was realized the measure of the oxygen
21 concentration again. After, the animals were weighted and the volume of the recipients was measured. The oxygen consumption was expressed in mg O2.g-1.h-1.
It was also measured the oxygen consumption in isolated anterior gills. The initial oxygen concentration was measured (DO-5519, Lutron Electronic Enterprise CO) in plastic recipients (10mL) with physiological solution of crustaceans (Salinity 30 – 370mM de NaCl, 12mM de KHCO3, 20mM de CaCl2, 15mM de Na3C6H5)7, 10mM de MgSO4 e 5mM de H3BO3; Salinity 2 - 35mM de NaCl, 0.5mM de KHCO3, 0.5mM de CaCl2, 5mM de MgSO4 e 5mM de H3BO3) immediately before putting the gills (01 couple of anterior gills in each recipient, n=6). Then, the recipients were sealed and, after 30 minutes, it was realized a new measurement. After this, the gills were weighted and the volume of the recipients was measured. The consumption of oxygen was expressed in mg O2.g-1.h-1.
4.4.2 Oxi-hemocyanin and protein
The levels of hemolymphatic protein were determined using a commercial reagent kit (Doles), a derivate method of Bradford (1976). For the measurement of oxi-hemocyanin, 100µL of hemolymph were immediately diluted in 900µL of distilled water in 10mm of quartz cuvette, and the absorbance was measured in 335nm using a spectrophotometer (Hitachi L-2000, Tokyo - Japan). The concentration of oxihemocyanin was calculated based in methods described by Hagerman (1986) and Chen and Cheng (1993).
4.4.3 Hemolymphatic glucose and lactate levels
The levels of glucose and lactate in the hemolymph were determined through a commercial reagent kit (Kovalent), being the dosages done spectrophotometrically in 490nm and 340nm, respectively. The concentration of glucose and lactate was expressed in mg/dL.
22 4.4.4 Analysis of lactate dehydrogenase (LDH) and citrate synthase enzymes
The activity of the LDH and citrate synthase enzymes were analyzed according to Lallier and Walsh (1991) with small modifications. The previous gills were homogenized in cooled buffer with ice (50mM imidazole; 0.1mM PMSF; pH 7.8). The homogenized product obtained was centrifuged (10,000g; 20min; 4°C) and the supernatant was used as source of enzyme. The activity of LDH and citrate synthase was analyzed spectrophotometrically in 340nm and 405nm, respectively, using a microplates reader (ELx808IU, BioTek Instruments, INc, Winooski, VT, USA).
4.5 Data analysis
The data were expressed as mean ± SE. The differences among the groups (control and exposed of cooper) during this period were evaluated by analysis of variance of two ways (ANOVA), followed by a post hoc Newman-Keuls test. The normality and the homogeneity of the variances were previously verified as ANOVA assumptions. In all cases, the adopted level of significance was of 95% (α=0.05).
4.6 Results and discussion
The total oxygen consumption in the blue crab C. sapidus without exposure to copper (zero time and 96h) or copper exposure (96h) at different salinities is shown in Figure 1. Animals acclimated to salinity 30 and submitted to hyposmotic shock (transferred abruptly salinity 30 to salinity 2), showed an increase in the oxygen consumption of the control (0.17 ± 0.02mg O2/g/h) and copper (0.16 ± 0.01mg O2/g/h) groups after 96 hours in comparison to the control group at time zero (0.12 ± 0.01mg O2/g/h). The results obtained in hyposmotic shock experiments are consistent with the literature, where low salinity induces increased oxygen consumption in the blue crab (Engel and Eggert, 1974). Osmotic regulation or osmoregulation comprises a series of strategies
23 developed by the organisms, which work together to cell volume maintenance (Gilles & Péqueux, 1983; Péqueux, 1995). Crustaceans are the animals group that best represents this phenomenon, having representatives adapted to various environments such as marine, freshwater, terrestrial and semi-terrestrial. So this increase in oxygen consumption is probably related to an increase in energy expenditure with the osmoregulatory activity of this animal in salinities below its isosmotic point, around 27 (Mantel and Farmer, 1983; Robinson, 1994; Piller et al., 1995). With respect to copper, although some studies have reported that metals inhibit oxygen consumption (for review see Spice and Weber, 1991), for the crabs exposed copper and kept in salinity 2, the oxygen consumption increased. Similarly to our results and using a very similar copper concentration of the present work, Pistole et al. (2008) observed a significant increase in metabolic rate of the fish Pimephales promelas exposed to copper (60μ/L) for 96 h as compared to their respective control. According to the same study, increased metabolic rate may reflect the implementation of cellular responses and compensatory mechanisms including the production of metallothionein and other defense proteins (Cousins, 1985; Smith et al, 2001; Rose et al., 2006; Kil et al, 2006;. Wu et al, 2006). In fact, Martins and Bianchini (2009) verified in this species an increase in the concentration metallothionein gills in low salinities, indicating an adaptive response of the blue crab C. sapidus to hyposmotic stress.
As for the overall oxygen consumption in animals kept at salinity 30, gill oxygen consumption did not change significantly between the time and experimental groups (Figure 2).
However, the salinity change 30 to 2 (hyposmotic shock) induced a significant decrease in gill oxygen consumption after 96 hours (0.09 ± 0.01 vs 0.14 ± 0.01mg O2/g/h) but not differentiated from animals treated with copper (0.12 ± 0.02mg O2/g/h). Aquatic organisms can be classified according to salinity tolerance medium. Thus, stenohaline animals are those that tolerate a narrow range of salinity and euryhaline those that support a wide range of salinity (Mantel & Farmer, 1983;
Péqueux, 1995). The euryhaline crustaceans have an essential feature to tolerate finds existing variation in salinity estuaries. Thus, such animals utilize two basic molecular mechanisms while
24 keeping a water balance and solutes: (1) anisosmotic regulation of extracellular fluid, which keeps the extracellular fluid constant independently from surrounding environment salinity; and (2) isosmotic regulation of intracellular fluid, which keeps the intracellular fluid isosmotic compared to the extracellular fluid (Gilles 1982; Péqueux, 1995). The osmoregulator animals depend mainly on (1) while osmoconformers depend, mainly, the (2) strategies (Gilles & Péqueux, 1983).
It should be noted that in this study were used only anterior gills, which have both morphological and functional differences compared to posterior gills. In the case of C. sapidus, the anterior gills have a thinner epithelium, greatly reduced cuticle and a limited number of organelles, which is characterized as a respiratory organ. However, in the posterior gills is observed a thick epithelium, an increase of the villi and a large number of mitochondria, which seem to be related to the transport of ions, featuring therefore the engagement of the body in ionic and osmotic adjustments (Henry & Cameron, 1982 Bar et al, 1983;. Péqueux & Gilles, 1985). Thus, in osmoregulatory processes of fish and crustaceans, the posterior gills would require a considerable amount of energy especially in a hyposmotic environment (Piller et al., 1995) and perhaps so the effect of copper would be more related to posterior gills. Indeed, it was seen that copper is a potent toxic agent in ionoregulatory process in C. sapidus acclimated to low salinity due to its action in inhibiting the expression of ionoregulatory proteins (Martins et al., 2011a).
With respect to hemolymphatic glucose levels (Table 1), the exposure to copper promoted an effect only in animals acclimated to salinity 30, increasing glucose levels after 24 hours of exposure to copper (30.29 ± 3.87 mg / dL ) compared to the control group at the same time (15.76 ± 1.32mg/dL). On the other hand, in hyposmotic shock an hyperglycemia was soon checked after the shock (39.54 ± 9.48mg/dL) compared to the initial time (18.38 ± 4.50mg/dL), not being verified a copper effect in this condition. This increase hemolymphatic glucose after osmotic stress in crustaceans has been reported by other studies indicating an effect on carbohydrate metabolism in these animals, or mobilizing glucose reserves for the energy supply for the different tissues in this stress situation (Santos and Nery, 1987; Da Silva and Kucharski, 1992). The concentration of
25 lactate (table 2) and oxyhemocyanin (table 3) in the hemolymph of animals subject to copper also did not change in any experimental condition. Some studies suggest that heavy metals may affect mainly the synthesis of respiratory pigments instead of affecting its function (Spicer and Weber, 1991). Corroborating to our results, a study of tiger shrimp (Penaeus rnonodon) showed that in 24 hours of exposure to copper (1.11 mg/L) did not alter the levels of oxyhemocyanin (Lin and Chen, 2001).
In relation to the lactate dehydrogenase (LDH) activity (Figure 3), no statistical difference was observed in both salinities conditions (30 and 2). However, in hyposmotic shock, after 96 h exposure to copper, there was a significant decrease in LDH activity (2.57 ± 0.87U/mg prot.) compared to its control (16.60 ± 3.51U/mg prot.). Some studies show different results regarding the effect of copper on the LDH activity. For example, Lauer et al. (2012), observed an increase in the activity of LDH in the anterior and posterior gills of the crab Neohelice granulata acclimated in salinity 2 and exposed for 96 hours at 1 mg/L of copper. Already, Teodorescu et al. (2012) observed a decrease in LDH activity in Carassius gibelio exposed to sublethal copper concentration under two different conditions (100 and 250mgL) for 72h. It can be speculated that inhibition of LDH by copper is due to accumulation of this metal in the gills (Martin et al. 2011a), entering the mitochondria and generating oxidative stress such as oxidation of proteins of key enzymes involved in fermentative catabolism of glucose. This modification can influence the three-dimensional structure of enzymes that affect their catalytic activity (Shanmuganathan et al., 2004). Another possible cause would be a direct reaction of the active site of the thiol group with copper LDH enzyme in the presence of NADH (Pamp et al. 2005).
The citrate synthase enzyme activity in the hyposmotic shock (Figure 4) showed that exposure to copper for 96h (0.02 ± 0.01U/mg prot.) significantly increased the enzyme activity compared to the control (0.003 ± 0.001U/mg prot.). In the study of Lauer et al. (2012), copper appeared to inhibit the citrate synthase activity in the anterior gills and increase activity in posterior gills of the crab Neohelice granulata acclimated in salinity 2. Already Craig et al. (2007) found an
26 increased enzyme in the liver but not in the gills zebrafish Danio rerio exposed for 48 h at 15μg/L for copper, indicating that this metal can affect the Krebs cycle in different tissues.
4.7 Conclusion
With this study we can conclude that the concentration of copper 1μM (nominal concentration), which was selected because it is considered an environmentally relevant concentration (Martins et al 2011a;.Martins et al 2011b), has a significant importance in the metabolism of the blue crab Callinectes sapidus, especially after the sudden reduction of salinity of the medium, a situation found in estuarine environments. Thus, the cooper associated with the hyposmotic shock had an effect mainly on enzymes activity of the glycolytic pathway and Krebs cycle.
According to the results, it is suggested an increase in oxidative metabolic activity and provide evidence that LDH and citrate synthase activity can be a sensitive indicator for aquatic toxicology studies, which should be the result of a specific research.
4.8 Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge the financial and in-kind support of the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brazil), “Coordenação de Aperfeiçoamento do Pessoal de Ensino Superior” (CAPES, Brasília, DF, Brazil) and the International Copper Association (ICA, USA).
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4.10 Figure caption
Figure 1. Total oxygen consumption of the blue crab Callinectes sapidus without exposure to copper (white bars) or with exposure to copper (black bars) for 96 hours in different salinities. A) Animals acclimated and kept salinity 30. B) Animals acclimated to salinity 30 and submitted to salinity 2 (hyposmotic shock). C) Animals acclimated and kept salinity 2. The total oxygen uptake measured at the times 0h and 96h are expressed in mgO2 / g / h.
34 Figure 2. Total oxygen consumption in the gills of the blue crab C. sapidus without exposure to copper (white bars) or with exposure to copper (black bars) for 96 hours in different salinities. A) Animals acclimated and kept salinity 30. B) Animals acclimated to salinity 30 and submitted to salinity 2 (hyposmotic shock). C) Animals acclimated and kept salinity 2. The total oxygen uptake measured at the times 0h and 96h are expressed in mgO2 / g / h.
Figure 3. Enzyme activity lactate dehydrogenase (LDH) in the previous gills of the blue crab C.
sapidus without exposure to copper (white bars) or with exposure to copper (black bars) for 96 hours in different salinities. A) Animals acclimated and kept salinity 30. B) Animals acclimated to salinity 30 and submitted to salinity 2 (hyposmotic shock). C) Animals acclimated and kept salinity 2. The LDH enzyme activity measured in the time 0h and 96h is expressed in LDH / mg.
Figure 4. Enzyme citrate synthase activity in the previous gills of the blue crab C. sapidus without exposure to copper (white bars) or with exposure to copper (black bars) for 96 hours in different salinities. A) Animals acclimated and kept salinity 30. B) Animals acclimated to salinity 30 and submitted to salinity 2 (hyposmotic shock). C) Animals acclimated and kept salinity 2. The enzyme citrate synthase activity measured at the times 0h and 96h is expressed in U / mg prot.
4.11 Tables caption
Table 1. Hemolymphatic glucose concentration in the blue crab C. sapidus with (1µM) or without copper exposition for 96 hours in three salinity conditions (salinity 30, hyposmotic shock and salinity 2). Data are expressed in mg/dL (mean ± SEM). The letters indicate significant differences (p<0.05).
35 Table 2. Hemolymphatic lactate concentration in the blue crab C. sapidus with (1µM) or without copper exposition for 96 hours in three salinity conditions (salinity 30, hyposmotic shock and salinity 2). Data are expressed in mg/dL (mean ± SEM). The letters indicate significant differences (p<0.05).
Table 3. Hemolymphatic oxyhemocyanin concentration in the blue crab C. sapidus with (1µM) or without copper exposition for 96 hours in three salinity conditions (salinity 30, hyposmotic shock and salinity 2). Data are expressed in mmol/L (mean ± SEM). The letters indicate significant differences (p<0.05).
4.12 Tables
Table 1
36 Table 2
Table 3
37 4.13 Figures
Figure 1
38 Figure 2
39 Figure 3
40 Figure 4
41 5 Discussão geral
Em nosso trabalho, observamos que, com relação ao consumo de oxigênio total do animal, os resultados obtidos nos experimentos de choque hiposmótico estão de acordo com a literatura, onde baixas salinidades induzem ao aumento do consumo de oxigênio no siri-azul (Engel e Eggert, 1974). A regulação osmótica ou osmorregulação compreende uma série de estratégias desenvolvidas pelos organismos, as quais atuam em conjunto para manutenção do volume celular (Gilles & Péqueux, 1983; Péqueux, 1995). Os crustáceos compõem o grupo animal que melhor representa esse fenômeno, possuindo representantes adaptados aos diversos ambientes, tais como:
marinho, dulciaqüícola, semiterrestre e terrestre. Portanto, este aumento no consumo de oxigênio está, provavelmente, relacionado a um incremento do gasto energético com a atividade osmorregulatória deste animal em salinidades abaixo do seu ponto isosmótico, que fica em torno de 27 (Mantel e Farmer, 1983; Robinson, 1994; Piller et al., 1995). Com relação ao cobre, apesar de alguns trabalhos relatarem que metais inibem o consumo de oxigênio (para revisão ver Spice e Weber, 1991), para os siris expostos ao cobre e mantidos na salinidade 2, o consumo de oxigênio aumentou. De maneira similar aos nossos resultados e usando uma concentração de cobre muito parecida com a que usamos, Pistole et al. (2008) observaram um aumento significativo na taxa metabólica do peixe Pimephales promelas expostos ao cobre (60µ/L) durante 96h, em comparação ao seu respectivo controle. Segundo este mesmo estudo, o aumento da taxa metabólica pode refletir a implementação de respostas celulares e mecanismos compensatórios que incluem a produção de metalotioneinas e outras proteínas de defesa (Cousins, 1985; Smith et al., 2001; Rose et al., 2006;
Kil et al., 2006; Wu et al., 2006). Martins e Bianchini (2009) indicam que em baixas salinidades ocorre um aumento da concentração de metalotioneínas branquial, sendo uma resposta adaptativa do siri-azul C. sapidus para o stress hipo-osmótico.
Os organismos aquáticos podem ser classificados de acordo com seu grau de tolerância a variação de salinidade do meio. Os crustáceos eurialinos apresentam uma característica essencial para tolerar a constate variação de salinidade existente nos estuários. Sendo assim, esses animais
42 utilizam dois mecanismos moleculares básicos, assegurando um balanço de água e solutos: (1) regulação anisosmótica do fluído extracelular (RAFE), que mantém o fluído extracelular constante independente da salinidade do meio circundante; e (2) regulação isosmótica do fluído intracelular (RIFI), que mantém o fluído intracelular isosmótico em relação ao fluído extracelular (Gilles 1982;
Péqueux, 1995). Os animais osmorreguladores dependem principalmente da RAFE, enquanto os osmoconformadores dependem, sobretudo, da RIFI (Gilles & Péqueux, 1983).
Cabe salientar que, na análise do consumo de oxigênio branquial deste trabalho, foram utilizadas apenas brânquias anteriores, que apresentam tanto diferenças morfológicas como funcionais em relação às brânquias posteriores. No caso de C. sapidus, os pares de brânquias anteriores possuem epitélio mais fino, cutícula bastante reduzida e um número de organelas limitado, caracterizando-se assim como um órgão respiratório. Entretanto, nos pares de brânquias posteriores observa-se um epitélio espesso, um aumento de vilosidades e um grande número de mitocôndrias, que parecem estar relacionados com o transporte de íons, caracterizando, portanto, o envolvimento deste órgão nas regulações iônica e osmótica (Henry & Cameron, 1982, Barra et al., 1983; Gilles & Péqueux, 1985). Sendo assim, nos processos osmorregulatórios de peixes e crustáceos, as brânquias posteriores demandariam uma quantidade considerável de energia principalmente em um ambiente hiposmótico (Piller et al., 1995) e talvez por isso o efeito do cobre estaria mais relacionado com as brânquias posteriores. De fato, já foi visto que o cobre é um potente agente tóxico no processo ionorregulatório em C. sapidus aclimatados em baixa salinidade devido à sua ação na inibição da expressão de proteínas ionorregulatórias (Martins et al., 2011a).
O aumento de glicose hemolinfático, observado após o estresse osmótico, já foi reportado em crustáceos por outros trabalhos, indicando um efeito no metabolismo de carboidratos nestes animais, ou seja, mobilizando as reservas de glicose para fornecimento de energia para os diferentes tecidos nesta situação de estresse (Santos e Nery, 1987; Da Silva e Kucharski, 1992). Quanto à concentração de lactato e oxi-hemocinina na hemolinfa, a exposição ao cobre também não as alterou em nenhuma condição experimental e temporal. Alguns trabalhos sugerem que os metais
43 pesados podem afetar principalmente a síntese de pigmentos respiratórios em vez de afetar sua função (Spicer e Weber, 1991). Corroborando com nossos resultados, um estudo feito com o camarão tigre (Penaeus rnonodon) mostrou que em 24 horas de exposição ao cobre (1,11mg/L) não alteraram os níveis de oxihemocianina (Lin e Chen, 2001).
Alguns trabalhos mostram resultados diferentes aos obtidos neste estudo, com relação ao efeito do cobre na atividade da LDH. Por exemplo, Lauer et al. (2012), verificaram um aumento na atividade da a LDH nas brânquias anteriores e posteriores do caranguejo Neohelice granulata aclimatados na salinidade 2 e expostos por 96h à 1mg/L de cobre. Já Teodorescu, et al. (2012) verificaram uma diminuição da atividade da LDH em Carassius gibelio expostos à duas concentrações subletais de cobre (100μg/l e 250μg/l) por 72 horas. Pode-se especular que esta inibição da LDH pelo cobre se deva a acumulação deste metal nas brânquias (Martins et al. 2011a), entrando nas mitocôndrias e gerando estresse oxidativo, como por exemplo oxidação de proteínas de enzimas-chave envolvidas no catabolismo fermentativo da glicose. Esta modificação pode influenciar a estrutura tridimensional de enzimas que afetam a sua atividade catalítica (Shanmuganathan et al., 2004). Outra possível causa seria uma reação direta do sítio ativo do grupo tiolíco com o cobre da enzima LDH na presença de NADH (Pamp, et al. 2005).
O aumento da atividade da enzima citrato sintase, observado na condição experimental de choque hiposmótico, foi resultado contrário ao encontrado no trabalho de Lauer et al. (2012), onde o cobre pareceu inibir a atividade da enzima citrate sintase nas brânquias anteriores e aumentar a atividade nas brânquias posteriores do caranguejo Neohelice granulata aclimatados na salinidade 2.
Já Craig et al. (2007) verificaram um aumento desta enzima no fígado mas não nas brânquias do zebrafish Danio rerio expostos por 48 h à 15µg/L de cobre, indicando que este metal pode afetar o ciclo de Krebs em diferentes tecidos.
Com o presente estudo, podemos concluir que a concentração de 1µM de cobre, pode ser considerada ambientalmente relevante, pois influencia significativamente o metabolismo do siri- azul Callinectes sapidus. Esta influência dá-se principalmente após brusca redução da salinidade do
