JOSÉ APRÍGIO NUNES LIMA
IMPORTÂCIA EPIDEMIOLOGICA DA FAUA FLEBOTOMÍICA (DIPTERA: PSYCHODIDAE) DE UMA ÁREA FLORESTAL COM POTECIAL DE TRASMISSÃO DE LEISHMAIOSES EM AAIDEUA, PARÁ, BRASIL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientadora: Profª Dra Edilene Oliveira da Silva Laboratório de Protozoologia, ICB-UFPA Co-orientador: Profº. Dr. Fernando Tobias Silveira
Laboratório de Leishmanioses, IEC-SVS Banca Examinadora: Profª. Dra. Marinete Marins Póvoa
Seção de Parasitologia, IEC-SVS Profª. Dra. Edna Aoba Yassui Ishikawa Núcleo de Medicina Tropical, UFPA Profª. Dra. Ana de Nazaré Martins da Silva Núcleo de Medicina Tropical, UFPA
Profª Dra. Ivoneide Maria da Silva (suplente) Laboratório de Parasitologia, ICB- UFPA
DEDICATÓRIA
A minha esposa Teodora Alves Lima, minhas filhas Hewelline, Emily, Suelen, Luciana e minha neta Luára que sempre me apoiaram em todos os sentidos.
Aos meus saudosos pais Osvaldo e Zuleima (in memorian)
AGRADECIMETOS
À Deus, por todas as conquistas e vitórias de minha vida;
À minha orientadora Profª Drª Edilene Silva, por me orientar e não ter dúvida da minha capacidade de vencer esta batalha;
Ao meu amigo co- orientador Prof. Dr. Fernando Silveira, que sempre me incentivou, orientou e acreditou que eu seria capaz;
Aos meus amigos e amigas do insetário de flebotomíneos: Edna Leão, Fábio Silva, Iorlando Barata, Luciene Santos, Roberto Brandão e Sueli Pinheiro por toda ajuda necessária para a conclusão deste trabalho;
Aos amigos Thiago Vasconcelos e Davi Oliveira pela ajuda fundamental no desenho do estudo e correção escrita;
À minha sobrinha Danille Lima pelo apoio com as observações da banca durante a qualificação desta dissertação;
À minha irmã Neide Cecim pelo incentivo constante para a conclusão deste trabalho; Ao bolsista de iniciação científica Patrick Botelho pelo apoio na formatação e normatização da dissertação;
À direção e à administração do Instituto Evandro Chagas por todo apoio logístico e financeiro prestado no decorrer deste trabalho;
Ao setor de transporte e a todos os motoristas do Instituto Evandro Chagas que sempre estiveram dispostos a ajudar no que fosse necessário;
Aos meus amigos do laboratório de cultivo João Brandão e Nonato Pires pela ajuda necessária no isolamento do material coletado;
Aos amigos do laboratório de infecção experimental Antônio Martins, Lucivaldo Ferreira e Adevaldo Eleres pela ajuda necessária na inoculação do material em animais de laboratório;
Aos amigos do serviço de esterilização Raimundo Machado e Raimundo Negrão pelo suporte técnico com o material estéril necessário;
Aos saudosos amigos do Laboratório de Leishmanioses que nos deixaram no decorrer dessa trajetóra: Adelson Souza (in memorian), Júlio Monteiro (in memorian) e Graça Silva (in memorian).
Aos demais amigos do Laboratório de Leishmanioses: Domingas Everdosa, Palheta da Luz, Marliane Campos, Zuíla Corrêa, Rosely de Jesus, Luciana Lima, Patrícia Ramos, De Leon Freitas, Lia Silva por todo apoio e palavras de incentivo;
Aos amigos Joelma Lima e Adeílson Gaspar pelo apoio na higienização de nosso laboratório;
À Daniela Soares pelas informações epidemiológicas da casuística da LTA no estado do Pará;
À Alcione Pinheiro, Luiz Guimarães e Fabrício Dias do Laboratório de Geoprocessamento pelo apoio nas imagens de satélite e pontuação das coordenadas geográficas da área de estudo;
Aos amigos do Laboratório de Protozoologia do ICB/ UFPA: Amanda Hage, Ana Paula Rodrigues, Bruno Martins, Chubert Sena, Caroline Almeida, Evelen Coêlho, Ingrid Rocha, Fernada Brasil, Jorge Pereira, Josineide Pantoja, Lienne Silveira, Luis Henrique, Paula Frade, Raquel Raick, Rodrigo Furtado e Sandro Pereira pelo apoio e coleguismo.
Aos secretários do PPGBAIP Raimundo Hosana e Mirna Tavares pelo apoio concedido durante o período de curso das disciplinas;
SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS 7 LISTA DE TABELAS 8 RESUMO 9 ABSTRACT 10 1. ITRODUÇÃO... 11
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE LEISHMANIOSES... 11
1.1.1 Leishmaniose Visceral... 12
1.1.2 Leishmanioses Tegumentar Americana ... 12
1.1.3 Situação da LTA na Região Metropolitana de Belém-PA... 15
1.2 FLEBOTOMÍNEOS VETORES DE Leishmania... 16
1.2.1 Ciclo biológico de flebotomíneos... 18
1.2.1.1 Ovos ... 18
1.2.1.2 Larvas ... 18
1.2.1.3 Pupas ... 19
1.2.1.4 Adultos ... 19
1.2.2 Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis (Lutz e eiva, 1912)... 20
1.2.3 Lutzomyia (yssomyia) flaviscutellata (Mangabeira,1942)... 20
1.2.4 Lutzomyia (yssomyia) antunesi (Coutinho, 1939)... 21
1.2.5 Lutzomyia (Psychodopygus) davisi (Root, 1934)... 21
1.2.6 Lutzomyia (Psychodopygus) ayrozai (Barreto & Coutinho,1940)... 22
1.2.7 Lutzomyia (Psychodopygus) paraensis (Costa Lima, 1941)... 22
2. JUSTIFICATIVA... 24 3. OBJETIVOS... 25 3.1 OBJETIVO GERAL... 25 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 25 4. MATERIAL E MÉTODOS... 26 4.1 TIPO DE ESTUDO... 26 4.2 ÁREA DE ESTUDO... 26 4.3 CAPTURA DE FLEBOTOMÍNEOS... 27
4.3.1 Comparação entre as diferentes armadilhas ... 27
4.4 TRIAGEM DE ESPÉCIMES E PROCESSAMENTO DO MATERIAL DE
CAMPO... 28
4.5 IDENTIFICAÇÃO TAXONÔMICA DAS FÊMEAS ... 28
4.6 DISSECÇÃO DE FEMEAS... 29 4.7 IDENTIFICAÇÃO DE MACHOS ... 30 4.8 CULTIVO DE PARASITOS... 30 4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 31 5. RESULTADOS... 32 5.1 FAUNA FLEBOTOMÍNICA... 32
5.2 COMPARAÇÃO ENTRE AS DIFERENTES FORMAS DE CAPTURA ... 33
5.3 FREQUÊNCIA MÉDIA MENSAL DE FLEBOTOMÍNEOS CAPTURADOS x PRECIPITAÇÃO PLUVIOMETRICA... 35
5.4 FREQUÊNCIAS MENSAIS DE ESPÉCIES DE INTERESSE EPIDEMIOLÓGICO... 36
5.5 PESQUISA DE INFECÇÃO NATURAL... 37
6. DISCUSSÃO... 38 7. COCLUSÕES... 42 8. REFERÊCIAS... 43 AEXO 1 ... 52 AEXO 2 ... 53 APÊDICE 1 ... 54
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
Figura 1 - Distribuição da LTA nas diversas regiões do Brasil, em 1990 e 2009... Figura 2 - Prevalência de LTA no estado do Pará. Em destaque, municípios sem casos da doença... Figura 3 - Municípios de ocorrência da LTA, segundo a procedência dos pacientes atendidos no Laboratório de Leishmanioses do IEC, em Belém e sua região metropolitana, no período de janeiro de 1995 a dezembro de 2010... Figura 4 - Bairros do município de Belém e Ananindeua onde ocorreram casos de LTA atendidos no Laboratório de Leishmanioses do IEC, no período de janeiro de 1995 a dezembro de 2010... Figura 5 - Formas imaturas e adultas de flebotomíneos... Figura 6 - A: Campus II do Instituto Evandro Chagas com destaque para a área de trabalho e posição de armadilhas luminosas. B: Localização do município de Ananindeua, onde está situado o campus II do IEC, no Estado do Pará e no Brasil... Figura 7 - Armadilha para captura de flebotomíneos ... Figura 8 - Trato digestivo de fêmea de flebotomíneo dissecada para pesquisa de infecção natural... Figura 9 - Meio de cultivo in vitro e modelo animal para cultivo in vivo... Figura 10 - Frequência mensal de flebotomíneos capturados e precipitação pluviométrica na área de estudo, segundo a estação metereológica automática Belém... Figura 11 - Frequências mensais de Lu. antunesi, Lu. flaviscutellata e Lu. longipalpis... 14 14 15 16 18 26 27 29 31 36 37
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Espécies capturadas e identificadas nas coletas de outubro de 2010 a outubro de 2011 no campus II do IEC, com as respectivas frequências de machos e fêmeas. ... Tabela 2 - Flebotomíneos capturados em três meses consecutivos (outubro, novembro e dezembro) utilizando diferentes armadilhas (CDC solo, CDC copa e Shannon). ... Tabela 3 - Comparação da dominância, diversidade e equitabilidade entre os indivíduos capturados pelos três tipos de armadilhas utilizadas no estudo. ...
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RESUMO
Nos últimos dez anos, a região Norte do Brasil registrou um dos maiores índices de leishmaniose cutânea. Neste contexto, o estado do Pará contribuiu com mais da metade da casuística da doença. Este estudo objetivou identificar a fauna flebotomínica em uma floresta residual primária em área do campus II do Instituto Evandro Chagas (IEC), no município de Ananindeua, estado do Pará, Brasil, que é cercado por áreas recém-urbanas. As capturas sistemáticas dos flebotomíneos de nove vezes ao mês realizadas com armadilhas luminosas CDC instaladas no solo (1,5 m) e da copa de árvores (20 m) e armadilha de Shannon. As coletas foram realizadas entre Outubro de 2010 a Outubro de 2011. Um total de 2.675 exemplares pertencentes a 23 espécies e dois gêneros foram capturados. As espécies mais frequentes foram Lutzomyia antunesi (50,09%), um dos vetores suspeitos de Leishmania (V.) lindenbergi, que, juntamente com L. (V.) lainsoni e L. (L.) amazonensis são os principais parasitas causadores de leishmaniose cutânea em Ananindeua. Lu. flaviscutellata (1,4%) e Lu. longipalpis (0,4%) chamaram a atenção por serem os vetores de L. (L.) amazonensis e L. (L.) i. chagasi, respectivamente. Uma fêmea de Lu. rorotaensis foi encontrados naturalmente infectada com um parasita Leishmania peripilárico que não foi isolado com sucesso em meio ágar- sangue NNN. A presença de vetores conhecidos na transmissão de L. (L.) i. chagasi e L. (L.) amazonensis, bem como um dos vetores suspeitos de L. (V.) lindenbergi nesta área demonstra a necessidade de vigilância epidemiológica e entomológica no município de Ananindeua.
ABSTRACT
In the last ten years, the North region of Brazil had recorded one of the highest rates of cutaneous leishmaniasis. In this context, the state of Pará has contributed with more than the half of the cases of the disease. This study aimed to identify the phlebotmine sandfly fauna in a residual primary forest into the park area of the Instituto Evandro Chagas (IEC) in the municipality of Ananindeua, Pará state, Brazil, which is surrounded by newly urban areas. The systematic catches of the phlebotomine sandflies were performed using CDC light traps set up at the canopy and ground (1,5 m) levels and Shannon traps. The caches were carried out from October 2010 to October 2011. A total of 2,675 specimens belonging to twenty-four species and two genera were caught. The most abundant species was Lutzomyia antutesi (50,09%), a suspected vector of Leishmania (V.) lindenbergi, which together with L. (V.) lainsoni and L. (L.) amazonensis are the principal leishmanial parasites causing cutaneous leishmaniasis in this area. Lu. flaviscutellata (1,4%) and Lu. longipalpis (0,4%) have drawn attention for being the vectors of L. (L.) amazonensis and L. (L.) i. chagasi, respectively. A female of Lu. rorotaensis was found to be naturally infected with a peripylarian leishmanial parasite which was not successfully isolated in the blood-agar Difco B45 culture medium. The presence of known vectors of L. (L.) i. chagasi and L. (L.) amazonensis as well as a suspected vector of L. (V.) lindenbergi in this area shows the need of epidemiological and entomological vigilance in the municipality of Ananindeua.
1. ITRODUÇÃO
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE AS LEISHMANIOSES
As leishmanioses são um conjunto de doenças parasitárias causadas por protozoários digenéticos da ordem Kinetoplastida Honigberg, 1963 emend Vickermam, 1976, família Trypanosomatidae Doflein, 1901 emend Grobben, 1905 e do gênero Leishmania Ross, 1903. Esses parasitos são transmitidos por insetos flebotomíneos (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) dos gêneros Lutzomyia França, 1924 no Novo Mundo e Phlebotomus Rondani e Berté, 1840 no Velho Mundo que são os hospedeiros invertebrados das espécies do gênero Leishmania Ross, 1903, que causam as leishmanioses em humanos e outros mamíferos (Brasil, 2007; Forattini, 1973).
Até meados da década de 60 acreditava-se que todas as formas promastigotas encontradas nos flebotomíneos capturados no campo pertenciam ao gênero Leishmania e que todas eram infectantes para o homem. Sabe-se atualmente, que outros parasitos da família Trypanosomatidae passam por uma forma evolutiva que é morfologicamente indistinguível das promastigotas do gênero Leishmania (Siqueira, 2004).
Conforme a classificação da Organização Mundial da Saúde, as leishmanioses humanas apresentam duas formas clínicas principais: viscerotrópica ou leishmaniose visceral (LV), dermotrópica ou leishmaniose cutânea (LT) e leishmaniose cutâneo-mucosa (LCM) (TDR-WHO, 2007).
Atualmente as leishmanioses apresentam uma prevalência de 12 milhões de casos no mundo, sendo que 350 milhões de pessoas estão ameaçadas de contraí-la, com registro de aproximadamente dois milhões de casos novos, em 88 países, dentre estes 72 em desenvolvimento. A proporção entre as duas formas da doença diferem quanto a valores e locais de ocorrência. Noventa por cento de todos os casos de leishmaniose visceral ocorrem no Brasil, Bangladesh, Índia e Sudão. Já sobre a leishmaniose tegumentar americana, a maior ocorrência da leishmaniose cutâneo-mucosa ocorrem no Brasil, Bolívia e Peru, e a maioria dos casos de leishmaniose cutânea ocorrem no Brasil, Afeganistão, Irã, Peru, Arábia Saudita e Síria (Brasil, 2007; CDC, 2013).
1.1.1 Leishmaniose Visceral
A forma viscerotrópica tem ampla distribuição, ocorrendo na Ásia, Europa, Oriente Médio, África e Américas. Na América Latina, é denominada leishmaniose visceral americana (LVA) ou “calazar” neotropical, tendo como agente causal a Leishmania (Leishmania) infantum chagasi (Cunha e Chagas, 1937), que já foi isolada em pelo menos 12 países, sendo 90% dos casos no Brasil, especialmente na Região Nordeste (Brasil, 2007). O registro do primeiro caso da doença no Brasil ocorreu em 1913, quando Migone, no Paraguai, descreveu o caso em material de necrópsia de paciente oriundo de Boa Esperança, Mato Grosso (Alencar et al. 1991). A partir de um estudo realizado para o diagnóstico e distribuição da febre amarela no Brasil, foram encontrados 41 casos positivos para Leishmania, identificados em lâminas de viscerotomias praticadas post-mortem, em indivíduos oriundos das regiões Norte e Nordeste (Penna, 1934).
A transmissão da LVA no Brasil é atribuída ao flebotomíneo Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis. Lutzomyia cruzi tem sido considerado como vetor secundário no estado de Mato Grosso do Sul, entretanto na região Amazônica apenas Lu. longipalpis é considerado transmissor (Brasil, 2007).
Na região Norte, atualmente, além da urbanização e da periurbanização, a LVA apresenta um novo caráter reemergente no mundo. Com o advento da Síndrome da Imunodeficiência Humana (AIDS/SIDA), a LVA tornou-se uma doença oportunista, com mudanças importantes no padrão epidemiológico da LVA, onde pacientes HIV positivos podem atuar como reservatórios da doença (Ashford, 2000; Dejeux,1999; Hailu et al.,2005).
1.1.2 Leishmaniose Tegumentar Americana
A forma dermotrópica ou Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença infecciosa, não contagiosa, causada por diferentes espécies de Leishmania, que primariamente, é uma infecção zoonótica de mamíferos silvestres, entretanto o ser humano pode ser envolvido secundariamente, acometendo a pele (forma cutânea) e nasobucofaríngea (forma cutâneo-mucosa) (Raso & Genaro, 1994).
No Brasil, a LTA é uma das afecções dermatológicas que merece mais atenção, devido sua magnitude, assim como pelo risco de ocorrência de deformidades que pode produzir no
ser humano, e também pelo envolvimento psicológico, com reflexo no campo social e econômico, uma vez que, na maioria dos casos, pode ser considerada uma doença ocupacional. A LTA apresenta ampla distribuição com registro de casos em todas as regiões brasileiras. É uma doença com grande diversidade de agente etiológico, de reservatórios e de vetores que apresenta diferentes padrões de transmissão e um conhecimento ainda limitado sobre alguns aspectos, o que a torna de difícil controle (Brasil, 2007).
No início do século passado, a LTA era conhecida pelo seu caráter ocupacional, acometendo trabalhadores associados a atividades de desmatamento, sendo uma zoonose rural e o homem hospedeiro acidental do protozoário. Hoje, ocorre de forma endêmica em áreas de colonização, sem caráter ocupacional, com o ciclo de transmissão zoonótico associado a animais domésticos ou sinantrópicos. Desde então, a transmissão da doença vem sendo descrita em vários municípios de todas as unidades federadas (Tolezano, 1994).
Nas últimas décadas, as análises epidemiológicas da LTA têm sugerido mudanças no padrão de transmissão da doença, inicialmente considerada zoonoses de animais silvestres, que acometia ocasionalmente pessoas em contato com as florestas. Posteriormente, a doença passou a ocorrer em zonas rurais, já praticamente desmatadas, e em regiões peri urbanas. Observa-se a existência de três perfis epidemiológicos: 1- silvestre em que ocorre a transmissão em áreas de vegetação primária; 2- ocupacional ou lazer em que a transmissão está associada à exploração desordenada da floresta e desmatamento para construção de estradas, extração de madeira, desenvolvimento de atividades agropecuárias e ecoturismo; 3- rural ou peri urbana - em áreas(Brasil, 2007).
Na década de 90 a região Nordeste liderava em casos de LTA, porém após vinte anos esta situação foi modificada, e a Região Norte passou a ter maior número de casos, superando todas as outras regiões do país, devido os grandes desmatamentos e assentamentos desordenados na periferia das cidades e interior da floresta (Sinavan, SVS/MS) (Figura1).
Figura 2- Prevalência de LTA no Estado do Pará. Em destaque, municípios sem casos da doença. Fonte: Leishmaniose/DCDTV/SESPA 2011.
Em levantamento realizado pela Secretaria de Estado de Saúde do Pará (SESPA) no período de 2007 a 2010, constatou-se que dos 144 municípios apenas 4 não possuíam registro de LTA (Chaves, Santa Cruz do Arari, Quatipuru, e Peixe Boi), possivelmente por falta de investigação e notificação (Sinavan,SVS/MS, 2011) (Figura 2).
Figura 1 – Distribuição da LTA nas diversas regiões do Brasil, em 1990 e 2009. Fonte: Sinavan/SVS/MS Muito alto Alto Médio Baixo Sem registro
1.1.3 Situação da LTA na Região Metropolitana de Belém-PA
Na Região Metropolitana de Belém os casos autóctones de LTA vêm crescendo consideravelmente nos últimos anos. No período de 1995 a 2010 (15 anos), foram atendidos em Belém e Ananindeua pelo Laboratório de Leishmaniose do IEC 48 casos, sendo que 27 destes foram oriundos da capital do Estado (Sales et al., 2011). De janeiro de 2011 até dezembro de 2012, foram registrados mais 9 casos da doença. Fonte: Laboratório de Leishmaniose do IEC, dados não publicados. (Figura 3).
Figura 3 - Municípios de ocorrência da LTA, segundo a procedência dos pacientes atendidos no Laboratório de Leishmanioses do IEC, em Belém e sua região metropolitana, no período de janeiro de 1995 a dezembro de 2010. Fonte: Adaptado de (Sales et al., 2011).
Destes casos registrados na referida região, os bairros e distritos com maior número foram Souza, Mosqueiro, Icoaraci (Belém) e Aurá (Ananindeua) Sales et al; 2011 (Figura 4).
1.2 FLEBOTOMÍNEOS VETORES DE Leishmania
No ano de 1922, Aragão pela primeira vez, demonstrou o papel dos flebotomíneos na transmissão da LTA no Brasil. Após 36 anos Forattini (1958) encontrou roedores silvestres parasitados em áreas florestais do Estado de São Paulo (Aragão,1922; Forattini, 1958; Brasil, 2007).
No novo mundo, os flebotomíneos envolvidos na transmissão das leishmanioses são insetos pertencentes à ordem Diptera, família Psychodidae, sub- família Phlebotominae e gênero Lutzomyia França, 1924. São conhecidos popularmente, dependendo da localização geográfica, como mosquito-palha, tatuquira, birigui, cangalhinha, fleboti entre outros (Tormen & Nascimento, 2006).
O gênero Lutzomyia, além de transmitir os agentes etiológicos das leishmanioses, também é implicado na transmissão de bactérias (Bartonella bacilliformis) e vírus (Phlebovirus, Orbivirus) (Killick-Kendrick, 1979; Young & Duncan, 1994).
A riqueza e abundância de espécies de diferentes grupos apresentam padrões distintos de distribuição. Algumas espécies são restritas ao ambiente silvestre e outras registradas em áreas profundamente alteradas pela ação humana. Os impactos ambientais decorrentes de ações antrópicas ao longo dos anos vêm alterando o hábitat dos flebotomíneos e com isso
Figura 4 - Bairros do município de Belém e Ananindeua onde ocorreram casos de LTA atendidos no Laboratório de Leishmanioses do IEC, no período de janeiro de 1995 a dezembro de 2010. Fonte: (Sales et al., 2011).
aumentando o risco para a transmissão de leishmanioses em virtude da adaptaçãode algumas espécies ao ambiente modificado(Rangel & Lainson, 2003).
Na região Amazônica, diversas espécies merecem destaque na transmissão das leishmanioses, sendo quatro do subgênero "yssomyia: Lutzomyia ("yssomyia) umbratilis Ward e Fraiha, 1977 e Lu. (".) anduzei Rozeboom, 1942, vetoras de Leishmania (Viannia) guyanensis Floch, 1954 (Lainson & Shaw, 1968; Arias & Freitas, 1978) e, Lu. (".) flaviscutellata Mangabeira, 1942 e Lu. (".) olmeca nociva Young e Arias, 1982, vetoras da L. (Leishmania) amazonensis Lainson & Shaw, 1972 (Ward et al., 1977).
A Serra dos Carajás, localizada no sudeste do Estado do Pará, Brasil, apresenta uma rica floresta tropical, onde são encontradas quatro espécies de Leishmania sp. de interesse médico-veterinário, cuja transmissão é feita pelos flebotomíneos: Lu. wellcomei Fraiha, Shaw e Lainson, 1971 , Lu. ubiquitalis, Lu. whitmani Antunes & Coutinho, 1939 e Lu. flaviscutellata Mangabeira, 1942. Em virtude da chegada de imigrantes no entorno do projeto Carajás, foi realizado estudo pela equipe do Laboratório de Leishmaniose (entomologia) do IEC para avaliar a fauna de flebotomíneos e sua provável participação na transmissão da leishmaniose tegumentar americana (LTA). Os achados da pesquisa demonstraram a grande diversidade e riqueza na região, num total de 69 espécies identificadas pertencentes a três gêneros: Psychodopygus, Lutzomyia e Brumptomyia. Logo, fica clara a importância da Serra dos Carajás como um dos maiores cenários mundiais de espécies primitivas de flebotomíneos (Souza et al., 2010).
No município de Belém já foram realizadas algumas investigações em bolsões de mata primária por equipes de entomologia do Museu Paraense Emilio Goeldi em parceria com o IEC nas quais foram encontrados os vetores Lu. flaviscutellata, Lu. antunesi, Lu. paraensis e Lu. Ayrozai (Ferreira & Gorayeb, 2010).
1.2.1 Ciclo biológico de flebotomíneos
O desenvolvimento biológico dos flebotomíneos é completo e compreende as fases de ovo, larva, pupa e adulto (Figura 5).
Figura 5- Formas imaturas de flebotomíneos: ovo (A), larva (B) e pupa (C). Formas adultas de flebotomíneos: fêmea (D) e macho (E).
Fonte: Laboratório de Leishmanioses. IEC
1.2.1.1. Ovos
Os flebotomíneos possuem ovos alongados e elípticos, ou encurvados medindo 300 a 500 µm de comprimento. Sua coloração é clara após a oviposição, porém escurecem após algumas horas (Marcondes, 2001).
1.2.1.2. Larvas
As larvas passam por quatro estádios, possuem aspecto vermiforme e apresentam peças bucais mastigadoras bastante ativas. As larvas de flebotomíneos são ativas, terrestres e saprófagas, se deslocando com rapidez em busca de alimento, sendo essa uma das razões pela
A B C
qual os criadouros naturais dos flebotomíneos são difíceis de serem encontrados. Estes fatos contribuem para a dificuldade no controle das leishmanioses, ao se considerar ações direcionadas ao vetor (Sherlock, 2003).
1.2.1.3. Pupas
As pupas não se alimentam e não se locomove, esta fase evolutiva libera uma substância que permite a mesma aderir ao substrato até o término de seu desenvolvimento. A estrutura da pupa é divido em cefalotórax, com duas asas e abdome (Sherlock, 2003).
1.2.1.4. Adultos
Medem de 3 a 4 mm de comprimento e possuem colorações diversas. Quando os adultos estão em repouso, mantêm as asas semi-eretas em relação ao corpo. O dimorfismo sexual é nítido entre machos e fêmeas, porém a distinção entre os sexos é feita com base, primeiramente, na genitália masculina constituída por estruturas com formas de ganchos que são encontradas no final do abdome. A parte abdominal da fêmea possui aspecto mais robusto e com cerdas pouco desenvolvidas, flebotomíneos machos não são hematófagos, mas as fêmeas necessitam realizar o repasto sanguíneo para o desenvolvimento dos ovos (Marcondes, 2001).
A maior ocorrência destes vetores é nos meses quentes e chuvosos para algumas espécies, e nos meses quentes e secos para outras (Forattini, 1973). A colonização de flebotomíneos no laboratório é utilizada como ferramenta vital para diversas pesquisas na área da biogenética, bioquímica e biologia molecular, o que aumenta ainda mais sua importância no mundo sanitarista (Sherlock, 2003).
Algumas espécies de flebotomíneos têm sido descritas como importantes vetoras de leishmanioses, com base em evidências como grau de antropofilia, infecção natural por Leishmania spp. (Lainson & Rangel, 2005).
1.2.2 Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis Lutz e eiva, 1912
É o principal vetor da LVA no Brasil. Possui habito preferencialmente silvestre, contudo está se urbanizando em consequência das ações antrópicas sobre o ambiente (Lainson & Rangel, 2003). É possível verificar a presença deste flebotomíneo nos domicílios e peridomicílios, tais como: casas de cães, galinheiros e chiqueiros ao longo das estradas que cortam a floresta (Lainson & Rangel, 2005; Dias et al., 2007).
Essa versatilidade, no que diz respeito à adaptação a novos ambientes, pode ser esclarecida pelo hábito alimentar eclético da espécie. O Lu. longipalpis usa o homem e animais domésticos tais como cães, galinhas e outros como fonte de alimentação e animais silvestres como raposas, roedores e gambás (Lima et al., 2003). Estudos utilizando precipitina para analisar o conteúdo intestinal do vetor mostraram que dentre esses vertebrados, as aves seguidas do homem e do cão são as mais procuradas pelo Lu. longipalpis para o repasto sanguíneo. Embora as aves sejam refratárias à infecção por L.(L.) infantum chagasi, desempenham um papel atrativo para o vetor. Portanto, têm grande importância epidemiológica na manutenção da LVA considerando que o vetor, ao circular no peridomicílio, atraídos por esses animais, entra em contato com reservatórios como os cães (Dias et al., 2003).
1.2.3 Lutzomyia (yssomyia) flaviscutellata Mangabeira, 1942
Na década de 40 Mangabeira e colaboradores em estudos pelo interior do Brasil, coletaram 57 diferentes espécies de flebotomíneos, perfazendo um total de 17 mil exemplares. Dentre estas espécies 35 eram novas, sendo descritas por Mangabeira, Lutzomyia flaviscutellata teve sua descrição com base em machos coletados na localidade denominada Aurá, no município de Belém, estado do Pará. Após 20 anos, Sherlock e Carneiro fizeram a associação dos sexos, a partir de espécies provenientes do estado da Bahia, e descreveram a fêmea dessa espécie (Fraiha & Ryan, 1986).
Lu. flaviscutellata é o vetor responsável pela transmissão de L. (L.) amazonensis que causa a forma clínica anérgica difusa da leishmaniose cutânea. Contudo, merece destaque o papel de Lu. flaviscutellata como mantenedor do ciclo enzoótico do parasito na natureza.
Além de sua ampla distribuição geográfica, pode ser encontrado em diferentes habitat. (Rangel & Lainson, 2003).
1.2.4 Lutzomyia (yssomyia) antunesi Coutinho, 1939
É uma espécie considerada altamente antropofílica, podendo ser capturada principalmente em troncos de árvores ocadas, tocas de animais, por meio de armadilhas luminosas CDC e eventualmente em armadilha de Shannon (Ryan, 1986).
E o provável vetor de Leishmania (Viannia) lindenbergi (Silveira et al. 2002), que é o mais novo agente de LTA, descoberto no Estado do Pará.
A L (V.) lindenbergi, foi isolada de casos de leishmanioses cutânea entre soldados do 2º. Batalhão de Infantaria de Selva (2 BIS), localizado em Belém, Estado do Pará, que adquiriram a infecção durante atividades militares próximas à área de floresta primária. Seu vetor e reservatório naturais ainda não são conhecidos, contudo suspeita-se que flebotomíneos da espécie Lutzomyia antunesi sejam seu provável vetor, devido a grande quantidade de exemplares capturados no local onde a infecção ocorreu (Silveira et al., 2002).
1.2.5 Lutzomyia (Psychodopygus) davisi Root, 1934
Lutzomyia (Psychodopygus) davisi, é um vetor de hábitat e comportamento diferenciado. Em estudos realizados em Rondônia, durante o período de 1997 a 2000, Gil et al. (2003), utilizando armadilhas luminosas tipo CDC e Shannon, registraram a presença dessa espécie com maior densidade no solo quando comparado com a captura em copa. Entretanto, estudos realizados por Azevedo et al. (2002) no Estado do Mato Grosso demonstrou que a maior densidade de Lu. davisi foi capturada na copa.
Pode-se considerar, ainda, que a espécie Lu. davisi é de grande importância epidemiológica. Em estudos de levantamento de fauna flebotomínica realizados na Serra dos Carajás – PA, entre dezembro de 2005 e setembro de 2007, foram capturados 2.433 exemplares desta espécie, dos quais, 4 (0.16%) foram encontrados com infecção natural por
flagelados, sendo dois caracterizados através da técnica de anticorpos monoclonais específicos como Leishmania (V.) braziliensis (Souza et al., 2010).
1.2.6 Lutzomyia (Psychodopygus) ayrozai Barreto e Coutinho, 1940
Lutzomyia ayrozai é reconhecida como uma espécie altamente antropofílica na região montanhosa do sudeste do Brasil (Aguiar & Soucassaux, 1984), com maior frequência nos meses quente e úmidos, diminuindo sua densidade nos meses frios e secos. Sua distribuição geográfica no Brasil ocorre no Estado do Pará e mais 11 estados e oito países da América Latina.
Lu. ayrozai foi sugerida como transmissora de Leishmania (Viannia) naiffi, isolada de pacientes nos estados do Amazonas e do Pará, embora alguns autores tenham observado que esses flebotomíneos possuem baixa antropofilia, no Estado do Pará. Entre os reservatórios naturais do parasita estão incluídos os tatus (Dasypus novemcintus Linnaeus, 1758) (Lainson et al., 1994; Lainson & Shaw, 1998).
1.2.7 Lutzomyia (Psychodopygus) paraensis
Esta espécie foi descrita por Costa Lima, em 1941, a partir de um exemplar de macho coletado em Belém, Pará. A distribuição geográfica no Brasil é conhecida nos estados do Amapá, Amazonas, Pará, Rondônia, Roraima. Nos demais países da América Latina, já foi catalogado na Colômbia, Equador, Peru, Venezuela e Guiana Francesa (Aguiar & Medeiros, 2003).
Estudos sobre a biologia de Lu. paraensis foram desenvolvidos em Monte Dourado, norte do Pará. No levantamento da fauna flebotomínica, os autores perceberam que esses espécimes estariam fazendo hematofagia noturna e apresentavam pouca atividade antropofílica devido a baixa atividade noturna do homem nesta região (Lainson et al., 1979).
Pesquisas realizadas também no norte do Brasil, em 1985, revelaram infecção natural por Leishmania em Lu. paraensis, em exemplar coletado com isca humana e registraram que os flagelados encontravam-se no intestino médio dos flebotomíneos recém-alimentados (Arias
et al., 1985). Em seguida em 1991, Lu. paraensis foi encontrada com infecção natural por L.(V.) naiffi Silveira et al., (1991) no município de Benevides, Pará.
Segundo Lainson e Shaw (1998), Lu. paraensis, provavelmente, estaria envolvida na transmissão para o homem de L.(V.) naiffi, juntamente com Lu. ayrozai, não só pela sua antropofília como também pelos achados de infecção natural.
2. JUSTIFICATIVA
O conhecimento sobre a fauna flebotomínica de um determinado local é de grande importância para a saúde pública devido a capacidade de algumas espécies serem transmissoras de patógenos. As novas instalações do Instituto Evandro Chagas (IEC), Campus II, estão sediadas na Rodovia BR-316, Km 07, município de Ananindeua-Pará, onde são encontrados bolsões de mata primária similares a outros localizados na periferia do município de Belém e no próprio município de Ananindeua, que apresenta alguns casos de leishmaniose cutânea diagnosticados pelo Laboratório de Leishmanioses do IEC. A etiologia destes casos tem sido associada, principalmente, à Leishmania (V.) lainsoni Silveira et al., 1987; L. (V.) lindenbergi Silveira et al., 2002; L. (L.) amazonensis Lainson & Shaw, 1972 (Sales et al., 2011).
Deste modo torna-se imprescindível que se façam investigações epidemiológicas na referida área sob o risco de transmissão de leishmanioses. Portanto, o conhecimento da fauna flebotomínica e a investigação de infecção natural contribuirá para o melhor entendimento da eco-epidemiologia da LTA na região metropolitana de Belém.
3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL
- Avaliar importância epidemiológica da fauna transmissora de leishmanioses em fragmento florestal no município de Ananindeua - PA.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Identificar a fauna flebotomínica da área de abrangência do campus II do IEC - Verificar a presença de espécies sabidamente vetores de agentes das leishmanioses humanas, tegumentar ou visceral;
- Comparar os índices de diversidade, dominância e equitabilidade entre as diferentes formas de coleta utilizadas;
- Determinar a taxa de infecção natural de fêmeas dissecadas;
- Caracterizar o padrão de infecção natural de acordo com o desenvolvimento do parasita no trato digestivo dos vetores;
- Determinar a frequência mensal dos flebotomíneos, com ênfase às principais espécies vetoras capturadas na área e comparar com o índice pluviométrico;
- Realizar isolamento de Leishmania spp. por inoculação em meios de cultura hamster;
- Caracterizar os parasitos isolados utilizando anticorpos monoclonais.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 TIPO DE ESTUDO
Foi realizado um estudo descritivo, longitudinal de abordagem quantitativa.
4.2 ÁREA DE ESTUDO
Área de mata primária do campus II do Instituto Evandro Chagas (S - 1.377021, W - 48.381611) com dimensões aproximadas de 19,3 hectares. Faz parte da área metropolitana de Ananindeua, sendo recoberta por resíduos florestais remanescentes da Floresta Tropical Úmida Amazônica, em sua maior parte constituída de mata primária (Figura 6, anexo 1).
Figura 6- A: Campus II do Instituto Evandro Chagas com destaque para a área de trabalho e posição de armadilhas luminosas. B: Localização do município de Ananindeua, onde está situado o campus II do IEC, no Estado do Pará e no Brasil. Fonte: Adaptado de www googlemap.com.br
4.3 CAPTURA DE FLEBOTOMÍNEOS
4.3.1 Comparação entre as diferentes armadilhas
Com o objetivo de comparar a atratividade e a composição faunística capturada por diferentes armadilhas, foram realizadas capturas com armadilhas de luz tipo CDC e Shannon (Figura 7) nos três primeiros meses do trabalho (outubro, novembro e dezembro/ 2010). As mesmas foram realizadas, utilizando 4 armadilhas ao nível do solo a 1m de altura e 2 armadilhas na copa de árvores a 20 m do solo, no horário de 18:00 às 6:00 h, durante 3 vezes por semana, em 27 noites, totalizando 324 horas trabalhadas.
Figura 7 – Armadilhas para captura de flebotomíneos: Armadilha tipo Shannon (A) e CDC (B). Fonte: Laboratório de Leishmanioses. IEC
As capturas com armadilha de Shannon foram realizadas no horário de 18:00 às 20:00 h durante 7 noites, totalizando 14 horas de trabalho.
O espaçamento entre os grupos de armadilhas foi de aproximadamente 30 m e a distância entre a armadilha posicionada mais próxima da área residencial foi de 25 m.
4.3.2 Determinação da frequência mensal de flebotomíneos
Com objetivo de verificar a frequência mensal das principais espécies capturadas, foram realizadas 3 capturas semanais com 6 armadilhas luminosas (CDC copa, n=2 e solo, n= 4) durante o intervalo de 13 meses ininterruptos (outubro de 2010 a outubro de 2011).
4.4 TRIAGEM DE ESPÉCIMES E PROCESSAMENTO DO MATERIAL DE CAMPO Os flebotomíneos capturados nas armadilhas de CDC foram retirados com ajuda de aspiradores de Castro manuais, devidamente identificados, levados ao laboratório e mantidos a uma temperatura de 4ºC para diminuição do metabolismo e mobilidade.
Inicialmente foram preparadas três “cubetas” de vidro, com as sequintes finalidades: a primeira com água destilada e sabão neutro para remoção das cerdas, a segunda com solução de Cloreto de Sódio (NaCl) a 0,9% para retirar o sabão e a terceira com solução salina estéril com antibiótico (gentamicina 0,04 mg/mL ) e fungicida ( 5 – fluorocytosine 10mg/mL) para desinfecção (apêndice 1). Após isso os flebotomíneos foram separados em machos e fêmeas em cubetas separadas. Em cada cubeta foi usado um pincel de seda nº 4 para fazer movimentos lentos e circulares para transferir os insetos para as cubetas seguintes. Posteriormente foram lavados com sabão neutro diluído com solução salina a 0,9%. Em seguida foram lavados duas vezes com solução salina para eliminar o excesso de sabão.
4.5 IDENTIFICAÇÃO TAXONÔMICA DAS FÊMEAS
Para identificação dos flebotomíneos, foi utilizada classificação de Young e Duncan (1994) e chave de Ryan (1986), com base na morfologia externa (coloração) e interna (espermatecas e cibário), com lente ocular 10/23 e microscópio micrométrico (Zeiss) com lente objetiva obtendo 400X. Os espécimes identificados foram registrados em ficha de campo padronizada conforme rotina do laboratório (anexo 2).
No caso de dúvida quanto a identificação em solução salina, foi realizada montagem entre lâmina e lamínula em líquido de Berlese (G.B.I. laboratoires), de acordo com a técnica adaptada de Ryan (1986). Na lâmina foram colocadas duas gotas de berlese; nos quais, foi
montada a espermateca extraída na dissecção. O material foi coberto com lamínula de vidro e levado ao microscópio óptico bacteriológico para identificação. O tempo para a manipulação das lâminas após a montagem foi de no máximo 12 horas. As lâminas foram mantidas na horizontal, enquanto sucessivas complementações do berlese que secava com o passar do tempo entre a lâmina e a lamínula conferiria qualidade à preparação.
As lâminas montadas foram identificadas com os seguintes dados dos exemplares: data, localidade, sexo, método de captura, e espaço resevado para a rubrica do identificador.
4.6 DISSECÇÃO DE FÊMEAS
Para verificação da taxa de infecção natural, foi utilizada a metodologia adaptada de Ryan et al (1987). Com auxílio de microscópio estereoscópico (Zeiss 2000-C) as fêmeas triadas foram colocadas em lâmina para microscopia 26x76mm sobre uma gota de solução salina (NaCl 0,9%) e utilizando um par de pinças entomológicas nº 05 foram seccionadas para exposição do trato digestivo (Figura 8) e montagem do mesmo em outra gota de solução salina estéril com antibiótico sob lamínula 22/22mm.
Figura 8 - Trato digestivo de fêmea de flebotomíneo dissecada para pesquisa de infecção natural. Em detalhe, seta indicando sangue em processo de digestão na porção média. Aumento de 100X. fonte: Laboratório de Leishmaniose IEC.
A análise microscópica foi realizada em microscópio bacteriológico (Zeiss Axiostar) com aumento de 400X para visualização de possíveis parasitos e seus respectivos padrões de
desenvolvimento no trato digestivo do vetor para classificação subgenérica de acordo com Lainson e Shaw (1987).
4.7 IDENTIFICAÇÃO DE MACHOS
Após o processamento das fêmeas, os machos foram colocados individualmente em gotas de solução salina em uma lâmina para identificação em microscópio estereoscópico e/ ou bacteriológico. No caso de dúvida quanto a identificação, os mesmos procedimentos adotados para as fêmeas foram realizados, adaptando-se para os machos. Em seguida, o flebotomíneo foi posicionado horizontalmente sobre as gotas de liquido berlese colocados em lâminas, com as asas e pernas na vertical. Para os machos foi constituída uma coleção úmida em álcool 70% e os exemplares encontram-se depositados na Coleção de Flebotomíneos do Instituto Evandro Chagas (ColFleb - IEC).
4.8 CULTIVO DE PARASITOS
No caso das fêmeas infectadas, a lamínula que conferia cobertura ao material analisado foi extraída e o material proveniente do trato digestivo triturado com auxílio de pinças estéreis com adição de 0,1mL de solução salina com antibiótico. O homogenado foi aspirado por seringa de 1mL com agulha de 25 X 0,7 e inoculado em alíquota em três tubos de cultura previamente preparados com meio NNN Difco B45 (Figura 9).
Uma segunda alíquota do material foi inoculada nas patas traseiras de dois hamsters (Mesocricetus auratus) (0,05mL em cada). Os animais foram mantidos em observação no Biotério do Laboratório de Leishmanioses do IEC por 2 meses (primeiro animal) e 4 meses (segundo animal) para posterior eutanásia em câmara de CO2 e extração de biópsias de pele.
&
Figura 9 - Meio de cultivo in vitro e modelo animal para cultivo in vivo. A: Meio de cultura NNN, B: Mesocricetus auratus (hamster).
Fonte: Laboratório de Leishmaniose IEC.
Em ambos os casos (cultura direta e inoculação em hamster) os meios de cultura foram mantidos a 25ºC no Laboratório de Cultivo Celular e lidos semanalmente até o limite de 1 mês, prazo de descarte dos mesmos.
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para avaliação da fauna flebotomínica foram aplicados os testes estatísticos para cálculos dos índices de riqueza e abundância ao longo do ano por meio do software Past. Para verificar as diferenças entre as amostras, foi aplicado o teste qui quadrado.
A diversidade das espécies capturadas por armadilha foi calculada através do índice de Shannon com auxílio do software Past, versão 2.12 (Hammer et al., 2001),
H’=-sum((ni/n)ln(ni/n)), com H’ representando índice de diversidade, o número de taxa, n o número
de indivíduos (ni). A equitabilidade foi calculada com o valor da diversidade dividida pelo logaritmo do número de taxa.
A taxa de infecção foi dada pelo número de fêmeas infectadas dividido pelo número de fêmeas dissecadas multiplicado por cem.
5. RESULTADOS
5.1 FAUNA FLEBOTOMÍNICA
Durante os meses de outubro de 2010 a outubro de 2011, um total de 2675 indivíduos foram capturados, pertencentes a 24 taxa, sendo 23 identificadas até o nível de espécie (Tabela 1), distribuídos em 2 gêneros (sensu Young e Duncan), sendo 2 espécies de Brumptomyia e 22 de Lutzomyia. A razão sexual total entre machos e fêmeas foi de 1:2 (871:1804), considerada estatisticamente significante (p= 0,0001).
Tabela 1- Espécies capturadas e identificadas nas coletas de outubro de 2010 a outubro de x2011 no campus II do IEC, com as respectivas frequências de machos e fêmeas.
Espécies M F Razão sexual
M: F
Total %
Lutzomyia antunesi (Coutinho) 404 936 1: 2,3 1340 50.09 Lu longispina (Mangabeira Filho) 288 580 1:2 868 32.44
Lu. davisi (Root) 36 43 1: 1,1 79 2.95
Lu. rorotaensis (Floch e Abonnenc) 23 37 1: 1,6 60 2.24
Lu. furcata (Mangabeira Filho) 14 44 1: 3,1 58 2.16
Lu. sordellii (Shannon e Del Ponte) 22 34 1: 1,5 56 2.09
Lu. paraensis (Costa Lima) 27 25 1: 1 52 1.94
Lu. tuberculata (Mangabeira Filho) 11 30 1: 2,7 41 1.53 Lu. flaviscutellata (Mangabeira Filho) 8 29 1: 3,6 37 1.38
Lu. ayrozai (Barreto e Coutinho) 9 8 1,1: 1 17 0.63
Lu. aragaoi (Costa Lima) 9 6 1,5: 1 15 0.56
Lu. longipalpis (Lutz e Neiva) 3 8 1: 2,6 11 0.41
Brumptomyia sp. ♀ (França e Parrot) 10 0: 10 10 0.37
Ps. geniculata (Mangabeira Filho) 6 1 6: 1 7 0.26
Lu. gomezi (Nitzulescu) 5 0: 5 5 0.18
Lu. pilosa (Damasceno e Causey) 3 1 3: 1 4 0.14
Lu. trinidadensis (Newstead) 3 1 3: 1 4 0.14
Lu hirsuta (Mangabeira Filho) 1 2 1: 2 3 0.11
Lu. infraspinosa (Mangabeira Filho) 1 2 1: 2 3 0.11
Br.avellari (Costa Lima) 1 1: 0 1 0.03
Br. travassosi (Mangabeira Filho) 1 1: 0 1 0.03
Lu. dendrophila (Mangabeira Filho) 1 1: 0 1 0.03
Lu. monstruosa (Foch e Abonnenc) 1 0: 1 1 0.03
Lu carrerai (Barretto) 1 0: 1 1 0.03
100.00
Total 871 1804 1:2 2675
Lu. antunesi foi a espécie mais frequente (50,09%), sendo a maioria fêmea (936, razão sexual M: F= 1: 2,3). A segunda espécie em frequência foi Lu. longispina (32,44%), também com predominância de exemplares fêmea (580, razão sexual M:F= 1:2).
É válido ressaltar que as espécies de valor epidemiológico e suas respectivas frequências registradas nas capturas foram Lu. davisi (2,95%, razão sexual M:F= 1: 1,1), Lu. paraensis (1,94%, razão sexual M:F=1:1), Lu. flaviscutellata (1,38%, razão sexual M:F= 1: 3,6), Lu. ayrozai (0,63%, razão sexual M:F=1,1: 1) e Lu. longipalpis (0,41%, razão sexual M:F= 1: 2,6).
5.2 COMPARAÇÃO ENTRE AS DIFERENTES FORMAS DE CAPTURA
Considerando o esforço amostral entre as capturas realizadas de forma sistemática com três tipos de armadilha em três meses consecutivos do verão amazônico (outubro, novembro e dezembro de 2010), foi registrado um total de 1752 indivíduos, pertencentes a 20 espécies. Foi registrado um total de 1.146 exemplares (17 espécies) em capturas por CDC em solo, 380 (11 espécies) em capturas por CDC em copa, e 227 (10 espécies) em capturas de Shannon.
A espécie mais frequente para todas as armadilhas foi Lu. antunesi com 598 espécimes capturados em CDC de solo, 227 em CDC de copa e 180 em Shannon. Lu. furcata foi a espécie com maior frequência em armadilhas CDC copa (15 exemplares) do que em CDC solo (12).
Tabela 2- Flebotomíneos capturados em três meses consecutivos (outubro, novembro e dezembro de 2010) utilizando diferentes armadilhas (CDC solo, CDC copa e Shannon).
CDC solo CDC copa Shannon
Espécies M F M+F M F M+F M F M+F Total Lutzomyia antunesi 198 400 598 86 141 227 52 128 180 1005 Lu. longispina 168 284 452 24 100 124 1 27 28 604 Lu. furcata 1 11 12 4 11 15 1 1 2 29 Lu. tuberculata 7 13 20 3 3 1 1 2 25 Lu. paraensis 4 9 13 1 1 2 6 2 8 23 Lu. aragaoi 6 6 12 1 1 13 Lu. davisi 5 3 8 2 2 1 2 3 13 Lu. sordellii 4 7 11 11 Lu. rorotaensis 7 7 1 1 1 1 9 Lu. flaviscutellata 5 5 5 Lu. infraspinosa 1 1 1 1 2 Lu. longipalpis 2 2 2 Lu. trinidadensis 1 1 1 1 2 Lu. ayrozai 1 1 1 1 2 Lu geniculata 1 1 1 1 2 Br. travassosi 1 1 1 Lu. dendrophila 1 1 1 Lu. gomezi 1 1 1 Lu. monstruosa 1 1 1
Total por armadilha 396 750 1146 122 258 378 63 163 227 1752 M: machos, F: fêmeas.
As espécies de valor epidemiológico já comprovado e suas respectivas frequências foram: Lu. paraensis (13 em CDC solo, 2 em CDC copa e 8 em Shannon), Lu. davisi (8 em CDC solo 2 em CDC copa e 3 em Shannon), Lu. flaviscutellata (5 em CDC solo) e Lu. ayrozai (1 em CDC solo e 1 em Shannon) e Lu. longipalpis ( 2 em CDC solo).
Comparações da dominância, diversidade e equitabilidade foram realizadas entre os indivíduos capturados em CDC solo, CDC copa e Shannon e os respectivos resultados são expressos na Tabela 3. Ao comparar a dominância, percebeu-se que a espécie dominante (Lu. antunesi) manteve significante diferença entre as armadilhas utilizadas, sendo maior em Shannon (D: 0,6456). Quanto à comparação da diversidade de espécies, as únicas armadilhas que obtiveram significativo diferenças foram Shannon e CDC solo, em que esta última apresentou maior índice (H: 1,105). A equitabilidade não demonstrou diferença na comparação entre armadilhas.
Tabela 3- Comparação da dominância, diversidade e equitabilidade entre os indivíduos capturados pelos três tipos de armadilhas utilizadas no estudo.
CDC solo CDC copa Boot p(eq) Perm p(eq)
Taxa (S) 17 11 0,134 0,379
Indivíduos (n) 1146 378 0 0
Dominância (D) 0,4287 0,47 0,024* 0,02* Diversidade (H) 1,105 0,9723 0,064 0,059 Equitabilidade (J) 0,3901 0,4055 0,807 0,888
CDC solo Shannon Boot p(eq) Perm p(eq)
Taxa (S) 17 10 0,215 0,528
Indivíduos (n) 1146 227 0 0
Dominância (D) 0,4287 0,6456 0,001* 0,001* Diversidade (H) 1,105 0,7961 0,002* 0,001* Equitabilidade (J) 0,3901 0,3458 0,681 0,787
CDC copa Shannon Boot p(eq) Perm p(eq)
Taxa (S) 11 10 0,851 0,911
Indivíduos (n) 378 227 0 0
Dominância (D) 0,47 0,6456 0,001* 0,001* Diversidade (H) 0,9723 0,7961 0,078 0,073 Equitabilidade (J) 0,4055 0,3458 0,219 0,307 Valor de p calculado por bootstrap, em que 1000 permutações randômicas são realizadas no teste.
* Valores de p considerados estatisticamente significativo (≤ 0,05).
5.3 FREQUÊNCIA MÉDIA MENSAL DE FLEBOTOMÍNEOS CAPTURADOS X PRECIPITAÇÃO PLUVIOMÉTRICA
Durante os meses de outubro de 2010 a outubro de 2011, a frequência média mensal de flebotomíneos capturados foi de 205 exemplares/ mês, variando entre 749 (Nov 2010) e 31 exemplares (Set 2011) (tabela 2).
A precipitação pluviométrica máxima ocorreu nos meses de fevereiro, março e abril de 2011 e a mínima em agosto de 2011. No período em que ocorreu a máxima frequência de flebotomíneos (Nov 2010), a precipitação variou entre 22 e 58 mm. Observando as frequências dos meses de outubro de 2010 e deste mesmo mês no ano seguinte (2011), constata-se uma redução de 652 para 80 exemplares.
Figura 10- Frequência mensal de flebotomíneos capturados e precipitação pluviométrica na área de estudo, segundo a estação metereológica automática Belém (fonte: www.inmep.gov.br). Dados referentes ao intervalo de outubro de 2010 a outubro de 2011.
5.4 FREQUÊNCIAS MENSAIS DE ESPÉCIES DE INTERESSE EPIDEMIOLÓGICO
Dentre as seis espécies de valor epidemiológico capturadas na área de estudo, 3 foram monitoradas mensalmente durante outubro de 2010 a outubro de 2011. Lu. flaviscutellata e Lu. longipalpis, por terem comprovada importância epidemiológica na região, bem como Lu. antunesi, suspeito na transmissão de L. (V.) lindenbergi. Suas respectivas frequências mensais ilustradas na figura 11.
Observa-se predominância de Lu. antunesi em todos os meses, com média de 103 exemplares/ mês, sendo a frequência máxima encontrada em novembro de 2010 (465) e mínima em setembro de 2011 (10). Lu. flaviscutellata apresentou frequência média mensal de 3 exemplares/ mês e Lu. longipalpis 1,8.
Figura 11 – Frequências mensais de Lu. antunesi, Lu. flaviscutellata e Lu. longipalpis, três principais espécies de interesse epidemiológico registradas no estudo. Fonte: Laboratório Leishmaniose IEC.
5.5 PESQUISA DE INFECÇÃO NATURAL
Durante o período pesquisado, um total de 1804 fêmeas foram dissecadas para pesquisa de infecção natural. Somente 1 exemplar de Lu. rorotaensis foi encontrado naturalmente infectado com flagelados sugestivos de infecção por Leishmania spp. As demais espécies não apresentaram ocorrência de infecção. A taxa de infecção natural no estudo foi 0,05% .
Analisando microscopicamente o desenvolvimento do parasito no trato digestivo do vetor, observou-se um padrão peripilárico, o que sugeriu serem protozoários do subgênero Viannia.
Após 1 mês de consecutivas leituras do meio semeado, o mesmo foi descartado por ser considerado negativo. Os hamsters inoculados foram eutanasiados e biopsiados conforme técnica descrita, entretanto também não obteve-se sucesso no isolamento da amostra.
6. DISCUSSÃO
O município de Ananindeua é considerado o segundo mais populoso do estado do Pará. Embora emancipado da capital Belém desde a década de 40, seu grande desenvolvimento teve início na década de 70 com a construção industrial e residencial (Sales et al., 2011). O progressivo desenvolvimento de Ananindeua tem atraído populações de diversos municípios em busca de condições de moradia e emprego, levando a elevada taxa populacional e especulação imobiliária.
A supressão da vegetação primária em vista à ocupação desordenada tem levado a criação de fragmentos florestais localizados nas proximidades de núcleos urbanos ou empresas, como é o caso do campus II do IEC, que possui em seu terreno um fragmento de mata com condições de estabelecimento de um ciclo eco- epidemiológico para leishmanioses. Além disso, esta área é cercada por residências cujos proprietários criam animais domésticos como cães e gatos e rurais, como galinhas que podem ser potenciais fontes de repasto sanguíneas de dípteros hematófagos, como flebotomíneos (Missawa & Lorosa., 2008; Afonso et al., 2012).
Sobre a domiciliarização de flebotomíneos e a possibilidade de estabelecimento de um ciclo intra e/ou peridomiciliar, vários estudos mostraram riqueza e abundância de flebotomíneos em áreas antropizadas, como as observadas no presente estudo (Oliveira et al., 2011). Instalações mal planejadas e péssimas condições de moradia observadas em torno da área de estudo também são consideradas condicionantes ao estabelecimento de ciclo peridomiciliar,conforme destaca Vilela et al (2011).
Sobre aspectos ecológicos, o índice de diversidade calculado para os três tipos de armadilhas não mostrou diferença entre CDC copa e CDC solo. Entretanto a diversidade foi significante maior em CDC solo que em Shannon. Isto pode ser atribuído ao tempo de coleta, visto que algumas espécies podem ter hábitos em um horário diferente daquele estipulado para a captura com este tipo de armadilha (18- 20:00h). A recomendação do Ministério da Saúde é que as capturas de Shannon não ultrapassem as 22:00h (Brasil, 2007). Mesmo que o método utilize isca luminosa, do mesmo modo que as armadilhas CDC, em virtude do CO² emitido pelos capturadores, ainda que apropriadamente paramentados e protegidos faz da armadilha de Shannon visto a elevada captura de fauna antropófila.
A presença de algumas espécies relacionadas com a transmissão de LTA como Lu. flaviscutellata e Lu. paraensis em um bolsão de floresta cercado por área urbana pode indicar a possibilidade de adaptação destas espécies a ambientes antropizados, considerando os hábitos silvestres destes vetores (Lainson et al., 1994).
Lutzomyia antunesi chamou a atenção por ser a espécie mais frequente capturada neste estudo (50,1%) e mais dominante nas capturas de Shannon (D: 0,6456), considerando que esta espécie ocorre geralmente em baixa incidência (<1%) em bolsões de floresta cercado por áreas urbanas (Oliveira et al., 2011). Neste estudo, embora nenhuma infecção natural tenha sido verificada nesta espécie, trabalho anterior realizados na Ilha de Marajó (Pará) área endêmica de leishmaniose visceral mostraram que três espécimes de Lu. antunesi estavam infectados com flagelados de desenvolvimento suprapilárico, (Ryan et al., 1984).
Lutzomyia davisi parece ser uma espécie muito adaptada, uma vez que tem sido abundante em outros estudos de fauna flebotomínea (Gil et al., 2003; Rodrigues et al 2011). Além disso, Lu. davisi foi mais capturado em armadilhas CDC solo do que em CDC copa, diferentemente de Feitosa et al (2006) que observaram em duas áreas de floresta residual no município de Manaus, e a maioria dos espécimes em copa. Embora não tenha sido observada infecção natural, Lu. davisi pode ser considerado de importância epidemiológica, uma vez que outros pesquisadores capturaram exemplares naturalmente infectados com L. (V.) naiffi no estado de Rondônia (Gil et al., 2003) e com L. (V.) braziliensis no estado do Pará (Souza et al., 2010).
Lu. paraensis, está envolvido com a transmissão de L. (V.) naiffi até o momento somente nos estados do Pará e Amazonas (Rangel & Lainson, 2003). Esta espécie foi capturada naturalmente infectada com L. (V.) naiffi em Benevides, município com características ambientais muito semelhantes à Ananindeua e localizado 15,5 km a partir dele (Silveira et al., 1991). Além disso, infecção natural pelo mesmo parasita foi detectada em espécimes de Lu. paraensis em floresta primária da Serra dos Carajás (Pará) à 818 km de Ananindeua (Souza et al., 2010).
Outra espécie de importância epidemiológica capturada na área estudada foi Lu. flaviscutellata. Esta espécie ocorre em outros municípios paraenses próximos a Ananindeua como Barcarena e Bujaru sempre em áreas florestais (Souza et al., 2010; Oliveira et al., 2011). Embora Lu. flaviscutellata não seja considerado uma espécie antropofílica, é o
principal vetor de L. (L.) amazonensis, agente etiológico da leishmaniose cutânea anérgica difusa, forma grave da doença em que lesões mutilantes e infecções secundárias podem debilitar o paciente (Silveira et al., 2009).
Outra espécie importante, relacionada com a transmissão L. (V.) naiffi na Amazônia e capturada no campus II do IEC foi Lu. ayrozai (Rangel & Lainson, 2003). Esta espécie, mais freqüentemente capturada em floresta do que em área peridomiciliar (Guimarães et al., 2012), foi capturada em baixa freqüência (0,63%), e apenas em CDC solo. Estes resultados são semelhantes ao de Silva (2002) que capturarou baixa densidade de Lu. ayrozai (0,7%) do total da fauna, mas diferente dos encontrados por Marcondes (2001) na Mata Atlântica do estado do Paraná, onde Lu. ayrozai representou 55% da fauna local, sendo 54% distribuída no solo e 46% em copa de árvores.
Lu. trinidadensis Newstead, 1922 foi capturado tanto próximo ao solo quanto na copa de árvore. Apesar da baixa densidade (0,14%) esta espécie tem importância epidemiológica, já que alguns espécimes foram encontrados infectados naturalmente com flagelados em Carajás, no estado do Pará, Brasil (Souza et al., 2010) e em Barquizimeto, Venezuela (Bonfante- Garrido et al., 1990). Lu. trinidadensis foi capturado em municípios próximos ao de Ananindeua, como Barcarena (Oliveira et al., 2011) e Bujaru (dados não publicados), onde casos de LTA são registrados.
Além de vetores de LTA, registrou-se Lu. longipalpis, que é considerado o principal transmissor de leishmaniose visceral americana (LVA). Apesar de um pequeno número de espécimes terem sido capturados na área de estudo, sua presença é muito importante, pois a LVA tem ocorrido em muitos centros urbanos, como Santarém (PA), Corumbá (MS), Belo Horizonte (MG) , Araçatuba (SP), Palmas (TO), Três Lagoas (MS), Campo Grande (MS) e Cuiabá (MT) (Ribeiro et al., 2007; De Paula et al., 2008; Brasil, 2010). Deste modo, a presença de Lu. longipalpis em nossa área de estudo confirma a sua capacidade de adaptação em ambientes antrópicos.
Entre as espécies de importância epidemiológica, a frequência de fêmeas foi maiorb do que os machos. Este padrão de razão sexual também foi observada por Gil et al (2003) em ambientes degradados no estado de Rondônia. Resultados semelhantes foram observados por Rodrigues et al (2011), em Uberlândia, Minas Gerais. De acordo com os autores, este padrão é associado à luz e a disponibilidade de fonte de alimentação de sangue nas proximidades das
armadilhas. É bem provável que algumas armadilhas neste estudo tenham sido posicionadas, ainda que aleatoriamente, próximo a tocas de animais, o que pode ter favorecido a captura de fêmeas.
Neste estudo, observou-se uma freqüência irregular mensal da fauna de flebotomíneos, apesar de que a maioria dos espécimes tenha sido capturados no período de alta precipitação no município de Ananindeua. Esta observação de elevada precipitação e elevada população de flebotomíneos também foi observado por Jeraldo et al (2012), em Aracaju, Nordeste do Brasil.
No entanto, alguns espécimes de Lu. longipalpis e Lu. flaviscutellata foram capturados em junho, quando ocorreu baixa precipitação no município de Ananindeua. Jeraldo et al (2012) também capturou maior número de espécies anteriores no mesmo mês. Estes dados relativos à captura de Lu. flaviscutellata foram diferentes dos de Machado et al (2012) que observaram no município de Taquaruçu, Tocantins, Brasil, maior abundância das espécies durante o período chuvoso .
Lu. antunesi foi capturado principalmente na estação chuvosa. Estes dados corroboram com Molina et al, (2008) em floresta aluvial da Colômbia. Barros et al, (2000) mostraram resultados semelhantes em um estudo da fauna de flebotomíneos no estado do Maranhão, onde os autores encontraram a maioria dos espécimes durante o período de execução.
A grande incidência das Leishmanioses no estado do Pará, incluindo alguns municípios próximos à área de estudo (BRASIL, 2010) e a elevada frequência de espécies flebotomíneos vetores capturados destacam a necessidade de realizar estudos adicionais para complementar as informações sobre a fauna de flebotomíneos nesta área e em seguida, fazer a prevenção e controle das leishmanioses, considerando a presença de espécies de flebotomíneos de importância epidemiológica.
7. COCLUSÕES
- De 24 espécies que compõem a fauna da área estudada, Lu. antunesi foi a mais frequente em todas as capturas;
- As espécies de valor epidemiológico registradas foram: Lu. antunesi, Lu. paraensis, Lu. davisi, Lu. flaviscutellata, Lu. ayrozai e Lu. longipalpis;
- As armadilhas CDC solo apresentaram maior índice de diversidade de espécies capturadas;
- A armadilha de Shannon foi a que apresentou maior dominância de Lu. antunesi;
- A frequência mensal máxima de flebotomíneos ocorreu em novembro de 2010;
- A frequência mensal máxima de flebotomíneos ocorreu no período que antecede a máxima precipitação pluviométrica;
- Com o registro de flagelados no intestino de um exemplar de Lu. rorotaensis, a taxa de infecção natural do estudo foi de 0,05;
- A fauna transmissora presente na área de estudo mostra a necessidade de implementação de medidas preventivas e de controle com fim de proteger a população exposta no município de Ananindeua.
8. REFERÊCIAS
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