EFEITOS DO AMBIENTE NO CRESCIMENTO MICROBIANO

EFEITOS DO AMBIENTE NO

CRESCIMENTO MICROBIANO

Temperatura

pH

Disponibilidade de água

Irradiação

Aplicações no controlo dos microrganismos

(Agentes anti-microbianos físicos)

O crescimento microbiano depende da temperatura

de um microrganismo e consequências moleculares e fisiológicas para a célula

ra te , µ ; death Temperaturas cardeais do crescimento microbiano -T optima (T_opt); -T mínima (T_min); -T máxima (T_max)

Microrganismos agrupados em classes consoante a gama de temperaturas

de que necessitam para crescimento

Mesófilos – maior parte dos eucariotas e muitas bactérias; maior parte dos microrganismos patogénicos.

Psicrófilos – muitas bactérias marinhas; microrganismos terrestres em habitats gelados;

algumas espécies que contaminam e deterioram alimentos refrigerados.

Termófilos – p.ex. encontrados em fontes termais; em materiais sujeitos a compostagem , etc.

Hipertermófilos – p.ex. bactérias encontrados em fontes hidrotermais de origem vulcânica;

ADAPTAÇÕES MOLECULARES À TERMOFILIA e HIPERTERMOFILIA



Proteínas / enzimas estáveis a temperaturas altas (termoestáveis)

⇒

⇒

⇒

⇒



Membranas celulares

- maior proporção de ácidos gordos saturados face a insaturados

nos fosfolípidos da bicamada lipídica



Membrana plasmática (bactérias do domínio Archaea)

- hidrocarboneto isopreno / fitanilo; estrutura em monocamada lipídica (bifitanilo)



Síntese e acumulação de solutos compatíveis

no citoplasma

(ex. fosfato de di-glicerol; fosfato de di-inositol, etc.)

ADAPTAÇÕES MOLECULARES À PSICROFILIA



Membranas celulares

- maior proporção de ácidos gordos insaturados face a saturados

nos fosfolípidos da bicamada lipídica

ln N

= lnN

–

µ

.(t-t

)

N_t – número de células viáveis (sobreviventes)

presentes no instante t após início da exposição da população microbiana ao agente letal.

µ_m – taxa específica de morte da população microbiana (unidades: tempo-1₎

N₀– número de células viáveis presentes no início da morte exponencial



Quando a população é pura (células da mesma espécie) a cinética de morte

é exponencial

. Aplicado a alimentos – ex. leite, cerveja, sumos, etc.

Leite – 62,9ºC, 30 min (recipientes largos) - 71,5ºC, 15 seg (em tubagem)

- 140ºC, 1-3 seg (tubagem) →→→→ leite UHT (Ultra-high-temperature) • Reduz a carga microbiana (p.ex. microrganismos patogénicos; microrganismos

que podem causar a deterioração dos alimentos) NÃO ESTERILIZA









Esterilização

TRATAMENTOS TÉRMICOS (CALOR)

- Ex. Calor seco ou calor húmido (na autoclave)

(ver aulas sobre Técnicas básicas da microbiologia)









Pasteurização

- Tindalização

- Ex. na indústria alimentar – esterilização de alimentos proteicos enlatados (carne, feijão), para destruição de endósporos da espécie bacteriana Clostridium botulinum

Tempo de redução decimal, D

- Intervalo de tempo necessário para

matar 90% da população de um

dado microrganismo quando sujeita

à temperatura T

É uma medida (comparável)

da extensão da

morte térmica de uma

população microbiana

a temperaturas diferentes

D

= 40 min

D

=4 min

D

= 12 min

Efeito da temperatura na curva de sobrevivência duma população

de uma espécie microbiana mesófila

• Materiais a sujeitar a tratamento térmico (p.ex. alimento, material ou equipamento

clínico, etc.) podem conter populações microbianas mistas

•

Selecção da Temperatura









Necessário

comparar

as taxas de morte térmica

de microrganismos diferentes

a uma mesma temperatura

(

→

→

→

→

curvas de tempo de

morte térmica;

estabelecidas

com base em procedimentos

padronizados)

Comparação das curvas de tempo de morte térmica do microrganismo A (a) e do microrganismo B (b).

O crescimento microbiano depende do valor do pH extracelular

pH

Para cada microrganismo:

Neutrófilos – pH optimo ~ 6-8;

maior parte das bactérias; protozoários.

Acidófilos – pH óptimo entre 1 e 6;

- maior parte dos fungos (pH_opt~ 4-6); - diversas espécies bacterianas,

que podem ser encontradas em ambientes ácidos (p.ex. fluidos

gástricos, fontes termais ácidas, solos vulcânicos ácidos,

águas ácidas associadas a minas de pirites, vinagre, sumos de frutos, alimentos fermentados, etc)

Alcalófilos – pH óptimo entre 8,5-11,5

- bactérias encontradas em lagos e solos alcalinos, etc.

O crescimento microbiano depende da

quantidade de água disponível no meio extracelular

Água do mar

(3%p/v NaCl

≡

a

~ 0.98)

Lago salgado

Salina

a

– actividade de água

- é estimada com base na razão entre a Pressão de Vapor do ar em equilíbrio com um material (ou solução) e a Pressão de vapor do ar em equilibrio com água pura;

- valores variam entre 0 e 1 (água pura);

- concentrações altas de NaCl e de açucares ⇒_{valores baixos de a}

w

Maior parte dos microrganismos não

são capazes de crescer em meios com

a

< 0,980

Importância prática

- Industria alimentar:

A desidratação dos alimentos e a adição de de sal

ou açuçar são meios utilizados para conservar alimentos

(prevenção da contaminação e deterioração por microrganismos

Halófilos – necessitam da presença de

concentrações moderadas de sal -> 3-5%(p/v), correspondente a

a_w < 0,980; (p.ex. água do mar). Halotolerantes

Osmófilos – vivem em ambientes com elevada concentração de açucar, com

a_w< 0,90-0,95 (p.ex. certos fungos)

Halófilos extremos – requerem 15-30%

de sal, dependendo da espécie em causa; vivem em salinas e lagos salgados; podem contaminar e deteriorar carne e peixe salgados.

Contudo, alguns microrganismos estão adaptados a viver em

meios com actividade de água baixa (< 0.98)

ACÇÃO ANTI-MICROBIANA DA IRRADIAÇÃO

Radiação Ultra-Violeta, raios-X, raios-gama e electrões são formas de radiação electromagnética com energia suficiente para afectar o crescimento microbiano e/ou causar a morte celular.

RADIAÇÃO IONIZANTE

Fontes de radiação uteís para esterilização de materiais:

Isóptopos radioactivos

_Co,

_Cs

_{(emissão de radiação gama)}

Curva de sobrevivência de uma

população microbiana em função

da dose de radiação.

Dose de radiação decimal – D

(dose que causa a morte de

90% da população inicial

⇒

_{10% de sobreviventes)}

D

₁₀

 Energia suficiente para produzir iões e outras espécies moleculares reactivas a partir das moléculas com as quais colide.

P.ex., produz electrões e radicais OH _{e H} _com

potente acção oxidante (⇒ _{alteração e rotura de}

DNA e proteinas ⇒ _{morte das células)}

Em alguns casos, os danos no DNA podem ser reparados por mecanismos específicos

Dose de radiação decimal

difere de organismo para

organismo

Deinococcus radiodurans

Bactéria resistente a doses elevadas de radiação

Pensa-se que seja um bom modelo de organismos capazes

de viver no Espaço (ex. Marte) Causas possíveis:

- mecanismos de reparação do DNA numerosos e muito eficientes

- Genoma com muitas sequências repetidas de vários genes

Também usada na industria alimentar, embora menos frequentemente

(ex. na esterilização de especiarias, carnes frescas - hamburguer)

– Mutações letais (principalmente,

λ

~ 260 nm)

Radiação ultravioleta (UV)

RADIAÇÃO UV (

λ

~ 260 nm) COMO AGENTE MICROBICIDA

- Util na desinfecção de superfícies

(não penetra sólidos ou filmes opacos, vidros sujos, etc.)

- Câmaras de fluxo laminar de segurança biológica

Staphylococcus aureus biofilm on

a cathether

Photomicrograph of a DAPI-stained biofilm that

developed on a stainless steel pipe (note the water channels; DAPI is a florochrome that associates to DNA inside the cells)

A biofilm of iron-oxidizing prokaryotes on the surface of rocks in the iron-rich Rio Tinto, Spain. As Fe2+ _{rich water} passes over and through the biofilm, iron oxidizing

microrganisms convert Fe2+ _{to Fe}3+ _{to obtain energy.}

Confocal laser microscopy of a

natural biofilm that developed on a

Crescimento microbiano em biofilmes

Desenvolvimento de

biofilme

numa superfície

sólida

BIOFILME - Comunidade estruturada de células (constituida por 1 ou mais espécies

microbianas), aderentes a uma superfície inerte (abiótica) ou viva (ex. tecido vivo),

embebidas numa matriz de polissacárido de origem microbiana.

Papel importante

de processos de

comunicação

entre células

(“quorum-sensing”;

)

e do funcionamento

em consórcio

Prescott, Herley, Klein, Microbiology, 5th edition

• simple biofilm

(single microorganism)

mature biofilm

photoautotroph

facultative

aerobe

sulfate reducer

Associação de células microbianas em biofilmes confere-lhes: - Protecção relativamente a condições agressoras (irradiação; calor;

desidratação; desinfectantes; antibióticos, etc.)

- Protecção face a fagocitose por células do sistema imunitário de organismos infectados

VANTAGENS (célula)

Interacções com outros organismos

- Comunicação entre células (ex. “quorum-sensing”) - Troca de material genético (p.ex. plasmídeos)

Em ecossistemas aquáticos, mais de 99% das bactérias crescem em biofilme.

No microambiente associado a uma superfície sólida (inerte ou viva ou particula de

matéria orgânica), os níveis de nutrientes são mais altos do que na fase líquida.

Modo principal de crescimento microbiano em ambientes naturais húmidos

Degradação ou corrosão de superfícies inertes (ou vivas)

Virulência

Resistência a antibióticos antibacterianos / resistência a desinfectantes

Exploração para

fins industriais

- Tratamento de efluentes orgânicos; - Remoção de metais poluentes;

- Processo tradicional de produção de vinagre a partir de etanol pela bactéria Acetobacter spp)

CONSEQUÊNCIAS DA FORMAÇÃO DE BIOFILMES

Comunicação

intercelular

em populações

microbianas –

“Quorum Sensing”

“quorum sensing” –

proteínas dependentes de “quorum”; já identificado em bactérias Gram-negativas, Gram-positivas e microrganismos eucariotas.

Figure 6.19

Prescott et al, Microbiology, McGrawHill, 5th edition

HSLS –

- Homoserine Lactone Signal

(uma das moléculas sensoras Identificadas em

Bactérias Gram-negativas)

Alguns exemplos de regulação da expressão de proteínas por

“quorum-sensing”:

- promoção da formação de biofilmes (bactérias ambientais e bactérias

infecciosas)

- síntese e libertação de toxinas e factores de virulência por algumas

bactérias patogénicas

- Síntese de antibióticos por certas bactérias, no solo

- bioluminescência em bactérias marinhas, ex. espécie Vibrio

fisheri

(emissão de luz – subproduto da actividade da enzima luciferase)

NOTAS SOBRE EFEITOS DO AMBIENTE NO

CRESCIMENTO MICROBIANO

ADAPTAÇÕES MOLECULARES À TERMOFILIA



Proteínas e enzimas estáveis a temperaturas altas (termoestáveis)

(p.ex. substituição de um ou mais aminoácidos em alguns locais críticos da proteina, em

comparação com a correspondente proteína mesófila; maior número de ligações iónicas entre aminoácidos com carga + ou -; interior hidrófobo altamente compactado

⇒ _{maior resistência à desnaturação térmica)}

⇒

⇒

⇒

⇒



Membranas com maior proporção de ácidos gordos saturados, face a

ácidos gordos insaturados, nos fosfolípidos da bicamada lipídica

(em comparação com as membranas de microrganismos mesófilos)

- permite manter bicamada lipídica com fluidez óptima e propriedades funcionais

a temperaturas altas, ~ 55-75ºC (bicamadas lipídicas com composição típica de microrganismos mesófilos ficariam demasiado fluidas e permeáveis quando expostas a essas temperaturas)

– domínio Bacteria e algumas arqueobactérias (domínio Archaea)



Membranas ricas no hidrocarboneto isopreno; estrutura em

monocamada lipídica.

- permite manter fluidez da bicamada lipídica óptima e membrana funcional a temperaturas muito altas, ~80-110ºC

- em bactérias hipertermófilas – domínio Archaea



Síntese e acumulação de solutos compatíveis no citoplasma

(ex. fosfato de di-glicerol; fosfato de di-inositol, etc.)

- contribuem para estabilizar as proteínas face à degradação térmica - em bactérias termófilas e hipertermófilas

ADAPTAÇÕES MOLECULARES À PSICROFILIA



Proteínas e enzimas estáveis a temperaturas baixas

- diferenças a nível da estrutura secundária ⇒_{estrutura menos rígida, mais flexivel, no frio}

- diferenças a nível da composição

(maior número de resíduos polares, menos aminoácidos hidrófobos no interior da proteína ⇒ _{maior flexibilidade e maior estabilidade, no frio)}



Membranas com maior proporção de ácidos gordos insaturados face a

ácidos gordos saturados, nos fosfolípidos da bicamada lipídica

(e, em alguns casos, com ácidos gordos poli-insaturados)

(em comparação com membranas de microrganismos mesófilos e termófilos) - permite manter bicamada lipídica com fluidez óptima e funcional

a temperaturas baixas, ~ 5-10ºC (bicamadas lipídicas típicas de microrganismos mesófilos ou termófilos ficariam demasiado rígidas quando expostas a essas temperaturas)

Temperaturas de fusão dos ácidos gordos (a.g.)

>

>

Adaptação de certos microrganismos ao crescimento

em meios com baixa a

Normalmente, envolve a acumulação intracelular de solutos compatíveis,

isto é, solutos que não afectam negativamente os processos biológicos.

(O aumento da sua concentração no citoplasma permite aumentar a a_w intracelular, equilibrando-a com a a_wextracelular, evitando a desidratação da célula)

Por exemplo, à custa de:



síntese de polialcoois (ex. glicerol, sorbitol, ribitol), aminoácidos ou

açucares (e.g. Trealose)

(observada em diversas halobactérias e em fungos e em algumas microalgas)



Transporte activo do ião K

do meio extracelular para o citoplasma, o que

leva à sua acumulação intracelular

Exemplos de locais onde podemos encontrar biofilmes bacterianos:



Naturais

- na superfície de rochas/pedras imersas em ambientes aquáticos

- na superfície de folhas ou outros tecidos em plantas

- na placa dentária



Artificiais

- interior de canalizações

- superfície de implantes ou próteses artificiais no corpo humano

- superfície lentes de contacto

- superfície de instrumentos médicos

- superfície de recipientes e de equipamentos para processamento de alimentos

- na superfície de filtros percoladores

Microrganismos associados em biofilmes podem levar à destruição (degradação ou corrosão) de superfícies inertes ou vivas.

  

No ser humano, a variedade de infecções microbianas crónicas envolvendo formação de biofilmes é bastante significativa.

A formação de biofilmes por certas bactérias tem sido explorada para

fins

industriais.

Exemplos:

- Tratamento de efluentes orgânicos; - Remoção de metais poluentes;

- Processo tradicional de produção de vinagre a partir de etanol pela bactéria Acetobacter spp)

ALGUMAS CONSEQUÊNCIAS DA FORMAÇÃO DE BIOFILMES

(para as actividades humanas)