UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
ROBERTA NOGUEIRA CHAVES
EFEITO DA TEMPERATURA E DO TEMPO DE TRANSPORTE DE TECIDO OVARIANO SOBRE A VIABILIDADE DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS
CAPRINOS CULTIVADOS IN VITRO
FORTALEZA-CEARÁ Dezembro de 2007
ROBERTA NOGUEIRA CHAVES
EFEITO DA TEMPERATURA E DO TEMPO DE TRANSPORTE DE TECIDO OVARIANO SOBRE A VIABILIDADE DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS
CAPRINOS CULTIVADOS IN VITRO
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em Ciências Veterinárias do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias – Faculdade de Veterinária, da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade
Animal
Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de
pequenos ruminantes
Orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo
FORTALEZA-CEARÁ Dezembro de 2007
CDD: 636.39
1. Caprino. 2. Folículos pré-antrais. 3. Conservação. 4. Ultra-estrutura. I. Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) – Universidade Estaual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
Orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo. 96 p.; il.
Efeito da temperatura e do tempo de transporte de tecido ovariano sobre a viabilidade de folículos pré-antrais caprinos cultivados in vitro/ Roberta Nogueira Chaves. - Fortaleza, 2007.
Título: Efeito da temperatura e do tempo de transporte de tecido ovariano sobre a
viabilidade de folículos pré-antrais caprinos cultivados in vitro.
Autor: Roberta Nogueira Chaves
Defesa em: 20/12/2007
Conceito obtido: __________________ Nota obtida: ___________
Banca Examinadora
________________________________________________
Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo (Orientador) Universidade Estadual do Ceará
_________________________________________ Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda (Examinador)
Universidade Estadual de Londrina
_________________________________________ Prof. Dr. Claudio Cabral Campello (Examinador)
Universidade Estadual do Ceará
_________________________________________ Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva (Examinadora)
Aos meu pais, Francisco Araújo Chaves e Eurinice Nogueira Chaves À Kenio Patrício Lima de Oliveira, meu esposo, meu amor... Dedico.
AGRADECIMENTOS
Não, não é simples agradecer o que quero. Quero trazer para dentro do texto aqueles que já o percorrem nas entrelinhas. E não só aos que me ajudaram efetivamente na construção dessa Dissertação, mas aos amigos e colegas que partilham comigo idéias e sentimentos. Àqueles que me ajudaram de alguma forma, no meu percurso nesses quase dois anos e, principalmente, a seguir adiante, sem perder o que pulsa, o que vibra, agradeço imensamente.
Em especial, a Deus, pela proteção, força e coragem para enfrentar as dificuldades na vida pessoal e profissional. E por me inspirar a certeza que nada nesse mundo ocorre por acaso.
Ao meu esposo, Kenio Patrício Lima de Oliveira, pelo inestimável apoio familiar que preencheu as diversas falhas que fui tendo por força das circunstâncias. E pela paciência e compreensão reveladas ao longo desses meses, mas principalmente pelo amor e exemplo de companheirismo no sucesso e no fracasso, na alegria e na tristeza, na saúde e na doença, nestes anos de nossa vidas.
Aos meus pais, Francisco Araújo Chaves e Eurinice Nogueira Chaves, por terem sido contínuo apoio em todos estes anos, ensinando-me, principalmente, a importância da construção e coerência de meus próprios valores. Pelo estímulo e apoio incondicional desde a primeira hora, pela paciência com que sempre me ouviram, e sensatez com que sempre me ajudaram.
Aos meus familiares, em especial, aos meus irmãos (Francisco Hernandes Nogueira Chaves e Renata Maria Nogueira Chaves) pela oportunidade de compartilharmos experiências. E meus sogros (José Patrício de Oliveira e Iza Helena Lima de Oliveira) por me receberem na família e pela compreensão nos momentos difíceis.
À Universidade Estadual do Ceará (UECE) e à Faculdade de Veterinária (FAVET) por todos os anos de ensino e aprendizagem.
Ao Dr. José Ricardo de Figueiredo, professor e orientador, que devido sua excelência profissional conferiu prestígio e valor ao meu trabalho. Agradeço pela abertura de espírito revelada desde a primeira aula, que logo me abriu a porta que rapidamente me encaminharia para o tema tratado nesta dissertação. Pela disponibilidade revelada ao longo desses meses, pelas críticas e sugestões relevantes, pelo apoio moral e amizade.
Ao meu co-orientador, Dr. José Roberto Viana Silva, pelo apoio e ensinamentos dedicados durante o desenvolvimento desse trabalho.
Ao Professor Dr. Claudio Cabral Campelo, pela atenção e orientação no tratamento estatístico dos dados, que aliadas à doçura do trato confirmaram que a simplicidade é apanágio dos Grandes.
Ao Prof. Dr. Marcelo Seneda e a Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva, por terem gentilmente aceito o convite para participar da banca de defesa.
Às amigas Doutoras, Ana Paula Ribeiro Rodrigues, Liliam Mara Trevisan Tavares e Maria Helena Tavares de Matos, pelo exemplo de mulheres fortes e profissionais admiráveis.
À Dra. Sônia Nair Bào e sua equipe do laboratório de Ciências Biológicas, pela valiosa cooperação, atenção e acolhimento.
À Regiane Rodrigues dos Santos, pela disponibilidade e respostas “a velocidade da luz”, sempre acompanhadas de comentários estimulantes e sensatos.
À Michelle da Costa e Silva, Gerusa de Aquino Lima e Teresa Carla da Nóbrega, por terem sido e por serem, antes de tudo, amigas.Entre nós fica provado que as grandes amizades aguentam grandes desafios.
Aos meus amigos, Claudio Afonso Pinho Lopes, Juliana Jales de Hollanda Celestino, Márcia Viviane Alves Saraiva, por sempre estarem presentes em todos os momentos, pelas conversas e apoio. Para agradecer a aliança, a confiança e a amizade, as palavras serão sempre poucas.
Ao meu grupo de trabalho do LAMOFOPA, agradeço toda a colaboração que me prestaram, incentivo e companhia, especialmente, Fabrício Sousa Martins, Isabel Bezerra Lima-Verde e Valdevene Rocha Araújo. Ainda aos estudantes de iniciação científica que dedicadamente participaram nos vários momentos dos estudos expresso o meu reconhecimento e faço votos que consigam realizar todos os seus projetos de vida.
À minha amiga (para sempre estagiária) Janaína da Costa Correia, pelo desafio que aceitou de abordar, na teoria e na prática, a temática do desenvolvimento do estudante do ensino superior, mas também pelo alegre, carinhoso, prestável e gratificante relacionamento que construímos. E a Anelise Maria Costa Vasconcelos Alvesque apesar do pouco tempo, tenho convicção que teremos um belo caminho pela frente.
A todos os professores de graduação e do PPGCV, pelos ensinamentos e contribuição para minha formação.
Aos funcionários do PPGCV, em especial a Adriana Albuquerque e Cristina Sabóia do Nascimento que colaboraram nos bastidores desta operação aproveito para expressar o meu profundo agradecimento.
À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico – FUNCAP, pelo apoio financeiro imprescindível para viabilizar a realização desse trabalho.
“O rio atinge o mar porque aprendeu a contornar os obstáculos” André Luiz
RESUMO
O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da conservação de fragmentos ovarianos em diferentes temperaturas e tempos de conservação sobre a viabilidade e crescimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos após cultivo in vitro. Os ovários caprinos (n=10) foram obtidos de animais de abatedouro. Cada par ovariano foi dividido em 19 fragmentos. Um fragmento foi imediatamente fixado para histologia clássica e microscopia eletrônica de transmissão (controle fresco – dia 0). Os fragmentos restantes foram distribuídos em Meio Essencial Mínimo (MEM) e mantidos a 4, 20 ou 35°C por 2 ou 4 h. Após cada tempo de conservação, fragmentos (n=30) foram fixados (não cultivados), enquanto fragmentos (n=60) foram cultivados in vitro por 1 ou 7 dias a 39°C e 5% de CO2 em MEM suplementado. Após cada período de conservação e/ou
cultivo, os fragmentos foram submetidos à histologia clássica e microscopia eletrônica de transmissão a fim de avaliar a morfologia folicular. Após 7 dias de cultivo, somente os fragmentos ovarianos armazenados a 4°C por 4 h mantiveram o percentual de folículos morfologicamente normais equivalentes ao controle fresco (P>0,05). Observou-se que em todos os tratamentos ocorreu uma redução (P>0,05) no número de folículos primordiais e um concomitante aumento nos folículos em desenvolvimento, indicando ativação. Além disso, houve um aumento no diâmetro oocitário e folicular após o cultivo de córtex ovariano submetido à conservação na temperatura de 4 °C por 2 e 4 h. A microscopia eletrônica de transmissão confirmou a histologia clássica, mostrando que a conservação na temperatura de 4 °C por 4 h, 20 e 35 °C por 2 h ajudou a manter a integridade morfológica dos folículos pré-antrais caprinos após 7 dias de cultivo. Em conclusão, os fragmentos ovarianos caprinos armazenados a 4°C por até 4 h melhoram a viabilidade folicular durante transporte e aumenta o crescimento folicular durante cultivo in vitro.
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the effect of storing goat ovarian fragments in different temperatures and storage times on viability and growth of preantral follicles cultured in vitro. Caprine ovaries (n=10) were collected at slaughterhouse and each ovarian pair was divided into 19 fragments. One fragment was immediately fixed for classical histology and transmission electron microscopy (fresh control – day 0). Remaining fragments were distributed in Minimal Essential Medium (MEM) and maintained at 4, 20 or 35 ºC for 2 or 4 h. After each conservation period, fragments (n=30) were fixed (non-cultured), while fragments (n=60) were cultured in vitro for 1 or 7 days at 39 ºC and 5% CO2 in supplemented MEM. Follicular morphology was
evaluated at the end of both conservation and culture periods, by classical histology and transmission electron microscopy. After 7 days of culture, only ovarian fragments stored at 4 ºC for 4 h maintained the percentage of morphologically normal follicles similar to fresh control (P>0.05). In all treatments, a significant reduction (P>0.05) in the number of primordial follicles and a concomitant increase in the developing follicles was observed, indicating follicular activation. Additionally, there was an increase in oocyte and follicular diameter after culture of ovarian cortex that had been previously chilled at 4 ºC for 2 or 4 h. Transmission electron microscopy confirmed that ovarian fragments conservation at 4 ºC for 4 h, 20 and 35 °C for 2 h helps to maintain morphological integrity of caprine preantral follicles after 7 days of culture. In conclusion, goat ovarian fragments stored at 4 ºC up to 4 h keep follicular viability during transportation and increase follicular growth during in vitro culture.
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
A : Antro
AMH : Hormônio Anti-Mülleriano
APAF-1 : Fator ativador de protease apoptótica
ATP : Adenosina Trifosfato
Bcl : gene anti-apoptótico
BMP : Proteína morfogenética do osso BSA : Albumina sérica bovina
BrdU : Bromodesoxiuridina
Ca++ : Íon Cálcio
CAD : Caspase Dnase ativada
CE : Ceará
CG : Células da Granulosa
CGP : Células Germinativas Primordiais CO2 : Dióxodo de carbono
CT : Células da Teca
DF : Distrito Federal
DNA : Ácido Desoxirribonucléico EGF : Fator de crescimento epidermal FAVET : Faculdade de Veterinária
FGF : Fator de crescimento fibroblástico FOPA : Folículos Ovarianos Pré-Antrais FSH : Hormônio Folículo Estimulante
FUNCAP : Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico
GC : Granulosa Cells (Células da granulosa) GDF-9 : Fator de crescimento de diferenciação 9
GH : Hormônio do crescimentoo
h : Horas
HC : Histologia Clássica
ICAD : Inibidor de caspase ativada pelo DNA IGF-I : Fator de crescimento semelhante à insulina I ITS : Insulina, Transferrina, Selênio
K+ : Íon Potássio
KGF : Fator de crescimento keratinócito KL : Kit ligand
LAMOFOPA : Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais
LH : Hormônio Luteinizante
LIF : Fator inibidor de leucemia
m : Mitocôndria
MEM : Meio Essencial Mínimo
MEM+ : Meio Essencial Mínimo suplementado MET : Microscopia Eletrônica de Transmissão
mL : Mililitro
mM : Milimolar
mm : Milímetro
mm3 : Milímetro Cúbico
MOIFOPA : Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-Antrais
n : Número
Na+ : Íon Sódio
Nm : Nanômetro
N : Núcleo
ng : Nanograma
NGF : Fator de crescimento do nervo
Nu : Nucleo do oócito
NUBIS : Núcleo de Biotecnologia de Sobral
PAS : Ácido periódico de Schiff PBS : Tampão fosfato salino
PCNA : Antígeno Nuclear de Proliferação Celular
pFSH : Hormônio folículo estimulante de origem porcina
pH : Potencial Hidrogeniônico
P<0,05 : Probabilidade de erro menor do que 5%
PPGCV : Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias RNAm : Ácido ribonucléico mensageiro
SAS :Statistical Analysis System SEM : Erro padrão da média
ser : smooth endoplasmic reticulum (retículo endoplasmático liso)
SNK : Student Newman Keul´s
TCM 199 : Meio de Cultivo de Tecido 199
TEM : Transmission Electron Microscopy (Microscopia Eletrônica de Transmissão)
TNF : Fator de necrose tumoral
TUNEL : Terminal deoxynucleotidil transferase-mediate deoxyuridine triphosphate biotin nick end-labeling
UECE : Universidade Estadual do Ceará UnB : Universidade de Brasília
VEGF : Fator de crescimento do endotélio vascular
ZP : Zona Pelúcida μL : Microlitro μm : Micrômetro μg : Micrograma °C : Graus Celsius % : Porcentagem 400x : Aumento de 400 vezes 4.000x : Aumento de 4.000 vezes 10.000x : Aumento de 10.000 vezes
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ilustração do ovário mamífero com suas principais estruturas 03 Figura 2. Folículos ovarianos após coloração com Ácido Periódico de Schiff (PAS)-Hematoxilina. Folículos pré-antrais: (a) primordial; (b) transição; (c) primário e (d) secundário. Folículos antrais: (e) terciário e (f) pré-ovulatório
05
Figura 3. Esquema ilustrando o desenvolvimento e dissolução dos cordões ovígeros durante a vida intra-uterina
07
Figura 4. Quadro resumido do desenvolvimento folicular ovariano 09
Figura 5. Esquema de ondas foliculares em ruminantes 10
Figura 6. Desenho esquemático ilustrando os fatores envolvidos nas diferentes fases do desenvolvimento folicular
13
Figura 7. Ilustração de vários estádios de morte celular por apoptose. Representação de mudanças estereótipas incluindo condensação, mudanças na estrutura nuclear e fragmentação da célula em pequenos corpos apoptóticos
17
Figura 8. Ilustração de vários estádios de morte celular por necrose. Representação de mudanças estereótipas incluindo aumento de volume celular, degeneração citoplasmática, desintegração das organelas e membrana
19
Figura 9. Modelos para cultivo in vitro de folículos pre-antrais. Folículos in situ
(fig. a, b) e isolados (fig. c, d, e, f) 23
Figure 1. Histological sections of ovarian fragments after PAS-Hematoxylin staining, showing morphologically normal (A) and degenerated (B, C) follicles. O: oocyte; NU: oocyte nucleus; GC: granulosa cells (x 400)
40
Figure 2. (A) Percentage (mean ± SEM) of primordial and (B) developing follicle (transition, primary and secondary) in non-cultured (fresh control) and cultured tissue for 1 or 7 days (P<0.05)
43
Figure 3. Electron micrograph of normal preantral follicle in non-cultured ovarian tissue (control). Note the presence of numerous mitochondria in the ooplasm. O: oocyte; Nu: oocyte nucleus; GC: granulosa cells; m: mitochondria; ser: smooth endoplasmic reticulum (x 4000).
Figure 4. Electron micrograph of normal preantral follicle in ovarian tissue culture for 7 days (4 °C 4 h). Note the great relation between the nucleus and the cytoplasm of granulosa cells (arrow). O: oocyte; Nu: oocyte nucleus; GC: granulosa cells; m: mitochondria; ser: smooth endoplasmic reticulum (x10000).
48
Figure 5. Electron micrograph of normal preantral follicle in ovarian tissue culture for 7 days (20 °C 2 h). O: oocyte; Nu: oocyte nucleus; GC: granulosa cells; m: mitochondria (x4000).
49
Figure 6. Electron micrograph of normal preantral follicle in ovarian tissue culture for 7 days (35 °C 2 h). O: oocyte; Nu: oocyte nucleus; GC: granulosa cells; m: mitochondria (x4000).
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Diâmetro de folículos primordiais, primários e secundários e seus oócitos e número de células da granulosa em secções equatoriais em caprinos
08
Table 1. Percentage (mean ± SEM) of morfologically normal follicles in fresh control – day 0, preserved and non-cultured tissue and preserved and cultured tissue in MEM+ for 1 or 7 days
41
Table 2. Follicular diameter (mean ± SEM; μm) in fresh control – day 0, preserved and non-cultured and preserved and cultured tissues for 1 or 7 days
45
Table 3. Oocyte diameter (mean ± SEM; μm) of follicles from fresh control – day 0, preserved and non-cultured and preserved and cultured tissues for 1 or 7 days
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 01 2. REVISÃO DE LITERATURA 02 2.1 O ovário mamífero 02 2.2 Oogênese 03 2.3 Foliculogênese em ruminantes 04
2.4 Importância dos fatores de crescimento na regulação dos
estádios foliculares 11
2.5 A população folicular ovariana 13
2.6 Atresia folicular 14
2.6.1 Apoptose 15
2.6.2 Necrose 17
2.7 Transporte e conservação de ovário 19
2.8 Importância da preservação de folículos pré-antrais (FOPA) 21
2.9 Cultivo in vitro de folículos 22
2.9.1 Estado atual do cultivo in vitro de folículos pré-antrais 24 2.9.2 Importância da composição do meio sobre desenvolvimento
folicular in vitro 25
2.10 Métodos de avaliação da morfologia folicular 26
3. JUSTIFICATIVA 28
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA 29
5. OBJETIVOS 30
Influência das condições de conservação sobre a viabilidade de folículos pré-antrais caprinos cultivados in vitro
7. CONCLUSÕES 59
8. PERSPECTIVAS 60
1. INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas, várias pesquisas na área da biologia ovariana em mamíferos têm sido direcionadas para o cultivo in vitro de oócitos inclusos em folículos pré-antrais (FOPA). Considerando-se os milhares de folículos pré-antrais presentes em um único ovário, a recuperação e cultivo desses oócitos poderá incrementar a maturação e fecundação in vitro para fins de utilização em programas de transferência embrionária, transgenia e clonagem. Contudo, para o aproveitamento máximo deste potencial oocitário faz-se necessário o desenvolvimento de protocolos de conservação que permitam a manutenção da viabilidade folicular durante o transporte do ovário do local de coleta até o laboratório, bem como durante as manipulações que antecedem o cultivo
in vitro.
Dentre os protocolos empregados, o resfriamento do tecido ovariano vem sendo realizado a 4 ou 20 °C, por períodos que variam de 2 a 24 h, utilizando diferentes meios como solução salina 0,9% (SANTOS et al., 2002), Braun-Collins (CARVALHO et al., 2001), à base de água de coco (SILVA et al., 2000), PBS (Phosphat Buffer Saline - SILVA et al., 2002) e TCM 199 (FERREIRA et al., 2001). O Meio Essencial Mínimo (MEM) tem sido largamente empregado com sucesso no cultivo in vitro de embriões (BRAW-TAL & YOSSEFI, 1997), podendo ser utilizado na conservação de FOPA caprinos. Esses meios também foram utilizados na preservação de folículos pré-antrais à temperatura fisiológica (39 °C) nos mesmos períodos de incubação, sendo observada a importância de um meio enriquecido e curto tempo (2 h) de transporte para a manutenção da viabilidade folicular (MATOS et al., 2004).
Para um melhor entendimento da importância deste trabalho serão abordados os seguintes aspectos relacionados ao ovário mamífero, oogênese, foliculogênese, população folicular ovariana, atresia folicular, métodos de avaliação da morfologia folicular, resfriamento e conservação de ovários e folículos pré-antrais, regulação da foliculogênese inicial e cultivo in vitro de folículos pré-antrais, ressaltando-se a importância do desenvolvimento de protocolos para conservação de folículos pré-antrais.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Ovário mamífero
O ovário mamífero é um órgão compreendido por muitos tipos de células diferenciadas, ou seja, oócitos, células da granulosa, da teca, luteais e do estroma ovariano. Todas estas células trabalham em conjunto para promover um ambiente ideal para que o ovário exerça as suas funções exócrina e endócrina (BRISTOL-GOULD & WOODRUFF, 2006). A função exócrina consiste da liberação de oócitos maturos aptos para fecundação. Como função endócrina o ovário produz hormônios esteróides responsáveis pelo desenvolvimento das características sexuais secundárias femininas e suporte da gestação (KNIGHT & GLISTER, 2006).
O ovário é constituído por duas regiões: cortical e medular. No córtex ovariano, imediatamente abaixo do epitélio germinativo, localiza-se a túnica albugínea que é rica em fibras colágenas, desprovida de vasos sanguíneos e é onde se encontra a grande maioria dos folículos primordiais. Após o início do crescimento, os folículos ovarianos deslocam-se para a parte mais profunda do córtex que contém abundante irrigação sanguínea. Na região cortical, além dos folículos ovarianos em diferentes estádios de desenvolvimento, podem ser encontrados corpos lúteos, albicans e hemorrágicos (LIU
et al., 2006).
A região medular é localizada na porção mais interna do ovário, com exceção dos eqüídeos. É constituída por tecido conjuntivo (fibroblastos, fibronectina, colágeno e fibras reticulares), células musculares lisas, nervos, vasos sanguíneos e linfáticos responsáveis pela nutrição e sustentação do ovário (HAFEZ, 1996; Figura 1).
Os eventos que marcam a morfogênese do ovário fetal incluem a colonização por células geminativas primordiais (CGP), interação das células geminativas primordiais com células somáticas, formação dos cordões ovígeros e, finalmente, o desaparecimento dos cordões ovígeros e concomitante estabelecimento de uma população de folículos primordiais e uma complexa rede vascular (JUENGEL et al., 2002b). A cronologia no desenvolvimento desses eventos que culminam na formação dos folículos primordiais parece ser semelhante em todos os mamíferos (SAWYER et
Figura 1. Ilustração do ovário mamífero com suas principais estruturas. Adaptado de http://www.tarleton.edu/~anatomy/ovary.html
2.2 Oogênese
A oogênese em ruminantes consiste na formação e diferenciação das células germinativas primordiais (CGP) até a formação do oócito haplóide fecundado (BRISTOL-GOULD & WOODRUFF, 2006). A oogênese inicia-se antes do nascimento, mas somente alguns oócitos conseguem completar este processo meses ou anos mais tarde no animal adulto, após a fecundação (FIGUEIREDO et al., 2003). Em ovinos e bovinos, ainda na vida embrionária, por volta do 20° e 30° dias de gestação, respectivamente, ocorre à migração de CGP do saco vitelíneo para a região das gônadas primitivas. Após um processo marcado pelo crescimento celular e pela redistribuição de organelas citoplasmáticas, as CGP dentro do ovário multiplicam-se ativamente e transformam-se em oogônias, as quais possuem alta atividade mitótica e transcricional (EPPIG et al., 2004). Dois tipos de células germinativas com funções diferentes resultam da última divisão mitótica das CGP. Uma inicia imediatamente outra divisão
mitótica e dá origem a uma linha de células oogoniais, enquanto a outra permanece em intérfase e divide-se periodicamente, originando novas CGP que se diferenciarão posteriormente em oogônias. Em ovinos e bovinos, a diferenciação das CGP em oogônias ocorre no 31º e 42º dia de gestação, respectivamente (RÜSSE, 1983). A fase que antecede este processo meiótico é marcada pela replicação do DNA (GORDON, 1994). Nesta fase, as oogônias se diferenciam e passam então a ser denominadas de oócitos (FAIR, 2003). Estes, então formados, começam a primeira divisão meiótica, passando pelos estádios da prófase I (leptóteno, zigóteno, paquíteno e diplóteno) da primeira divisão meiótica (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005). No estádio de diplóteno ou vesícula germinativa da prófase I, ocorre a primeira interrupção da divisão meiótica e formação dos oócitos primários, que permanecem neste estádio até a puberdade (SUH et
al., 2002). Na puberdade, imediatamente antes da ovulação, com o pico dos hormônios
folículo estimulante (FSH) e luteinizante (LH), os oócitos que terminaram seu crescimento retomam a meiose e o núcleo passa do estádio de vesícula germinativa para diacinese (CECCONI et al., 2004b). Em seguida, ocorre o rompimento da vesícula germinativa, progressão para metáfase I, anáfase I e telófase I, expulsão do primeiro corpúsculo polar e formação do oócito secundário (BETTERIDGE et al., 1989). Inicia-se a Inicia-seguir a Inicia-segunda divisão meiótica, em que o núcleo do oócito evolui até o estádio de metáfase II, quando ocorre a segunda interrupção da meiose (GORDON, 1994). O oócito permanece neste estádio até ser fecundado pelo espermatozóide, quando então completa a meiose e expulsa o segundo corpúsculo polar, formando o oócito haplóide fecundado (MOORE & PERSAUD, 1994).
2.3 Foliculogênese em ruminantes
O folículo é considerado a unidade morfológica e funcional do ovário mamífero, cuja função é proporcionar um ambiente ideal para o crescimento e maturação do oócito (CORTVRINDT & SMITZ, 2001). A foliculogênese, evento iniciado na vida pré-natal na maioria das espécies, pode ser definida como o processo de formação, crescimento e maturação folicular, iniciando-se com a formação do folículo primordial e culminando com o estádio de folículo de pré-ovulatório (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005). Ocorre simultaneamente à oogênese quando o oócito está entre as fases de prófase I e metáfase II, na maioria das espécies. Em outras palavras, a foliculogênese inicia após e
termina antes da oogênese (FIGUEIREDO et al., 2003). Em ruminantes, a foliculogênese tem sido bastante estudada em ovinos e bovinos, mas poucas informações são disponíveis em caprinos.
O folículo ovariano é formado por vários tipos celulares, sendo composto por um oócito circundado por células somáticas (granulosa e tecais) (MAGOFFIN, 2005). Esses dois tipos celulares são responsáveis pela síntese de numerosos hormônios que promovem a complexa regulação do desenvolvimento folicular (SKINNER, 2005). Durante a foliculogênese, a morfologia folicular é alterada uma vez que o oócito cresce e as células circundantes se diferenciam (BRISTOL-GOULD & WOODRUFF, 2006). De acordo com o grau de evolução, os folículos podem ser classificados em pré-antrais ou não cavitários (primordiais, transição, primários e secundários) e antrais ou cavitários (terciários e pré-ovulatórios) (Figura 2) (FIGUEIREDO et al., 2003).
CG O b N CG a c CG O e f d CT CT O ZP A CG O O A CG
Figura 2. Folículos ovarianos após coloração com Ácido Periódico de Schiff (PAS)-Hematoxilina. Folículos pré-antrais: (a) primordial; (b) transição; (c) primário e (d) secundário. Folículo antrais: (e) terciário e (f) pré-ovulatório. N: núcleo do oócito; O: oócito; CG: células da granulosa; ZP: zona pelúcida; A: antro; CT: células da teca.
Durante a vida fetal, a formação dos folículos primordiais em ovários de caprinos, ovinos e bovinos é observada aos 62, 75 e 120 dias, respectivamente (BEZERRA et al., 1998; McNATTY et al., 1999; RÜSSE, 1983). Células germinativas
primordiais surgem aproximadamente três semanas após a fertilização e migram através de movimentos amebóides do epitélio do saco vitelínico para a gônoda em formação. Durante essa migração, as CGP se multiplicam rapidamente por mitose e com sete semanas de gestação originam grupos de oogônias, conectados entre si por interações citoplasmáticas denominados cordões primitivos (Figura 3) (SMITZ & CORTVRINDT, 2002).
Após a colonização dos ovários pelas células germinativas primordiais e posterior diferenciação em oogônias e oócitos, uma camada de células somáticas planas, conhecidas também como células da pré-granulosa, circundam os oócitos formando assim os folículos primordiais (JUENGEL et al., 2002b). A maioria das células da pré-granulosa são recrutadas das células mesoteliais oriundas do epitélio da superfície ovariana que tem alta atividade proliferativa. Após circundarem os oócitos, as células da pré-granulosa param de se multiplicar e entram em um período de quiescência (SAWYER et al., 2002). A zona pelúcida nesse estádio não é observada, verificando-se apenas uma justaposição do oócito e células da granulosa, sem nenhuma junção específica. O núcleo do oócito é relativamente grande e ocupa uma posição central e as organelas são uniformemente distribuídas no citoplasma ou as vezes mais próximas ao núcleo (LUCCI et al., 2001). Uma vez formados, os folículos primordiais representam o
pool de células germinativas disponíveis durante toda a vida reprodutiva (EPIFANO &
DEAN, 2002), embora estudos recentes tenham sugerido que a oogênese pós-natal também pode ocorrer em fêmeas mamíferas (JOHNSON et al., 2004). É importante ressaltar que os folículos primordiais correspondem a um total de 90% de todos os folículos presentes no ovário (SMITZ & CORTVRINDT, 2002). A proliferação celular é retomada somente quando um folículo primordial quiescente começa a crescer, dias, meses ou anos após a sua formação (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005). Os mecanismos seletivos pelos quais alguns folículos crescem e outros permanecem quiescentes ainda não são completamente elucidados (EPIFANO & DEAN, 2002). Sabe-se que o desenvolvimento folicular inicial, incluindo a transição de folículo primordial para primário (ativação folicular) é pouco dependente de gonadotrofinas e que é regulado, principalmente, por fatores intra-ovarianos (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005).
As características morfológicas que marcam o início do crescimento de folículos primordiais são: aumento do diâmetro oocitário, proliferação das células da granulosa e
transformação do formato destas células de pavimentoso para cúbico. Durante esta fase, os folículos que apresentam células da granulosa com ambos os formatos pavimentoso e cúbico são denominados intermediários ou de transição (BARNETT et al., 2006).
Células epiteliais da superfície ovariana
Células i ti
Folículo primordial
Figura 3. Esquema ilustrando o desenvolvimento e dissolução dos cordões ovígeros durante a vida intra-uterina. Adaptado de JUENGEL et al., 2002b.
Quando o oócito é circundado por uma camada completa de células da granulosa de formato cúbico, os folículos são classificados como primários (FORTUNE, 2003). Em caprinos, ovinos e bovinos, o aparecimento de folículos primários, em fetos, ocorre aos 71, 100 e 140 dias de gestação, respectivamente (BEZERRA et al., 1998; McNATTY et al., 1999; RÜSSE, 1983). Os folículos primários são o primeiro estádio de crescimento saindo do pool de reserva. À medida que os folículos iniciam o crescimento, as proteínas que irão formar a zona pelúcida começam a ser sintetizadas (LEE et al., 2000). A zona pelúcida é uma matriz extracelular glicoprotéica localizada entre o oócito e as células da granulosa e consiste de três glicoproteínas sintetisadas pelo oócito, denominadas ZP1, ZP2 e ZP3 (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005). As células da teca são recrutadas do estroma e podem ser organizadas ao redor da membrana basal (SKINNER, 2005). Os folículos secundários são caracterizados pelo aumento do oócito, a presença de duas ou mais camadas de células da granulosa e as primeiras células da
teca (SILVA et al., 2004b). Neste estádio, a zona pelúcida é claramente identificada ao redor do oócito (PARROT & SKINNER, 2000). Além disso, as células da granulosa apresentam uma extensiva rede de junções do tipo gap, que são canais membranários que permitem a passagem de nutrientes, íons inorgânicos, mensageiros e pequenos metabólitos entre as células (KIDDER & MHAWI, 2002). O núcleo do oócito assume uma posição excêtrica e as organelas começam a mover-se para a periferia (LUCCI et
al., 2001). Os folículos secundários são observados em ovários de fetos caprinos, ovinos
e bovinos aos 80, 120 e 210 dias de gestação, respectivamente (BEZERRA et al., 1998; McNATTY et al., 1999; RÜSSE, 1983). Apesar de serem responsivos às gonadotrofinas, os folículos secundários podem desenvolver-se até o estádio antral com uma quantidade mínima de FSH circulante (McGEE & HSUEH, 2000). Os diâmetros das categorias foliculares mencionadas anteriormente são mostrados na Tabela 1.
Tabela 1. Diâmetro de folículos primordiais, primários e secundários e seus oócitos e número de células da granulosa em secções histológicas em caprinos.
Classe folicular Diâmetro (μm) Nº de CG
Folículo Oócito
Primordial 20,0 15,9 1-14
Primário 24,4 17,4 5-26
Secundário 44,2 24,5 13-114
Adaptado de LUCCI et al., 2001.
Com a intensa proliferação das células da granulosa, uma área preenchida por fluido folicular é identificada na camada granulosa e, a partir de então, os folículos passam a ser classificados como antrais. O fluido antral pode servir como uma importante fonte de substâncias reguladoras ou moduladoras derivados do sangue ou secreções de células foliculares como gonadotrofinas, esteróides, fatores de crescimento, enzimas, proteoglicanos e lipoproteías. Durante o desenvolvimento folicular, a produção de fluido antral é intensificada pelo aumento da vascularização folicular e permeabilidade dos vasos sanguíneos, os quais estão fortemente relacionados com o aumento do folículo antral (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005). A formação dos
folículos antrais em caprinos, ovinos e bovinos é observada aos 110, 135 e 230 dias, respectivamente (BEZERRA et al., 1998; McNATTY et al., 1999; RÜSSE, 1983). A partir deste estádio, o diâmetro folicular aumenta acentuadamente devido ao crescimento do oócito, multiplicação das células da granulosa, da teca e aumento da cavidade antral.
O desenvolvimento dos folículos antrais é caracterizado por uma fase de crescimento, recrutamento, seleção e dominância, sendo a formação de folículos pré-ovulatórios (último estádio de desenvolvimento folicular) um pré-requisito para a ovulação e formação do corpo lúteo, bem como manutenção da fertilidade (Figura 4) (DRUMMOND, 2006). O folículo pré-ovulatório é caracterizado por um oócito circundado por células da granulosa especializadas que são denominadas de células do cumulus. As células da granulosa de folículos pré-ovulatórios param de se multiplicar em resposta ao hormônio luteinizante (LH) e iniciam o processo final de diferenciação. A ovulação ocorre em resposta ao pico de LH. Em todas as espécies, a formação de folículos pré-ovulatórios ocorre geralmente durante a puberdade (DRIANCOURT, 2001).
Adaptado de BARNETT et al., 2006.
Os folículos antrais iniciais possuem RNAm para receptores de FSH nas células da granulosa, mas são relativamente independentes de gonadotrofinas durante seu período de crescimento inicial, uma vez que eles aumentam em tamanho na presença ou ausência de baixas concentrações de FSH e LH (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005). Estudos ultra-sonográficos indicam que o ciclo estral de cabras é caracterizado por um padrão de ondas de desenvolvimento folicular nos ovários (ROCHE, 1996). Uma onda folicular envolve um crescimento de um grupo de folículos antrais dos quais geralmente um ou dois folículos são selecionados para crescer até mais de 5 mm. O número de ondas foliculares por ciclo varia entre duas a cinco, entretanto, o padrão predominante em cabras com ciclo estral de comprimento normal (19-22 dias) é de quatro ondas (Figura 5) (CASTRO et al., 1999).
O aumento das concentrações plasmáticas de FSH constitui um dos estímulos necessários para o recrutamento e emergência da onda folicular (ADAMS et al., 1992). O folículo selecionado é conhecido como folículo dominante e suprime ativamente o crescimento dos demais folículos pela secreção de estradiol e inibina provocando a regressão ou atresia dos mesmos (FORTUNE et al., 2001).
Recrutamento Seleção Dominância Atresia
Pool folicular sensível à
gonadotrofinas
Dias do ciclo estral Luteólise Diâmetro folicular (μm)
Figura 5. Esquema de ondas foliculares em ruminantes. Adaptado de http://www.beef.unl.edu/learning/estrous.shtml
O controle do desenvolvimento ovariano, regulação do crescimento e seleção folicular são eventos importantes, mas ainda não completamente elucidados. Ao longo do ciclo reprodutivo, folículos ovarianos em todas as fases de desenvolvimento estão presentes e geralmente podem ser classificados em três estádios, ou seja, folículos quiescentes, em crescimento ou atrésicos. Os sinais que interrompem a latência do folículo primoridal quiescente e induzem início de seu crescimento em direção à ovulação ou atresia ainda não são completamente conhecidos (BRISTOL-GOULD & WOODRUFF, 2006).
2.4 Importância dos fatores de crescimento na regulação dos estádios foliculares
A foliculogênese ovariana é um processo complexo envolvendo padrões de secreção endócrina, parácrina e autócrina (SCOTT et al., 2004). Como descrito anteriormente, o desenvolvimento folicular até o estádio antral inicial pode ocorrer na ausência de gonadotrofinas (FSH e LH), mostrando que os fatores de crescimento locais desempenham um papel crucial nesta etapa (EPPIG, 2001).
Provavelmente, a ativação de folículos primordiais é regulada pelo balanço entre fatores estimulatórios e um fator inibitório presente no próprio ovário. Dentre os fatores estimulatórios para ativação folicular, destacam-se: Kit Ligand (KL – PARROTT & SKINNER, 1999), fator de crescimento de diferenciação-9 (GDF-9 – VITT et al., 2000), fator de crescimento fibroblástico-2 (FGF-2 – NILSSON et al., 2001), fator inibidor de leucemia (LIF – NILSSON et al., 2002), fator de crescimento queratinócito (KGF – NILSSON & SKINNER, 2003) e proteína morfogenética do osso 4 (BMP-4 – KEZELE et al., 2002) e 7 (BMP-7 – LEE et al., 2001). O fator de crescimento do nervo (NGF) é considerado importante, mas não essencial na ativação de folículos primordiais (DISSEN et al., 2001). Por outro lado, alguns estudos têm demonstrado que o hormônio Anti-Mülleriano (AMH) inibe o recrutamento de folículos primordiais para o pool de folículos em crescimento (CARLSSON et al., 2006).
A transição folicular do estádio primário para secundário é regulado por membros da família do fator de crescimento transformante (TGF-β), GDF-9, proteína
morfogenética do osso 15 (BMP-15) (CECCONI et al., 2004b). Além destes, também atuam a Ativina A (ZHAO et al., 2001b), fator de crescimento epidermal (EGF – GUTIERREZ et al., 2000), fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF – YANG & FORTUNE, 2007) e testosterona (YANG & FORTUNE, 2006).
Nos folículos secundários ou multilaminares, as junções gap facilitam a comunicação bi-direcional e permitem a transferência de nutrientes, metabólitos (como aminoácidos e nucleotídeos), outras moléculas (hormônios, neurotrofinas e fatores de crescimento) e sinais meióticos estimulatórios e inibitório entre oócito e células da granulosa. Nessa classe folicular é sugerido que o desenvolvimento esteja principalmente associado com fatores locais (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005), tais como: Ativina A (THOMAS et al., 2003), KGF (McGEE et al., 1999), TGF-β (LIU et
al., 1999), EGF (GUTIERREZ et al., 2000), GDF-9 (HAYASHI et al., 1999) e BMP-15
(JUENGEL et al., 2002a). Além desses, podemos citar o hormônio do crescimento (GH – LIU et al., 1998) e fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-I – ZHAO, 2001a). Embora folículos secundários sejam responsivos às gonadotrofinas, como hormônio folículo estimulante (FSH) e luteinizante (LH), eles podem desenvolver para estádio antral com uma circulação mínima dos mesmos (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005).
Os sinais para formação do antro não são bem conhecidos. Estudos in vitro com folículos de roedores mostraram que FSH (MAO et al., 2002), LH (CORTVRINDT et
al., 1998), ativina (ZHAO et al., 2001b), IGF-I (DRIANCOURT, 2001), fator de
crescimento fibroblástico 8 (FGF-8 – BURATINI et al., 2005) e KL (DRIANCOURT et
al., 2000) são possíveis candidatos nesse respeito. Estudos in vitro com folículos
secundários em bovinos mostraram um efeito estimulatório do EGF na formação do antro (Figura 6) (GUTIERREZ et al., 2000).
Figura 6. Desenho esquemático ilustrando os fatores envolvidos nas diferentes fases do desenvolvimento folicular. Adaptado de BRISTOL-GOULD & WOODRUFF, 2006.
2.5 População folicular ovariana
O estoque finito e não renovável de células germinativas é considerado como uma premissa básica da fisiologia da reprodução. O declínio progressivo do número de oócitos ao longo da vida pós-natal ocorre principalmente por mecanismos apoptóticos, e na senilidade, a ausência de células germinativas nos ovários apresenta-se como fenômeno amplamente aceito (SENEDA & BORDIGNON, 2007).
Em muitos mamíferos, a população folicular ovariana é estabelecida ainda na vida intra-uterina (primatas e ruminantes – KNIGHT & GLISTER, 2006) ou em um curto período de tempo após o nascimento (roedores – OJEDA et al., 2000). Por outro lado, recentemente trabalhos têm demonstrado mecanismos envolvidos na formação de novas células germinativas e folículos na mulher (BUKOVSKY et al., 2005) e camundonga adulta (JOHNSON et al., 2004). Esses autores demonstraram indícios da continuidade da oogênese e foliculogênese no período pós-natal, pela atuação de células-tronco. Foi evidenciada a presença de proteínas específicas do início da meiose em ovários de camundongas adultas. De acordo como o conceito atual, a expressão dessas proteínas deveria ocorrer apenas durante a vida intra-uterina (SENEDA & BORDIGNON, 2007). Em trabalho subseqüente (JOHNSON et al., 2005), um grupo de camundongas foi submetido à esterilização química, sendo descrita ausência de
folículos após tratamento. Em seguida, os animais receberam transfusão de medula óssea e sangue periférico e, uma semana após, folículos viáveis em crescimento foram identificados nos ovários. Para BUKOVSKY et al. (2005), a renovação folicular pós-natal ocorre regularmente em mulheres, mas a origem das células-tronco para tal não seria a medula óssea, e sim células germinativas presentes na superfície do epitélio ovariano.
Independente disso, a população folicular difere entre as espécies, além de ser observada uma forte variação individual (KATSKA-KSIAZKIEWICZ, 2006), sendo de aproximadamente 1.500 na camundonga (SHAW et al., 2000); 160.000 na ovelha (AMORIM et al., 2000); 35.000 na cabra (LUCCI et al., 1999) e aproximadamente 2.000.000 na mulher (ERICKSON, 1986). Ao longo da vida do animal, ocorre uma redução ordenada, geralmente exponencial, no número de folículos pré-antrais (SHAW
et al., 2000). Essa redução é devida a dois fenômenos que ocorrem naturalmente no
ovário: (i) a ovulação e (ii) a atresia ou morte folicular. Somente uma pequena parte (0,1%) dos folículos primordiais chega ao estádio de ovulação (NUTTINCK et al., 1993), pois a maioria (99,9%) torna-se atrésica durante as fases de crescimento e maturação (OTALA et al. 2002).
2.6 Atresia folicular
Os folículos pré-antrais representam 90% da população folicular e são responsáveis pela renovação contínua de folículos antrais no ovário. Entretanto, a maioria, ou seja, 99,9% dos folículos pré-antrais não chega até a ovulação, mas sofre um processo conhecido por atresia folicular (KATSKA-KSIAZKIEWICK, 2006). A atresia, apesar de causar a perda de vários folículos ovarianos, é um evento crucial para manutenção da homeostase ovariana em mamíferos, assegurando a ciclicidade dos animais e prevenindo o desenvolvimento de múltiplos embriões durante a gestação (AMSTERDAM et al., 2003). A atresia é um fenômeno natural que é comum a todos as espécies domésticas, podendo ocorrer em qualquer estádio do desenvolvimento folicular, sendo mais comum nos estádios antrais mais avançados (GLAMOCLIJA et
al., 2005). Ela pode ocorrer por via apoptótica ou degenerativa, fazendo com que o
O processo de atresia usualmente difere entre folículos pré-antrais (primordiais, primários e secundários) e antrais. Em folículos pré-antrais, as primeiras alterações indicativas de atresia ocorrem no oócito, como por exemplo, retração da cromatina nuclear e fragmentação oocitária, o que desencadeia o processo de eliminação irreversível dos folículos ovarianos neste estádio de desenvolvimento (MORITA & TILLY, 1999). É importante ressaltar que após a formação da cavidade antral, ocorre uma alteração na sensibilidade do oócito e das células da granulosa. A partir deste estádio, o oócito torna-se altamente resistente e as primeiras alterações indicativas de atresia são observadas nas células da granulosa (JORIO et al., 1991). A seguir, serão descritos os mecanismos de atresia de folículos ovarianos através da apoptose e da necrose.
2.6.1 Apoptose
A apoptose, também conhecida como morte celular programada, é um evento geneticamente determinado, ou seja, depende do balanço de genes pró e anti-apoptóticos, e é observada nos folículos ovarianos durante toda a vida, incluindo a fase pré-natal (HUSSEIN, 2005). A apoptose é geralmente mediada por mecanismos intrínsecos, podendo também ser influenciada por fatores extrínsecos (JOHSTONE et
al., 2002). Dentre os fatores que podem levar a apoptose destaca-se o estresse
oxidativo, irradiação, ativação de genes promotores de apoptose, bem como danos no DNA, citocinas, proteínas virais e a deficiência de fatores de sobrevivência da célula (JOHNSON, 2003).
O início, execução e regulação da apoptose envolvem vários fatores bioquímicos e as caspases possuem um papel central como sinalizador da apoptose. Elas são membros da família de proteinases cisteínicas com especificidade para ligações peptídicas envolvendo o aspartato. São expressas como pró-enzimas e são proteoliticamente processadas para a sua forma ativa após estímulo apoptótico (STRASSER et al., 2000). Existem 14 tipos de caspases, sendo estas identificadas como caspase-1 até caspase-14 (TIBBETS et al., 2003). Funcionalmente, a família das caspases pode ser dividida em duas subfamílias. As caspases-1, -4, e -5 estão envolvidas com o processamento de citocinas inflamatórias como as interleucina-1β e pró-interleucina-18, e têm funções pró-inflamatórias. Os outros membros da família
funcionam especificamente para a morte celular por apoptose, e são subdivididas em iniciadoras (caspases-2, -8, -9 e -10) e executoras ou efetoras (caspase-3, -6 e -7) (STRASSER et al., 2000). As caspases iniciadoras são clivadas em resposta a um estímulo apoptótico e ativam as caspases efetoras (GREEN, 2003). Durante a apoptose, as caspases efetoras clivam numerosas proteínas localizadas na membrana celular, núcleo e citoplasma. A ativação da CAD (caspase DNase ativada) para facilitar a degradação do DNA é uma das funções importantes das caspases no processo apoptótico (NAGASE et al., 2003).
Dois diferentes padrões moleculares sinalizadores podem levar a ativação das caspases e a escolha da via utilizada pela célula é profundamente influenciada pelo estímulo apoptótico inicial. A primeira via é através de receptores de superfície celular (receptores de morte), constituindo a via extrínseca, exemplificada pela ligação do fator de necrose tumoral (TNF) e do antígeno Fas (polipeptídeo associado à membrana, membro da superfamília de receptores TNF) aos seus respectivos receptores. A segunda via, conhecida como intrínseca, mediada pelas mitocôndrias, ocorre principalmente por meio de sinalizadores de estresse intrínseco, seguida de instruções para o desenvolvimento da apoptose (HENGARTNER, 2000; KAUFMANN & HENGARTNER, 2001).A integridade mitocondrial e a liberação do citocromo c dentro do citosol são primariamente controlados pelos membros da família Bcl-2 (Gene anti-apoptótico; DESAGHER & MARTINOU, 2000). O mecanismo preciso pelo qual os membros da família Bcl-2 modulam a apoptose não estão completamente elucidados, especialmente as funções relacionadas com a liberação do citocromo-c do compartimento intermediário mitocondrial no citosol (SUZUKI et al., 2000).
Existem três hipóteses para esse fato: 1) Proteínas Bcl-2 podem se inserir dentro da membrana mitocondrial, formando em seguida canais que permitem a passagem de moléculas (REED & KROEMER, 2000); 2) Membros da família Bcl-2 podem interagir com outras proteínas na membrana mitocondrial formando grandes poros na membrana da mitocôndria (REED & KROEMER, 2000); e 3) Membros da família Bcl-2 podem alterar a permeabilidade da membrana, causando turgidez mitocondrial e eventual ruptura da membrana mitocondrial externa, com a liberação de proteínas intermembranárias no citosol (HENGARTNER, 2000). O citocromo-c citosólico dispara a formação do apoptossoma mitocondrial, que é indicativo de apoptose e consiste do citocromo c, Apaf-1 (Fator ativador de protease apoptótica) e caspase-9
(JOZA et al., 2002). A ligação do citocromo c à proteína adaptadora Apaf-1 recruta a pró-caspase-9. Essa pró-caspase é clivada, e a sua forma ativa, ou seja, caspase-9, promove uma ativação proteolítica da caspase-3. Tal caspase leva informação da apoptose ao núcleo e ela própria, cliva a proteína ICAD (inibidor de caspase ativada pelo DNA) que está normalmente ligada a uma endonuclease (CAD) que reside no núcleo. Após essa clivagem, a endonuclease é liberada e faz a quebra do DNA a cada 180-200 pares de bases ou múltiplos (HUSSEIN, 2005).
As características morfológicas da apoptose são condensação periférica da cromatina nuclear seguida pelo rompimento do citoesqueleto (BLONDIN et al., 1996), compactação da célula e fragmentação citoplasmática e nuclear, resultando na formação de múltiplos corpos apoptóticos (RACHID et al., 2000). Em seguida, os corpos apotóticos são fagocitados pelas células vizinhas, sem ocorrer processo inflamatório. Durante todo o processo, a permeabilidade celular permanece inalterada, e as organelas mantêm sua integridade morfofuncional (Figura 7).
Normal Condensação Fragmentação Corpos apoptóticos Figura 7. Ilustração de vários estádios de morte celular por apoptose. Representação de mudanças estereótipas incluindo condensação, mudanças na estrutura nuclear e fragmentação da célula em pequenos corpos apoptóticos. Adaptado de PADANILAM, 2003.
2.6.2 Necrose
A necrose, diferentemente da apoptose, é considerada uma forma não programada de morte celular e é iniciada devido a algum estímulo circunstancial resultando na rápida quebra da homeostasia celular (BRAS et al., 2005).
A necrose comumente ocorre devido a estímulos tóxicos, isquêmicos, degenerativos e imunológicos, podendo tais fatores também induzir a apoptose. Além disso, alguns estímulos que levam a ocorrência de apoptose podem em certas circunstâncias (como depleção de energia ou redução da ativação das caspases) induzir o fenômeno da necrose (ZEISS, 2003). Geralmente, a necrose é iniciada por mecanismos não celulares como isquemia, deficiência de níveis de ATP (BHATIA, 2004), trauma, levando a danos irreversíveis na célula (McCULLY et al., 2004). Recentes trabalhos têm sugerido que além dessas causas, mecanismos “ativos” como uma sobrecarga de Na+, acúmulo de Ca2+ e mudanças na permeabilidade da mitocôndria podem também participar e levar ao processo necrótico (PADANILAM, 2003).
O padrão bioquímico que leva a morte celular necrótica é pouco conhecido. Em injúrias isquêmicas ou hipóxicas, a depleção de energia ocorre devido a uma deficiente produção de ATP associada a um rápido consumo de ATP pelas bombas e devido à hidrólise e perda de ATP. O aumento do volume celular associado com a morte celular necrótica é iniciado devido ao influxo de Na+ e liberação de ATP devido à ruptura da membrana (PADANILAM, 2003). O aumento dos níveis de Na+ no citosol ativa a bomba Na+-K+-Atpase, resultando na dissipação de ATP. Nos estádios iniciais da injúria, um simultâneo efluxo de K+ mantém a homeostase iônica. Severas depleções de ATP levam a falhas no mecanismo de balanço da bomba de íons, levando a um influxo de Na+ e águ,a o qual resulta em inchaço e ruptura da célula. Esse acúmulo de Na+ concomitante com uma severa deficiência de ATP é o maior responsável pela necrose (CARINI et al., 1995). O aumento dos níveis de Ca2+ ativa endonucleases para degradar DNA, bem como proteases celulares ativas para degradar diversas estruturas e proteínas sinalizadoras (WANG, 2000).
A participação da mitocôndria na necrose a na apoptose pode ocorrer pela abertura de poros durante a permeabilidade mitocondrial transitória. Alguns segundos mensageiros e proteínas pró-apoptóticas, incluindo membros da família Bcl-2, podem induzir a abertura de poros na mitocôndria (KROEMER & REED, 2000).
Em condições in vitro, especialmente durante a conservação, ocorre alteração no fornecimento de oxigênio e nutrientes para o ovário. Nesta situação, a isquemia pode ser uma das principais causas do desencadeamento da morte folicular por degeneração (FARBER, 1982), resultando em alterações na permeabilidade da membrana celular. Essas alterações podem levar ao aumento de água intracelular e do volume celular, vacuolização citoplasmática e, conseqüentemente, degeneração (BARROS et al., 2001).
A morfologia de uma célula que sofreu necrose é bem distinta de uma célula que sofreu apoptose, com mudanças ultra-estruturais ocorrendo tanto no citoplasma quanto no núcleo (SCAFFIDI et al., 2002). As principais características são: floculação da cromatina, turgidez e completa degeneração do citoplasma e da matriz mitocondrial, rompimento da membrana plasmática, e eventual extravasamento do conteúdo citoplasmático dentro do espaço extracelular (NEWTON & ILLINGWORTH, 2001) (Figura 8). Diferentemente da apoptose, a cromatina não é empacotada em discretas partículas ligadas a membrana.
Normal Inchaço reversível Inchaço irreversível Desintegração Figura 8. Ilustração de vários estádios de morte celular por necrose. Representação de mudanças estereótipas incluindo aumento de volume celular, degeneração citoplasmática, desintegração das organelas e membrana. Adaptado de SLOT, 2004.
2.7 Transporte e preservação de ovários
Visando evitar a enorme perda folicular que ocorre naturalmente in vivo, vem sendo desenvolvida a biotécnica de manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais (MOIFOPA), que consiste no isolamento, conservação e cultivo folicular in
para preservação de folículos pré-antrais (SANTOS et al., 2003), visando melhorar as condições de transporte mantendo a viabilidade folicular até sua manipulação (SANTOS et al., 2004). Sendo assim, o objetivo da preservação consiste em garantir que as células permaneçam com uma baixa taxa metabólica durante o período de estocagem, a fim de que possam ser resgatadas para continuar o seu desenvolvimento in
vitro. Entretanto, para que isso seja possível, mesmo após longos períodos de
preservação, alguns fatores essenciais para a sobrevivência das células devem ser levados em consideração, tais como: escolha do meio utilizado durante o processo de resfriamento, temperatura e tempo de preservação (SANTOS et al., 2004).
Diferentes soluções e meios têm sido utilizados para a preservação de FOPA, podendo ser citados como exemplos: TCM 199 (COSTA et al., 2005), solução salina 0,9% (MATOS et al., 2004), PBS (SANTOS et al., 2002), solução Braun-Collins (CARVALHO et al., 2001) e solução à base de água de coco (LUCCI et al., 2004). Dentre os meios de conservação empregados, o MEM (Meio Essencial Mínimo) tem sido utilizado no cultivo in vitro de folículos pré-antrais em diferentes espécies mantendo a viabilidade folicular (JEWGENOW et al., 1998) e ativação de folículos primordiais (MARTINS et al., 2005).
Técnicas para armazenamento de ovários a curto período já foram desenvolvidas para caprinos (SILVA et al., 2000), ovinos (ANDRADE et al., 2002) e bovinos (LUCCI
et al., 2004). Nesses estudos, as temperaturas de 4, 20 e 39 °C foram testadas para
preservação de folículos pré-antrais. Em geral, a temperatura mais satisfatória é a de 4 °C, permitindo uma boa preservação de folículos pré-antrais em suínos por períodos de até 18 ou 24 h, enquanto 20 °C preserva os folículos por apenas 4 ou 6 h, não afetando a habilidade para posterior desenvolvimento in vitro (LUCCI et al., 2007).
Em caprinos, a preservação de fragmentos ovarianos in vitro com valores semelhantes aos encontrados in vivo foram obtidos a 4 °C em solução salina e Braun-Collins por 12 h (CARVALHO et al., 2001; SILVA et al., 2000) e em água de coco, TCM 199 e PBS por 24 h (FERREIRA et al., 2001; SILVA et al., 2000; SANTOS et
al., 2002), e a 20 °C em meio água de coco, solução salina e TCM 199, Braun-Collins e
PBS por 4 h (CARVALHO et al., 2001; SILVA et al., 2000; SANTOS et al., 2002; FERREIRA et al., 2001). No entanto, nenhum desses trabalhos mostraram resultados satisfatórios quando os fragmentos ovarianos foram transportados a 39 °C nem mesmo por 4 h (FERREIRA et al., 2001; SILVA et al., 2000; SANTOS et al., 2003).
vascular impede o suprimento de oxigênio e energia para os ovários. A privação de oxigênio do tecido resulta em uma mudança do metabolismo aeróbico para anaeróbico, sendo o acido láctico o produto principal, acumulado dentro da célula causando redução do pH (WONGSRIKEAO et al., 2005).
Com a intenção de reduzir esses efeitos, a hipotermia provocada por baixas temperaturas (4 e 20 °C), provoca uma redução no metabolismo celular, minimizando as necessidades metabólicas e aumentando a resistência de folículos à redução de nutrientes e oxigênio durante a preservação in vitro (SILVA et al., 2003). O metabolismo fisiológico (39 °C) associado a baixa tensão de oxigênio em estudos in
vitro leva a degeneração folicular (CELESTINO et al., 2007). No entanto, ovários
bovinos têm sido transportados em temperaturas de 35 °C sem problemas para um subsequente cultivo in vitro (39 °C) (SAHA et al., 2000).
Neste sentido, o transporte e período de armazenamento dos ovários, e em particular, temperatura do meio usado durante transporte estão entre os fatores que afetam a maturação completa do oócito (TAS et al., 2006).
2.8 Importância da preservação de folículos pré-antrais de animais domésticos
Tendo em vista a grande perda de folículos pré-antrais, que ocorre naturalmente
in vivo, e a ausência de métodos eficientes de cultivo desses folículos in vitro, a
conservação do tecido ovariano ou dos folículos pré-antrais tem sido uma alternativa para preservar os gametas femininos da espécie humana (PICTON & GOSDEN, 2000), bem como de várias espécies mamíferas domésticas bovinos (LUCCI et al., 2004), ovinos (CASPACCHIETTI et al., 2004), caprinos (RODRIGUES et al., 2004), felinos ( JEWGENOW et al., 1998).
Especificamente com relação aos animais de produção, as pesquisas têm como objetivo preservar e contribuir para a multiplicação de animais de alto valor genético. Além disso, animais como os ovinos e caprinos poderão servir de modelo experimental para aplicação na espécie humana, haja vista a similaridade da gônada feminina entre essas espécies (SALLE et al., 2002). Além de sua importância para a formação de bancos de germoplasma animal, os milhares de folículos pré-antrais de um mesmo animal, preservados podem ser destinados para pesquisas que visem o crescimento,
maturação e fecundação in vitro, clonagem, transgenia, congelação e vitrificação (PICTON, 2001).
2.9 Cultivo in vitro de folículos ovarianos
O objetivo principal do cultivo in vitro de FOPA é permitir o desenvolvimento folicular assegurando o crescimento e maturação dos oócitos, bem como a multiplicação e posterior diferenciação das células da granulosa inclusas nesses folículos (FIGUEIREDO et al., 2003). O cultivo de ovários tem sido usado para avaliar a importância da vascularização (FORTUNE et al., 2000), apoptose (FLAWS et al., 2001) e fatores de crescimento (ERICKSON, 2001) para desenvolvimento de folículos primordiais (O`BRIEN et al., 2003).
Em roedores, a pequena dimensão dos ovários possibilita o cultivo do órgão inteiro, o que tem sido bastante útil para o estudo da foliculogênese inicial em pequenos mamíferos (FORTUNE, 2003). Por outro lado, em animais domésticos de médio e grande porte, devido às grandes dimensões dos ovários, não é possível utilizar este modelo. Para estes animais, o cultivo de pequenos fragmentos de córtex ovariano, rico em folículos primordiais, tem sido realizado para o estudo da ativação e crescimento de folículos primordiais caprinos (SILVA et al., 2004a), bovinos (BRAW-TAL & YOSSEFI, 1997) e humanos (SCOTT et al., 2004 e ZHANG et al., 2004). Folículos humanos permaneceram viáveis por quatro semanas quando cultivados em sistema “in
situ” (HOVATTA et al., 1997). O cultivo de pequenos fragmentos de córtex ovariano
tem a vantagem de manter a integridade estrutural folicular e as interações entre as células foliculares e células do estroma, facilitando a perfusão do meio para o tecido ovariano (TELFER, 1996).
Já o segundo sistema de cultivo folicular envolve o isolamento, mecânico ou enzimático dos folículos ovarianos pré-antrais (ABIR et al., 2001b). As técnicas de isolamento desenvolvidas possibilitam a recuperação de milhares de folículos pré-antrais a partir de um único ovário (FIGUEIREDO et al., 2003). Além disso, o cultivo de folículos isolados permite o monitoramento diário do crescimento folicular in vitro e o efeito in vitro de hormônios e fatores de crescimento sobre cada classe folicular (ABIR et al., 2001a).
Os folículos primários e secundários podem ser isolados e cultivados individualmente. Desta forma, métodos mecânicos têm sido desenvolvidos para isolar um grande número de folículos intactos de ovários de cabras (LUCCI et al., 1999), ovelhas (CECCONI et al., 1999), vacas (FIGUEIREDO et al., 1999), ratas (ZHAO et
al., 2000) e camundongas (LENIE et al., 2004). Uma vez isolados, os folículos podem
ser cultivados na sua forma intacta, para o estudo dos efeitos in vitro de hormônios e fatores de crescimento nos folículos primários ou secundários (SILVA, 2005). Os principais sistemas realizam o cultivo dos folículos diretamente sobre o suporte de plástico, sobre uma matriz de colágeno ou inclusos em gotas de colágeno (DEMEESTERE et al., 2005) (Figura 9).
a b c
In situ (ovário inteiro) In situ (fragmentos) isolado sobre placa
d e f
Isolado em suspensão isolado sobre matriz isolado incluso em matriz Figura 9. Modelos para cultivo in vitro de folículos pre-antrais. Folículos in situ (Fig. a, b) e isolados (Fig. c, d, e, f). Adaptado de HARTSHORNE, 1997.
2.9.1 Estado atual do cultivo in vitro de folículos pré-antrais
Vários autores têm utilizado sistemas de cultivo in situ e isolado para estudar o desenvolvimento de folículos pré-antrais em roedores e ruminantes (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005). Em gatas (JEWGENOW & STOLTE, 1996), gambás (BUTCHER & ULLMAN, 1996) e macacas (FORTUNE et al., 1998) já foi observado o crescimento
de folículos pré-antrais após cultivo in vitro, porém sem a formação de antro. Nas espécies bovinas (ITOH et al., 2002), ovinas (CECCONI et al., 1999), caprinas (HUAMIN & YONG, 2000) e humana (ROY & TREACY, 1993), folículos pré-antrais isolados foram cultivados in vitro e se desenvolveram até o estádio antral. Em suínos, folículos secundários crescidos in vitro chegaram até a ovulação, tiveram seus oócitos fecundados in vitro, com desenvolvimento até estádio de blastocisto (WU et al., 2001).
Os maiores avanços do cultivo folicular foram obtidos em roedores, tendo sido obtido o nascimento de crias viáveis a partir do cultivo de oócitos provenientes de folículos pré-antrais de camundongas, em que o oócito adquiriu competência para maturação, fertilização e desenvolvimento embrionário (O’ BRIEN et al., 2003). Tal crescimento foi obtido através de dois sistemas de cultivo. O primeiro consistiu no cultivo de ovários inteiros para obtenção da transição de primordial para primário. O segundo consistiu no isolamento e cultivo de folículos primários e secundários. Provavelmente essa estratégia é necessária para promover o crescimento de folículos primordiais de espécies domésticas e primatas (SILVA et al., 2006). Embora a utilização de fragmentos ovarianos no cultivo permita a ativação folicular (HOVATTA
et al., 1999), a variedade de células presentes no cultivo in situ torna o sistema pouco
definido e impede estudos mais detalhados sobre a biologia dos oócitos e da foliculogênese nos estádios iniciais de desenvolvimento (MURUVI et al., 2005). O presente desafio é determinar condições de cultivo apropriadas para dar suporte à transição de folículos primários para secundários “in vitro”. Esta fase apresenta alta sensibilidade à degeneração em virtude da alta atividade biossintética e consumo de nutrientes, sendo a composição do meio um importante fator para a obtenção de sucesso durante o cultivo de folículos pré-antrais in vitro (WANDJI et al., 1997).
2.9.2 Importância da composição do meio sobre desenvolvimento folicular in vitro
O desenvolvimento de um sistema de cultivo de base que garanta a ativação e crescimento folicular para um estádio em que os oócitos podem ser maturados e fertilizados in vitro é importante para estudar os fatores que controlam o crescimento oocitário e multiplicação das células da granulosa (ANDRADE et al., 2005).
A composição do meio de cultivo é um importante fator para obtenção de sucesso durante o cultivo in vitro de folículos ovarianos. FIGUEIREDO et al. (1994)
