O objetivo principal do cultivo in vitro de FOPA é permitir o desenvolvimento folicular assegurando o crescimento e maturação dos oócitos, bem como a multiplicação e posterior diferenciação das células da granulosa inclusas nesses folículos (FIGUEIREDO et al., 2003). O cultivo de ovários tem sido usado para avaliar a importância da vascularização (FORTUNE et al., 2000), apoptose (FLAWS et al., 2001) e fatores de crescimento (ERICKSON, 2001) para desenvolvimento de folículos primordiais (O`BRIEN et al., 2003).
Em roedores, a pequena dimensão dos ovários possibilita o cultivo do órgão inteiro, o que tem sido bastante útil para o estudo da foliculogênese inicial em pequenos mamíferos (FORTUNE, 2003). Por outro lado, em animais domésticos de médio e grande porte, devido às grandes dimensões dos ovários, não é possível utilizar este modelo. Para estes animais, o cultivo de pequenos fragmentos de córtex ovariano, rico em folículos primordiais, tem sido realizado para o estudo da ativação e crescimento de folículos primordiais caprinos (SILVA et al., 2004a), bovinos (BRAW-TAL & YOSSEFI, 1997) e humanos (SCOTT et al., 2004 e ZHANG et al., 2004). Folículos humanos permaneceram viáveis por quatro semanas quando cultivados em sistema “in
situ” (HOVATTA et al., 1997). O cultivo de pequenos fragmentos de córtex ovariano
tem a vantagem de manter a integridade estrutural folicular e as interações entre as células foliculares e células do estroma, facilitando a perfusão do meio para o tecido ovariano (TELFER, 1996).
Já o segundo sistema de cultivo folicular envolve o isolamento, mecânico ou enzimático dos folículos ovarianos pré-antrais (ABIR et al., 2001b). As técnicas de isolamento desenvolvidas possibilitam a recuperação de milhares de folículos pré- antrais a partir de um único ovário (FIGUEIREDO et al., 2003). Além disso, o cultivo de folículos isolados permite o monitoramento diário do crescimento folicular in vitro e o efeito in vitro de hormônios e fatores de crescimento sobre cada classe folicular (ABIR et al., 2001a).
Os folículos primários e secundários podem ser isolados e cultivados individualmente. Desta forma, métodos mecânicos têm sido desenvolvidos para isolar um grande número de folículos intactos de ovários de cabras (LUCCI et al., 1999), ovelhas (CECCONI et al., 1999), vacas (FIGUEIREDO et al., 1999), ratas (ZHAO et
al., 2000) e camundongas (LENIE et al., 2004). Uma vez isolados, os folículos podem
ser cultivados na sua forma intacta, para o estudo dos efeitos in vitro de hormônios e fatores de crescimento nos folículos primários ou secundários (SILVA, 2005). Os principais sistemas realizam o cultivo dos folículos diretamente sobre o suporte de plástico, sobre uma matriz de colágeno ou inclusos em gotas de colágeno (DEMEESTERE et al., 2005) (Figura 9).
a b c
In situ (ovário inteiro) In situ (fragmentos) isolado sobre placa
d e f
Isolado em suspensão isolado sobre matriz isolado incluso em matriz Figura 9. Modelos para cultivo in vitro de folículos pre-antrais. Folículos in situ (Fig. a, b) e isolados (Fig. c, d, e, f). Adaptado de HARTSHORNE, 1997.
2.9.1 Estado atual do cultivo in vitro de folículos pré-antrais
Vários autores têm utilizado sistemas de cultivo in situ e isolado para estudar o desenvolvimento de folículos pré-antrais em roedores e ruminantes (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005). Em gatas (JEWGENOW & STOLTE, 1996), gambás (BUTCHER & ULLMAN, 1996) e macacas (FORTUNE et al., 1998) já foi observado o crescimento
de folículos pré-antrais após cultivo in vitro, porém sem a formação de antro. Nas espécies bovinas (ITOH et al., 2002), ovinas (CECCONI et al., 1999), caprinas (HUAMIN & YONG, 2000) e humana (ROY & TREACY, 1993), folículos pré-antrais isolados foram cultivados in vitro e se desenvolveram até o estádio antral. Em suínos, folículos secundários crescidos in vitro chegaram até a ovulação, tiveram seus oócitos fecundados in vitro, com desenvolvimento até estádio de blastocisto (WU et al., 2001).
Os maiores avanços do cultivo folicular foram obtidos em roedores, tendo sido obtido o nascimento de crias viáveis a partir do cultivo de oócitos provenientes de folículos pré-antrais de camundongas, em que o oócito adquiriu competência para maturação, fertilização e desenvolvimento embrionário (O’ BRIEN et al., 2003). Tal crescimento foi obtido através de dois sistemas de cultivo. O primeiro consistiu no cultivo de ovários inteiros para obtenção da transição de primordial para primário. O segundo consistiu no isolamento e cultivo de folículos primários e secundários. Provavelmente essa estratégia é necessária para promover o crescimento de folículos primordiais de espécies domésticas e primatas (SILVA et al., 2006). Embora a utilização de fragmentos ovarianos no cultivo permita a ativação folicular (HOVATTA
et al., 1999), a variedade de células presentes no cultivo in situ torna o sistema pouco
definido e impede estudos mais detalhados sobre a biologia dos oócitos e da foliculogênese nos estádios iniciais de desenvolvimento (MURUVI et al., 2005). O presente desafio é determinar condições de cultivo apropriadas para dar suporte à transição de folículos primários para secundários “in vitro”. Esta fase apresenta alta sensibilidade à degeneração em virtude da alta atividade biossintética e consumo de nutrientes, sendo a composição do meio um importante fator para a obtenção de sucesso durante o cultivo de folículos pré-antrais in vitro (WANDJI et al., 1997).
2.9.2 Importância da composição do meio sobre desenvolvimento folicular in vitro
O desenvolvimento de um sistema de cultivo de base que garanta a ativação e crescimento folicular para um estádio em que os oócitos podem ser maturados e fertilizados in vitro é importante para estudar os fatores que controlam o crescimento oocitário e multiplicação das células da granulosa (ANDRADE et al., 2005).
A composição do meio de cultivo é um importante fator para obtenção de sucesso durante o cultivo in vitro de folículos ovarianos. FIGUEIREDO et al. (1994)
descreveram que a sobrevivência dos folículos pré-antrais bovinos in vitro foi reduzida na ausência de hipoxantina e substratos energéticos, tais como piruvato e glutamina. Foi demonstrado também que uma mistura de piruvato (0,23 mM), glutamina (2 mM) e hipoxantina ao meio de cultivo de base (MEM), suplementado com ITS (insulina – 6,25 μg/ml, transferrina - 6,25 μg/ml e selênio - 6,25 μg/ml) aumentou significativamente a porcentagem de folículos morfologicamente normais durante o cultivo. JEWGENOW et
al. (1998) mostraram também que a adição de piruvato, glutamina e hipoxantina ao
meio de cultivo (MEM) são essenciais para o crescimento de folículos pré-antrais felinos in vitro.
Insulina é normalmente adicionada ao meio de cultivo como fator de sobrevivência, permitindo um melhor aproveitamento das fontes de energia do meio e aumentando os precussores metabólicos como aminoácidos e glicose (LIU et al., 2002). Os antioxidantes (selênio e transferrina) são relatados como importantes substâncias a serem adicionadas ao meio. Alguns autores sugerem que o processo de maturação folicular está relacionado aos altos níveis de transferrina e seus receptores na célula e que selênio pode ser adicionado ao meio de cultivo para ativar enzimas envolvidas na detoxificação e eliminação de radicais livres (DEMEESTERE et al., 2005). SILVA et al. (2004b) demonstraram a importância da adição de tais substâncias ao MEM durante o cultivo de folículos pré-antrais caprinos inclusos no tecido ovariano. O FSH é usualmente adicionado ao meio de cultivo de folículos pré-antrais em camundongas e grandes mamíferos (MAO et al., 2002). Em caprinos, a adição de 50 ng/mL de FSH ao meio de cultivo de folículos pré-antrais inclusos em tecido ovariano foi responsável pela preservação da viabilidade folicular, aumento dos diâmetros folicular e oocitário bem como pela manutenção da integridade ultra-estrutural dos folículos (MATOS et al., 2007). MITCHELL et al. (2002) revelaram que na ausência de FSH somente 10% dos folículos sobreviveram durante crescimento in vitro.