Avaliação do efeito do stresse hídrico no desenvolvimento
dos tecidos da azeitona: impactos na acumulação de azeite
Dissertação de Mestrado em Engenharia Agronómica
Marília Cristina Pires Silva
Anabela Afonso Fernandes Silva
Eunice Luís Vieira Areal Bacelar
Avaliação do efeito do stresse hídrico no desenvolvimento
dos tecidos da azeitona: impactos na acumulação de azeite
Dissertação de Mestrado em Engenharia Agronómica
Composição do Júri:
Presidente do júri: Professor Doutor Virgílio Alexandre Cardoso e Falco da Costa 1º Vogal: Professor Coordenador com Agregação José Alberto Cardoso Pereira 2º Vogal: Professora Doutora Anabela Afonso Fernandes Silva
VILA REAL, 2014
Marília Cristina Pires Silva
Orientadora: Anabela Afonso Fernandes Silva
Coorientadora: Eunice Luís Vieira Areal Bacelar
O trabalho que se apresenta teve o apoio financeiro de:
Projeto: IRRIGOLIVE " Rega deficitária na oliveira (Olea europaea L.), na região da Terra Quente Transmontana, com vista à otimização dos recursos hídricos, produtividade e qualidade do azeite. PROJETO IRRIGOLIVE - PA 44662 IF0019
“As doutrinas expostas neste trabalho são da exclusiva responsabilidade do autor”
v
Agradecimentos
Este trabalho teve um grande significado, uma vez que permite-me concluir o mestrado, desse modo, queria deixar aqui o meu agradecimento para algumas pessoas que contribuíram de alguma forma para este trabalho.
Ao magnífico reitor da UTAD, professor António Fontainhas Fernandes pelo suporte que permitiu a realização do presente trabalho.
À minha orientadora, à Professora Doutora Anabela Silva e a minha coorientadora Professora Doutora Eunice Bacelar, queria agradecer por me terem permitido realizar este projeto, por me transmitirem os ensinamentos necessários à realização deste trabalho e toda a atenção e paciência.
Agradeço a simpatia e disponibilidade ao Sr. Engenheiro João Oliveira proprietária do olival em estudo.
Ao Doutor Alfredo Aires pelo ensinamento e apoio na elaboração deste trabalho. Agradeço também a amizade e paciência com que sempre me tratou.
Aos funcionários do Departamento de Agronomia, em especial à Técnica Áurea Queirós e à Técnica Rosa, o meu agradecimento pela ajuda, paciência e disponibilização dos meios necessários à realização deste trabalho.
À doutora Helena e à Dona Ana do Departamento de Biologia e Ambiente quero agradecer a ajuda e simpatia.
Aos meus amigos e colegas de curso Vera Castro, Jeremy Teixeira, Sofia Ribeiro, Carla Sousa e Daniela Ochoa agradeço por todo o incentivo e amizade, que mesmo distantes continuam a apoiar-me.
Ao meu namorado, Daniel Gonçalves, agradeço o carinho, paciência e força que me tem dado principalmente nestes últimos anos.
Aos meus pais, ao meu irmão e aos meus avós que sempre lutaram para que eu conseguisse chegar onde cheguei. Agradeço todo o esforço, sacrifício, dedicação e amor que sempre me ofereceram e por nunca deixarem de acreditar em mim.
vi
Resumo
A oliveira é uma cultura tradicionalmente de sequeiro na região de Trás-os-Montes, contudo o aumento da procura de azeite e de azeitona de mesa resultou no aumento da produtividade, levando à necessidade de rega na época de maior défice hídrico. Mas a aplicação de rega tem de ser bem gerida pelo agricultor de forma a rentabilizar a produção e economizar água.
Com este trabalho pretendeu-se estudar o desenvolvimento e qualidade da azeitona durante o seu crescimento e maturação com a aplicação de vários tratamentos: rega deficitária 40% e 75% da evapotranspiração cultural (ETc), rega parcial das raízes (PRD -
partial root drying System) e rega máxima,100% da evapotranspiração cultural (ETc), na
cultivar (cv). Cobrançosa, num olival situado na Terra Quente Transmontana. Para isso, foram analisados parâmetros histológicos, biométricos, teor em gordura, composição fenólica e atividade antioxidante das azeitonas e ainda o estado hídrico da oliveira.
Ao nível histológico, foram constatadas algumas diferenças nos frutos dos 4 tratamentos. Inicialmente verificou-se uma grande influência do regime hídrico na espessura da cutícula, apresentando o tratamento 100% ETc os menores valores. No entanto, não se
registaram diferenças na espessura da cutícula entre azeitonas maduras. Comparando os valores ao longo dos estados fenológicos, verificou-se que apenas no tratamento 100% ETc as
células epidérmicas aumentaram consideravelmente ao longo do desenvolvimento da azeitona, provavelmente em consequência de um maior grau de turgescência. Também se verificou que o tratamento 40% ETc apresentou menor área das células do mesocarpo em
todos os estados fenológicos, contrariamente ao tratamento 100% ETc, que se destacou com
os maiores valores.
Por outro lado, o teor em gordura em relação à matéria seca foi muito influenciado pelo tratamento de rega, sendo superior no tratamento 40%ETc (37,74%),
seguido do tratamento PRD, com 32,34%, o tratamento 100% ETc, com 31,41% e por fim o
tratamento 75%ETc, com 28,29%.
Relativamente à qualidade do fruto, o teor em polifenois totais e orto-difenois diminuiu durante a maturação e foram afetados pelo tratamento de rega. Os tratamentos com menor aplicação de água apresentaram maiores teores de polifenois totais e orto-difenois.
vii Foi encontrada uma relação altamente significativa entre o conteúdo em polifenois totais e orto-difenois com a atividade antioxidante na maturação do fruto. A oleuropeína e o verbascósido foram os compostos fenólicos que mais se destacaram na maturação em todos os tratamentos de rega.
Palavras-chave: Olea europaea L., tratamento de rega, mesocarpo, compostos fenólicos e
viii
Abstract
The olive tree is a traditionally rainfed crop in the region of Trás -os- Montes, however the increased demand olive oil and table olives resulted in the increased productivity, leading to the need of watering during periods of greater water deficit. But the application of irrigation must be managed by the farmer in order to monetize the production and save water.
With this work we intend to study the development and quality of olive during growth and maturation with the application of various treatments: stress irrigation 40% and 75% of crop evapotranspiration (ETc), irrigation partial roots (PRD - partial root drying) and
maximum irrigation, 100% crop evapotranspiration (ETc), in cv. Cobrançosa, situated in Terra
Quente Transmontana. For that, were analyzed histological parameters, biometric, fat content, phenolic content and antioxidant activity of the olive and also the water status of the olive tree.
The histological level, some differences were found in fruits of four treatments. Initially there was a great influence of water regime in cuticle thickness, with 100% ETc
treatment the lowest. However, there was no difference in cuticle thickness of ripe olives. Comparing the values over the growth stages, it was found that only in the 100% ETc
epidermal cells increased considerably over the development of the olive, probably as a consequence of a higher degree of turgidity. It was also found that treatment 40% ETc of the
cells showed lower area of the mesocarp in all growth stages, contrary to treat 100% ETc.,
which are highlighted with the highest values.
On the other hand, the fat content in the dry matter was greatly influenced by irrigation treatment, the treatment being greater than 40%ETc ( 37,74 %) tirar espaço followed by treatment PRD , with 32,34%, treatment 100%ETc, with 31,41% and finally the treatment 75%ETc, with 28,29% .
Regarding the quality of the fruit content, the total of polyphenols and ortho-diphenols decreased during maturation and were affected by the irrigation treatment. Treatments with lower water application showed higher levels of total polyphenols and ortho-diphenols.
A highly significant relationship between the content of total polyphenols and
ix verbascósido were the phenolic compounds that excelled at maturity in all irrigation treatments.
Keywords: Cobrançosa, irrigation treatment, mesocarp, phenolic compounds and antioxidant activity
x
Índice
Resumo………..vi
Abstract ... viii
Índice ... x
Índice de Figuras ... xii
Índice de Quadros ... xvi
Abreviaturas ... xvii
CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO ... 18
1.1. Enquadramento temático ... 19
1.2. Classificação sistemática da oliveira ... 20
1.3. Olivicultura em Portugal ... 21
1.4. A azeitona ... 25
1.4.1. Desenvolvimento do exocarpo, mesocarpo e endocarpo ... 25
1.5. Constituição química dos diferentes tecidos da azeitona ... 28
1.6. Rega no Olival ... 29
1.6.1. Estratégias de rega deficitária ... 32
1.7. Resposta da oliveira à rega ... 32
1.8. Acumulação de gordura na azeitona ... 34
1.9. Compostos fenólicos... 35
1.9.1. Compostos fenólicos na azeitona ... 37
1.9.2. Importância dos compostos fenólicos ... 38
1.10. Objetivos ... 39
CAPÍTULO 2 MATERIAL E MÉTODOS ... 41
2.1. Localização do campo experimental ... 42
2.2. Caraterização climática ... 43
xi
2.4. Amostragem de frutos ... 46
2.5. Estado hídrico da planta ... 47
2.6. Estudo histológico das azeitonas ... 48
2.7. Parâmetros biométricos do fruto ... 50
2.8. Determinação do teor de gordura nas azeitonas ... 51
2.9. Análises químicas ... 54
2.9.1. Preparação dos extratos para a determinação dos polifenois totais, orto-difenois e atividade antioxidante ... 54
2.9.2. Determinação dos polifenois totais ... 55
2.9.3. Determinação do teor em orto-difenois ... 56
2.9.4. Caraterização do perfil fenólico por HPLC ... 57
2.9.5. Poder redutor – Fe3+ para Fe2+ ... 60
2.9.6. Sequestro dos radicais de ABTS. ... 61
2.9.7. Sequestro dos radicais livres do DPPH ... 63
2.9.8. Oxidação do β-caroteno - ácido linoleico ... 65
2.9.9. Análise de pigmentos ... 66
2.9.10. Microscopia ótica ... 67
2.10. Análise estatística dos dados ... 67
CAPÍTULO 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 68
3.1. Estado hídrico ... 69
3.2. Análise histológica das azeitonas ... 71
3.3. Parâmetros biométricos do fruto... 78
3.4. Teor de gordura ... 82
3.5. Compostos fenólicos, pigmentos e atividade antioxidante ... 84
CAPÍTULO 4 CONCLUSÃO ... 95
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 98
xii
Índice de Figuras
Figura 1.1 Área de olival das diferentes regiões do país.. ... 22
Figura 1.2 Evolução do setor do azeite em Portugal (1000 ton). ... 23
Figura 1.3 Destino das exportações portuguesas de azeite no ano 2010.. ... 23
Figura 1.4 Caraterísticas do fruto e da folha da cultivar. Cobrançosa. ... 25
Figura 1.5 Principais tecidos da azeitona (cultivar Cobrançosa): a - exocarpo; b - mesocarpo; c – endocarpo.. ... 25
Figura 1.6 Peso e diâmetro transversal da azeito ao longo do seu desenvolvimento. ... 26
Figura 1.7 Corte histológico de uma seção de uma azeitona da cultivar. Cobrançosa onde é possível ver: A-epiderme (cutícula, células da epiderme); B-mesocarpo. ... 27
Figura1.8 Organização e características dos tecidos adjacentes à epiderme da azeitona – hipoderme, mesocarpo exterior e mesocarpo. ... 28
Figura1.9 Relação entre a aplicação de água e a produção de azeitonas em duas colheitas. .. 31
Figura 1.10 Concentração de gordura (% de gordura/peso seco) em diferentes condições hídricas nas últimas duas fases da lipogénese. ... 35
Figura1.11 Estrutura base dos flavonoides. ... 36
Figura 1.12 Estrutura molecular base dos ácidos benzoicos (esquerda) e dos ácidos cinâmicos (direita) e respetivas estrutura dos ácidos mais abundantes nos alimentos.. ... 36
Figura 1.13 Estrutura molecular da oleuropeína (esquerda) e do ligostrósido (direita).. ... 37
Figura 1.14 Estrutura molecular do verbascósido.. ... 38
Figura 2.1 Localização do ensaio experimental no concelho de Vila Flor no Nordeste de Portugal. ... 42
Figura 2.2 Parcela de olival em estudo com o desenho experimental da parcela em estudo em bloco aleatório. A cor azul corresponde ao tratamento 40% ETc, a cor amarela ao tratamento 75% ETc, a cor preta ao tratamento PRD e a cor verde ao tratamento 100% ETc. ... 45
Figura 2.3 Colheita das azeitonas no dia 29 de novembro e separação, em caixas, pelos respetivos tratamentos de rega. ... 45
Figura 2.4 Fases de desenvolvimento da cor na azeitona.. ... 46
Figura 2.5 Medição do potencial hídrico. A- ramo de oliveira cortado em bisel na câmara de pressão; B- leitura do potencial hídrico ... 47
Figura 2.6 Primeira etapa da preparação histológica das azeitonas. A-Corte das azeitonas; B- aparelho de inclusão; C- micrótomo rotativo; D- cortes foram colocados em lâminas depois de esticados na água aquecida ... 49
Figura 2.7 Segunda etapa da preparação histológica das azeitonas. A- serie etílica de concentrações decrescentes; B-Corante utilizado (azul de toluidina); C-Montagem de uma lâmina definitiva; D-lâminas em repouso para o meio de montagem solidificar. ... 50
Figura 2.8 Descaroçamento das azeitonas. ... 51 Figura 2.9 Determinação do teor de gordura pelo método de Soxhlet. A- Amostra de azeitona
C-xiii evaporador de vácua para evaporar o éter de petróleo; D-exsicador com os balões a arrefecer, para posterior pesagem da gordura. ... 53
Figura 2.10 Preparação dos extratos. A-Maceração do mesocarpo das azeitonas; B-Adição de
metanol/água destilada às azeitonas esmagadas C-filtração dos extratos de restos sólidos de azeitona; D-Decantação do extrato para eliminar a gordura. ... 54
Figura 2.11 Determinação dos polifenos totais. A-Solução antes do repouso de 1h no escuro;
B-Solução após o repouso de 1 h no escuro (da direita para a esquerda seguem-se os tratamentos 100% ETc, 75% ETc, 40% ETc e PRD). ... 56
Figura 2.12 Determinação do teor em orto-difenois. Solução após a reação do molibdato de
sódio com os extratos (da direita para a esquerda seguem-se os tratamentos 100% ETc, 75%
ETc, 40% ETc e PRD)... 57
Figura 2.13 Caraterização do perfil fenólico por HPLC. A-Extração de gordura com hexano;
B-Microtubos com extratos no bloco térmico; C- Quantificação dos fenólicos individuais por HPLC equipado com um detetor Diodearry ... 59
Figura 2.14 Determinação do poder redutor – Fe3+ para Fe2+. A-acerto do pH da solução de fosfato de sódio; B-soluções usadas (fosfato de sódio, ácido tricloracético, hexacianoferrato de potássio e cloreto férrico); C- Aspeto (cor amarela) depois de colocar o ácido tricloracético; D-reação de mudança de cor provocada pela adição de FeCl3 (da direita para a
esquerda seguem-se os tratamentos 100% ETc, 75% ETc, 40% ETc e PRD). ... 61
Figura 2.15 Princípio do método da determinação da capacidade antioxidante do radical
ABTS.. ... 61
Figura 2.16 Sequestro dos radicais de ABTS. A-mistura do ABTS com água ultra pura; B-
catião ABTS•+; C-amostras em banho-maria a 37ºC durante 10 minutos; D- após a incubação das amostras é visível a descoloração (da direita para a esquerda o tratamento 100% ETc, 75%
ETc, 40% ETc e PRD)... 63
Figura 2.17 Sequestro dos radicais livres de DPPH. A-preparação da solução de DPPH;
B-após o período de incubação são evidentes as mudanças de coloração (da direita para a esquerda seguem-se os tratamentos 100% ETc, 75% ETc, 40% ETc e PRD); C- Comparação
da mudança de coloração entre o tratamento 100% ETc e 40% ETc; D-leitura no
espectrofotómetro. ... 64
Figura 2.18 Oxidação do β-caroteno - ácido linoleico. A-Evaporação do clorofórmio num
extrator de vácuo; B- Após a adição de água destilada à solução de β-caroteno - ácido linoleico; C-Soluções com o extrato no tempo 0 (da direita para a esquerda seguem-se os tratamentos 100% ETc, 75% ETc, 40% ETc e PRD); D-Soluções com o extrato no tempo 2h
(da direita para a esquerda seguem-se os tratamentos 100% ETc, 75% ETc, 40% ETc e PRD).
... 66
Figura 3.1Fotografias obtidas por microscopia ótica para determinar a espessura da cutícula e
a área e perímetro das células da epiderme (200µm), nos tratamentos de rega 1-40%ETc (rega deficitária contínua), 2-PRD (Partial Root Drying System), 3-75%ETc (rega deficitária contínua) e 4-100%ETc (rega máxima), A - dia 15 de julho - estado fenológico endurecimento do caroço e B- dia 29 de novembro – estado fenológico maturação ... 72
Figura 3.2 Espessura da cutícula (µm) das azeitonas nos tratamentos de rega 40%ETc (rega
xiv 100%ETc (rega máxima) no dia 15 de julho - estado fenológico endurecimento do caroço, no
dia 17 de setembro – estado fenológico verde e no dia 29 de novembro – estado fenológico maturação. Letras diferentes significam valores estatisticamente diferentes para o teste de separação de médias de Tukey para um p <0,05 entre os tratamentos de rega em cada data e estado fenológico. ... 73
Figura 3.3 Área das células da epiderme (µm2) das azeitonas nos tratamentos de rega 40%ETc (rega deficitária continua), 75%ETc (rega deficitária continua), PRD (Partial Root
Drying System) e 100%ETc (rega máxima), no dia 15 de julho - estado fenológico
endurecimento do caroço, no dia 17 de setembro – estado fenológico verde e no dia 29 de novembro – estado fenológico maturação. Letras diferentes significam valores estatisticamente diferentes para o teste de separação de médias de Tukey para um p <0,05 entre os tratamentos de rega em cada data e estado fenológico. ... 74
Figura 3.4 Perímetro das células da epiderme (µm) das azeitonas nos tratamentos de rega
40%ETc (rega deficitária continua), 75%ETc (rega deficitária continua), PRD (Partial Root
Drying System) e 100%ETc (rega máxima), no dia 15 de julho - estado fenológico
endurecimento do caroço, no dia 17 de setembro – estado fenológico verde e no dia 29 de novembro – estado fenológico maturação. Letras diferentes significam valores estatisticamente diferentes para o teste de separação de médias de Tukey para um p <0,05 entre os tratamentos de rega em cada data e estado fenológico. ... 74
Figura 3.5 Número de células do mesocarpo nos tratamentos de rega40%ETc (rega deficitária
continua), 75%ETc (rega deficitária continua), PRD (Partial Root Drying System) e 100%ETc
(rega máxima), no dia 15 de julho - estado fenológico endurecimento do caroço, no dia 17 de setembro – estado fenológico verde e no dia 29 de novembro – estado fenológico maturação. Letras diferentes significam valores estatisticamente diferentes para o teste de separação de médias de Tukey para um p <0,05 entre os tratamentos de rega em cada data e estado fenológico. ... 75
Figura 3.6 Fotografias obtidas por microscopia ótica das células do mesocarpo (50µm), nos
tratamentos 1-40%ETc (rega deficitária contínua), 2-PRD (Partial Root Drying System), 3-75%ETc (rega deficitária contínua) e 4-100%ETc (rega máxima), A- dia 15 de julho - estado fenológico endurecimento do caroço, e B- dia 29 de novembro – estado fenológico maturação. ... 76
Figura 3.7 Área das células do mesocarpo (µm2) das azeitonas nos tratamentos de rega40%ETc (rega deficitária continua), 75%ETc (rega deficitária continua), PRD (Partial
Root Drying System) e 100%ETc (rega máxima), no dia 15 de julho - estado fenológico
endurecimento do caroço, no dia 17 de setembro – estado fenológico verde e no dia 29 de novembro – estado fenológico maturação. Letras diferentes significam valores estatisticamente diferentes para o teste de separação de médias de Tukey para um p <0,05 entre os tratamentos de rega em cada data e estado fenológico. ... 77
Figura 3.8 Perímetro das células do mesocarpo (µm) das azeitonas nos tratamentos de rega
40%ETc (rega deficitária continua), 75%ETc (rega deficitária continua), PRD (Partial Root
Drying System) e 100%ETc (rega máxima), no dia 15 de julho - estado fenológico
endurecimento do caroço, no dia 17 de setembro – estado fenológico verde e no dia 29 de novembro – estado fenológico maturação. Letras diferentes significam valores
xv estatisticamente diferentes para o teste de separação de médias de Tukey para um p <0,05 entre os tratamentos de rega em cada data e estado fenológico. ... 77
Figura 3.9 Relação entre o peso e volume dos frutos, juntando todos os tratamentos de rega e
os dias 17 de setembro e 29 de novembro. ... 81
Figura 3.10 Teor de gordura (%, peso seco), nos tratamentos de rega40%ETc (rega deficitária
continua), 75%ETc (rega deficitária continua), PRD (Partial Root Drying System) e 100%ETc
(rega máxima), na colheita (dia 29 de novembro). Letras diferentes significam valores estatisticamente diferentes para o teste de separação de médias de Tukey para um p <0,05. . 83
Figura 3.11 Teor de polifenois totais (mg.kg-1 peso seco equivalentes de ácido gálico) nos tratamentos de rega 40%ETc (rega deficitária continua), 75%ETc (rega deficitária continua),
PRD (Partial Root Drying System) e 100%ETc (rega máxima), no dia 17 de setembro - estado
fenológico verde e no dia 29 de novembro – estado fenológico maturação. Letras diferentes significam valores estatisticamente diferentes para o teste de separação de médias de Tukey para um p <0,05 entre os tratamentos de rega em cada data e estado fenológico. ... 85
Figura 3.12 Teor de orto-difenois (mg.kg-1 peso seco equivalentes de ácido cafeico) nos tratamentos de rega 40%ETc (rega deficitária continua), 75%ETc (rega deficitária continua),
PRD (Partial Root Drying System) e 100%ETc (rega máxima), no dia 17 de setembro - estado
fenológico verde e no dia 29 de novembro – estado fenológico maturação. Letras diferentes significam valores estatisticamente diferentes para o teste de separação de médias de Tukey para um p <0,05 entre os tratamentos de rega em cada data e estado fenológico. ... 86
Figura 3.13 Cromatograma obtido por HPLC a 280nm, onde se identificam os compostos:
1-Hidroxitirosol, 2- tirosol, 3-cianidina-3- glicósido, 4-cianidina-3-rutinósido, 5-rutina, 6-verbascósido, 7-luteolina, 8-ácido ferúlico, 9-naringina (padrão interno) e 10-oleuropeína. .. 87
Figura 3.14 Atividade antioxidante determinada pelos métodos A-Poder redutor – Fe3+ para Fe2+, B-Sequestro dos radicais de DPPH, C-Sequestro de radicais de ABTS e D-Oxidação do β-caroteno-ácido linoleico, nos tratamentos de rega 40%ETc (rega deficitária continua),
75%ETc (rega deficitária continua), PRD (Partial Root Drying System) e 100%ETc (rega
máxima), no dia 17 de setembro – estado fenológico verde e no dia 29 de novembro – estado fenológico maturação. Letras diferentes significam valores estatisticamente diferentes para o teste de separação de médias de Tukey para um p <0,05 entre os tratamentos de rega em cada data e estado fenológico. ... 94
xvi
Índice de Quadros
Quadro 1.1 Classificação dos 8 primeiros países produtores de azeite e produção mundial.. 19 Quadro 1.2 Sistemática da Olea europaea L.. ... 21 Quadro 1.3 Composição química das diferentes partes constituintes da azeitona (% em
relação ao peso fresco). ... 29
Quadro 1.4 Resposta da oliveira ao défice hídrico durante o desenvolvimento da cultura .... 34 Quadro 2.1 Dados climáticos da Quinta do Carrascal no período que decorreu o estudo. ... 44 Quadro 3.1 Potencial hídrico do ramo de base e ao meio-dia-solar (MPa), nos tratamentos de
rega 40%ETc (rega deficitária continua), 75%ETc (rega deficitária continua), PRD (Partial
Root Drying System) e 100%ETc (rega máxima), nos dias 25 de julho e 25 de setembro. ... 70
Quadro 3.2 Teor relativo em água das folhas (RWC, %), nos tratamentos de rega 40%ETc
(rega deficitária continua), 75%ETc (rega deficitária continua), PRD (Partial Root Drying
System) e 100%ETc (rega máxima), nos dias 20 de Junho e 17 de Setembro. ... 71
Quadro 3.3 Peso fresco dos frutos, do mesocarpo e do endocarpo (g) nos tratamentos de rega
40%ETc (rega deficitária continua), 75%ETc (rega deficitária continua), PRD (Partial Root
Drying System) e 100%ETc (rega máxima), no dia 17 de setembro - estados fenológicos verde
e no dia 29 de novembro – estado fenológico maturação. ... 79
Quadro 3.4 Volume médio dos frutos (cm3), do mesocarpo e do endocarpo, nos tratamentos de rega 40%ETc (rega deficitária continua), 75%ETc (rega deficitária continua), PRD (Partial
Root Drying System) e 100%ETc (rega máxima), no dia 17 de setembro - estado fenológico
Verde e no dia 29 de novembro – estado fenológico maturação. ... 81
Quadro 3.5 Quantificação dos compostos fenólicos individuais identificados por HPLC (µg/g
peso seco): hidroxitirosol, tirosol, cianidina-3- glicósido, cianidina-3-rutinósido, rutina, verbascósido, luteolina, ácido ferúlico e oleuropeína. ... 90
Quadro 3.6 Clorofila a, clorofila b e carotenoides totais (µg/mL) quantificados no extrato
metanólico nas azeitonas dos tratamentos de rega 40%ETc (rega deficitária continua),
75%ETc (rega deficitária continua), PRD (Partial Root Drying System) e 100%ETc (rega
máxima), no dia 17 de setembro - estado fenológico verde e no dia 29 de novembro – estado fenológico maturação. ... 91
Quadro 3.7 Correlação entre os compostos fenólicos totais, orto-difenois, compostos
fenólicos individuais identificados por HPLC (hidroxitirosol, tirosol, cianidina-3- glicósido, cianidina-3-rutinósido, rutina, verbascósido, luteolina, ácido ferúlico e oleuropeína) e atividade antioxidante (Poder redutor – Fe3+ para Fe2+, Sequestro dos radicais de DPPH e Sequestro de radicais de ABTS). ... 93
xvii
Abreviaturas
Abs. – Absorvância
ABTS– Ácido 2,2 – azino – bis – 3 – etilbenzotiazolina – 6 – sulfónico DOP – Denominação de Origem Protegida
FAO – Food and Agricultural Organization of the United Nations ETc – Evapotranspiração cultural
ETo – Evapotranspiração de referência
HPLC – High Perfomance Liquid Chromatography
INE – Instituto Nacional de Estatística
PRD – (Partial Root Drying System) Rega parcial das raízes RD – Rega deficitária
RDC - Rega deficitária contínua RDI - Rega deficitária controlada rpm- Rotações por minuto
18
CAPÍTULO 1
19
1.1. Enquadramento temático
A oliveira (Olea europaea L.) ocupa cerca de 9,5 milhões de hectares na Bacia Mediterrânica (COI, 2014). A partir de meados da década de 90 do século anterior assistiu-se a uma expansão mundial do setor do azeite tanto na produção como no consumo. Esta tendência deve-se em grande parte ao elevado valor nutricional reconhecido da dieta mediterrânica (Barjol, 2014).
A nível mundial a produção de azeite atingiu as 3 321 000 ton na campanha 2011/2012 (Quadro 1.1). A produção de azeite na União Europeia corresponde a 76% da produção mundial e tem crescido significativamente nos últimos anos (Sousa et al., 2014). A Espanha ocupa o 1º lugar a nível mundial dos países produtores, com 1615 000 ton na campanha 2011/2012, com 616 000 ton em 2012/2013 (valores provisórios) e para a campanha 2013/2014 são estimadas 1537 000 ton, segue-se a Itália e a Grécia. Portugal, ocupa o 8º lugar dos países produtores, com uma produção em 2011/2012 de 76 000 ton, em 2012/2013 rondou as 59 000 ton (valores provisórios) e prevê-se que na campanha 2013/2014 atinja novamente as 76 200 ton (Barjol, 2014).
. Quadro 1.1 Classificação dos 8 primeiros países produtores de azeite e produção mundial.
Países Produção (ton)
2011/2012 2012/2013 (provisórios) 2013/2014 (estimados) Espanha 1 615 000 616 300 1 536 600 Itália 399 200 415 500 450 000 Grécia 294 600 357 900 230 000 Turquia 191 000 195 000 180 000 Síria 198 000 198 000 135 000 Marrocos 120 000 100 000 120 000 Tunísia 182 000 220 000 80 000 Portugal 76 200 59 100 76 200 Mundial 3 321 000 2 425 000 3 098 000 Adaptado de Barjol (2014).
Em Portugal, uma das regiões mais importantes no cultivo da oliveira é a região de Trás-os-Montes com 5 535 explorações de olival. Assim, nesta região o olival ocupa uma área total de 75 266 ha, que correspondem a 22% da área total de olival total das explorações do país. Esta região é a principal produtora de azeitona de mesa com 2 740 ha (67%)
(INE-20 RGA, 2009). Na região de Trás-os-Montes, é a Terra Quente Transmontana que tem maior importância na produção de azeite, nomeadamente nas localidades de Mirandela, Vila Flor e Alfândega da Fé. As cultivares predominantes nesta região são Verdeal Transmontana, Madural, Cobrançosa e Cordovil que permitem a produção de azeites equilibrados, com um aroma e sabor a frutos frescos, por vezes amendoado e com uma sensação a doce verde amargo e picante (Alves, 2007).
A oliveira é uma espécie que desenvolveu características anatómicas e morfológicas que a torna adaptada às características do clima mediterrânico, com produções substanciais sob baixa disponibilidade hídrica, elevada temperatura e radiação solar (Bacelar
et al., 2004; Fernandes-Silva et al., 2010). Contudo, com a aplicação de rega durante os
períodos longos de défice hídrico responde com aumento da produtividade, devido ao aumento da produção de frutos, tanto em tamanho como em número (Rapoport et al., 2004; Machado et al., 2013).
Deste modo, a rega é usada com o objetivo de aumentar a produção, o tamanho dos frutos, a relação polpa/caroço e a quantidade de azeite (Rapoport et al., 2004). Embora a rega tenha um impacto positivo sobre a produção de azeite, também é conhecido que alguns regimes hídricos podem afetar a qualidade do azeite, como a sua composição em compostos fenólicos e estabilidade oxidativa do azeite (Patumi et al., 2002; Palese et al., 2010; Machado
et al., 2013).
1.2. Classificação sistemática da oliveira
A oliveira, Olea europaea L. pertence à ordem Oleales e à família Oleaceae. É a única espécie desta família com fruto comestível. O género Olea é um dos mais importantes economicamente, uma vez que apresenta 30 a 35 espécies. Ao nível da subespécie é aceite que as oliveiras cultivadas pertencem à subespécie sativa e as oliveiras silvestres à subespécie
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Quadro 1.2Sistemática da Olea europaea L..
Adaptado de Doveri e Baldoni (2007).
A oliveira está entre as culturas mais antigas da região do Mediterrâneo. Nos registos arqueológicos foram datados da idade do Neolítico bosques de oliveiras cultivadas em Espanha e no sul da França. Antes da sua domesticação, o zambujeiro era endémico em toda a região do Mediterrâneo e especialmente no Médio Oriente. A oliveira selvagem cresce abundantemente em florestas densas, e acredita-se ser originária da Bacia do Mediterrâneo. No processo de domesticação esteve envolvida a seleção das árvores de grande porte e de frutos de alto teor em gordura (Doveri e Baldoni, 2007).
1.3. Olivicultura em Portugal
O olival é a cultura permanente com maior dispersão em Portugal, com 336 mil hectares. Cerca de 99% da área total de olival destina-se à produção de azeite. A região do Alentejo é a principal produtora, com 49% da área (Figura 1.1), de seguida é a região de Trás-os-Montes, com 22% e a Beira Interior, com 14% (INE-RGA, 2009).
Divisão Spermatophyta
Subdivisão Magnoliophytina (Angiospermae)
Classe Magnoliopsida (Dicotyledoneae)
Subclasse Lamiidae Ordem Oleales Família Oleaceae Subfamília Oleoideae Tribo Oleae Género Olea
Espécie Olea europaea L.
Subespécie Olea europaea L. subsp. sativa Hoff. et Link.
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Figura 1.1 Área de olival das diferentes regiões do país. Adaptado de INE-RGA (2009).
Atualmente, a plantação intensiva e super-intensiva é responsável por 9% da área de olival, localizada principalmente na região do Alentejo, uma vez que possui empreendimentos hidroagrícolas recentes (INE-RGA, 2009).
A azeitona de mesa é produzida principalmente na região de Trás-os-Montes com 67% da área e o Alentejo com 21%
Entre 1999 e 2009 verificou-se uma diminuição do número de explorações (18%), mas a área ocupada pelo olival não sofreu alterações significativas. Apenas a região alentejana e de Trás-os-Montes contribuíram para a estabilidade da área das explorações, com 8,3 ha e 2,1 ha com dimensão média do olival, respetivamente. Nas outras regiões a área diminuiu, pois os olivais são de pequenas dimensões, os compassos largo e as variedades de baixa produtividade de azeitona e/ou rendimento em azeite (INE-RGA, 2009; Jorge, 2012).
O setor do azeite em Portugal tem vindo a aumentar tanto a nível de produção como a nível de consumo (Figura 1.2). A autossuficiência foi atingida na campanha 2010/2011 (COI). 22% 4% 14% 8% 49% 3% Trás-os-Montes Beira Litoral Beira Interior Ribatejo e Oeste Alentejo Algarve
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Figura 1.2 Evolução do setor do azeite em Portugal (1000 ton). Adaptado de COI.
Portugal, segundo os valores de 2010, exportou 45 516,1 ton de azeite (Figura 1.3), sendo o principal destino o Brasil (28 877,1 ton), seguindo-se a Angola (1 970,2 ton), os EUA (1 771,4 ton), a Coreia do Sul (1094,2 ton) e a Venezuela (973,8 ton) (COI, 2014).
Figura 1.3 Destino das exportações portuguesas de azeite no ano 2010. Adaptado de COI.
Em Portugal existem seis Denominações de Origem Protegida para o mercado do azeite, designadamente - Azeite de Trás-os-Montes, Azeites da Beira Interior, Azeites do Ribatejo, Azeites do Norte Alentejo, Azeite de Moura e Azeites do Alentejo Interior. Esta certificação baseia-se em características agro-ecológicas dessas áreas e no uso das cultivares locais (Alves, 2007). 64% 4% 2% 4% 2% 24% Brasil EUA Venezuela Angola Coreia do Sul Outros
24 A cultivar Cobrançosa é de origem transmontana e faz parte das cultivares autorizadas para todas regiões DOP do País (Alves, 2007; Cordeiro et al., 2010). É uma cultivar bastante regular e produtiva, com dupla aptidão, sendo maioritariamente destinada à produção de azeite. Apresenta bom rendimento em azeite, que pode variar entre 18 e 22% (Cordeiro et al., 2010).
Esta cultivar é um das principais da região transmontana, representando 30% das cultivares da região, sendo utilizado principalmente para a produção de azeite (Machado et
al., 2013). Os frutos são elipsoidais (Figura 1.4) e podem pesar entre 2,5 a 5 g (DGADR, 2010).
Figura 1.4 Caraterísticas do fruto e da folha da cultivar Cobrançosa. Adaptado de Cordeiro et al. (2010).
A produção tende a ser elevada e constante. A época de maturação dos frutos é precoce a média (meados de Novembro) e apresenta baixa resistência ao desprendimento, embora a queda natural seja insignificante, o que facilita a colheita mecanizada.(Cordeiro et
al., 2010).
Adapta-se a climas frios e apresenta resistência à clorose férrica originada pelos solos com calcário. A cultivar Cobrançosa está bem adaptada às condições de seca, em resultado da alta densidade dos tecidos foliares e a presença de uma camada de cutícula espessa e tricomas (Bacelar et al., 2004). É sensível à tuberculose e menos sensível à gafa e mosca-da-azeitona. Tem boa capacidade de propagação por estaca herbácea (Bartolini et al., 2005; DGADR, 2010).
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1.4. A azeitona
A azeitona é um fruto pequeno de forma elipsoidal e globosa. Botanicamente é uma drupa com três tecidos principais: no exterior o exocarpo, no meio o mesocarpo (84-90% do peso total) e no interior o endocarpo (13-23% do peso total) (Figura 1.5). A espessura destes tecidos varia em função da cultivar, estado de maturação do fruto, disponibilidade de água, entre outros (Ryan e Robards, 1998). O conjunto destes tecidos denomina-se pericarpo e tem origem na parede do ovário. No fruto maduro o exocarpo reveste o fruto, o mesocarpo é uma polpa carnuda e o tecido mais interno, ou seja, o endocarpo é esclerificado (Gucci et al., 2009; Hammami et al., 2011).
As dimensões do fruto estão compreendidas entre 1 a 4 cm de comprimento e 0,6 a 2 cm de diâmetro, o seu peso varia entre 1-2 g em frutos de pequeno tamanho e 10-20 g nos de grande tamanho. No estado maduro pode apresentar várias colorações desde cor preta, preta-violácea ou roxo, dependendo da variedade A colheita faz-se muitas vezes no estado verde para preservar as propriedades organoléticas do fruto (Barranco et al., 2008; Bacelar et
al., 2009).
Figura 1.5 Principais tecidos da azeitona (cultivar. Cobrançosa): a - exocarpo; b - mesocarpo; c – endocarpo.
Adaptado de Bacelar et al. (2009).
1.4.1. Desenvolvimento do exocarpo, mesocarpo e endocarpo
O desenvolvimento do fruto (Figura 1.6) é resultado de um conjunto de complexas interações entre fatores genéticos, hormonais e ambientais que determinam o seu tamanho, forma e composição (Gucci et al., 2009).
26 O exocarpo é a camada exterior e mais finada da azeitona. É composto pela epiderme e cutícula que são responsáveis pela interação da azeitona com fatores abióticos e bióticos (Hammami e Rapoport, 2012). A cutícula é muito fina durante a floração e polinização, uma vez que o ovário ainda está protegido pelas pétalas, contudo rapidamente se desenvolve e engrossa, para formar a primeira barreira de proteção. A cutícula apresenta-se mais desenvolvida na azeitona do que nas outras drupas, podendo representar 40% do exocarpo. O desenvolvimento da cutícula depende de fatores genéticos, mas também ambientais. Também se podem formar alguns estomas na epiderme que depois se convertem em lenticelas para atuarem na troca de gases (Knoche et al., 2001; Parsons et al., 2013).
Figura 1.6 Peso e diâmetro transversal da azeito ao longo do seu desenvolvimento. Adaptado de Proietti et al.
(1999)
O mesocarpo começa a desenvolver-se a partir da fecundação e termina na maturação. As células do mesocarpo são parenquimatosas, pouco diferenciadas, mas com uma grande capacidade de crescimento. Estas células são todas semelhantes e formam uma malha uniforme e muito compacta (Figura 1.7). Do exterior para o interior do mesocarpo dá-se um aumento progressivo no tamanho das células. Durante o desenvolvimento do mesocarpo as células aumentam consideravelmente de tamanho e, ao mesmo tempo, ocorre a formação de espaços intercelulares e surgem alguns escleritos. O azeite é armazenado nos vacúolos das células parenquimatosas do mesocarpo (Connor e Fereres, 2010; Hammami et al., 2011).
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Figura 1.7 Corte histológico de uma seção de uma azeitona da -cultivar Cobrançosa onde é possível ver:
A-epiderme (cutícula, células da A-epiderme); B-mesocarpo.
Hammami et al. (2013) definiram a organização dos tecidos do mesocarpo em nove camadas de células agrupadas em duas partes distintas (Figura 1.8). O tamanho e o número de células distinguem a primeira zona como hipoderme. As cinco camadas de células imediatamente interna à hipoderme são compostas por células menores do que as do mesocarpo, mas apresentam um comportamento similar, assim foram consideradas como o mesocarpo externo.
Após a fecundação, no mesocarpo ocorrem principalmente processos de divisão e expansão celular. A divisão celular prolonga-se durante as 6 a 8 semanas depois da floração. Por outro lado, depois deste período o crescimento do mesocarpo deve-se apenas à expansão celular. O processo de crescimento pode ser contínuo ou descontínuo, dependendo das condições ambientais, e particularmente do estado hídrico. Nesta fase a expansão celular acontece ao mesmo tempo que a acumulação de azeite (Gucci et al., 2009).
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Figura1. 8 Organização e características dos tecidos adjacentes à epiderme da azeitona – hipoderme, mesocarpo
exterior e mesocarpo. Adaptado de Hammami et al. (2013)
O endocarpo inicia o desenvolvimento a partir da fecundação e aumenta o tamanho nos meses seguintes. No estado maduro, o endocarpo é composto exclusivamente por células esclerificadas. A dureza destas células é devida à deposição de uma camada secundária espessa com elevado conteúdo em lenhina (Bacelar et al., 2009; Hammami et al., 2013).
O tamanho do mesocarpo e do endocarpo depende da cultivar e das condições ambientais (Hammami et al., 2011).
1.5. Constituição química dos diferentes tecidos da azeitona
No que concerne à composição química da azeitona, os constituintes dependem e variam de acordo com as diferentes camadas de tecidos que formam este fruto, Assim, a água e o azeite são os constituintes maioritários do mesocarpo e da semente, como se pode verificar
29 no Quadro 1.3. O teor de água na azeitona é inferior à maioria das drupas, o mesocarpo apresenta cerca de 50-60% de água e 20-30% de azeite, existe uma relação inversa entre estes componentes. A semente tem cerca de 30% de água e 27% de azeite (Connor e Fereres, 2010).
Os açúcares redutores também fazem parte da constituição da polpa da azeitona e podem atingir os valores de 3-4%, onde se destaca a glucose, frutose e sacarose (Barranco et
al., 2008). A fração de polissacarídeos presentes no mesocarpo é constituída
fundamentalmente por celulose, hemicelulose e lenhina, chegando a alcançar valores da ordem de 4% (Conde et al., 2008).
O conteúdo em proteínas do mesocarpo é de 1-3%, sendo a arginina o aminoácido mais importante. Outros compostos que alcançam importância relevante na polpa são os compostos fenólicos que podem atingir valores entre 1 e 3% do seu peso fresco (Ryan e Robards, 1998).
A semente apresenta um conteúdo em hidratos de carbono de 27% e elevado conteúdo em proteínas (10%) e compostos fenólicos (5 a 1%) (Barranco et al., 2008).
Por fim, o endocarpo é constituído maioritariamente por celulose (30%) e outros polissacáridos como a lenhina, hemicelulose (41%) (Barranco et al., 2008).
Quadro 1.3 Composição química das diferentes partes constituintes da azeitona (% em relação ao peso fresco).
Constituintes (%) Mesocarpo Endocarpo Semente
Água 50–60 9,3 30 Teor de gordura 15–30 0,7 27,3 Açúcares 3–75 41 26,6 Celulose 3– 6 38 1,9 Matéria azotada 2–5 3,4 10,2 Cinzas 1–2 4,1 1,5 Compostos fenólicos 2–2,5 0,1 5–1 Outros constituintes - 3,4 2,4
Adapatdo de Ryan e Robards (1998).
1.6. Rega no Olival
A oliveira é uma cultura perfeitamente adaptada às condições climáticas típicas do clima Mediterrânico. Tradicionalmente era produzida em olivais extensivos, com baixa densidade de plantação e em condições de sequeiro (Iniesta et al., 2009).
30 Esta planta possui mecanismos anatómicos e fisiológicos, de adaptação e tolerância à seca agronómica, que fazem com que responda bem à estratégia de rega deficitária (RD). O objetivo deste tipo de rega é aplicar água abaixo das necessidades hídricas da cultura, mas de uma forma racional, para manter o rendimento o mais próximo possível ao seu potencial máximo. (Fereres e Soriano, 2007).
No que diz respeito, por exemplo, a mecanismos anatómicos as folhas são pequenas, e com uma cutícula cerosa densa na página superior, possui um mesófilo denso; na página inferior apresenta tricomas ou escamas peltadas que aumentam a resistência da perda de água pela folha (Bacelar et al., 2004; Guerfel et al., 2009). Outro mecanismo importante é a capacidade que a oliveira tem em diminuir o potencial hídrico foliar para valores extramente baixos (-8MPa), o que permite a extração de água de solo, mesmo abaixo do ponto de emurchecimento permanente determinado em laboratório, considerado para a grande maioria das plantas (Moriana et al., 2003; Fernandes-Silva, 2008). Por outo lado, a máxima condutividade estomática (gs) ocorre nas primeiras horas da manhã e vai reduzindo durante as
horas de maior calor. Estes mecanismos revelam uma elevada adaptabilidade da oliveira a condições limitantes de água (Barranco et al., 2008; Greven et al., 2009).
A oliveira é uma cultura bem adaptada ao clima mediterrânico, contudo a rega no período estival faz aumentar o rendimento desta cultura. A necessidade de rega no olival surgiu com o aumento considerável do consumo de azeite, a extrema secura que existe nos locais de produção e a inovação das técnicas de regadio, como por exemplo a rega gota-a-gota (Barranco et al., 2008). Para executar a rega é preciso conhecer exatamente a água que a oliveira necessita em cada local onde é cultivada e nos diferentes estados de desenvolvimento em que se devem aplicar (Fernández, 2006; Aganchich et al., 2009).
Uma boa gestão da água a aplicar na rega requer a quantificação da evapotranspiração do olival (ETc), ou seja, contempla as perdas de água para a atmosfera na
forma de vapor em resultado da evaporação da água do solo e da transpiração da oliveira. A metodologia mais utilizada para determinar as necessidades hídricas do olival foi proposto pela Food and Agriculture Organization (FAO) pela seguinte expressão: ETc = ETo x Kc
(Doorenbos e Pruitt, 1977); ETo é a evapotranspiração de uma cultura de referência, como
seja o relvado, sem pragas e doenças, em conforto hídrico e com uma altura de 8-10 cm; Kc é
o coeficiente cultural. A evapotranspiração de referência (ETo) é calculada a partir da equação
de Penman-Monteith (Allen et al., 1998), considerando parâmetros meteorológicos característicos do local/região onde o olival está implantado. O Kc das árvores de folha caduca
31 é afetado pela arquitetura da copa, densidade de árvores, práticas de poda, produtividade, método de rega e intervenções no solo. Porém, no olival a determinação de Kc é ainda mais
complexa, uma vez que a oliveira é uma espécie perene que está ativa durante todo o ano, assim exige uma época de rega mais controlada, especialmente depois de invernos secos (Orgaz et al., 2006; Testi et al., 2006). Num estudo realizado na cultivar. Cobrançosa, no Vale da Vilariça, foram considerados os valores médios do Kc, no período de verão e nas árvores
com rega máxima (100% ETc), de 0,28, no ano 2004, 0,31 no ano 2005 e 0,4 no ano 2006
(Fernandes-Silva, 2008).
Geralmente não existe uma relação linear entre a produtividade e a evapotranspiração (Moriana et al., 2003; Fereres e Soriano, 2007). Alguns autores mostraram que a relação entre o rendimento de azeite e ETc é curvilínea (Figura 1.9). Isto significa que a
aplicação de água para a produção ideal de azeite pode ser menor do que a calculada para uma ETc máxima (Patumi et al., 2002; Moriana et al., 2003; Tognetti et al., 2006). Segundo um
estudo realizado por Grattan et al. (2006) na Califórnia alcança-se o máximo de produção entre 70% a 75% ETc e a qualidade é superior na aplicação de 33 a 40% ETc.
Figura1. 9 Relação entre a aplicação de água e a produção de azeitonas em duas colheitas. Adaptado de Grattan et al. (2006)
Como as respostas produtivas das árvores não são afetados por níveis moderados de défice hídrico, considera-se a estratégia de rega deficitária é a mais recomendada em zonas áridas e semiáridas para minimizar o consumo de água (Palese et al., 2010).
32
1.6.1. Estratégias de rega deficitária
As técnicas de RD mais utilizadas são a rega deficitária contínua (RDC), a rega deficitária controlada (RDI) e, mais recentemente, a rega parcial das raízes (PRD - partial
root drying System) (Fernández, 2006; Masmoudi et al., 2010).
A rega deficitária controlada consiste na redução de água aplicada durante os estados fenológicos menos sensíveis ao défice hídrico sem prejudicar o rendimento final em produtividade (Pérez-López et al., 2008; Palese et al., 2010; Dell’Amico et al., 2012). É aplicada pela rega cerca de 100% da ETc nos estados fenológicos mais sensível ao défice
hídrico, como na floração, divisão e expansão celular do fruto e acumulação de gordura, e interrompida nos estados fenológicos menos sensíveis, como no endurecimento do caroço. Contudo esta técnica requer um conhecimento detalhado sobre as caraterísticas fisiológicas das árvores, agronómicas e climáticas do local de cultivo(Fernández, 2006).
A rega parcial das raízes (PRD) (Partial Root Drying System) tem como objetivo usar quantidades de água semelhantes às que se utilizam na rega deficitária controlada, mas alcançar um maior desempenho das culturas, regando apenas metade da zona radicular, enquanto a outra metade é mantida sob solo seco. A rega é alternada de um lado da raiz para o outro a cada 2-3 semanas, mas para tal é necessário a instalação de duas linhas de gotejadores no sentido da linha da oliveira, em vez de uma linha usada nos outros sistemas de rega (Centritto et al., 2005; Wahbi et al., 2005). Em termos fisiológicos, este tipo de rega desencadeia um mecanismo de sinalização entre a parte radicular e a parte aérea da planta que induz o fecho dos estomas e, consequentemente melhora a eficiência do uso da água. O que acontece na parte não regada da planta é um mecanismo de feed-forward através do ácido abscísico (ABA), uma vez que este atua como um sinal de défice hídrico a nível radicular. O ABA é produzido nas raízes com o solo seco e é transportado para a parte aérea da planta, onde regula a taxa de expansão foliar e abertura dos estomas. Este mecanismo permite reduzir substancialmente a perda de água através dos estomas nos períodos em que há défice hídrico (Kang e Zhang, 2004; Aganchich et al., 2009).
1.7. Resposta da oliveira à rega
Uma gestão eficaz da água de rega no olival é estritamente fundamental para conhecer os efeitos da água em cada fase do desenvolvimento da oliveira. O tempo de
33 duração e a intensidade do défice hídrico experienciado pelo olival podem influenciar a produtividade de frutos e de azeite, o rendimento em azeite, o tamanho dos frutos, o peso do mesocarpo, a relação mesocarpo/endocarpo (polpa/caroço), a concentração de substâncias antioxidantes naturais, tais como compostos fenólicos, bem como as propriedades sensoriais do azeite (Gucci et al., 2009; Hammami et al., 2011). No Quadro 1.4 é possível visualizar o efeito do défice hídrico nos diferentes estados do desenvolvimento da oliveira.
A oliveira nas condições do clima Mediterrânico apresenta dois períodos de crescimento vegetativo acentuado, um na primavera e o outro no outono quando as árvores não estão sujeitas a défice hídrico. O défice hídrico no início do ciclo vegetativo do olival pode reduzir o rendimento devido a efeitos sobre a floração e vingamento.
A divisão (primeira fase de crescimento do fruto) e expansão (terceira fase de crescimento do fruto) das células do mesocarpo são as principais responsáveis pelo tamanho final das azeitonas. Quando ocorre défice hídrico nestas etapas pode comprometer as dimensões finais do fruto e consequentemente a acumulação de gordura. Uma vez que a biossíntese do azeite e o seu armazenamento ocorre nos vacúolos das células do mesocarpo, e consequentemente as disponibilidades hídricas do fruto determinam o seu tamanho e a acumulação de azeite. Desta forma, a falta de água pode provocar o desenvolvimento de frutos pequenos, sendo a relação mesocarpo/endocarpo inferior em relação à dos frutos de árvores bem regadas, causada pelo reduzido peso do mesocarpo (Barranco et al., 2008).
Na segunda fase do desenvolvimento do fruto, quando ocorre o endurecimento do caroço, a existência de défice pode em certos casos ter um efeito benéfico (Iniesta et al., 2009). Dell’Amico et al. (2012) verificou que a aplicação de défice hídrico nas primeiras semanas de desenvolvimento do fruto, (6 a 8 semanas após floração), que corresponde ao endurecimento do caroço, provocava um atraso no fecho dos estomas, fazendo diminuir a pressão de turgescência nas folhas. Por outro lado, constatou uma mudança do potencial hídrico das folhas para o fruto, permitindo que se mantivesse a pressão de turgescência do fruto e não afetando o seu desenvolvimento.
34
Quadro 1.4 Respostas da oliveira ao défice hídrico durante o desenvolvimento da cultura
Adaptado de Barranco et al. (2008)
1.8. Acumulação de gordura na azeitona
A acumulação de azeite na azeitona tem início no final do período de endurecimento do caroço (Lavee e Wodner, 2004; Iniesta et al., 2009). Normalmente as cultivares com menor tamanho de frutos têm na maturação maior teor de azeite do que as cultivares de frutos grandes (Lavee e Wodner, 2004).
A fonte de carbono para a biossíntese de lípidos pode ser a folha ou o fruto. A formação de ácidos gordos segue uma rota bioquímica que utiliza como substrato o percursor de Acetil-CoA, assim como outros cofatores do metabolismo dos açúcares. Por isso, existe uma correlação inversa entre o conteúdo de gordura e o conteúdo em açúcares durante o processo de desenvolvimento e maturação da azeitona (Conde et al., 2008).
Durante a biossíntese ocorrem uma série de reações de condensação do unidades de acetato até se formar o ácido palmítico. Nas células do mesocarpo o azeite é acumulado na forma de triacilglicerídeos (TAG) (Conde et al., 2008).
A evolução da lipogénese (biossíntese dos lípidos) pode ser representada por uma curva sigmoide e dividida em três fases. A fase da biossíntese lenta que ocorre no início da formação do fruto até ao endurecimento do caroço que corresponde a 4% do conteúdo total em azeite por peso seco. Nesta fase o fruto é fotossinteticamente ativo (Barranco et al., 2008).
A fase seguinte é a fase da biossíntese acelerada que ocorre entre o endurecimento do caroço até ao início da maturação. É nesta etapa que se inicia a formação dos diglicerídeos e dos triglicerídeos e é mais rápida durante os meses de agosto e setembro para atingir o Fase de desenvolvimento Período do ano Efeito do défice hídrico
Crescimento vegetativo Todo o ano Reduz o crescimento dos ramos e o número de flores no ano seguinte. Desenvolvimento das gemas
florais Fevereiro-Abril
Reduz o número de flores. Aborto do ovário.
Floração Maio Reduz a fecundação.
Vingamento do fruto Maio-Junho Queda acentuada de frutos e aumenta a alternância.
Crescimento inicial do fruto Junho-Julho Diminui o tamanho do fruto-menor número de células/fruto
Crescimento posterior do
fruto Agosto-Colheita
Diminui o tamanho do fruto-menor tamanho das células no fruto Acumulação de azeite Julho-Novembro Diminui o conteúdo em azeite/fruto
35 máximo de produção no final de setembro e início de outubro. No final desta fase o fruto apresenta cerca de 27% do total de azeite por peso seco de azeitona.
Na última fase (fase de estabilização) a velocidade de formação do azeite começa a diminuir de forma progressiva desde o meio do mês de outubro até ao final de dezembro (Figura 1.10).
Figura 1.10 Concentração de gordura (% de gordura/peso seco) em diferentes condições hídricas nas últimas
duas fases da lipogénese. Adaptado de Fernandes-Silva (2008)
O processo de lipogénese ocorre principalmente no mesocarpo, onde se encontra 90% do azeite total da azeitona. A biossíntese ocorre durante o crescimento das células da azeitona e está praticamente concluída no início da maturação. A colheita de frutos no final do estado em verde não implica uma perda de rendimento em azeite e permite maior facilidade no manuseamento das azeitonas pós-colheita, pois os frutos são mais resistentes a danos mecânicos e infeções fúngicas do que no estado de completa maturação (García et al., 1996).
1.9. Compostos fenólicos
Estruturalmente, os compostos fenólicos são constituídos por um ou mais grupos hidroxilo ligados a um anel aromático. Estes compostos podem ser classificados em flavonoides ou não-flavonoides. (Vermerris e Nicholson, 2007).
36 Este grupo é também conhecido como polifenois e aparecem nas plantas em forma de glicosídeos, sendo uma das substâncias responsáveis pela atribuição do perfil sensorial dos frutos. Sob o ponto de vista nutricional, os flavonoides (Figura 1.11) são compostos antioxidantes capazes de inibir a oxidação de lipoproteínas de baixa densidade. Os efeitos bioquímicos e farmacológicos são muito vastos, mas destacam-se os efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios, anti-plaquetários e antialérgicos (Michalak, 2006).
Figura1. 11 Estrutura base dos flavonoides. Adaptado de Gonçalves (2006).
Os compostos não-flavonoides compreendem os estilbenos e os ácidos fenólicos (subdivididos em ácidos benzoicos e ácidos cinâmicos) (Figura 1.12).
Figura 1.12 Estrutura molecular base dos ácidos benzoicos (esquerda) e dos ácidos cinâmicos (direita) e
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1.9.1. Compostos fenólicos na azeitona
O conteúdo fenólico na azeitona depende de fatores genéticos e pode ser afetado pelas condições climáticas durante a produção, técnicas agronómicas e o amadurecimento dos frutos (Conde et al., 2008).
A azeitona é uma boa fonte de vários compostos fenólicos, podendo atingir 5% do seu peso seco (Barranco et al., 2008). As classes mais importantes dos compostos fenólicos existentes na azeitona incluem os ácidos fenólicos, álcoois fenólicos, flavonoides e secoiridoides (Ryan e Robards, 1998; Mateos et al., 2001; Vinha et al., 2005).
Os principais álcoois fenólicos encontrados na azeitona são o 3,4- dihidroxifeniletanol (hidroxitirosol) e p- hidroxifeniletanol (tirosol). Os flavonoides mais comuns incluem a luteolina-7- glucósido, rutinósido e apigenina-7- glicósido, e as antocianinas (cianidina-3- glicósido e cianidina-3-rutinósido).
A oleuropeína e o ligostrósido são secoiridoides predominantes na polpa da azeitona no estado verde (Figura 1.13). Alguns derivados de oleuropeína foram encontrados nas azeitonas, nomeadamente demetiloleuropeina, oleuropeína aglicona e ácido elenolico (Ryan et al., 2002; Morelló et al., 2005; Vinha et al., 2005).
Figura 1.13 Estrutura molecular da oleuropeína (esquerda) e do ligostrósido (direita). Adaptado de Ryan et al.
(2002).
O principal composto fenólico presente no fruto é a oleuropeína. Este composto é responsável pelo intenso sabor amargo dos frutos verdes e tem um elevado poder antioxidante e valor nutricional (Esti et al., 1998; Barranco et al., 2008). A quantidade de oleuropeína é muito elevada nos frutos jovens, podendo atingir valores superiores a 15% do peso seco. Contudo, verifica-se um rápido declínio da oleuropeína e, consequentemente do conteúdo
38 fenólico durante a fase de maturação da azeitona, este acontecimento está relacionado com o aumento da atividade de enzimas hidrolíticas (β-hidroxilase) observada durante este período (Esti et al., 1998; Visioli et al., 2002; Conde et al., 2008).
Seis a oito meses após a floração as azeitonas iniciam a maturação que é visível pela mudança de cor, mas fisiologicamente é associada há diminuição do conteúdo em oleuropeína e em clorofila e por um aumento de antocianinas. Isto acontece porque a síntese de antocianinas requer a presença de açúcares livres e a oleuropeína degrada-se nos seus constituintes, ácido elenólico e glucose (Ryan e Robards, 1998; Ryan et al., 2002).
Por outro lado, o composto verbascósideo (Figura 1.14), que é o principal derivado de ácido hidroxicinâmico, e é detetado nas azeitonas muito jovens, a sua acumulação inicia-se mais tarde do que a oleuropeína, mas ainda no estado verde do fruto e atinge o máximo depois. Da mesma forma, diminui com o avançar da maturação (Ryan et al., 1999).
Figura 1.14 Estrutura molecular do verbascósido. Adaptado de Ryan et al. (2002).
Os compostos fenólicos e particularmente os secoiridóides, influenciam as propriedades sensoriais da azeitona e do azeite. São em grande parte responsáveis pelas modificações que ocorrem durante o processamento de azeitonas de mesa, uma vez que elimina o amargor das azeitonas dado pela elevada concentração de oleuropeína (Mateos et
al., 2001; Vinha et al., 2005).
1.9.2. Importância dos compostos fenólicos
A gordura nos alimentos pode ser degradada pelas elevadas temperatura e um longo tempo de armazenamento. O processo de degradação é provocado por reações de oxidação que diminuem o valor nutricional e a qualidade sensorial dos alimentos. A oxidação lipídica pode ser evitada ou retardada não permitindo o contato com o oxigénio, controlando a
39 temperatura, inativando as enzimas catalíticas da oxidação, reduzindo a pressão de oxigénio e usando acondicionamentos adequados para os alimentos (Pokorny et al., 2001; Youngson, 2003). Os agentes antioxidantes tendem a estabilizar os ácidos gordos nos alimentos através da reação com radicais livres, pois sequestram iões metálicos e interrompendo a fase de propagação da oxidação lipídica (Ryan e Robards, 1998).
O interesse pelos compostos fenólicos da azeitona deve-se principalmente ao poder antioxidante que pode ser desempenho através de um ou mais mecanismos: inibição de radicais livres e/ou complexão de metais. Estes mecanismos estão associados a benefícios para a saúde humana e também conferem estabilidade oxidativa ao próprio azeite, sendo um parâmetro importante na avaliação da qualidade do mesmo. (Ryan e Robards, 1998; Conde et
al., 2008). A atividade antioxidante de compostos fenólicos é principalmente devida às suas
propriedades de oxidação-redução, as quais podem desempenhar papel importante na absorção e neutralização de radicais livres, sequestrando o oxigénio triplete e singlete ou decompondo peróxidos.
As espécies reativas de oxigénio (ROS) são continuamente formadas como um resultado de processos metabólicos normais e pode oxidar e danificar macromoléculas celulares, que conduzem ao desenvolvimento de doenças entre as quais o cancro, aterosclerose, diabetes, artrite, malária e doenças cardíacas. Estas substâncias também estão ligadas com processos responsáveis pelo envelhecimento dos organismos (Visioli e Galli, 2001; Tripoli et al., 2005). As ROS são as várias formas de oxigénio ativado, entre as quais se incluem os denominados radicais livres (Tripoli et al., 2005).
1.10. Objetivos
Como consequência intensificou-se o setor da olivicultura gerindo de forma sustentável as técnicas agronómicas aplicadas. Uma das formas para conseguir aumentar a produtividade e qualidade foi aplicar rega no olival (Rapoport et al., 2004; Aganchich et al., 2009).
Com este trabalho pretende-se estudar o efeito de deferentes regimes hídricos no desenvolvimento dos tecidos e composição química da azeitona da cultivar Cobrançosa durante o período de tempo compreendido entre o endurecimento do caroço até à colheita do fruto. Para tal foram analisados os seguintes parâmetros:
40 Análise histológica das azeitonas dos diferentes tratamentos de rega, estudando a evolução da área e do perímetro das células do mesocarpo e da densidade de células numa determinada área desse tecido, espessura da cutícula e ainda área e perímetro das células da epiderme.
Analisar quimicamente as azeitonas em termos de composição fenólica e atividade antioxidante;
Quantificar a gordura em relação à matéria seca existente nas azeitonas maduras por um método químico.
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CAPÍTULO 2
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2.1. Localização do campo experimental
O ensaio experimental está localizado na Quinta do Carrascal (latitude: 41,25° N e longitude: 7,09°W), situado na Terra Quente Transmontana (Figura 2.1), a 141 m de altitude e a 12 km da Foz do Rio Sabor. Está inserida na região de Denominação de Origem Protegida “Azeite de Trás-os-Montes” e também na região demarcada de Vinho do Porto. O olival onde decorreu o ensaio está no modo de produção biológica e a cultivar estudada foi a Cobrançosa.
Figura 2.1Localização do ensaio experimental no concelho de Vila Flor no Nordeste de Portugal.
