Determinação do polimorfismo de 15 microssatélites do cromossomo Y na população do Estado de Alagoas, Nordeste do Brasil

Texto

(1)PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA. UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA. DETERMINAÇÃO DO POLIMORFISMO DE 15 MICROSSATÉLITES DO CROMOSSOMO Y NA POPULAÇÃO DO ESTADO DE ALAGOAS, NORDESTE DO BRASIL. DALMO ALMEIDA DE AZEVEDO. Recife, PE Março, 2006.

(2) DALMO ALMEIDA DE AZEVEDO. DETERMINAÇÃO DO POLIMORFISMO DE 15 MICROSSATÉLITES DO CROMOSSOMO Y NA POPULAÇÃO DO ESTADO DE ALAGOAS, NORDESTE DO BRASIL Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Genética da Universidade Federal. de. Pernambuco,. como. parte. dos. requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre em Genética. Orientador: Prof. Dr. Luiz Mauricio da Silva, Depto.. de. Genética,. Centro. de. Ciências. Biológicas, UFPE. Co-Orientador: Prof. Dr. Luiz Antonio Ferreira da Silva, Depto. de Biologia, Centro de Ciências Biológicas, UFAL.. Recife, PE Março, 2006.

(3) Azevedo, Dalmo Almeida de Determinação do polimorfismo de 15 microssatélites do cromossomo Y na população do Estado de Alagoas, Nordeste do Brasil / Dalmo Almeida de Azevedo.- Recife : O Autor, 2006. 126 folhas : il., fig., tab., gráf. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Genética, 2006. Inclui bibliografia e anexos. 1. Genética humana – Genética de populações. 2. Polimorfismo do cromossomo Y, Estado de Alagoas – Microssatélites. 3. Freqüência de haplótipos – Análise de mutação – Reação multiplex de PCR (Reação em Cadeia de Polimerase). I. Título. 575.17 576.53. CDU (2.ed) CDD (22.ed.). UFPE BC2006-254.

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(5) À minha ESPOSA, ROSILDA, E FILHOS, ARTHUR E ELIZABETH, dedico..

(6) AGRADECIMENTOS Ao professor Dr. Luiz Mauricio pela orientação, companheirismo e pelo constante estímulo à busca do conhecimento; Ao professor Dr. Luiz Antonio pelo incentivo, pelas oportunidades e pelo exemplo dado na busca constante pela realização dos ideais; Ao professor Dr. Eurípedes pelo apoio e orientação no estágio à docência e ao professor Dr. Francisco pela prestatividade; Aos colegas do Laboratório de DNA Forense da UFAL: Fátima, Cássia, Ana, Laura, Kely, Djavan e Iede pela amizade e apoio. À Adriana pela ajuda com o sequenciamento; Aos docentes do Programa de Pós-graduação em Genética da UFPE que contribuiram para a minha formação; De maneira especial à Rosilda, minha esposa, que me apoiou, sempre esteve ao meu lado durante este curso e assumiu sozinha o cuidado dos nossos filhos quando estive ausente; Aos doadores das amostras, sem eles este trabalho não teria sido possível; A Deus... por tudo; Ao CNPq e à FINEP pelo apoio financeiro dado pelo para a realização deste trabalho.. Muito Obrigado!.

(7) SUMÁRIO Página Lista de Figuras. 7. Lista de Tabelas. 11. Lista de abreviaturas. 14. Resumo. 16. 1. Introdução. 17. 2. Revisão Bibliográfica:. 19. 2.1. Identificação Humana Através do DNA. 19. 2.2. Microssatélites. 20. 2.3. Microssatélites do Cromossomo Y. 21. 2.4. Taxa de Mutação em Microssatélites do Cromossomo Y 2.5. Descrição dos Microssatélites do Haplótipo Mínimo mais DYS447, DYS458 e DYS464. 26 31. 2.5.1. DYS19. 31. 2.5.2. DYS385. 32. 2.5.3. DYS389I/II. 33. 2.5.4. DYS390. 34. 2.5.5. DYS391. 35. 2.5.6. DYS392. 36. 2.5.7. DYS393. 36. 2.5.8. DYS447. 37. 2.5.9. DYS458. 37. 2.5.10. DYS464. 38. 2.6. Estudos do Cromossomo Y em Populações Brasileiras. 40. 4.

(8) 3. Referências Bibliográficas. 42. 4. Manuscrito de Artigo Científico Diversity and Mutation Analysis of Minimal Haplotype YMicrosatellites Loci Plus DYS447, DYS458 and DYS464 in. 49. Alagoas, Northeastern Brazil 5. Conclusões 6. Abstract. 57 58. 7. Anexos. 59. 7.1. Anexo 1: Informações Complementares. 60. 7.1.1 Detalhamento das Metodologias Utilizadas. 61. 7.1.1.1. Obtenção das Amostras. 61. 7.1.1.2. Extração do DNA. 61. 7.1.1.3. Amplificação do DNA. 63. 7.1.1.4. Otimização das Reações de Amplificação. 65. 7.1.1.5. Montagem das Escadas Alélicas. 65. 7.1.1.6. Detecção. 66. 7.1.1.7. Determinação dos Alelos. 66. 7.1.1.8. Sequenciamento. 66. 7.1.1.9. Análise Estatística. 69. 7.1.2. Detalhamento dos Resultados. 71. 7.1.2.1. Análise de Polimorfismo. 71. 7.1.2.2. Mutações. 98. 7.1.3. Discussão dos Resultados Adicionais. 102. 7.1.4. Perspectivas. 109. 7.1.5. Referências Citadas. 110. 5.

(9) 7.2. Anexo 2: Instruções para Autores, Genetics And Molecular Biology. 113. 7.3. Anexo 3: Instruções para Autores, Journal of Forensic Sciences. 116. 6.

(10) LISTA DE FIGURAS Figura. Página. Revisão da Literatura Figura 1. Estrutura de um microssatélite com 11 repetições [tcta]. A seqüência acima corresponde ao alelo 11 (11 repetições).. 21. Figura 2. Esquema da distribuição dos marcadores do haplótipo mínimo mais DYS447, DYS458 e DYS464 ao longo do cromossomo Y. (Modificado Short Tandem Repeat DNA Internet Database). 26. Figura 3. Esquema do deslizamento da polimerase. a) Pareamento normal do filamento novo com o filamento molde. b) Deslizamento do filamento novo para trás dando origem à inserção. c) Deslizamento do filamento novo para frente causando deleção. Este é o mecanismo primário de formação de bandas de repetição ou stutter. (Modificado de Butler, 2005).. 27. Figura 4: a) Sequência do microssatélite DYS19 (GBAC017019 (r&c)). Sombreado em verde o sítio de pareamento do primer sense e em azul o sítio do primer antisense. b) Alinhamento das seqüências X77751 e AC017019 demonstrando a diferença de um par de bases, destacada em vermelho. A seqüência complementar é identificada com um c. (Modificado de Short Tandem Repeat DNA Internet Database).. 31. Figura 5: Seqüência do microssatélite DYS385 (GB: AC022486 (r&c)). Em vermelho a seqüência repetitiva, sombreado em verde o sítio de pareamento do primer sense e em azul o do primer antisense.. 32. 7.

(11) Figura 6: Esquema da posição relativa dos dois locos do microssatélite DYS385. As seqüências das duas regiões têm os sentidos indicados pelas setas e a distância também está demonstrada. (modificado de Butler, 2003).. 33. Figura 7: a) Esquema dos dois fragmentos do DYS389. O primer sense (verde) pareia em dois sítios. O retângulo tracejado e azul representa o fragmento maior (DYS389II) e o vermelho o fragmento menor (DYS389I). b) Seqüência do marcador DYS389, número de acesso no GenBank GB-AC017019 (r&c). Em vermelho as duas sequências repetitivas, sombreado em verde o primer sense e em azul o primer antisense.. 34. Figura 8: Seqüência do DYS390 (GB: AC0011289 (r&c)). Em vemelho o trecho de seqüências repetitivas, o sombreado verde assinala a seqüência do primer sense e o sombreado azul a seqüência do primer antisense.. 35. Figura 9: Seqüência do DYS391 (GB: AC011302). As seqüências dos primers sense e antisense estão destacadas com sombreado verde e azul, respectivamente. Em vermelho o trecho de seqüência repetitiva.. 35. Figura 10: Seqüência do DYS392 (GB: AC011745 (r&c)). O sombreado verde e o azul assinalam as seqüências dos primers sense e antisense, respectivamente. Em vermelho o trecho de seqüências repetitivas.. 36. Figura 11: Seqüência do DYS393 (GB: AC06152). As seqüências dos primers sense e antisense estão marcadas com sombreado verde e azul, respectivamente. O trecho de seqüências repetitivas está em vermelho.. 36. Figura 12: Seqüência do DYS447 (GB: AC005820). Os sombreados em verde e azul marcam as seqüências dos primers sense e antisense, respectivamente e o trecho de seqüências repetitivas está em vermelho.. 37. 8.

(12) Figura 13: Seqüência do DYS458, (GB: AC010902.4). Sombreadas em verde e vermelho assinalam as seqüências dos primers sense e antisense, respectivamente. Em vermelho a seqüência de repetições.. 37. Figura 14: Seqüência do DYS464 (GB: X17354). Os sombreados verde e azul assinalam as seqüências dos primers sense e antisense, respectivamente. Em vermelho o trecho de seqüências repetitivas.. 38. Figura. 15: esquema das quatro regiões do microssatélite DYS464. São apresentadas as distâncias aproximadas entre os locos a, b, c e d.. 39. Figura 16: A marcação dos alelos do marcador DYS464 pode ser feita tanto pelo método de tipagem conservador (TC) como pelo método de tipagem expandido (TE). (Modificado de Butler and Schoske, 2005). 39. Anexo 1: Informações Complementares Gráfico 1: Distribuição das freqüências alélicas para o microssatélite DYS19. Gráfico 2: Freqüências genotípicas para o microssatélite DYS385. Gráfico 3: Freqüências alélicas para o microssatélite DYS389I.. 72. Gráfico 4: Distribuição das freqüências alélicas para o microssatélite DYS389II.. 77. Gráfico 5: Distribuição das freqüências alélicas para o microssatélite DYS390.. 78. Gráfico 6: Distribuição das freqüências alélicas para o microssatélite DYS391.. 79. Gráfico 7: Distribuição das freqüências alélicas para o microssatélite DYS392.. 80. 73 76. 9.

(13) Gráfico 8: Distribuição das freqüências alélicas para o microssatélite DYS393. Gráfico 9: Distribuição das freqüências alélicas para o microssatelite DYS447.. 81. Gráfico 10: Distribuição das freqüências alélicas para o microssatélite DYS458.. 83. Gráfico 11: Distribuição das freqüências haplotípicas para os microssatélites DYS464a/b/c/d.. 86. Figura 1: Seqüências das mutações detectadas para o loco DYS390. Os sítios onde ocorreram as mutações estão sombreados em amarelo. Nos casos 49-MC e 978-A houve deleção de uma repetição e no caso 1134-A houve a inserção de uma unidade repetitiva.. 100. Figura 2: Seqüências das mutações detectadas para o loco DYS158. Os sítios onde ocorreram as mutações estão sombreados em amarelo.. 101. Gráfico 12: Diversidades gênicas para todos os microssatélites analisados neste trabalho.. 103. Gráfico 13: Diversidades gênicas das populações de Alagoas, U.S. afro-americanos, U.S. hispânicos, U.S. caucasianos e da Áustria para os locos DYS447, DYS458 e DYS464, conforme dados da tabela 21.. 104. Gráfico 14: Diversidades gênicas das populações de Alagoas, da Bahia, do Brasil (cinco regiões geopolíticas), ameríndios, de Portugal e de Moçambique para locos do haplótipo mínimo, conforme dados da tabela 20. Gráfico. 15: Diversidades haplotípicas , para o haplótip mínimo, observadas nas populações de Alagoas, Brasil (cinco regiões geopolíticas) Portugal e Moçambique, conforme dados da tabela 21.. 82. 106. 107. 10.

(14) LISTA DE TABELAS Tabela. Página. Revisão da Literatura Tabela 1. Microssatélites do Y mais utilizados. O alelo de referência corresponde ao número de repetições da seqüência depositada no GenBank que em alguns casos é considerada como reversa e complementar (r&c) para que haja concordância com motivos de repetição usados anteriormente. (Modificado de Butler, 2003).. 23. Tabela 2. Seleção de alguns estudos da taxa de mutação para marcadores do cromossomo Y. (Modificado de Dupuy et al., 2004).. 30. Manuscrito Tabela 1. Gene diversities for each locus and haplotypic diversity for minimal haplotype locy and for all 15 loci haplotype.. Tabela 2. Father/son mutations observed. The total number of allele transmitions were 255 for DYS390 and DYS458, for DYS464 were 1020.. 55. 56. Anexo 1: Informações Complementares Tabela 1: Número de indivíduos proveniente de cada município.. 62. Tabela. 63. Tabela. 2: Composição de cada multiplex concentrações dos primers. 3: Seqüências dos primers utilizados respectivas fontes.. e e. 64. 11.

(15) Tabela 4: Alelos, número de ocorrências, freqüências alélicas e diversidade gênica para o microssatélite DYS19. Tabela. 5: Genótipos, número de ocorrências, freqüências genotípicas e diversidade gênica para o microssatélite DYS385. Tabela 6: Alelos, número de ocorrências, freqüências alélicas e diversidade gênica para o microssatélite DYS389I. 72. 74. 75. Tabela 7: Alelos, número de ocorrências, freqüências 79 alélicas e diversidade gênica para o microssatélite DYS389II. Tabela 8: Alelos, número de ocorrências, freqüências 78 alélicas e diversidade gênica para o microssatélite DYS390. Tabela 9: Alelos, número de ocorrências, freqüências 79 alélicas e diversidade gênica para o microssatélite DYS391. Tabela 10: Alelos, número de ocorrências, 80 freqüências alélicas e diversidade gênica para o microssatélite DYS392. Tabela 11: Alelos, número de ocorrências, 81 freqüências alélicas e diversidade gênica para o microssatélite DYS393. Tabela 12: Alelos, número de ocorrências, 82 freqüências alélicas e diversidade gênica para o microssatélite DYS447. Tabela 13: Alelos, número de ocorrências, 83 freqüências alélicas e diversidade gênica para o microssatélite DYS458. Tabela 14: Haplótipos, número de ocorrências, freqüências e diversidade haplotípica para os 84-85 microssatélites DYS464a/b/c/d. Tabela 15: Haplótipos observados na população de 88-93 Alagoas para a amostra de 255 indivíduos. Tabela 16: Número de ocorrências e diversidade haplotípica dos haplotipos compostos pelos 94-97 marcadores do haplótipo mínimo para a amostra de 255 indivíduos. Tabela 17: Perfis genéticos dos casos, ou duplas pai/filho, em que foram detectadas 98 mutações. São apresentados também os índices de paternidade para cada caso.. 12.

(16) Tabela 18: Número de mutações, taxa de mutação (µ) e intervalo de confiança (IC) para cada loco individual e para os 15 locos. Tabela 19: Diversidades gênicas para os locos DYS447, DYS458 e DYS464 na população de Alagoas, em três populações dos Estados Unidos (afro-americanos, caucasianos e hispânicos) (Schoske et al. 2004) e na população da Áustria (Berger et al. 2003). Tabela 20: Diversidades gênicas para os locos do haplótipo mínimo nas populações de Alagoas, Bahia, Brasil (cinco regiões geopolíticas), Ameríndios, Portugal e Moçambique. Tabela 21: Diversidades haplotípicas (DH) das populações de Alagoas, do Brasil (cinco regiões geopolíticas), Portugal e Moçambique para o haplótipo mínimo. Tabela 22: Haplótipos mais freqüentes de quatro populações brasileiras, quatro européias e duas africanas.. 99. 104. 105. 106. 108. 13.

(17) LISTA DE ABREVIATURAS bp CE CI CNPq D DAZ DH DNA dNTP GD H HD IBGE IC ISFG LGMH µl mM MSY MVR-PCR ng NRY PAR1 PAR2 PCR PD STRs Taq U UFPE. Pares de Bases Chance de Exclusão Confidence Interval Intervalo de Confiança Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Diversidade Deleted in Azoospermia Deletado na Azoospermia Diversidade Haplotípica Desoxiribonucleic Acid Ácido Desoxirribonucléico Dinucleotideo Trifosfato Gene Diversiti Diversidade Gênica Haplótipo Haplotype Diversiti Diversidade Haplotípica Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística Intervalo de Confianza International Society of Forensic Genetics Laboratório de Genética Molecular Humana Microlitro Milimolar Male-specific region of the Y Região do Y Específica do Macho Minisatellite Variant Repeat Amplified by PCR Repetição Variável de Minissatélite Amplificada por PCR nanograma Nonrecombining Region of the Human Y Chromosome Região não recombinante do cromossomo Y Humano Pseudoautosomal Region 1 Região Pseudoautossômica 1 Pseudoautosomal Region 2 Região Pseudoautossômica 2 Polymerase Chain Reaction Reação em Cadeia da Polimerase Poder de Discriminação Short Tandem Repeats Repetições Curtas em Tandem Thermophylus aquaticus Unidade Universidade Federal de Pernambuco. 14.

(18) V VNTRs YHRD. Variância Variable Number of Tandem Repeats Repetições em Tandem de Número Variável Y Haplotype Reference Database Base de Dados de Referência de Haplótipo do Y. 15.

(19) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... RESUMO. Microssatélites localizados na região não recombinante do cromossomo Y (NRY) são amplamente utilizados em estudos forenses e populacionais. Neste trabalho foi feita a análise do polimofismo e da taxa de mutação de 15 microssatélites do cromossomo Y (haplótipo mínimo mais DYS447, DYS458, DYS464) numa amostra da população de Alagoas constituída por 255 duplas pai/filho. Foi observado um total de 230 haplótipos diferentes dos quais 207 ocorreram apenas uma vez. Através da análise de pais e filhos foram detectadas mutações em oito das 3.825 transmissões alélicas analisadas, com uma taxa de mutação média estimada em 2,092 × 10-3. O haplótipo mínimo mais comum ocorreu 16 vezes e é também o haplótipo mais comum entre caucasianos das populações do Rio de Janeiro e São Paulo bem como nas populações européias do sul de Portugal, Madri (Espanha) e Ligúria (Itália). O haplótipo mínimo mais comum das populações Yanomami, Bantu e de Moçambique não foi encontrada nenhuma vez na amostra analisada.. PALAVRAS-CHAVE: ciência forense, identificação humana, microssatélites do cromossomo Y, haplótipo mínimo, DYS447, DYS458, DYS464, Alagoas, Brasil.. 16.

(20) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... 1- INTRODUÇÃO Regiões polimórficas do DNA têm sido amplamente utilizadas em identificação humana como marcadores genéticos, pois permitem que seja feita a distinção entre indivíduos. Merecem destaque os marcadores constituídos. por. seqüências. curtas. repetidas. em. tandem,. os. microssatélites, cujo polimorfismo é resultante da variação no número de repetições. O perfil genético obtido pela combinação de vários microssatélites geralmente pode ser muito raro. A raridade de um perfil depende principalmente de dois fatores: o número de marcadores e a freqüência dos alelos ou variantes. Quanto maior for o número de marcadores utilizados e quanto menor for a freqüência dos alelos, mais raro será o perfil. Marcadores. localizados. nos. autossomos. têm. capacidade. de. discriminação uma vez que o perfil, para cada marcador, é resultado da combinação dos alelos dos dois cromossomos homólogos. Marcadores localizados na região não recombinante do cromossomo Y têm menor capacidade de discriminação. Devido à natureza haplóide do Y marcadores nele localizados são transmitidos de pai para filho por várias gerações, na forma de haplótipo, sendo modificados apenas por mutação. Portanto os haplótipos do Y são utilizados para a identificação de patrilinhagens, mas não se aplicam à identificação individual. O haplótipo do Y mais estudado até hoje nas populações mundiais foi denominado de haplótipo mínimo e é constituído pelos marcadores DYS19, DYS385, DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS392 e DYS393. Alguns destes marcadores são pouco informativos, pois têm diversidade gênica muito baixa. Para superar esta deficiência, são formados haplótipos estendidos pela combinação de novos marcadores com os marcadores do haplótipo mínimo. De modo geral estes marcadores adicionais possuem diversidade gênica alta.. 17.

(21) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... Para que um haplótipo possa ser usado, em investigações de paternidade e em análises forenses, é indispensável que seja feita a caracterização, na população, das freqüências alélicas de cada marcador e da diversidade dos haplótipos resultantes da combinação de vários marcadores. A população de Alagoas, como as demais populações do Nordeste brasileiro, é caracterizada pela miscigenação entre caucasianos, negros e índios. O estudo de polimorfismos de microssatélites e de haplótipos do cromossomo Y é de grande valia para o esclarecimento da contribuição genética dada por estes grupos ancestrais para a população atual. Além disto, este estudo populacional é indispensável para que estes marcadores possam ser utilizados em estudos forenses e de paternidade. O presente trabalho tem como objetivos: GERAL ¾ Caracterizar. a. população. do. Estado. de. Alagoas. quanto. ao. polimorfismo dos microssatélites DYS19, DYS385, DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS447, DYS458 e DYS464, e quanto. à. diversidade. de. haplótipos. constituídos. com. estes. marcadores. ESPECÍFICOS ¾ Comparar os dados obtidos com os de outras populações do mundo quanto ao grau de variabilidade genética; ¾ Fornecer dados para a validação dos testes de investigação de paternidade e de identificação humana realizados no Laboratório de Genética Molecular Humana (LGMH) da Universidade Federal de Pernambuco e no Laboratório de DNA Forense da Universidade Federal de Alagoas; ¾ Ampliação. do. banco. de. dados. do. Nordeste. brasileiro. com. freqüências haplotípicas dos microssatélites ligados ao cromossomo Y.. 18.

(22) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... 2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. 2.1. Identificação Humana Através do DNA Um conjunto de marcadores dos grupos sanguíneos (antígenos. eritrocitários, polimorfismos alozímicos e de proteínas séricas) era utilizado na ciência forense antes do uso da biologia molecular (Martin et jh al. 2001). Em 1985 Jeffreys, Wilson e Thein introduziram na ciência forense uma técnica de biologia molecular chamada por eles de “DNA fingerprinting” que se baseava no uso de sondas multilocais de VNTRs (Variable Numbers of Tandem Repeats, repetições em tandem de número variável). No mesmo ano Gill et al. (1985) demonstraram que os minissatélites. ou. VNTRs. poderiam. ser. utilizados. em. investigações. criminais, uma vez que células de diferentes tecidos de um mesmo indivíduo possuem o mesmo padrão de bandas. Além disto, as VNTRs possibilitavam a tipagem de amostras quando o tempo decorrido entre a coleta ou. deposição e a tipagem era maior e apresentavam um maior. poder de discriminação. Com o advento da amplificação de DNA in vitro através da PCR (Polimerase Chain Reaction, reação em cadeia de polimerase) foi possível a obtenção de perfis genéticos de amostras biológicas com DNA degradado. ou. em. pequenas. quantidades. (Mullis et. al.. 1986).. O. desenvolvimento da técnica denominada MVR-PCR (Minisatellite Variable Region Amplified by PCR, repetição variável de minissatélite amplificada por PCR) aumentou a eficiência da tipagem de amostras degradadas e com pouco DNA, sendo também aplicável à análise de misturas como ocorre em casos de estupro (Jeffreys et al. 1991). A identificação humana através do perfil de DNA se tornou padrão em investigações criminais, sendo que a maioria dos sistemas de tipagem com finalidade forense é baseada em locos genéticos com seqüências repetidas em tandem, que. 19.

(23) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... apresentam variação na seqüência e no número de elementos repetitivos (Schneider 1997). 2.2 Microssatélites O. seqüenciamento. do. genoma. humano. revelou. que. os. 23. cromossomos do Homo sapiens são compostos aproximadamente por três bilhões de pares de bases, dos quais 1,1% corresponde a éxons, 24% a íntrons e 75% são seqüências intergênicas (Venter et al. 2001). Cerca de 50% do genoma humano é constituído por seqüências repetitivas que podem estar dispersas ou organizadas em tandem, uma ao lado da outra. Os microssatélites, também conhecidos como STRs (Short Tandem Repeats), são seqüências repetitivas constituídas por unidades básicas, ou repetições, com dois a seis pares de bases (pb) de tamanho e que estão presentes nos genomas humano, animal, de plantas e fungos. Nos humanos, estima-se que compreendam cerca de 20% do genoma e podem se localizar em regiões intergênicas, em íntrons ou em regiões flanquedoras.. São. encontrados. tanto. nos. autossomos. como. nos. cromossomos sexuais (Arcot et al. 1995; Schlötterer 1998; Hummel 2003). O polimorfismo dos microssatélites se deve tanto ao ganho como à perda de unidades sendo que os alelos são identificados pelo número de unidades (figura 1) (Schlötterer 1998). Desde que foram descobertos os microssatélites têm tido ampla aplicação em áreas como biologia molecular, genética funcional e qualitativa e biologia populacional. Isso se deve a sua hipervariabilidade, abundância e ampla distribuição por todo o genoma, por fornecerem informação genealógica e por poderem ser amplificados por PCR. A aplicabilidade dos microssatélites na identificação individual, em casos forenses. e. de. paternidade,. tornou-os. os. marcadores. genéticos. predominantemente utilizados nessa área a partir da década de 1990. 20.

(24) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... (Goldstein e Schlötterer 1999; Schoske 2003). A amplificação de microssatélites através da PCR possibilita a análise de amostras com DNA degradado ou em pequena quantidade (Ruitberg et al. 2001). A utilização ampla de microssatélites pelos cientistas forenses tornou necessária a criação de normas que orientassem e padronizassem o emprego destes marcadores. Em 1998 a International Society for Forensic Genetics (ISFG) publicou diretrizes e recomendações sobre a nomenclatura de sistemas de microssatélites que são seguidas de forma generalizada por cientistas forenses (Olaissen et al. 1998).. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10 11. gtctgtctatctatctatctatctatctatctatctatctatctatctatctg 11 repetições = alelo 11. Figura 1: Estrutura de um microssatélite com 11 repetições [tcta]. A sequência acima corresponde ao alelo 11 (11 repetições).. 2.3 Microssatélites do Cromossomo Y O DNA humano está organizado em 23 pares de cromossomos sendo 22 pares de autossomos e um par de cromossomos sexuais, sendo o sexo feminino homogamético (XX) e o masculino heterogamético (XY). O cromossomo Y, exclusivo do sexo masculino, apresenta duas regiões, PAR1 (região pseudoautossômica 1) e PAR2 (região pseudo autossômica 2), que encontram homologia no cromossomo X recombinando com o mesmo. na. meiose. e. correspondendo. a. aproximadamente. 5%. da. seqüência total do cromossomo Y. A maior parte do cromossomo Y não. 21.

(25) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... recombina com nenhum outro cromossomo sendo denominada região não recombinante do cromossomo Y (NRY) ou região masculino-específica do cromossomo Y (MSY). Com cerca de 60 milhões de pares de bases (pb) a NRY humana é constituída por seqüências altamente repetitivas (Lahn et al. 2001). O primeiro microssatélite do cromossomo Y descrito foi o 27H39LR, atualmente denominado DYS19, sendo utilizado para excluir um suspeito em um caso de estupro (Roewer e Epplen 1992). De acordo com Butler (2003) no início de 2002 havia apenas 30 microssatélites do Y disponíveis para os pesquisadores. Em 2003 o número de microssatélites descritos cresceu consideravelmente. Berger et al. (2003) se referiu à existência de aproximadamente 50 microssatélites do cromossomo Y descritos. Jobling e Tyler Smith (2003) citaram um número entre 100 e 200 novos microssatélites na NRY dos quais 30 eram marcadores polimórficos, com repetições de três, quatro e cinco nucleotídeos. Segundo Butler (2003) neste mesmo ano mais de 200 marcadores tinham sido depositados no Genome Database. Como resultado de um minucioso rastreamento da seqüência do cromossomo Y realizado por Kayser et al. (2004) foram identificados 166 novos marcadores o que eleva para mais de 300 o número atual de microssatélites já descritos . A tabela 1 apresenta os microssatélites mais utilizados até hoje e suas principais características.. 22.

(26) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... Tabela 1: Microssatélites do Y mais utilizados. O alelo de referência corresponde ao número de repetições da seqüência depositada no GenBank que em alguns casos é considerada como reversa e complementar (r&c) para que haja concordância com motivos de repetição usados anteriormente. (Modificado de Butler, 2003). Nome do marcador DYS19 DYS385 a/b DYS389I DYS389II DYS390 DYS391 DYS392 DYS393 YCAII a/b. Intervalo de alelos 10-19 7-28 9-17 24-34 17-28 6-14 6-17 9-17 11-25. Motivo da repetição TAGA GAAA (TCTG)(TCTA) (TCTG)(TCTA) (TCTA)(TCTG) TCTA TAT AGAT CA. Número de Acesso Alelo de ao GenBank referência AC017019 (r&c) 15 AC022486 (r&c) 11 AC004617 (r&c) 12 29 AC011289 24 AC011302 11 AC011745 (r&c) 13 AC006152 12 AC015978 23. As duas principais razões para o estudo do cromossomo Y são a especificidade masculina em testes com misturas de DNA e a habilidade para traçar linhagens paternas. Os microssatélites do Y podem ser usados para várias aplicações em identificação humana como análise forense de evidências. de. estupro,. testes. de. paternidade. com. pai. falecido,. investigações de pessoas desaparecidas e estudos antropológicos e populacionais (Schultes et al. 1998; Butler 2003; Jobling e Tyler-Smith 2003). Em casos complexos de teste de parentesco, a eficiência da análise feita com marcadores autossômicos pode ser aumentada com a utilização de marcadores do cromossomo Y (Szibor et al. 2003). Na identificação de pessoas desaparecidas parentes da mesma patrilinhagem podem ser usados como referência (Butler 2003). Como a grande maioria dos crimes é cometida por indivíduos do sexo masculino a tipagem de amostras de cena de crime com marcadores do cromossomo, Y geralmente é informativa. Nos casos de estupro em que o DNA do agressor e o da vítima estão misturados, estes marcadores dão informação específica sobre o agressor. Em casos nos quais o exame citológico falha em detectar espermatozóides, podem estar presentes outros tipos de células do agressor. Pode ocorrer também que o agressor. 23.

(27) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... seja azoospérmico ou vasectomizado, o que faz com que as técnicas utilizadas para separar espermatozóides dos componentes femininos não funcionem. Nestas circunstâncias pode-se fazer a identificação através de marcadores do cromossomo Y (Jobling et al. 1997; Sibille et al. 2002; Redd et al. 2002; Butler 2003). A tipagem por meio do DNA possibilita que indivíduos associados falsamente a evidências forenses sejam inocentados e o número de agressores em potencial seja reduzido a um só indivíduo. Locos polimórficos. de. microssatélites. marcadores. genéticos. baseados. localizados em. PCR. nos. autossomos. mais. são. informativos. os. para. individualizar material biológico. Marcadores autossômicos podem, assim, diferenciar quaisquer dois indivíduos excetuando-se gêmeos idênticos (Budowle et al. 2001). Marcadores do cromossomo Y têm menor poder de discriminar indivíduos que marcadores autossômicos. Isto se deve à redução da variabilidade pela ausência de recombinação e à natureza haplóide do cromossomo Y, cada indivíduo possui apenas um alelo por marcador o que é menos informativo que um marcador autossômico com a mesma diversidade alélica, mas apresentando dois alelos por indivíduo (Bosch et al. 2002). Devido à ausência de recombinação os marcadores localizados na NRY são passados de pai para filho combinados na forma de haplótipo, sem sofrer qualquer alteração uma geração após a outra, a menos que ocorra mutação (Mitchel e Hammer 1996). Em decorrência desta propriedade, vários marcadores podem ser utilizados para compor um haplótipo. Para aumentar o potencial de discriminação de um haplótipo pode-se recorrer à análise de um maior número de marcadores ou, o que é mais viável, utilizar uma combinação dos marcadores mais polimórficos (Schoske et al. 2004). Foi estabelecido na Europa pelo Y Chromosome Haplotype Reference Database (YHRD) um “haplótipo mínimo” e um “haplótipo estendido”. O. 24.

(28) Azevedo, D.A.. haplótipo. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... mínimo. é. composto. pelos. marcadores. DYS19,. DYS385,. DYS389I, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS392 e DYS393. O haplótipo estendido é composto pelos marcadores do haplótipo mínimo mais o marcador YCAII. Apesar de aumentar consideravelmente o poder de discriminação do haplótipo, o marcador YCAII não é ideal para o estudo de misturas de amostras masculinas, pois apresenta um alto número de bandas inespecíficas (bandas de repetição ou stutter). (Roewer et al. 2001; Schoske et al. 2004). Embora o poder discriminatório do haplótipo mínimo seja grande, necessidades. forenses. específicas. algumas. vezes. requerem. mais. informação (Sánchez-Diz et al. 2003). Nos Estados Unidos o Scientific Working Group on DNA Analysis Methods (SWGDAM) definiu um haplótipo composto pelos marcadores do haplótipo mínimo mais os marcadores DYS438 e DYS439, o qual não apresentou nenhuma perda apreciável na capacidade discriminatória, em relação ao haplótipo estendido do YHRD, com a vantagem da eliminação do problema de bandas inespecíficas produzidas pelo marcador YCAII (Butler 2003). Foram estudados vários novos marcadores que apresentam alto grau de polimorfismo e que poderiam ser combinados para a obtenção de um haplótipo com um poder de discriminação considerável. Dentre estes podem ser destacados os marcadores DYS458, DYS447 e DYS464, os quais apresentam valor de diversidade mais elevado que o dos locos DYS438 e DYS439, sendo candidatos à composição de um haplótipo juntamente com os locos do haplótipo mínimo, com elevada capacidade de discriminação (Redd et al. 2002; Berger et al. 2003; Butler e Schoske 2004). Na figura 2 está representada esquematicamente a distribuição ao longo do cromossomo Y dos marcadores do haplótipo mínimo mais os marcadores DYS447, DYS458 e DYS464. Tendo em vista a grande diversidade de locos de microssatélites do cromossomo Y, é evidente a necessidade de que sejam envidados esforços para a obtenção de bancos de dados confiáveis para que estes. 25.

(29) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... marcadores possam ser utilizados. Para propósitos forenses é essencial a identificação de polimorfismos que possibilitem a discriminação entre a maioria das linhagens não relacionadas de uma dada população e o estabelecimento de um banco de dados representativo da estrutura geográfica e étnica das populações de interesse cujo tamanho possibilite estimar as freqüências de haplótipos raros (Roewer et al. 2001).. Marcadores do Haplótipo Mínimo. Heterocromatina. PAR 1. PAR 2. Figura 2: Esquema da distribuição dos marcadores do haplótipo mínimo mais DYS447, DYS458 e DYS464 ao longo do cromossomo Y. (Modificado de Short Tandem Repeat DNA Internet Database).. 2.4 Taxa de Mutação em Microssatélites do Cromossomo Y O. “deslizamento”. (slippage). da. polimerase. é. considerado. o. mecanismo originador de mutações em microssatélites bem como de artefatos, durante a PCR, que contém uma repetição a menos que o alelo principal, conhecidos como “bandas de repetição” ou “stutter”. O deslizamento da polimerase ocorre quando esta se dissocia do DNA, durante uma pausa na replicação, o filamento em síntese se separa do. 26.

(30) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... filamento molde e volta a parear com outra repetição para a frente ou para traz da posição correta (erro de pareamento). A replicação é então retomada completando o processo no qual o comprimento do filamento recém sintetizado pode ser maior ou menor do que o do filamento molde (figura 3) (Viguera, Canceill e Erlich 2001). Este pareamento fora de registro é uma propriedade intrínseca das seqüências de microssatélites e ocorre a frequências elevadas (Schlötterer 1998) sendo o mecanismo responsável. pela. grande. variabilidade. em. locos. de. microssatélites. (Klintschar e Wiegand 2003).. a) Normal 1. 2. 3. 5’. GAT. GAT. GAT. 3’. CTA. CTA. CTA. CTA. CTA. CTA. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 5’. b) Inserção causada pelo deslizamento para trás 2’ 1. 2. 5’. GAT. GAT. 3’. CTA. CTA. CTA. CTA. CTA. CTA. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 5’. c) Deleção causada pelo deslizamento para frente 1. 2. 3. 5. 5’. GAT. GAT. GAT. GAT. 3’. CTA. CTA. CTA. CTA. CTA. 1. 2. 3. 5. 6. C. T T A. Formação de bandas de repetição (stutter). 5’. 4. Figura 3: Esquema do deslizamento da polimerase. a) Pareamento normal do filamento novo com o filamento molde. b) Deslizamento do filamento novo para trás dando origem à inserção. c) Deslizamento do filamento novo para frente causando deleção. Este é o mecanismo primário de formação de bandas de repetição ou stutter. (Modificado de Butler 2005).. 27.

(31) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... Idade, sexo e estrutura da região repetitiva são considerados os três principais. fatores. associados. ao. aumento. da. susceptibilidade. dos. microssatélites a eventos mutacionais (Brinkman et al. 1998; Holtkemper et al. 2001). Regiões repetitivas contínuas mais longas, com 10 ou mais repetições, estariam mais sujeitas à mutação do que regiões repetitivas mais curtas ou descontínuas (Kayser et al. 2000; Holtkemper et al. 2001). A relação entre a estrutura do microssatélite e a taxa de mutação tem se apoiado em estudos que demonstraram existir uma variação substancial da taxa de mutação entre locos de microssatélites (Di Rienzo et al. 1998; Dupuy et al. 2004) podendo ser maior que 80 % (Zhivotovsky et al. 2004). O aumento da taxa de mutação para pais com idade mais avançada é confirmado por Góes et al. (2004) cujos dados apresentam uma média de idade mais elevada para os pais envolvidos em eventos mutacionais. Por outro lado nos estudos realizados por Kayser et al. (2000) e Dupuy et al. (2004) não foi verificada uma diferença estatisticamente significativa entre a média de idade dos pais envolvidos e os não envolvidos em eventos mutacionais. Em. casos. de. paternidade. com. pai. falecido,. nos. quais. o. reconhecimento de paternidade é requerido por um indivíduo do sexo masculino, a tipagem com microssatélites do cromossomo Y é muito utilizada, pois homens da mesma linhagem possuem o mesmo perfil. Verifica-se, porém, que em alguns casos pessoas aparentadas podem apresentar uma diferença em haplótipos constituídos por vários locos devido à mutação. Por esse motivo é necessário o conhecimento da taxa de mutação de cada loco analisado para avaliar a possibilidade de uma possível falsa exclusão (Rolf et al. 2001). Algumas abordagens que têm sido utilizadas para determinar a taxa de mutação de microssatélites são: a análise de trios pais/filho ou duplas pai/filho, o monitoramento de genealogias, a estimativa teórica da taxa de. 28.

(32) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... mutação através do estudo de diferentes populações e a tipagem do DNA de células espermáticas (Holtkemper et al. 2001). A primeira avaliação da taxa de mutação em microssatélites do cromossomo Y foi feita através da análise de genealogias. Neste estudo foram utilizados os marcadores do haplótipo mínimo mais o DXYS156 sendo verificada uma taxa média de mutação de 2,1 x 10-3, que é semelhante à de microssatélites autossômicos (Heyer et al. 1997). Utilizando a tipagem de células espermáticas, Holtkemper et al. (2001) registrou taxas de mutação iguais a 1,8 x 10-3 e 2,1 x 10-3 para os marcadores DYS390 e DYS19, respectivamente, que estão muito próximas das que foram observadas por Heyer et al. (1997). O método mais utilizado para a estimativa de taxas de mutação de microssatélites do cromossomo Y é a análise direta de pares pai/filho com paternidade confirmada através de marcadores autossômicos e com índice de paternidade maior que 1.000 (probabilidade de paternidade maior que 99,9). Este método foi utilizado por Kayser et al. (1997) que observou uma taxa de mutação de 3,2 x 10-3 para o microssatélite DYS19 em uma amostra de 626 pares pai/filho. Num estudo mais amplo compreendendo 4.999. meioses. de. pares. pai/filho. com. paternidade. confirmada. (probabilidade ≥ 99,9 %) foi observada uma taxa de mutação média de 2,80 x 10-3 para 15 microssatélites (haplótipo mínimo mais YCAIa/b, YCAIIa/b e DYS413a/b) que é muito semelhante à observada por Heyer et al. (1997) (Kayser. et al. 2000). Outros estudos utilizando este mesmo. método foram realizados por Ballard et al (2005) e Dupuy et al. (2004) cujos resultados são apresentados na tabela 2 juntamente com os de outros estudos feitos de 1997 a 2005. De acordo com recomendações da ISFG a taxa de mutação deve ser calculada em relação ao número de transmissões de alelos e não em relação ao número de meioses. Assim para marcadores que possuem duas cópias como o DYS385 ou quatro cópias como o DYS464 o número de. 29.

(33) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... transmissões alélicas é respectivamente igual a duas e quatro vezes o número de meioses (número de duplas pai/filho) (Gusmão et al. 2005).. Tabela 2: Seleção de alguns estudos da taxa de mutação para marcadores do cromossomo Y. (Modificado de Dupuy et al. 2004). Estudo. Ballard et al. (2005). Dupuy et al. (2004). Berger et al. (2003). Holtkemper et al. (2001). Kayser et al. (2000). Heyer et al. (1997). DYS390. 0. 4,5×10-3. -. 3,9×10-3. 8,6×10-3. -. DYS391. 8,1×10-3. 4,5×10-3. -. -. 4,8×10-3. -. DYS385. 1,7×10-2. 4,0×10-3. -. -. 2,1×10-3. 4,7×10-3. DYS389II. 8,1×10-3. 2,3×10-3. -. -. 4,7×10-3. 9,3×10-3. DYS389I. 4,0×10-3. 2,3×10-3. -. -. 2,4×10-3. -. DYS19. 4,1×10-3. 1,7×10-3. -. 4,3×10-3. 2,0×10-3. -. DYS393. 0. 5,7×10-4. -. -. -. -. DYS388. -. 5,7×10-4. -. -. -. -. DYS392. 0. -. -. -. -. 4,7×10-3. DYS439. 4,0×10-3. -. -. -. -. -. DYS460. 1,3×10-3. -. -. -. -. -. DYS464. -. -. 2,8×10-2. -. -. -. Marcador. 30.

(34) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... 2.5 Descrição dos Microssatélites do Haplótipo Mínimo mais DYS447, DYS458 e DYS464 2.5.1 DYS19 – localização: Yp11.2 O primeiro microssatélite do cromossomo Y a ser descrito foi o DYS19, denominado originalmente 27H39LR (Roewer e Epplen, 1992) também conhecido como Y-H39 (Butler 2003). Duas seqüências deste microssatélite estão depositadas no GeneBank (GB): X77751, com 12 repetições, e AC017019 (seqüência reversa e complementar: r&c), com 14 repetições (figura 4a). Tem como motivo a sequência [TAGA]n e sua localização cromossômica é Yp11.2. A seqüência X77751 tem um par de bases a menos que a seqüência AC017019 na região de pareamento do primer (figura 4b) (Short Tandem Repeat DNA Internet Database).. a). 43201 43261 43321 43381. tagtggctgg tccatctggg tatctatcta tatataatac. ggcaccagga ttaaggagag tctatctacc tatatatata. gtaatacttc tgtcactata tatctatcta ttaaaaaaca. gggccatggc tctatctatc tctaaaacac ctataacaga. catgtagtga tatctatcta tatatatata aactcagtag. ggacaaggag tctatctatc taacactata tcatagtgaa. b) 1 DYS19_X77751 ACCCAGA TGGACTCCTTGTCCT CACTACATG -CCAT- --------------- 186 2 DYS19_AC017019c ACCCAGA TGGACTCCTTGTCCT CACTACATGGCCATG GCCCGAA 232. Figura 4: a) Sequência do microssatélite DYS19 (GB: AC017019 (r&c)). Sombreado em verde o sítio de pareamento do primer sense e em azul o sítio do primer antisense. b) Alinhamento das seqüências X77751 e AC017019 demonstrando a diferença de um par de bases, destacada em vermelho. A seqüência complementar é identificada com um c. (Modificado de Short Tandem Repeat DNA Internet Database). 31.

(35) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... 2.5.2 DYS385 – localização: Yq11.222 O microssatélite DYS385 foi descrito em 1998 por Schneider et al. e tem como motivo a sequência [GAAA]n. No GB está depositada a seqüência reversa e complementar (r&c) cujo código de acesso é AC022486 (figura 5). O DYS385 apresenta um padrão de dois alelos resultante da duplicação da região do cromossomo Y onde se localiza, sendo que as porções duplicadas estão orientadas em sentido oposto e separadas por 40.775 pares de bases (pb) (figura 6). Os alelos das duas regiões são designados “a” e “b” levando em conta apenas a determinação do tamanho do alelo feita por eletroforese e não a posição física no cromossomo (Butler 2003). Os fragmentos, ou alelos, observados são tratados como genótipos e os alelos devem ser escritos separados por hífen (Gusmão et al. 2005).. 126721 126781 126841 126901 126961. ttttaaaaaa ctttctttct ttctttctct ttctttttta ttgttgtttg. taatctatct ttctttcttt ttcctctttc ctttctttct gcatggtgtc. attccaatta ctttctttct tctttcttct ccttccttcc tagctctgtc. catagtcctc ttctttccct ctttctttct ttcctttctg acccatgctg. ctttcttttt tccttccttc ttttctcttt aatttcattt gattgcagtg. ctctttcttt cttccttcct ttctctttct cttttctttg ccatcatttc. Figura 5: Seqüência do microssatélite DYS385 (GB: AC022486 (r&c)). Em vermelho a seqüência repetitiva, sombreado em verde o sítio de pareamento do primer sense e em azul o do primer antisense.. 32.

(36) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... DYS385a. DYS385b. 40.775 pb. Figura 6: Esquema da posição relativa dos dois locos do microssatélite DYS385. As seqüências das duas regiões têm os sentidos indicados pelas setas e a distância também está demonstrada. (modificado de Butler 2003).. 2.5.3 DYS389I/II – localização: Yq11.21 O microssatélite DYS389I/II foi originalmente descrito por Roewer et al (1996). O mesmo par de primers origina dois amplicons que diferem no tamanho em cerca de 120 pb sendo que o menor é denominado DYS389I e o maior DYS389II (figura 7a). A amplificação de dois fragmentos de tamanhos diferentes se deve à existência de dois sítios de pareamento do primer sense que se localizam nas regiões flanqueadoras dos dois trechos de seqüências repetitivas que compõem este marcador (figura 7b) (Butler 2005). O loco DYS389II é constituído por dois trechos de repetições que têm como motivo as sequências [TCTG]n[TCTA]p e [TCTG]q[TCTA]r e o loco DYS389I é constituído por um trecho de repetições [TCTG]q[TCTA]r. As letras subscritas (n, p, q e r) representam o número variável das repetições.. 33.

(37) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... a). DYS389I. DYS389II. b) 62501 62561 62621 62681 62741. aattatccctgagtagcagaagaatgtcatagatagatgatggactgctagataaataga tagattgatagagggagggatagatagatagatagatagatagatagatagatagacaga cagacagatacatagataatacagatgagagttggatacagaagtaggtataatgataga tagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagacagacagacagacaga cagacacacacatagataatacagatgagagttggataca. Figura 7: a) Esquema dos dois fragmentos do DYS389. O primer sense (verde) pareia em dois sítios. O retângulo tracejado e azul representa o fragmento maior (DYS389II) e o vermelho o fragmento menor (DYS389I). b) Seqüência do marcador DYS389, número de acesso no GenBank GB-AC017019 (r&c). Em vermelho as duas sequências repetitivas, sombreado em verde o primer sense e em azul o primer antisense.. 2.5.4 DYS390 – localização: Yq11.221 Marcador descrito por Roewer et al (1996) o microssatélite DYS390 é. constituído. pelas. repetições. [TCTG]n[TCTA]p[TCTG]q[TCTA]r.. Sua. seqüência pode ser acessada no GB pelo código AC011289 e possui 11 repetições (figura 8) (Short Tandem Repeat DNA Internet Database). É o microssatélite do Y com a maior taxa de mutação (Kayser et al. 2000; Kayser e Sajantilla 2001).. 34.

(38) Azevedo, D.A.. 69301 69361 69421 69481. ggagaaatgg gatagataga atagatagat tattatgggg. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... atgacagtaa tgatagatag agatagacag taccaaaatg. aatgaaaaca atagatagac acagacagac cagggcccaa. ttgcaatgtg agatagatag agacagacag aaatgtgtaa. tatactcaga atagatagat acagacagat aatatatgtg. aacaaggaaa agatagatag agatagaata tgaatgtaat. Figura 8: Seqüência do DYS390 (GB: AC0011289 (r&c)). Em vemelho o trecho de seqüências repetitivas, o sombreado verde assinala a seqüência do primer sense e o sombreado azul a seqüência do primer antisense.. 2.5.5 DYS391 – localização: Yq11.21 O microssatélite DYS391 foi publicado em 1996 por Roewer et al. É constituído pela seqüência repetitiva [TCTA]n. Duas seqüências deste marcador, ambas com 11 repetições, estão depositadas no GB: G09613 e AC011302 (Short Tandem Repeat DNA Internet Database). A sequência AC011302 com a identificação da seqüência repetitiva e das seqüências dos primers é apresentada na figura 9.. 31021 tatacctaac ctatcatcca tccttatctc ttgtgtatct attcattcaa tcatacaccc 31081 atatctgtct gtctgtctat ctatctatct atctatctat ctatctatct atctatctat 31141 ctgcctatct gcctgcctac ctatccctct atggcaattg cttgcaacca gggagatttt. Figura 9: Seqüência do DYS391 (GB: AC011302). As seqüências dos primers sense e antisense estão destacadas com sombreado verde e azul, respectivamente. Em vermelho o trecho de seqüência repetitiva.. 35.

(39) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... 2.5.6 DYS392 – localização: Yq11.222 O microssatélite DYS392 (Roewer et al. 1996) é formado pela seqüência. repetitiva. de. três. nucleotídeos. [TAT]n.. As. seqüências. depositadas no GB com código de acesso G09867 e AC06152 (figura 10) apresentam respectivamente 16 e 13 repetições (Short Tandem Repeat DNA Internet Database).. 52081 52141 52201 52261 52321. agacccagtt tcaaagaagt aataataata ttgttttcct agctagatta. gatgcaatgt caaaacagag ataataataa tcttggcttt atgaagaaaa. aaattcctac ggatcattaa taataataat taaataacaa. agtcaaagtg acctaccaat aataaataaa acacttgaaa. gaaagtagtc cccattcctt tggtgataca tcaaattagt. tggaaatatc agtaaataat agaaaaaaat tgtttttaaa. Figura 10: Seqüência do DYS392 (GB: AC011745 (r&c)). O sombreado verde e o azul assinalam as seqüências dos primers sense e antisense, respectivamente. Em vermelho o trecho de seqüências repetitivas.. 2.5.7 DYS393 – localização: Yp11.31 O microssatélite DYS393 (Rower et al. 1996) é constituído pela seqüência repetitiva de quatro nucleotídeos [AGAT]n. Sua seqüência pode ser encontrada no GB sob os códigos de acesso G09601, com 15 repetições, e AC06152, com 12 repetições (figura 11) (Short Tandem Repeat DNA Internet Database).. 21061 tgtagttatg ttttatttgt cattcctaat gtggtcttct acttgtgtca atacagatag 21121 atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag atatgtatgt cttttctatg 21181 agacatacct cattttttgg acttgagttt tattttttta. Figura 11: Seqüência do DYS393 (GB: AC06152). As seqüências dos primers sense e antisense estão marcadas com sombreado verde e azul, respectivamente. O trecho de seqüências repetitivas está em vermelho.. 36.

(40) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... 2.5.8 DYS447 – localização: Yq11.21 O microssatélite DYS447 é composto pela seqüência repetitiva de cinco nucleotídeos cuja estrutura é: [TAATA]n[TAAAA]1[TAATA]p[TAAAA]1 [TAATA]q. Sua seqüência depositada no GenBank, com código de acesso AC005820, possui 23 repetições, figura 12 (Redd et al. 2002). Este marcador destaca-se pelo baixo grau de formação de bandas de repetição (stutter) menos de 2% que é uma característica desejável para análise de evidências forenses (Butler 2003).. 91681 91741 91801 91861. gggtggtcac tataatataa tataatataa tgtccagaaa. agcatggctt tataatataa tataaaataa ggcagagata. ggttttatac tataaaataa tataatataa acgcaaagca. attttaggga gacataaggc attaatataa tataatataa tataatataa tataatataa tataatataa tataatataa acattagttc agccccctgc. Figura 12: Seqüência do DYS447 (GB: AC005820). Os sombreados em verde e azul marcam as seqüências dos primers sense e antisense, respectivamente e o trecho de seqüências repetitivas está em vermelho.. 2.5.9 DYS458 – localização: Yp11.223 O microssatélite DYS458 foi também descrito primeiramente por Redd et al. (2002). É constituído por seqüência repetitiva de quatro nucleotídeos cuja estrutura é: [GAAA]n. Sua seqüência no GenBank, com código de acesso AC010902.4, possui 16 repetições (figura 13).. 43981 tcaagattga gccattgcac tgcagactga gcaacaggaa tgaaactcca atgaaagaaa 44041 gaaaaggaag gaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga 44101 aagaaagaaa gaaaggaggg tgggcgtggt ggctcatgct tgtaatgcca gaactttggg. Figura 13: Seqüência do DYS458, (GB: AC010902.4). Sombreadas em verde e vermelho assinalam as seqüências dos primers sense e antisense, respectivamente. Em vermelho a seqüência de repetições.. 37.

(41) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... 2.5.10 DYS464 – localização: Yq11.223 e Yq11.23 O microssatélite DYS464 é constituído pela seqüência repetitiva cuja estrutura é: [CCTT]n (figura 14). Foi descrito por Redd et al. (2002) e é o marcador mais polimórfico do cromossomo Y já publicado, possuindo um potencial elevado para fazer discriminação entre patrilinhagens (Berger et al. 2003; Butler e Schoske 2004). Ocorre quatro vezes (figura 15) na região palindrômica próximo do centro do braço longo do cromossomo Y a cerca de 25 megabases da região DAZ (deleted in azoospermia) (Reed et al. 2002; Butler 2003). Os perfis para o DYS464 podem apresentar de apenas um alelo, se o mesmo alelo for encontrado nos quatro locos, a quatro alelos, se os locos tiverem alelos diferentes. Quando é utilizada a detecção por fluorescência, em perfis com dois ou três alelos, a presença do mesmo alelo em mais de um loco resulta em desbalanceamento entre os picos. A marcação dos perfis pode ser feita levando-se em conta apenas as bandas ou picos observados, tipagem conservadora, ou pode levar em conta a altura relativa dos picos, tipagem expandida (aplicável só na detecção por fluorescência), registrando mais de uma vez o alelo referente ao pico mais alto (figura 16) (Butler e Schoske 2004; Butler 2005).. 3121 3181 3241 3301 3361. tactacatgg acatgcctgc tctttccttc ttccctcctt tctctttttt. actgacagaa cttccttcct cttcttccct ccttccttcc cttttcttcc. ccctgagttt tccttccttc tctcttcctt ttctttcctt ctgaaagagt. acgagctttg cttccttcct cctccctcca cctttctctc ctctctgtta. ggctatgctc tccttccttc tccctccctt cttccttcct cccaggtatg. agtttaaaat cttccttcct ccttccttcc ccttctctct gtgtataata. Figura 14: Seqüência do DYS464 (GB: X17354). Os sombreados verde e azul assinalam as seqüências dos primers sense e antisense, respectivamente. Em vermelho o trecho de seqüências repetitivas.. 38.

(42) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... DYS464: quatro cópias (a, b, c, d) a. b. c. ~225 kb. ~1.400 kb. d. ~225 kb. Figura 15: esquema das quatro regiões do microssatélite DYS464. São apresentadas as distâncias aproximadas entre os locos a, b, c e d.. Métodos deTipagem. TE. 17-17-17-17. 15-15-17-17. 12-14-14-16. 14-15-16-17. TC. 17. 15-17. 12-14-16. 14-15-16-17. Figura 16: A marcação dos alelos do marcador DYS464 pode ser feita tanto pelo método de tipagem conservador (TC) como pelo método de tipagem expandido (TE). (Modificado de Butler e Schoske 2005). 39.

(43) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... 2.6 Estudos do Cromossomo Y em Populações Brasileiras Portugal foi a principal fonte de imigrantes europeus que chegaram ao Brasil entre 1500 e 1808. Neste período cerca de 500.000 imigrantes portugueses chegaram ao Brasil sendo a maioria homens (IBGE 2000). Os primeiros. brasileiros. foram. resultado. do. casamento. entre. homens. portugueses e mulheres ameríndias (Carvalho-Silva et al. 2001). Da metade do século 16 até o século 19 estima-se que 4.000.000 de escravos africanos foram trazidos para o Brasil. No período que vai de 1820 a 1975, 70 % dos mais de cinco milhões de imigrantes europeus que chegaram oficialmente no Brasil eram portugueses e italianos (IBGE 2000). A população do Brasil é resultante da intensa miscigenação ocorrida principalmente entre as linhagens ameríndias, européias e africanas (Pena et al. 2000). Estudos do cromossomo Y têm demonstrado que a origem paterna da população brasileira é predominantemente européia.. De acordo com. Santos et al. (2003) a diversidade de haplótipos de microssatélites do Y da população da Bahia é semelhante à de Portugal e significativamente maior que a de populações do noroeste da África, região de origem da maioria dos africanos transportados para a Bahia. Na população do Rio de Janeiro dentre 129 haplótipos foram encontrados sete haplótipos que provavelmente seriam de origem banto (Góes et al. 2004). O exame de polimorfismos da NRY em 200 brasileiros auto definidos como brancos, de várias regiões geográficas, demonstrou que a grande maioria dos cromossomos Y (97,5 %) é de origem européia, 2,5 % de origem africana (sul da África) e nenhum de origem ameríndia (Carvalho-Silva et al. 2001). Estudos comparativos têm demonstrado que a variação haplotípica entre as populações das cinco regiões geopolíticas do Brasil não é significativa (Santos et al. 2003; Grattapaglia et al. 2004).. 40.

(44) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... Os microssatélites do cromossomo Y têm sido o tema de pesquisas realizadas no mundo todo e isto é confirmado pelo grande número de trabalhos publicados bem como de populações estudadas. Este fato demonstra a importância destes marcadores para a ciência forense e para a genética de populações.. 41.

(45) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Arcot SS, Wang Z, Weber JL, Deininger PL and Batzer MA (1995) Alu repeats: a. source for the genesis of primate microsatellites.. Genomics 29: 136-144. Ballard DJ, Phillips C, Wright G, Thacker CR, Robson C, Revoir AP and Court DS (2005) A study of mutation rates and de characterization of intermediate, null and duplicated alleles for 13 Y chromosome STRs. Forensic Sci Int. 155: 65-70. Berger B, Niederstätter H, Brandstätter A and Parson W (2003) Molecular characterization and Austrian Caucasian population data of the multicopy Y-chromosomal STR DYS464. Forensic Sci Int 137: 221-230. Bosch E, Lee AC, Calafell F, Arroyo E, Henemman P, Knijiff P and Jobling MA (2002) High resolution Y chromosome typing: 19 STRs amplified in three multiplex reactions. Forensic Sci Int 125: 42-51. Brinkmann B, Klintschar M, Neuhuber F, Hühne J and Rolf B (1998) Mutation rate in human microsatellites: influence of the structure and length of the tandem repeat. Am J Hum Gen 62: 1408-1415. Budowle B, Shea B, Niezgoda S and Chakrabory R (2001) CODIS STR loci data from 41 sample populations. J Forensic Sci 46: 453-489. Butler JM (2003) Recent developments in Y-short tandem repeat and Ysingle nucleotide polymorphism analysis. Forensic Sci Rev 15: 91111. Butler. JM. (2005). Forensic. DNA. typing.. Elsevier. Academic. Press,. Burlington. 660 pp. Butler JM and Schoske R (2004) Forensic value of the multi-copy Y-STR marker DYS464. Int Congr Ser 1261: 278-280.. 42.

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(48) Azevedo, D.A.. Determinação do Polimorfismo de 15 Microssat.... Kayser M, Roewer L, Hedman M, Henke L, Henke J,Bruer S, Krüger C, Krawczak M, Nagy M, Dobosz T, Szibor R, Knijff P, Stoneking M and Sajantila. A. (2000). Characteristics. and. frequency. of. germline. mutations at microsatellite loci from the human Y chromosome, as revealed by direct observation in father/son pairs. Am J Hum Genet 66: 1580-1588. Kayser M and Sajantilla A (2001) Mutations at Y-STR loci: implications for paternity and forensic analysis. Forensic Sci Int 118: 116-121. Klintschar M and Wiegand P (2003) Polymerase slippage in relation to the uniformity of tetrameric repeat stretches. Forensic Sci Int 135:163166. Lahn BT, Pearson NM and Jegalian K (2001) The human Y chromosome in the light of evolution. Nature Gen 2: 207-216. Martin PD, Schmitter H and Schneider PM (2001) A brief history of the formation of DNA databases in forensic science wthin Europe. Forensic Sci Int 119: 225-231. Mitchell RJ and Hammer MF (1996) Human evolution and the Y chromosome. Curr Opin Genet Dev 6: 737-742. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G and Erlich H (1986) Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 51: 263-273. Olaissen B, Bär W, Brinkmann B, Budowle B, Carracedo A, Gill P, Lincoln P, Mayr WR and Rand S (1998) DNA recommendations 1997 of the International Society for Forensic Genetics. Vox Sang 74: 61-63. Pena SDJ, Carvalho-Silva DR,. Alves-Silva J, Prado VF and Santos FR. (2000) Retrato molecular do Brasil. Ciência Hoje 159: 16-25. Redd AJ, Agellon AB, Kearney VA, Contreras VA, Karafet T, Park H, Knijff P, Butler JM and Hammer MF (2002) Forensic value of 14 novel STRs on the human Y chromosome. Forensic Sci Int 130: 97-111.. 45.

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