INSTITUTO DE QUIMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
RICARDO LEAL CUNHA
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA
DETERMINAÇÃO DE ESTIMULANTES ANFETAMÍNICOS
INALTERADOS DE INTERESSE FORENSE EM URINA
EMPREGANDO DLLME E GC-MS
Salvador
2013
RICARDO LEAL CUNHA
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA
DETERMINAÇÃO DE ESTIMULANTES ANFETAMÍNICOS
INALTERADOS DE INTERESSE FORENSE EM URINA
EMPREGANDO DLLME E GC-MS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química, Instituto de Química, Universidade Federal da Bahia, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Química Analítica.
Orientador: Prof. Dr. Pedro Afonso de Paula Pereira Co-orientador: Prof. Dr. Wilson Araújo Lopes
Salvador
2013
Cunha, Ricardo Leal.
Desenvolvimento de método analítico para determinação de estimulantes
anfetamínicos inalterados de interesse forense em urina empregando DLLME e GC-MS / Ricardo Leal Cunha. - 2013.
100 f.:il.
Orientador: Prof. Dr. Pedro Afonso de Paula Pereira. Co-orientador: Prof.Dr. Wilson Araújo Lopes
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Instituto de Química, Salvador, 2013.
1. Estimulantes - Anfetamínicos. 2.Anfetaminas - Abuso. 3. Drogas - Abuso. 4. Analise cromatográfica. 5. Microextração. I. Pereira, Pedro Afonso de Paula. II. Lopes, Wilson Araújo. III. Universidade Federal da Bahia. Instituto de Química. III. Título.
CDD – 615.19
CDU – 543.544:615..074
Dedico este trabalho
Aos meus pais, pelos ensinamentos, pela educação e por tudo que proporcionaram ao longo da minha vida. A minha mãe Glória, pelas orações, pelo amor e dedicação, por me incentivar sempre a continuar estudando e perseverando em busca dos objetivos. Agradeço a Deus por ter uma mãe como você...
Aos meus irmãos, por fazerem parte da minha vida, fontes de constante incentivo e companheirismo.
AGRADECIMENTOS
Terei sempre que agradecer em primeiro lugar a Deus, por todas as bênçãos dispensadas durante esses anos e por me fortalecer nos momentos de dificuldade na realização desse trabalho.
Ao Prof. Pedro Afonso, pela orientação, pelos ensinamentos, pela paciência e compreensão durante todo o trabalho e pela receptividade ao aceitar ser meu orientador. Ao Prof. Wilson Lopes pela amizade e co-orientação.
Aos colegas da Coordenação de Toxicologia Forense e da Coordenação de Análise Instrumental do Laboratório Central de Polícia Técnica (LCPT). Agradeço de maneira especial a Ana Cecília e Celinalva pelos ensinamentos, pelo aprendizado durante esses anos na Polícia Técnica e por confiarem em nosso trabalho.
Ao amigo e diretor do Laboratório Central de Polícia Técnica, Dr. Alexsandro Fiscina por apoiar e incentivar a realização desse trabalho nas dependências do LCPT. Ao amigo e Coordenador Técnico Paulo Portela por suas palavras de incentivo e motivação.
Ao Dr. Bruno Gil de Carvalho Lima, Perito Legal do Instituto Médico-Legal Nina Rodrigues (IMLNR), por sua ajuda e cooperação através do Comitê de Ética em Pesquisa desse instituto.
Ao Perito Criminal Joaci da Coordenação de Hematologia Forense por sua inestimável ajuda num momento determinante desse trabalho.
Aos colegas do Laboratório de Pesquisa em Química – LPQ (UFBA), pela amizade e momentos agradáveis de conversas descontraídas. Ao amigo Fábio, pelas estimulantes conversas sobre instrumentação analítica e espectrometria de massas.
A todas as pessoas que direta ou indiretamente colaboraram para a realização desse trabalho. Muito obrigado!
“Pensava que nós seguíamos caminhos já feitos, mas parece que não os há. O nosso ir faz o caminho."
CUNHA, Ricardo Leal. Desenvolvimento de método analítico para determinação de estimulantes anfetamínicos inalterados de interesse forense em urina empregando DLLME e GC-MS. 98 f. il. 2013. Dissertação (Mestrado) – Instituto de Química, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2013.
RESUMO
O consumo de drogas de abuso é uma prática crescente no mundo moderno. Dessa forma, as drogas sintéticas e mais particularmente os derivados da anfetamina, ocupam um lugar de destaque. O consumo de estimulantes anfetamínicos tais como fenproporex (FEN), dietilpropiona (DIE) e sibutramina (SIB) se tornou uma prática comum entre motoristas profissionais nas estradas brasileiras nos últimos anos e entre pessoas que desejam perder peso, mas fazem o uso dessas substâncias de forma indiscriminada. O presente trabalho constitui o desenvolvimento de um método analítico, empregando microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME), capaz de detectar e quantificar esses medicamentos em baixas concentrações em amostras de urina. As análises foram realizadas utilizando cromatografia à gás acoplada a espectrometria de massas (GC-MS). O método apresentou boa performance analítica, com excelente linearidade na faixa dinâmica de 1 a 1000 ng/mL para DIE, FEN e SIB,
com valores de R2 iguais a 0,9926 , 0,9994 e 0,9951, respectivamente. Os limites de
detecção (LD), foram de 0,1 ng/mL para DIE e FEN e de 0,05 ng/mL para SIB. O coeficiente de variação intradia variou de 6,63% a 7,95% enquanto o interdia variou de 3,89% a 5,47%. A recuperação relativa encontrada foi superior a 82,88% para DIE, 88,58% para FEN e 95,60% para SIB. O método desenvolvido mostrou-se bastante útil na análise dos compostos estudados em amostras de urina postmortem ou in vivo.
CUNHA, Ricardo Leal. Development of analytical method for determination of unchanged amphetamines-type stimulants of forensic interest in urine using DLLME and GC-MS. 98 f. il.(2013). Master Dissertation – Institute of Chemistry, Federal University of Bahia, Salvador, 2013.
ABSTRACT
The drug abuse consumption is a growing practice in the modern world. Thus, synthetic drugs and more particularly amphetamine derivatives, occupy a prominent place. The consumption of stimulants-type amphetamines such as fenproporex (FEN), diethylpropion (DIE) and sibutramine (SIB) has become a common practice among professional drivers on Brazilian roads in recent years and among people who wish to lose weight, but make use of these substances indiscriminately. The present work is the development of an analytical method using dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) capable of detecting and quantifying these drugs at low concentrations in urine samples. Analyses were performed using gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). The method showed good analytical performance with excellent linearity in a dynamic range from 1 to 1000 ng/mL for DIE, FEN and SIB, with R2 values equal to 0.9926, 0.9994 and 0.9951, respectively. The limits of detection (LOD) were 0.1 ng/ml for DIE and FEN and 0.05 ng/mL to SIB. The intraday variation coefficient ranging from 6.63% to 7.95% while the interday ranged from 3.89% to 5.47%. The relative recovery founded was 82.88% for DIE, 88.58% for FEN and 95.60% for SIB. The method proved to be very useful in the analysis of these compounds in postmortem or in vivo urine samples.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 – Estrutura química da anfetamina...27
FIGURA 2 – Estrutura química da efedrina...27
FIGURA 3 – Tipos de anfetaminas consumidas por motoristas de caminhão no estado de São Paulo em 2009...29
FIGURA 4 – Posição dos grupos substituintes na estrutura da β-fenetilamina...29
FIGURA 5 – Estrutura química da dietilpropiona...31
FIGURA 6 – Esquema para a biotransformação da dietilpropiona...32
FIGURA 7 – Estrutura química do fenproporex...32
FIGURA 8 – Esquema da biotransformação do fenproporex...34
FIGURA 9 – Estrutura química da sibutramina...35
FIGURA 10 – Esquema da biotransformação da sibutramina...36
FIGURA 11 – Etapas envolvidas na microextração líquido-líquido dispersiva...45
FIGURA 12 – Espectro de massas do fenproporex empregando ionização por impacto de elétrons (EI-MS)...49
FIGURA 13 – Esquema do procedimento de preparação das soluções padrão dos analitos...54
FIGURA 14 - Procedimento da microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) em urina...57
FIGURA 15 – Cromatograma de íons selecionados (SIM) de uma amostra de urina contendo 100 ng/mL de DIE, FEN e SIB...65
FIGURA 16 – Espectros de massas por impacto de elétrons (EI-MS) no modo full scan para (a) DIE, (b) FEN e (c) SIB...66
FIGURA 17 – Cromatograma de íons selecionados (SIM) para adicionado de 1 ng/mL de DIE, FEN e SIB em urina...68
FIGURA 18 – Medidas relacionadas ao cálculo do fator de assimetria...69
FIGURA 19 – Área dos picos cromatográficos para DIE, FEN e SIB extraídos da urina em concentração inicial de 100 ng/mL, utilizando-se CHCl3, CH2Cl2 e CS2 como solventes extratores...71
FIGURA 20 – Área dos picos cromatográficos para DIE, FEN e SIB com concentrações de 100 ng/mL, utilizando-se metanol, acetonitrila e acetona como solventes dispersores...72
FIGURA 21 – Área dos picos cromatográficos em função do pH para DIE nas concentrações de 1, 10 e 20 ng/mL...73
FIGURA 22 – Área dos picos cromatográficos em função do pH para FEN nas concentrações de 1, 10 e 20 ng/mL...73
FIGURA 23 – Área dos picos cromatográficos em função do pH para SIB nas concentrações de 1, 10 e 20 ng/mL...73
FIGURA 24 – Avaliação do efeito salting out: áreas dos picos em função da adição de NaCl na amostra nas quantidades percentuais de 0,0% m/v, 0,5% m/v e 5,0% m/v....75
FIGURA 25 – Variação na área dos picos cromatográficos para os analitos no teste de estabilidade (1 ng/mL)...77
FIGURA 26 – Variação na área dos picos cromatográficos para os analitos no teste de estabilidade (100 ng/mL)...77
FIGURA 27 – Variação na área dos picos cromatográficos para os analitos no teste de estabilidade (1000 ng/mL)...78
FIGURA 28 – Curva de calibração e coeficiente de correlação para DIE na faixa de 1 a 1000 ng/mL...80
FIGURA 29 – Curva de calibração e coeficiente de correlação para FEN na faixa de 1 a 1000 ng/mL...81
FIGURA 30 – Curva de calibração e coeficiente de correlação para SIB na faixa de 1 a 1000 ng/mL...81
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Grupos substituintes na estrutura da β-fenetilamina para anfetamina (ANF),
fenproporex (FEN), dietilpropiona (DIE) e sibutramina (SIB)...30
TABELA 2 - Métodos analíticos utilizados na determinação de DIE em urina...41
TABELA 3 - Métodos analíticos utilizados na determinação de FEN em urina...42
TABELA 4 - Métodos analíticos utilizados na determinação de SIB em urina...43
TABELA 5 – Propriedades físicas da água e de diferentes solventes orgânicos empregados como extratores na otimização de microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME)...55
TABELA 6 - Íons selecionados para identificação e quantificação dos compostos estudados...67
TABELA 7 - Valores de fator de assimetria (As) a partir dos picos cromatográficos obtidos em extrato de urina com adicionado de 100 ng/mL para DIE, FEN e SIB...70
TABELA 8 - Valores de fator de alargamento (TF) a partir dos picos cromatográficos obtidos em extrato de urina com adicionado de 100 ng/mL para DIE, FEN e SIB...70
TABELA 9 - Valores de pKa para AMP, DIE, FEN e SIB...73
TABELA 10 - Valores de limites de detcção (LD) e limites de quantificação (LQ) para o método...79
TABELA 11 - Valores determinados (%) para precisão do injetor do GC-MS, nas concentrações de 1, 100 e 1000 ng/mL...83
TABELA 12 - Valores adquiridos (%) para precisão intra-dia, nas concentrações de 1, 100 e 1000 ng/mL...83
TABELA 13 - Valores determinados (%) para precisão inter-dia, nas concentrações de 1, 100 e 1000 ng/mL...84
TABELA 14 - Parâmetros de performance analítica otimizados para DLLME...84
TABELA 15 – Valores de concentração, erro relativo, recuperação e fator de enriquecimento (FE) para DIE, FEN e SIB em amostra de urina com adicionado de 1 ng/mL...86
TABELA 16 – Valores de concentração, erro relativo, recuperação e fator de enriquecimento (FE) para DIE, FEN e SIB em amostra de urina com adicionado de 10 ng/mL...87
TABELA 17 – Valores de concentração, erro relativo, recuperação e fator de enriquecimento (FE) para DIE, FEN e SIB em amostra de urina com adicionado de 1000 ng/mL...87
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANF Anfetamina
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
As Fator de assimetria
ATR-FTIR Reflectância total atenuada acoplada a espectroscopia no infravermelho
por transformada de Fourier
CV Coeficiente de variância
D Debye
DAD Detector de arranjo de diodos
DIE Dietilpropiona
DI-SPME Imersão direta – microextração em fase sólida
DLLME Microextração líquido-líquido dispersiva
DPRF Departamento de Polícia Rodoviária Federal
DPT Departamento de Polícia Técnica
EI Impacto de elétrons
EI-MS Espectrometria de massas por impacto de elétrons
EUA Estados Unidos da América
eV elétron-volt
FE Fator de Enriquecimento
FEN Fenproporex
GC Cromatografia à gás
GC-FID Cromatografia à gás acoplada ao detector de ionização em chama
GC-MS Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas
GGLAS Gerência Geral de Laboratórios de Saúde Pública
HPLC-DAD Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de diodos
HR-MS Espectrometria de massas de alta resolução
ICH Conferência Internacional para Harmonização
IMLNR Instituto Médico-Legal Nina Rodrigues
IUPAC União Internacional de Química Pura e Aplicada
LC Cromatografia líquida
LC-MS Cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas
LCPT Laboratório Central de Polícia Técnica
LLE Extração líquido-líquido
LD Limite de detecção
LQ Limite de quantificação
LPME Microextração em fase líquida
LPQ Laboratório de Pesquisa em Química
m/z Relação massa/carga
MDA 3,4-metilenodioxiamfetamina
MDEA Metildietanolamina
MDMA 3,4 –metilenodioximetamfetamina
MDPA 3,4-metilenodioxi-N-propilanfetamina
MEPS Microextração em adsorvente empacotado
MS Espectrometria de massas
MS/MS Espectrometria de massas em sequência
NIST Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia
NPD Detector de nitrogênio e fósforo
PA Para análise
PE Ponto de ebulição
pH Potencial hidrogeniônico
pKa Logaritmo negativo da constante de dissociação ácida
R2 Coeficiente de determinação
RDC Resolução da Diretoria Colegiada
RE Recuperação da extração
RPM Rotações por minuto
S/N Razão sinal-ruído
SIB Sibutramina
SIM Monitoramento de íon selecionado
SNC Sistema nervoso central
SPE Extração em fase sólida
SPME Microextração em fase sólida
TF Fator de alargamento
TR Tempo de retenção
UHPLC Cromatografia líquida de ultra eficiência
UNODC Escritório das Nações Unidas para Drogas e Crime
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO...19 2. OBJETIVOS...24 2.1. OBJETIVOS GERAIS...25 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...25 3. REVISÃO DA LITERATURA...26
3.1. ANFETAMINA E DERIVADOS ANFETAMÍNICOS...27
3.1.1. Dietilpropiona...30
3.1.2. Fenproporex...32
3.1.3. Sibutramina...34
4. ASPECTOS ANALITICOS...37
4.1. ASPECTOS GERAIS...38
4.2. URINA COMO MATRIZ BIOLÓGICA...39
4.3. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS ASSOCIADOS A TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO EMPREGADOS NA DETERMINAÇÃO DE DIE, FEN E SIB EM URINA...40
4.4. PREPARO DE AMOSTRAS...44
4.4.1. Microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME)...45
4.5. CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE MASSAS (GC-MS)...48
5. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL...51
5.1. MATERIAIS...52
5.2. EQUIPAMENTOS E ACESSÓRIOS...52
5.3. PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES PADRÃO DE CALIBRAÇÃO...52
5.3.1. Dietilpropiona...53
5.3.2. Fenproporex...53
5.4. PROCEDIMENTO DE OTIMIZAÇÃO DA EXTRAÇÃO POR DLLME...55
5.4.1. Seleção do solvente extrator...55
5.4.2. Seleção do solvente dispersor...55
5.4.3. Efeito do pH na amostra...56
5.4.4. Influência do efeito salting-out...56
5.4.5. Volume do solvente extrator...56
5.5. PROCEDIMENTO EMPREGADO NA EXTRAÇÃO...56
5.6. MÉTODO ANALÍTICO POR GC-MS...58
5.6.1. Condições de separação no cromatógrafo a gás...58
5.6.2. Condições do espectrômetro de massas...58
5.6.3. Condições do amostrador CTC-COMBIPAL...58
5.7. FIGURAS DE MÉRITO CONSIDERADAS NA VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO...59
5.7.1. Seletividade...59
5.7.2. Linearidade...60
5.7.3. Precisão...60
5.7.4. Limite de detecção (LOD)...61
5.7.5. Limite de quantificação (LOQ)...61
5.7.6. Fator de recuperação...62
5.7.7. Estabilidade...62
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO...64
6.1. DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALITICO...65
6.1.1. Separação cromatográfica e identificação por GC-MS...65
6.1.2. Otimização da microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME)...71
6.1.2.1. Seleção do solvente extrator...71
6.1.2.2. Seleção do solvente dispersor...71
6.1.2.3. Efeito do pH da amostra...72
6.1.2.4. Influência do efeito salting-out...75
6.2. VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALITICO...79
6.2.1. Limites de detecção e quantificação (LD e LQ)...79
6.2.2. Linearidade...80
6.2.3. Fator de recuperação...82
6.2.4. Precisão do instrumento e do método...83
7. APLICAÇÃO DO MÉTODO...85
7.1. APLICAÇÃO DO MÉTODO DESENVOLVIDO NA ANÁLISE DE AMOSTRAS DE URINA...86
8. CONCLUSÕES...88
9. REFERÊNCIAS ...90
CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO
As drogas são um fator onipresente na sociedade moderna, com reflexos em vários campos da atividade humana como, por exemplo, economia, saúde, segurança e criminalidade. Diversos campos científicos se dedicam à análise e controle de drogas e fármacos e, dentre esses, destaca-se a Química Analítica (Ojanperä, 2009). Embora representem um problema marcante no atual contexto social, as drogas de abuso são tão antigas quanto a humanidade e têm sido usadas para vários propósitos no curso da história recente (Clarke, 2004).
Uma definição generalista para o termo “droga de abuso” é a que considera qualquer substância que é usada para algum outro propósito diferente daquele para o qual foi planejada (Clarke, 2004). Dessa forma, o uso intencional de uma determinada substância pode ocorrer para fins terapêuticos, como os benzodiazepínicos, ou em um uso laboratorial ou industrial como no caso dos solventes orgânicos voláteis. Entretanto, esses compostos podem ser utilizados como entorpecentes (Clarke, 2004; Levine, 2010).
Muitas drogas atualmente consumidas de forma abusiva foram, no passado, não só comercializadas livremente, mas também promovidas como substâncias benéficas pela indústria farmacêutica. Um padrão de consumo desordenado de produtos farmacêuticos, tais como as anfetaminas usadas como moderadores do apetite, levou ao aumento das restrições legais e à consequente escalada do comércio ilícito dessas substâncias (Cody, 2000; UNODC, 2012).
De acordo com o relatório anual World Drug Report 2012, do Escritório das Nações Unidas para Drogas e Crime (UNODC), o consumo de estimulantes anfetamínicos (excluindo "ecstasy") teve uma prevalência estimada de 0,3% a 1,2% da população mundial em 2010, ou entre 14 milhões e 52,5 milhões de usuários, estimados globalmente. Esse grupo de drogas continua a ser o segundo mais utilizado no mundo, perdendo apenas para a Cannabis (UNODC, 2012).
Na classe química dos estimulantes, estão incluídos estimulantes psicomotores, aminas simpatomiméticas, anfetamina e os derivados anfetamínicos (Ouyang, 2010). No âmbito forense, os derivados anfetamínicos utilizados como estimulantes do sistema nervoso central, ocupam um lugar de destaque como, por exemplo, em casos de suicídio (Bell, 2001) ou como droga de abuso (Cody, 2000).
No Brasil, o consumo de derivados anfetamínicos tornou-se um problema de saúde pública nos últimos anos. O uso de substâncias como fenproporex (FEN) e dietilpropiona (DIE) por motoristas profissionais nas estradas brasileiras, se tornou uma prática comum (Nascimento, 2007).
Entre os caminhoneiros, a ingestão dessas substâncias ocorre com o intuito de manter a vigília em percursos de longa distância. As propriedades estimulantes dessas substâncias, no sistema nervoso central, são capazes de reduzir o cansaço e aumentar o estado de alerta e a atenção (Yonamine, 2012). No entanto, ao passar esses efeitos, os sintomas mais imediatos são sonolência profunda, agressividade e depressão, fatores que podem provocar a ocorrência de graves acidentes (Fakhouri, 2010).
Essa constatação está de acordo com dados do Departamento de Polícia Rodoviária Federal, DPRF (BRASIL, 2009), em que o Brasil figura como o líder mundial em acidentes de trânsito em rodovias. Por outro lado, na última década, apesar das medidas de prevenção tomadas em nível nacional, não houve redução no número de acidentes (Pechansky et al. 2010).
De acordo com Nascimento et al. (2007), em um estudo realizado com motoristas profissionais em uma rodovia do estado de Minas Gerais, ficou constatado que as anfetaminas eram adquiridas em postos de combustíveis, drogarias e nas próprias empresas de transportes. Em outro estudo realizado por Yonamine et al. (2012), em rodovias no estado de São Paulo, o FEN e a DIE foram relatados como os derivados anfetamínicos mais consumidos nas estradas. Dessa forma, é possível estabelecer uma relação entre a aquisição dessas substâncias e o consumo por esses profissionais em sua atividade laboral.
De acordo com o Art. 1º da Resolução RDC 52/2011 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), é vedada, entre outras ações, a fabricação, importação, distribuição, transporte, comércio e uso de medicamentos ou fórmulas medicamentosas que contenham as substâncias dietilpropiona, fenproporex e mazindol, seus sais e isômeros, bem como intermediários. A comercialização de sibutramina (SIB), apesar de restrita, ainda pode ser realizada sob rigoroso controle
do profissional de saúde que a prescrever para fins terapêuticos, como adjunto no tratamento da obesidade (ANVISA, 2011).
Apesar dessa proibição, apreensões desses medicamentos pela polícia ainda têm ocorrido. De acordo com dados do Laboratório Central de Polícia Técnica do Departamento de Polícia Técnica da Bahia (LCPT/DPT), desde 06 de dezembro de 2011, data em que a resolução entrou em vigor, houve apreensões no estado da Bahia, em regiões com grande fluxo de caminhões, como nas cidades de Vitória da Conquista e Feira de Santana.
Desde o início de 2012, novas apreensões de Desobesi®-M, contendo cloridrato de sibutramina em suas cápsulas, têm sido realizadas na Bahia. Análises preliminares empregando GC-MS e HPLC-DAD indicaram a presença desse princípio ativo, demonstrando a prática de falsificação, considerando que esse medicamento originalmente continha fenproporex. Em recente trabalho realizado por Mariotti et al. (2013), cápsulas de Desobesi®-M apreendidas pela Polícia Federal no estado do Rio Grande do Sul, foram analisadas por ATR-FTIR. Os resultados comprovaram a presença de sibutramina numa quantidade até 2 vezes superior àquela presente nas formulações farmacêuticas originais, numa clara tentativa de burlar a legislação e manter o comércio ilegal de estimulantes anfetamínicos.
Diante desses fatos, torna-se necessário avaliar o consumo dessa classe de droga de abuso, a partir da análise toxicológica de fluidos biológicos (p.e. saliva e urina), sendo esta uma abordagem promissora (Souza et al., 2011). Ao considerar os resultados obtidos com essa abordagem, é possível estabelecer a prevalência no uso de determinadas substâncias em rodovias brasileiras (Yonamine, 2012; Zancanaro, 2012) ou em outro contexto de interesse forense como, por exemplo, o consumo ilegal para fins terapêuticos.
O método analítico desenvolvido nesse trabalho, com o objetivo de determinar estimulantes anfetamínicos inalterados em urina, justifica-se por haver uma grande dificuldade de aquisição dos padrões de metabólitos das substâncias estudadas. Embora as concentrações desses compostos em urina representem menos de 5% da quantidade absorvida após a ingestão, ao empregar uma técnica de pré-concentração
(p.e. DLLME, SPME) e um método sensível de análise como GC-MS, é possível determinar medicamentos e drogas de abuso inalterados em urina (Strano-Rossi et
CAPITULO 2 – OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
Desenvolver e aplicar um método analítico capaz de detectar, identificar e quantificar, em níveis traço, fenproporex (FEN), dietilpropiona (DIE) e sibutramina (SIB) inalterados em urina, empregando microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) e cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS).
2.2 Objetivos específicos
Desenvolver e otimizar a técnica de microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) para extração e pré-concentração dos analitos em urina;
Desenvolver e otimizar método analítico para identificar e quantificar os analitos em estudo, utilizando cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS);
Validar a metodologia analítica considerando os parâmetros de validação já estabelecidos na literatura;
Aplicar a metodologia desenvolvida em amostras de urina provenientes do Laboratório de Toxicologia Forense do Departamento de Polícia Técnica da Bahia;
3.1 Anfetamina e derivados anfetamínicos
Anfetamina e alguns derivados estruturalmente semelhantes são utilizados como droga de abuso e causam sérios problemas sociais e de saúde pública em muitos países (Balíková, 2007). O termo “anfetamínicos” refere-se ao grupo de substâncias que contêm a anfetamina e/ou seus derivados, tais como metanfetamina, dietilpropiona, fenproporex, dentre outros (Oga et al, 2008).
O composto denominado “anfetamina” representa, a partir da sua estrutura
química (FIGURA 1), a classe das β-fenetilaminas, substâncias que apresentam
atividades simpatomiméticas. Drogas simpatomiméticas "imitam" a ação de neurotransmissores endógenos que funcionam como estimulantes do sistema nervoso simpático (Moore, 2010).
FIGURA 1. Estrutura química da anfetamina.
A anfetamina foi sintetizada pela primeira vez pelo químico romeno Lazăr Edeleanu em 1877, na Universidade de Berlin (atualmente, Universidade Humboldt de Berlin), sendo chamada inicialmente de fenilisopropilamina. Este foi o primeiro de uma série de compostos sintéticos relacionados à estrutura da efedrina (FIGURA 2), isolada da planta Ephedra sinica, no mesmo ano (Shulgin, 1992).
Na década de 1930, compostos da classe das anfetaminas foram utilizados clinicamente como estimulantes do sistema nervoso central (SNC) no tratamento da depressão, período em que se tornou evidente o seu potencial como droga de abuso. Dessa forma, desde aquela época, a capacidade das anfetaminas em aliviar a fadiga, melhorar o desempenho em atividades físicas e intelectuais, aumentar a confiança e produzir euforia, tem levado ao seu uso abusivo (Ouyang, 2010; Moore, 2010; Chasin, 2008).
O consumo de anfetaminas (incluindo metanfetamina, fenmetrazina e dietilpropiona), ganhou proporções epidêmicas entre os anos de 1940 e 1970. Naquele período, soldados, trabalhadores de indústrias e prisioneiros de guerra utilizaram essas substâncias, durante a Segunda Guerra Mundial e a Guerra do Vietnam (Moore, 2010; Oga, 2008). Dessa forma, buscavam-se os principais efeitos farmacológicos imediatos dos compostos anfetamínicos, tais como estimulação locomotora, euforia, excitação e supressão do apetite (Rang, 2008).
Em anos recentes, o uso clínico de derivados anfetamínicos como fenproporex e dietilpropiona, era justificado pelos efeitos anorexígenos percebidos durante o consumo regular (Medley, 2010). Drogas anorexígenas, que são estruturalmente relacionadas com a anfetamina, agem principalmente no centro da saciedade no hipotálamo, sendo capazes de inibir a fome, tornando-se uma importante ferramenta terapêutica no tratamento da obesidade (Oga, 2008; Rang, 2008; Craddock, 1976). Por outro lado, a busca por efeitos relacionados às propriedades estimulantes desses medicamentos, como o aumento do estado de alerta e atenção, levou ao consumo irregular dos chamados “rebites” por motoristas de caminhões nas estradas brasileiras (Nascimento, 2007; Yonamine, 2012; Zancanaro, 2012).
O estudo realizado por Yonamine et al. (2011), com motoristas profissionais nas estradas do estado de São Paulo, comprova o uso abusivo de substâncias ilícitas: de um total de 452 voluntários que cederam amostras de urina, 9,3% (n=42) apresentaram resultado positivo para alguma das substâncias analisadas (anfetaminas, canabinóides e cocaína). Entre os entrevistados, 7,5% (n=34) admitiram consumir regularmente medicamentos derivados de anfetamina, como mostrado na FIGURA 3.
FIGURA 3. Tipos de anfetaminas consumidas por motoristas de caminhão no estado de São Paulo em 2009 (adaptado de Yonamine et al., 2011).
Em geral, os efeitos semelhantes produzidos no SNC pela anfetamina e seus derivados, são devidos à similaridade estrutural existente entre essas substâncias. A
estrutura química das anfetaminas possui o esqueleto básico da β-fenetilamina
(FIGURA 4).
FIGURA 4. Posição dos grupos substituintes na estrutura da β-fenetilamina
Os diferentes substituintes nas posições meta e para do anel aromático e no carbono secundário da cadeia lateral (TABELA 1), determinam os efeitos periféricos
2% 50% 22% 35% 0 10 20 30 40 50 60
no sistema nervoso central, podendo acentuar alguns desses efeitos e abolir outros (Oga, 2008; Rang, 2008; Balíková, 2007; Cody, 2000).
TABELA 1. Grupos substituintes na estrutura da β-fenetilamina para anfetamina (ANF), fenproporex (FEN), dietilpropiona (DIE) e sibutramina (SIB).
Substância R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 ANF DIE FEN SIB H CH2CH3 CH2CH2CN CH3 H CH2CH3 H CH3 CH3 CH3 CH3 CH3CH2(CH2)CH3 H O H CH2CH2CH2 H H H H H H H Cl H H H H
Efeitos tóxicos, causados por substâncias classificadas como derivados anfetamínicos, ocorrem principalmente nos sistemas cardiovascular e neuropsíquico. Os sintomas da intoxicação aguda produzida pelos derivados anfetamínicos tais como hipertermia, edema cerebral e colapso cardiovascular são semelhantes àqueles causados pelo uso da cocaína. Podem provocar também, além dos efeitos estimulantes clássicos, sensações psicodélicas (Oga, 2008; Rang, 2010; Balíková, 2007).
3.1.1 Dietilpropiona (DIE)
A dietilpropiona, [2-(dietilamino)-1-fenil-1-propanona], foi sintetizada pela primeira vez em 1928, por Hyde e colaboradores (Korolkovas, 1982). Também conhecida como anfepramona, é um estimulante anfetamínico originalmente empregado como inibidor do apetite. Foi amplamente utilizado no Brasil e em outros países americanos e europeus, para controle de peso e tratamento médico da obesidade (Garcia-Mijares, 2009; Douglas, 1982). A sua produção e comercialização foi proibida pela ANVISA através da Resolução RDC Nº 52, de 06 de outubro de 2011 (ANVISA, 2011).
O sal cloridrato apresenta-se na forma de um pó branco finamente dividido, com aspecto cristalino, contendo aproximadamente 84,9% de base livre. Possui
fórmula química C13H19NO e massa molecular 205.29 Da. Considerando as suas
propriedades físico-químicas, possui ponto de fusão em torno de 181ºC e elevada solubilidade em água, metanol, acetonitrila e clorofórmio. (ChemSpider, 2012; Balíkóva, 2007).
A estrutura molecular da DIE apresenta uma amina terciária e um carbono quiral (FIGURA 5), sendo ambos isômeros farmacologicamente ativos (Beckett, 1973). No passado, até o ano de 2011, era comercializado na forma racêmica nos
medicamentos Dualid S® e Inibex S® (Mey, 1999; Medley, 2009; Aché, 2011).
FIGURA 5. Estrutura química da dietilpropiona (DIE).
Considerando a sua atividade farmacológica, a dietilpropiona é uma amina simpatomimética que produz efeitos adversos como o aumento da transpiração, palpitações, boca seca e estimulação do sistema nervoso central, refletido pelo aumento da irritabilidade, nervosismo ou insônia e psicose. Muitos desses sintomas têm sido relatados de forma semelhante à de outras drogas da classe das anfetaminas (Medley, 2009; Douglas, 1982).
De acordo com Beckett et al. (1987), o metabolismo da dietilpropiona produz cinco metabólitos que, ao todo, correspondem a 85% da droga excretada. Somente em torno de 3-4% da dose é eliminada na forma inalterada exclusivamente pela via renal (Rice et al., 2000). A via metabólica da dietilpropiona é mostrada na FIGURA 6.
FIGURA 6. Esquema para a biotransformação da dietilpropiona, proposto por Beckett et al. (1973)
3.1.2 Fenproporex (FEN)
O fenproporex, 3-[(1-fenil-2-propanil)-amino]-propanonitrila, é uma droga anorexígena que foi banida em muitos países do mundo, inclusive no Brasil (Cody, 1996; ANVISA, 2011). Inicialmente classificada como uma substância não estimulante, em um estudo realizado por Tognoni et al. (1972) ficou demonstrado que a sua ingestão leva à formação de quantidades consideráveis de anfetamina no organismo, pela clivagem enzimática da ligação entre o nitrogênio e o grupo cianoetil (FIGURA 7).
Originalmente, foi sintetizado e ensaiado em laboratórios franceses, em 1965 (Korolkovas,1988). Apresenta-se normalmente como o sal cloridrato, na forma de um pó branco de aspecto cristalino, possuindo fórmula química C12H16N2 e massa molecular 188.26 Da. É solúvel em água, acetonitrila, metanol e etanol e apresenta ponto de fusão em torno de 155ºC (ChemSpider, 2011; Budavari, 2001).
O FEN foi empregado com um propósito terapêutico, como inibidor do apetite, por apresentar propriedades anorexígenas no tratamento de pacientes obesos com concomitante comprometimento cardiovascular (Aché, 2009; Bell, 2001; Oga, 2008). Entretanto, por causa dos efeitos estimulantes quando do seu uso, possui um grande potencial de abuso (Cody, 1999). No Brasil, o consumo dessa substância em particular por motoristas de caminhão, foi observado em alguns estados da federação (Nascimento, 2007; Yonamine, 2004).
Apesar de o uso irregular de medicamentos derivados de anfetaminas ser conhecido há alguns anos, a proibição de produzir e consumir o FEN no Brasil, surgiu somente com a publicação da Resolução RDC Nº 52 de 6 de outubro de 2011 pela ANVISA, sendo o mesmo regulamento que proibiu a comercialização da DIE (ANVISA, 2011).
A ingestão de FEN origina 14 diferentes metabólitos, como mostrado na FIGURA 8 (Kraemer, 1998; Maurer, 2000). Entretanto, o composto original pode ser determinado na sua forma livre em urina, apesar de 25% a 30% da dose sofrer biotransformação através do chamado efeito de primeira passagem, promovido por enzimas presentes no fígado, por degradação enzimática na flora intestinal ou uma combinação das duas causas (Bell, 2001).
De acordo com Cody (1993), entre 5,4% e 8,7% da droga é excretada na forma inalterada na urina em pH ácido. Entretanto, sem controle do pH da urina, menos de 3% da dose é excretada na forma intacta.
FIGURA 8. Esquema da biotransformação do fenproporex proposto por Kraemer et al. (2000).
3.1.3 Sibutramina (SIB)
A sibutramina (SIB) foi desenvolvida e comercializada inicialmente, como um potencial antidepressivo, na década de 1980 pelo laboratório Knoll Pharmaceuticals (atualmente, Abbott Laboratories), na Alemanha (Luque et al., 2002). De acordo com as normas da IUPAC, o seu nome sistemático é 1-[1-(4-clorofenil)-ciclobutil]-N,N,3-trimetil-1-butanamina. Possui fórmula molecular C17H26ClN e massa molecular 279.84 Da.
Quando na forma de cloridrato, apresenta-se como um pó branco cristalino, com ponto de fusão 191,5 ºC e solubilidade moderada em água e solventes orgânicos polares como metanol e acetonitrila (ChemSpider, 2012). Sua estrutura molecular apresenta um carbono quiral, na mesma posição que a anfetamina, o que confere atividade farmacológica para ambos isômeros (FIGURA 9).
FIGURA 9. Estrutura química da sibutramina (SIB)
Assim como outros fármacos anorexígenos, a SIB é empregada para fins terapêuticos, no tratamento da obesidade, ou quando a perda de peso é clinicamente indicada (Heal et al., 1998). No Brasil, pode ser encontrada nas dosagens 10 mg (equivalente a 8,37 mg de sibutramina) e 15 mg (equivalente a 12,55 mg de sibutramina), sendo vendida mediante prescrição médica e retenção de receita. Seu medicamento de referência é o cloridrato de sibutramina, sendo comercializado sob a marca Reductil® (Abbott, 2012).
A comercialização da SIB no Brasil foi recentemente regulamentada, pela resolução RDC Nº 52 da ANVISA, mesmo instrumento jurídico utilizado para proibir a venda de FEN e DIE (ANVISA, 2011). Nesse sentido, no Art. 2º, parágrafo único, existe a determinação de que a prescrição e a venda de medicamentos ou fórmulas que contenham a SIB deverão ser realizadas por meio da Notificação de Receita "B2", mediante receituário azul, numerado e identificado com os dados do médico. De acordo com o Art. 4º, as prescrições deverão ser também acompanhadas de um termo de responsabilidade entre o médico e o paciente em três vias, sendo uma para ser arquivada no prontuário do paciente, outra na farmácia que dispensar o medicamento e outra com o paciente (ANVISA, 2011).
As restrições quanto à prescrição e uso do medicamento devem-se aos seus importantes efeitos adversos. Além de apresentar potencial de abuso (Arfken et al., 2003), os principais distúrbios provocados pelo uso de SIB, são aqueles relacionados com problemas cardiovasculares, tais como aumento da frequência cardíaca e da pressão arterial (Luque, 2002; Abbott, 2011).
O mecanismo de ação da SIB envolve a inibição da recaptação da serotonina (5-hidroxitriptamina) e norepinefrina. Porém, esse efeito é provocado por um ou mais de seus metabólitos, sendo esses, assim, os princípios ativos, indicando que o composto inalterado atua apenas como um pró-fármaco (Botrè et al., 2007).
Após a ingestão de SIB, ocorre a eliminação urinária de seis metabólitos principais, além da SIB na forma livre, porém em níveis traço (Strano-Rossi et al., 2007). A biotransformação da SIB ocorre de acordo com a FIGURA 10.
CAPÍTULO 4 – ASPECTOS ANALÍTICOS
4.1 Aspectos gerais
Em toxicologia forense, para que compostos de interesse possam ser quantificados em diferentes matrizes biológicas é necessário, inicialmente, identificá-los através de uma triagem, utilizando-se testes de imunoensaio, que identificam classes de compostos de interesse toxicológico (Flanagan et al. 2007). Atualmente, técnicas cromatográficas hifenadas, tais como cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) ou cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS), são consideradas "padrão-ouro" em análise toxicológica, pois oferecem altas sensibilidade, especificidade e capacidade de identificação nesse tipo de análise (Maurer, 2012; Kraemer, 1998; Cody, 2000; Chasin, 2008).
Essas técnicas são de particular importância para a análise de diferentes substâncias de interesse toxicológico em matrizes biológicas complexas, tais como sangue, urina, conteúdo estomacal, tecidos ou matrizes alternativas como cabelo, saliva, mecônio ou unhas (Maurer, 2012; Alves, 2010). A necessidade de separação dos diferentes compostos presentes nessas matrizes, para que possam ser posteriormente identificados e quantificados, torna essencial o uso de técnicas cromatográficas. Por outro lado, a espectrometria de massas (MS) oferece capacidade de identificação inequívoca, quando aliada a outros critérios de confirmação como, por exemplo, tempo de retenção cromatográfico obtido com um padrão de referência (Chasin, 2008).
A cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS), oferece importantes vantagens quando utilizada em análises toxicológicas no âmbito forense. Dentre essas, destaca-se a capacidade de identificação e quantificação de drogas de abuso, medicamentos, venenos e seus metabólitos polares, sem necessidade de derivatização e à temperatura ambiente, preservando substâncias termolábeis (Peters, 2011; Flanagan, 2007). Entretanto, pouquíssimos laboratórios de toxicologia forense no Brasil dispõem dessa técnica, pelo fato de demandar um alto custo de aquisição, operação e pessoal especializado (Guttman, 2004; Thurman et al., 2009).
Nesse sentido, o relatório intitulado “Levantamento de laboratórios analíticos de toxicologia forense”, produzido pela Gerência Geral de Laboratórios de Saúde Pública (GGLAS) da ANVISA, demonstra que a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS), atualmente, é a técnica analítica mais amplamente empregada nesses laboratórios (Guttmann et al., 2004).
4.2 Urina como matriz biológica
Muitas amostras biológicas como fluidos corporais (p.e. sangue, urina, humor vítreo), tecidos, cabelo e outras partes do corpo humano, podem ser coletadas durante a autopsia ou exame ‘in vivo’. Quando uma ou mais amostras dessas matrizes são corretamente processadas em laboratório, é possível adquirir dados analíticos que podem auxiliar na resolução de crimes (Levine, 2009).
Nesse sentido, a urina é bastante útil na determinação de substâncias de interesse toxicológico. Importantes vantagens na sua utilização envolvem a disponibilidade frequente e em grande volume (em torno de 1000 mL a 2000 mL por dia) e a presença de venenos, drogas de abuso, fármacos inalterados e metabólitos em concentrações relativamente altas (Flanagan, 2007; Miller, 1999).
A urina humana é composta por, aproximadamente, 98% de água, possuindo poucos interferentes endógenos na sua constituição (Raikos et al., 2003). Esse aspecto a torna uma matriz relativamente limpa, somente apresentando níveis significativos de proteínas e lipídeos (que podem interferir no processo de extração), durante estados patológicos (Costa, 2004).
Apesar de as concentrações de fármacos/drogas obtidas em urina, estabelecerem somente um vínculo relativo com os efeitos farmacológicos, é possível obter importantes informações toxicológicas quando essa matriz é analisada.
A exemplo dessa afirmação, de acordo com Bell et al. (2001), em um caso de suicídio com o uso de anfetaminas, foi encontrado um teor de 1,2 µg/mL de FEN na urina, indicando uma ingestão em grande quantidade dessa substância pela vítima.
4.3 Métodos cromatográficos associados a técnicas de extração empregados na determinação de DIE, FEN e SIB em urina
Nas TABELAS 2, 3 e 4 a seguir são relacionados alguns trabalhos envolvendo a determinação, respectivamente, de DIE, FEN e SIB em urina, usando diferentes técnicas de extração e análise.
De acordo com Ouyang et al. (2005), DIE e SIB podem ser analisadas empregando-se extração líquido-líquido (LLE) e posterior injeção em GC-MS, sem derivatização. Os íons qualificadores utilizados na identificação de DIE foram m/z 72, 77 e 100.
Com o objetivo de quantificar o analito, foi escolhido o íon m/z 100 considerando o critério da singularidade, de modo que íons com maior razão massa/carga permitem uma maior discriminação (Sparkman, 2007). Por sua vez, a SIB apresentou os íons qualificadores m/z 58, 72 e 114, sendo este último utilizado para quantificação.
T A B E L A 2 . M é to d o s a n a lí ti c o s u ti liz a d o s n a d e te rm in a ç ã o d e D IE e m u ri n a . E x tr a ç ã o S e p a ra ç ã o F a s e e s ta c io n á ri a F a s e m ó v e l D e te c ç ã o R e fe rê n c ia S P M E G C D B -5 (5 % f e n ilm e ti lsi lico n e ) H é lio M S S tr a n o -R o s si e t a l. , 2 0 0 5 S P E L C C -1 8 o ct a d e ci l 5 m M a ce ta to d e a m ô n io e m 0 ,1 % á ci d o f ó rm ico / a ce to n it ri la T O F -M S K o lm o n e n e t a l. , 2 0 0 7 L L E G C D B -5 (5 % f e n ilm e ti lsi lico n e ) H é lio M S B o tr è , e t a l. , 2 0 0 8 S P E L C C -1 8 o ct a d e ci l 1 0 m M f o rm ia to d e a m ô n io /á ci d o f ó rm ico (0 ,5 % ) / a ce to n it ri la (9 0 :1 0 , v /v ) M S /M S O u y a n g e t a l. , 2 0 1 0 L L E G C H P -5 (5 % f e n ilm e ti lsi lico n e ) H é lio M S O u y a n g e t a l. , 2 0 1 0 - U H P L C C -8 o ct il 1 m M a ce ta to d e a m ô m io /0 ,0 0 1 % á ci d o a cé ti co / m e ta n o l H R -M S G ir ó n e t a l. , 2 0 1 2
T A B E L A 3 . M é to d o s a n a lí ti c o s u ti liz a d o s n a d e te rm in a ç ã o d e F E N e m u ri n a E x tr a ç ã o S e p a ra ç ã o F a s e e s ta c io n á ri a F a s e m ó v e l D e te c ç ã o R e fe rê n c ia L L E G C H P -1 1 % f e n il-d im e ti lp o lisi lo x a n o H é lio M S C o d y e t a l. 1 9 9 6 , 1 9 9 9 . L L E G C H P -5 5 % f e n il-m e ti lsi lico n e H é lio M S M a u re r e t a l. , 2 0 0 0 L L E G C D B -1 7 5 0 % f e n il-m e ti lp o lisi lo x a n e H é lio ; H2 ; M S N P D B e ll e t a l. , 2 0 0 1 S P M E G C D B -5 5 % f e n il-m e ti lsi lico n e H é lio M S S tr a n o -R o s si e t a l. , 2 0 0 5 S P E L C C -1 8 o ct a d e ci l 5 m M a ce ta to d e a m ô n io e m 0 ,1 % á ci d o f ó rm ico / a ce to n it ri la T O F -M S K o lm o n e n e t a l. , 2 0 0 7 L L E G C D B -5 5 % f e n il-m e ti lsi lico n e H é lio M S B o tr é e t a l. , 2 0 0 8 - U H P L C C 8 O ct il 1 m M a ce ta to d e a m ô m io /0 ,0 0 1 % á ci d o a cé ti co / m e ta n o l H R M S G ir ó n e t a l. , 2 0 1 2
T A B E L A 4 . M é to d o s a n a lí ti c o s u ti liz a d o s n a d e te rm in a ç ã o d e S IB e m u ri n a . E x tr a ç ã o S e p a ra ç ã o F a s e e s ta c io n á ri a F a s e m ó v e l D e te c ç ã o R e fe rê n c ia L L E G C D B -5 ( 5 % f e n ilm e ti lsi lico n e ) H é lio M S B o tr è , e t a l. , 2 0 0 8 S P E L C C -1 8 o ct a d e ci l 1 0 m M f o rm ia to d e a m ô n io /á ci d o fó rm ico ( 0 ,5 % ) / a ce to n it ri la (9 0 :1 0 , v /v ) M S /M S O u y a n g e t a l. , 2 0 1 0 L L E G C H P -5 (5 % f e n ilm e ti lsi lico n e ) H é lio M S O u y a n g e t a l. , 2 0 1 0 S P E L C C 1 8 o ct a d e ci l á ci d o f ó rm ico 0 ,2 % (e m á g u a ) / á ci d o f ó rm ico 0 ,2 % (e m m e ta n o l) g ra d ie n te 0 -9 5 % M S /M S H su e t a l. , 2 0 1 1
Na determinação de FEN inalterado em urina, foram empregados diferentes métodos analíticos, de acordo com a descrição na TABELA 3. A identificação foi realizada, monitorando-se os íons qualificadores m/z 56, 91 e 97. O íon m/z 97 foi selecionado como íon quantificador. Strano-Rossi et al. (2005), determinou FEN utilizando microextração em fase sólida por imersão direta (DI-SPME) e sem derivatização, com posterior injeção em GC-MS.
4.4 Preparo de amostras
A complexidade do procedimento aplicado na preparação de amostras dependerá de importantes fatores, tais como a natureza da amostra, a natureza da droga a ser analisada, o método cromatográfico a ser utilizado e o seu respectivo sistema de detecção. De uma forma geral, todos esses fatores são interdependentes (Flanagan, 2007).
Atualmente, muitos sistemas de extração miniaturizados têm sido empregados em toxicologia analítica. Dentre esses, a microextração em fase sólida (SPME), a microextração em sorvente empacotado (MEPS) e a microextração em fase líquida (LPME) têm sido alternativas importantes (Kokosa, 2012; Abdel-Rehim, 2010; Pragst, 2007). No entanto, essas técnicas apresentam limitações em termos de custo de operação (p.e. SPME e MEPS) ou baixa seletividade para analitos muito polares (p.e. LPME).
As tendências mais recentes apontam no sentido da utilização de técnicas que utilizam uma menor quantidade de amostra e quantidade mínima de solventes orgânicos, até mesmo para análise de traços. Os principais objetivos são obter maior sensibilidade e especificidade na extração (Bonato et al., 2008), aliado à mínima geração de resíduos, indo ao encontro de um dos princípios da Química Verde.
Nesse contexto, a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME), tem se destacado como uma técnica simples e de baixo custo, apresentando excelentes resultados em diferentes aplicações analíticas, inclusive em análises forenses (Mudian, 2012; Yamini, 2010; Jofré, 2010).
4.4.1 Microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME)
A microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) foi introduzida por Rezaee
et al. em 2006, como uma técnica de microextração baseada em um sistema ternário
de solventes. É um método simples e rápido, onde são utilizados alguns microlitros de um solvente extrator apropriado, ou seja, um solvente orgânico, pouco miscível em água e que deve possuir densidade maior que a da água, como diclorometano, clorofórmio ou dissulfeto de carbono e um solvente dispersor como metanol, acetona ou acetonitrila, que deve ser solúvel na amostra e no solvente extrator (Yamini, 2010; Mashayekhi, 2012).
A técnica consiste na injeção de uma mistura dos solventes, extrator e dispersor, em uma amostra aquosa com os analitos de interesse, acondicionada em um tubo tipo Falcon (Zanella, 2011). Após a rápida injeção da mistura, uma grande turbulência é produzida resultando na dispersão do solvente extrator em uma nuvem de gotículas finamente divididas. A solução turva formada guarda uma grande área superficial na interface entre o solvente extrator presente nas gotículas e o meio aquoso da amostra (FIGURA 11).
FIGURA 11. Etapas envolvidas na microextração líquido-líquido dispersiva (adaptado de Zanella, 2011).
O estado de equilíbrio entre as duas fases é alcançado rapidamente. Logo, o tempo de extração é muito curto, sendo esta uma das principais vantagens da técnica (Rudaz, 2013; Yamini, 2010). A segunda etapa do procedimento de extração é a centrifugação da solução contendo a dispersão, o que levará à formação de uma gota sedimentada no fundo cônico do tubo. Uma seringa de pequeno volume é utilizada para transferir a gota sedimentada (20 a 150 uL) para um pequeno frasco contendo um microtubo onde é colocada a amostra, que será levado ao GC-MS para análise.
As recentes aplicações da DLLME demonstram importantes vantagens do seu uso em relação às técnicas convencionais de extração (Yamini, 2010; Rudaz, 2013), tais como redução da quantidade usada de solventes orgânicos, simplicidade e baixo custo do procedimento e o considerável fator de enriquecimento do analito.
Por fator de enriquecimento, compreende-se o aumento expressivo da concentração dos analitos no extrato final, em relação às concentrações destes na amostra, de modo que quantidades traço dos analitos de interesse podem ser determinadas mesmo com um pequeno volume de amostra. Nesse sentido, torna-se viável o emprego de diferentes métodos de análise, até mesmo aqueles com menor sensibilidade que a técnica de GC-MS, graças à capacidade de pré-concentrar que a DLLME apresenta (Rezaee, 2006).
As principais variáveis que influenciam de maneira crítica a eficiência do procedimento de extração em DLLME são a natureza do solvente extrator e do solvente dispersor, o pH da amostra e o volume dos solventes extrator e dispersor utilizados (Mashayekhi, 2012; Rudaz, 2013; Jofré, 2010; Yamini, 2010; Rezaee, 2006).
Por causa das propriedades dos solventes extratores, a cromatografia gasosa (GC) foi a primeira técnica analítica empregada para analisar os extratos obtidos com DLLME, na determinação de pesticidas e contaminantes não-polares em amostras de água (Yamini, 2010; Rezaee, 2006). Dessa forma, um fator importante que influencia a recuperação da extração é a escolha de um solvente orgânico apropriado. No estudo realizado por Mashayekhi et al. (2012), diferentes solventes orgânicos apresentaram valores de recuperação muito distintos na determinação de anfetaminas em urina.
Ainda considerando a eficiência da extração, o solvente dispersor exerce um papel importante na formação das pequenas gotículas do solvente extrator na solução contendo a amostra. Torna-se necessário que este apresente miscibilidade intermediária entre o meio aquoso polar, considerando a diluição da amostra de urina em água, e o caráter apolar ou fracamente polar do solvente extrator. Dessa forma, a interface formada serve como meio de transferência de massa da fase aquosa para a fase orgânica, sendo que a grande superfície de contato entre as gotículas de solvente extrator e a fase aquosa contribui para a ocorrência desse fenômeno.
Para que a transferência de massa entre as duas fases ocorra de maneira efetiva, é necessário que os analitos estejam na forma não ionizada. O principal fator que favorece essa condição é o pH da amostra. Os experimentos realizados por Jofré
et al. (2010), demonstraram que diferentes valores de pH influenciam o fator de
enriquecimento dos analitos na fase orgânica. Logo, o pH da amostra de urina é particularmente importante para a extração de compostos ionizáveis, como as substâncias de interesse toxicológico (p.e. anfetaminas) que possuem caráter predominantemente básico, com valores de pKa entre 6 e 10.5 (Rudaz, 2013).
Além desses importantes parâmetros, os volumes dos solventes extrator e dispersor são críticos para a formação da gota no fundo do tubo de extração. Uma pequena quantidade do solvente extrator dificulta a formação da gota, em um volume tal que possa ser transferida para um microtubo, além de, possivelmente, não fornecer gotículas capazes de extrair quantitativamente os analitos que serão levados posteriormente ao GC-MS. Por outro lado, o volume do solvente dispersor afeta diretamente a formação do sistema trifásico (água/solvente dispersor/solvente extrator), e o grau de dispersão do solvente extrator na fase aquosa e, consequentemente, o fator de enriquecimento, que também é diminuído ao ser utilizado grande volume do solvente extrator (Rezaee, 2010).
Em DLLME, o fator de enriquecimento (FE), é definido como a razão da
concentração do analito na fase sedimentada (Csed) e a concentração inicial do analito
FE =
(1)O valor de Csed é obtido a partir de uma curva de calibração adequada. A recuperação da extração (RE) é definida como a porcentagem da quantidade total do analito (ŋo), extraído da fase orgânica sedimentada (ŋsed), de acordo com as EQUAÇÕES 2 e 3:
RE =
ŋŋx 100 =
x 100
(2)
RE =
FE x 100
(3)
onde Vsed e Vaq são os volumes de fase sedimentada e da solução da amostra, respectivamente (Mashayekhi, 2012; Rezaee, 2010).
4.5 Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS)
A cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) é uma combinação de duas técnicas microanalíticas: cromatografia a gás (GC), uma técnica de separação e, espectrometria de massas (MS), uma técnica de identificação e quantificação (Kitson et al., 1996; Sparkman, 2007).
Essa combinação apresenta importantes vantagens (Abian, 1999). A mais relevante é a capacidade de fornecer a identidade das substâncias analisadas. O espectro de massas é muito mais específico que aqueles fornecidos por detectores de absorção molecular, tais como DAD (detector de arranjo de diodos) ou IV (infravermelho), principalmente ao serem utilizadas diferentes técnicas de ionização (Sparkman, 2007; Pavia, 2010).
Quando empregada em análises forenses, a ionização por impacto de elétrons (EI) é de grande utilidade, pois o espectro obtido por essa técnica (FIGURA 12) pode ser comparado com bancos de dados específicos, que contêm milhares de espectros de massas de substâncias de interesse toxicológico. (Maurer et al., 2011; NIST, 2011; Sparkman, 2007; Levine, et al., 2010; Pavia, 2010).
A aquisição de dados em espectrometria de massas por impacto de elétrons (EI-MS), começa com a fragmentação das moléculas que eluem da coluna cromatográfica capilar e se chocam com um feixe de elétrons com energia média de 70 eV. Os fragmentos ionizados formados com diferentes razões massa/carga (m/z) são separados ao passar por um analisador de massas (p.e. quadrupolo de transmissão), que gera um campo eletromagnético por onde são conduzidos os íons ressonantes até o detector.
FIGURA 12. Espectro de massas por impacto de elétrons (EI-MS) do fenproporex (FEN)
Outro importante aspecto da técnica é a eficiente separação proporcionada pela cromatografia em fase gasosa (GC) com colunas capilares. Mesmo analisando amostras de natureza complexa, como matrizes biológicas, é possível conseguir uma separação com excelente resolução, pois esse tipo de coluna fornece bandas muito estreitas, proporcionando picos cromatográficos finos e simétricos, que são utilizados para distinguir diferentes substâncias com tempos de retenção muito próximos (Collins, 2007; Skoog, 2009). (replib) Fenproporex 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 0 50 100 51 56 68 77 91 97 115 132 144 173 187 NH N
Frequentemente, para que as substâncias de interesse toxicológico possam ser determinadas por essa técnica, torna-se necessária a transformação do analito em um produto derivatizado (Maurer, 2011). Reações de derivatização são empregadas, principalmente, quando se deseja obter um composto de maior volatilidade ou um aumento de resposta a um dado tipo de detector, favorecendo a sua análise por cromatografia gasosa. Outro aspecto importante é aquele relacionado à degradação do analito frente as altas temperaturas do sistema de injeção (Collins et al., 2007; Lanças, 1993; McNair, 2009).
No entanto, o emprego de uma reação de derivatização requer minucioso estudo da cinética de formação do produto e da determinação do rendimento dessa reação, para que seja possível o desenvolvimento de um método quantitativo. Diante das dificuldades impostas por essa estratégia analítica e considerando os procedimentos anteriormente empregados por Strano-Rossi et al.(2010) e Ouyang (2010) na análise de FEN, DIE e SIB inalterados em urina, considera-se mais fácil a determinação desses analitos sem a utilização de reações de derivatização.
CAPÍTULO 5 – PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
5.1 Materiais
As substâncias químicas de referência (SQR) utilizadas como padrões secundários foram obtidas a partir de produtos comerciais. A dietilpropiona (cloridrato
de anfepramona) foi obtida do medicamento Inibex® S (Medley), em cápsulas de 50
mg. A sibutramina (cloridrato de sibutramina) foi obtida do medicamento Plenty® (Medley), em cápsulas de 15 mg. O fenproporex (cloridrato de fenproporex) foi obtido
do medicamento Desobesi-M® (Aché), em cápsulas de 25 mg. Os solventes orgânicos
utilizados foram metanol, diclorometano, acetonitrila, clorofórmio e dissulfeto de carbono grau P.A. da Merck (Darmstadt, Alemanha). O hidróxido de sódio P.A. foi adquirido da Synth (Brasil).
5.2 Equipamentos e acessórios
No procedimento de análise das amostras de urina foi utilizado cromatógrafo a gás Agilent (EUA) modelo 7890A acoplado a espectrômetro de massas (quadrupolo simples) Agilent (EUA) modelo 5975C, com amostrador automático CombiPAL da CTC Analytics (Suiça). A coluna instalada no cromatógrafo durante a realização das análises foi uma coluna capilar de sílica fundida do tipo WCOT (Wall Coated Open Tubular), fase estacionária HP-5ms (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), marca Agilent J&W Scientific (EUA). O gás de arraste utilizado foi hélio 6.0 (99,9999%) da White Martins (Brasil). No procedimento de extração foi utilizada centrífuga universal para tubos falcon da Cientec (Brasil). A água ultrapura foi obtida do purificador Milli-Q modelo RiOS da Merck Millipore (Alemanha). Na preparação das soluções padrão utilizou-se balança analítica modelo AUW-220 da marca Shimadzu (Japão). As membranas de nylon 0,45 µm Millex®, utilizadas para filtração, foram da marca Merck Millipore (Alemanha).
5.3 Preparação das soluções padrão de calibração
A preparação das soluções padrão para a calibração foi feita a partir de diluições do conteúdo das cápsulas contendo dietilpropiona, fenproporex e sibutramina em acetonitrila. As diluições dos padrões procederam-se como a seguir:
5.3.1 Dietilpropiona (DIE)
Para preparar a solução padrão de DIE, o conteúdo de uma cápsula foi pesado em balança analítica, obtendo-se a massa de 0,4842 g. Considerando o teor de 75 mg do princípio ativo em cada cápsula, pesou-se 0,3228 g para a obtenção de uma solução estoque de concentração 500 µg/mL. Dessa forma, o conteúdo pesado equivalente a 50 mg de DIE foi solubilizado em acetonitrila, levado ao ultrassom por 20 minutos, filtrado em membrana de nylon 0,45 µm e adicionado em balão volumétrico aferido em 100 mL.
5.3.2 Fenproporex (FEN)
A solução padrão de FEN foi preparada, inicialmente, pesando-se o conteúdo de uma cápsula em balança analítica, obtendo-se a massa de 0,4137g. Considerando o teor de 25 mg do princípio ativo em cada cápsula, tomou-se 0,8275g do pó para a obtenção de solução estoque de concentração 500 µg/mL. A massa equivalente a 50 mg do princípio ativo foi solubilizada em acetonitrila e levado ao ultrassom por 20 minutos. A solução foi filtrada em membrana de nylon 0,45µm e transferida para um balão volumétrico de 100 mL, sendo posteriormente aferido.
5.3.3 Sibutramina (SIB)
A solução estoque de SIB foi preparada a partir de 0,8166 g do pó contido na cápsula do medicamento. O conteúdo de cada cápsula, pesando 0,2450 g, continha 15mg do princípio ativo. Dessa forma, tomou-se o equivalente a 50mg de SIB, que foi solubilizado em acetonitrila, levado ao ultrassom por 20 min, filtrado em membrana de nylon 0,45 µm e transferido para balão volumétrico aferido em 100 mL.
Todas as soluções estoque preparadas foram armazenadas em balões volumétricos previamente condicionados com acetonitrila e posteriormente vedados com tampa de vidro e fita teflon. Os balões foram mantidos em geladeira à temperatura média de 5ºC. O fluxograma a seguir (FIGURA 13) demonstra o esquema utilizado na preparação das soluções:
FIGURA 13. Esquema do procedimento de preparação das soluções padrão dos analitos.
O ideal para qualquer análise é ter a garantia de um padrão primário, ou seja, um padrão analítico certificado. Entretanto, ao utilizar como padrão um produto comercial de procedência conhecida, como por exemplo, formulações farmacêuticas adquiridas dentro do prazo de validade, é possível considerá-lo como um padrão secundário de boa qualidade (Leite, 2008).
Dessa forma, é preciso levar em consideração o grau de pureza oferecido por esse material e a forma correta de armazenamento, de modo a manter a confiabilidade dos resultados adquiridos no método analítico desenvolvido.
Conteúdo pesado da cápsula
Béquer com acetonitrila
Filtração em membrana 0.45µm
ultrassom por 20 minutos
Balão volumétrico 100 mL
Solução estoque
