M é to d o s U tiliza d o s no
B io c o n tro /e d e F ito p a tó g e n o s
Métodos usados no ...
2007 L V - 2 0 0 8 .0 0 0 1 8
Em p resa Brasileira de P e sq uisa A g ro p e c u á ria E m b rap a Uva e Vinho
M in is té rio da A g ricu ltu ra , P ecu ária e A b a s te c im e n to
M é to d o s usados no
B iocontrole de F ito p ató g en o s
E d ito re s:
Rosa M a ria V a ld e b e n ito S a n h u e z a Ita m a r S o a re s de M e lo
Bento Gonçalves, RS 2007
Exemplares desta publicação podem ser adquiridos na: E m b ra p a U v a s V in h o Rua Livramento, 515 Caixa Postal 130 Fone: (0xx)54 3455 8 0 0 0 Fax: (0xx)54 3451 2792 h ttp ://w w w .cn p u v.e m b ra p a.b r [email protected] C o m itê d e P u b lic a ç õ e s
Presidente: Lucas da Ressurreição Garrido Secretária-Executiva: Sandra de Souza Sebben
Membros: Luiz A n te n o r Rizzon, Kátia M id o ri Hiwatashi, Osmar Nickel.
Viviane M aria Zanella Bello Fialho
Normalização bibliográfica: Kátia M id o ri Hiwatashi Elaboração da capa: Luciana Elena M endonça Prado
1a e d iç ã o
1* impressão (2007): 5 0 0 exemplares
T o do s os d ire ito s re s e r v a d o s .
A reprodução não-autorizada desta publicação, no todo ou em parte, constitui violação dos direitos autorais (Lei ns 9.610).
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Embrapa Uva e Vinho
M étodos usados no biocontrole de fitopatógenos/E ditado por Rosa Maria Valdebenito Sanhueza e Itamar Soares de Melo. - Bento Gonçalves: Embrapa Uva e Vinho. 2007.
141 p.
ISBN 978-85-89921-05-3
1. Doença de planta. 2. Antagonismo. 3. M icrorganismo. I. Valdebenito Sanhueza, Rosa Maria, ed. II. Melo, Itamar Soares de. ed.
CDD 579 ( 21. Ed.) © Embrapia, 2007
A p r e s e n ta ç ã o
Em consonância com a missão institucional da Embrapa Uva e Vinho, desde longa data vêm sendo desenvolvidas ações de pesquisa e desenvolvim ento que têm gerado im portantes resultados no tocante ao com ponente am biental. E isto ocorre porque é com provada a necessidade de buscar-se o desenvolvim ento sustentado do espaço rural, tendo-se em vista as exigências de m ercado, dos produtores e dos órgãos ambientais em reduzir-se o im pacto am biental da atividade produtiva.
É neste contexto que o controle biológico se insere. Ao m axim izar o uso de organism os naturais no m anejo de pragas e doenças, esta tecnologia contribui decisivam ente para que a produção se dê com reduzido im pacto, em benefício da alm ejada sustentabilidade. Esta publicação é resultante de estudos de pesquisadores da Embrapa Uva e Vinho e de outras Unidades da Embrapa, além de essenciais parceiros, os quais, em parceria, têm contribuído para a m elhoria do conhecim ento sobre esta im portante área.
Temos certeza que as inform ações aqui divulgadas servirão para o m aior conhecim ento e uso do controle biológico, bem com o de estím ulo e suporte para novas ações de pesquisa que resultem em tecnologias am bientalm ente lim pas e tecnicam ente viáveis.
Alexandre H offm ann Chefe-Geral Embrapa Uva e Vinho
S u m á rio
Isolam ento de antagonistas a pató ge n os que colonizam ferim entos de plantas
Rosa M aria Valdebenito Sanhueza e Ita m ar Soares de M elo ... 9
O btenção de epífitas de frutos e seleção de antagonistas no controle de podridões de pós-colheita
Rosa M aria Valdebenito Sanhueza e Ita m ar Soares de M elo ... 13
Isolam ento de colonizadores de clam idosporos de Fusarium oxysporum
Ita m a r Soares de M e lo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 17
Isolam ento de bactérias do rizoplano e endorizosfera e seu efeito na colonização de raízes e na p ro m o ção do crescim ento de plantas
Ita m a r Soares de M e lo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 21
Isolam ento de antagonistas para controle de doenças vasculares
Rosa M aria V aldebenito Sanhueza e Ita m ar Soares de M elo ... 27
A valiação do efeito p ro te to r e curativo de antagonistas a patógenos que colonizam folhas
Rosa M aria V aldebenito Sanhueza, M argareth Z am b on i-P in otti e A n a Elisa S ilveira Perez ... 31
M u ltip lica çã o de C lonostachys rosea
Rosa M aria V aldebenito Sanhueza e Gilberto D ali O nder ... 35
Seleção de fungos e n d o fítico s em fruteiras e flores
Rosa M aria V aldebenito Sanhueza e M argareth Z am boni-P inoti ... 39
Isolam ento seletivo de bactérias ativas para nucleação de gelo
Isolam ento de fungos m icorrízicos
Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 45
Isolam ento seletivo de Bacillus
W agner B e ttio l ... 49
O btenção de m utantes e co m p etitivid ad e de isolados de bactérias resistentes a antibióticos
Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 53
O btenção de m utantes de Trichoderma spp. resistentes a fungicidas
Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 55
Identificação de bactérias por análise dos ácidos graxos
Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 59
Identificação de bactérias pelo seqüenciam ento de genes 16S ribossôm ico (16S rDNA)
Fernando D in i A n dre ote ... 67
Identificação e diferenciação de linhagens de leveduras antagônicas a fitopatógenos utilizando sondas convencionais com o indicadores na reação de polim erização em cadeia
Luis Fernando Revers e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 75
Produção de sideróforos por rizobactérias
Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 79
Produção de a ntibióticos por m icrorganism os
Produção de bactérias para uso no controle biológico
Deise M aria Fontana C apalbo ... 97
Encapsulam ento de m icrorganism os
Rosa M aria Valdebenito Sanhueza e Ita m ar Soares de M elo ... 103
Roteiro para form ulação experim ental pó m olhável de biopesticida (sigla internacional WP)
Cláudia M ed ug no ... 109
Isolam ento de actinom icetos visando ao controle biológico de fitopatógenos
Joelm a M arcon. Jose A n to n io da Silva e M aria Carolina Quecine ... 117
Avaliação in vitro da colonização de raízes por rizobactérias
B rigida P. Vilar Queiroz e Ita m a r Soares de M elo ... 121
Seleção de rizobactérias capazes de form arem biofilm es
Francisco Eduardo de C. Costa e Ita m a r Soares de M elo ... 125
Avaliação ecotoxicológica de m icrorganism os em organism os não-alvo, organism os aquáticos e mamíferos
Vera Lúcia de Castro e Cláudio Jonsson ... 129
Apêndice
M étodos usados no Biocontrole de Fitopatógenos - 49
Iso lam en to seletivo de
B a cillu s
Wagner B ettio11
0 gênero Bacillus é form ado por bactérias em form a de bastonete, móveis e com form ação de endosporo altam ente resistente ao calor. Katz e Demain (1977) estabeleceram que m em bros do gênero Bacillus produzem cerca de 167 antibióticos, principalm ente polipeptídeos. Desse total, 66 são elaborados por isolados de B. subtilis. Dos m etabólitos produzidos verifica-se que podem apresentar ação contra bactérias Gram positivas e negativas e fungos. Esses autores apontam , dentre outros, os seguintes antibióticos produzidos por
B. subtilis. m icobacilina, subtilina, bacilom icina, bacilisina, fungistam ina,
b ulbiform ina, bacilina, subsporina, bacilocina, m icosubtilina, fungocina, iturina e eum icina.
Bacillus subtilis e seus m etabólitos vêm sendo estudados com o agentes de
controle biológico de diversos fitopatógenos da filosfera, rizosfera, esperm osfera e em pós-colheita, com relativo sucesso. Esse agente de controle biológico foi relatado controlando Uromyces phaesoli, Puccinia pelargonii-zonalis, Hem ilieia
vasta trix. R hizoctonia solani, Bipolaris sorokiniana, S clerotium rolfsii, Sclerotinia sclerotiorum , Fusarium oxysporum. P ythium aphaniderm atum , Gaeumannomyces g ra m in is var. tritici, M acrophom ina phaseolina, Botrytis cinerea, Fusarium m oniliform e, C ylindrocladium , Erw inia amylovora. C olletotrichum gloeosporioides, P enicillium d ig ita tu m e Penicillium italicum , entre outros.
A lém de B. subtilis, outras espécies, com o B. cereus e B. p u m ilu s têm ação sobre fitopatógenos.
A capacidade de produzir antibióticos, junto a substâncias que atuam com o surfactantes, pode ser uma das maneiras pelas quais Bacillus su btilis exerce antagonism o a várias espécies de fito pa tó ge no s. Entretanto, além da antibiose essa bactéria pode agir por indução de resistência do hospedeiro.
Diversos produtos com erciais à base de Bacillus su btilis estão no m ercado, com o por exemplo: RhizoPlus (FZB Biotechnik GmbH), Serenade 1,34 SC (AgraQuest, Inc.), Kodiak (Gustafson, Inc.), System 3 (Helena Chemical Co.)
50 - M étodos usados no Biocontrole de Fitopatógenos
O b je tiv o
Isolam ento seletivo de Bacillus spp.
P ro to c o lo
1. Coletar m aterial vegetal (raiz, caule, fru to e fo lha ) e lavar corr ja to de água destilada esterilizada.
2. Recolher o lavado em béquer esterilizado e filtra r em carrada de gaze, distribuindo o filtrad o em tubos de ensaio esterilizados.
3. Colocar os tubos em banho maria a 80°C p or 20 m inutos.
4. Retirar alíquotas para o bte r diluição em série na razão 1:10 ( 1 0 1 a 10 3). 5. Transferir 0,2 mL da suspensão das d ilu içõ e s para placa com BDA ou ágar
nutritivo (AN) e espalhar com auxílio de alça de Drigalski.
6. Após 24 horas de incubação a ± 29°C no escuro, repicar as colônias de
Bacillus spp. que crescerem para tu bo s co m BDA ou A N .
Atenção: Substituição das passagens 1 e 2.
Retirar discos ou fragm entos das folhas, fru to s, caules ou raízes e colocar num tubo com 20 mL de água destilada esterilizada e deixar por 10 m inutos em banho ultra-som ou sob agitação.
O isolam ento tam bém pode ser realizado a p a rtir de solo ou substrato, para tanto, substituir as passagens 1 e 2, c o lo can do 10 g de solo em 9 0 mL de água destilada esterilizada.
Para identificação das bactérias ao nível de espécies, realizar os testes bioquím icos (BUCHANAN; GIBBONS, 1975) ou utilizar a té c n ic a baseada na análise de ácidos graxos da m em brana celular em c rom atog ra fia gasosa, utilizando softw are de identificação de m icrorganism os (MIDI, Sherlock® TSBA Library version 5.0, M icrobial ID, Newark, DE, USA), sim ilar ou versões m ais recentes.
M étodos usados no Biocontrole de Fitopatógenos - 51
R e fe rê n c ia s B ib lio g rá fic a s
BU C H AN AN , R. I.; GIBBONS, N. G. B a rg e y 's m a n u a l o f d e te rm in a tiv e
b a c te rio lo g y . 8. ed. B altim ore: The W illiam s & W ilkens, 1975. 1268 p.
KATZ, E.; D EM AIN . A. L. The peptide antibiotics of Bacillus. chem istry, biogenesis, and possible fu n c tio n s . B a c te rio lo g ic a l R eview , v. 41, n. 2. p. 4 4 9 -4 6 4 , 1977. NORRIS, J. R.; BERKELEY, R. C. W.; LOGAN, N. A.; 0 DOONELL, A. G. The genera B acillus a n d S porolactobacillus. In: STARR. M. P.; STOLP, H.; TRUPER, H. G. (Ed.). T h e p ro k a ry o te s . N ew York: Springer-Verlag, 1981. p. 1711-1742.
