UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
JÉSSICA NAYARA GÓES DE ARAÚJO
AVALIAÇÃO DO HLA-G SOLÚVEL E DO PERFIL DE CITOCINAS COMO POTENCIAIS BIOMARCADORES PLASMÁTICOS DO CARCINOMA
PAPILÍFERO DA TIREOIDE
NATAL - RN 2018
JÉSSICA NAYARA GÓES DE ARAÚJO
AVALIAÇÃO DO HLA-G SOLÚVEL E DO PERFIL DE CITOCINAS COMO POTENCIAIS BIOMARCADORES PLASMÁTICOS DO CARCINOMA
PAPILÍFERO DA TIREOIDE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas (PPgCF) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obter o título de mestre em Ciências Farmacêuticas.
ORIENTADOR: Prof.a Dr.a Vivian Nogueira Silbiger CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. André Ducati Luchessi
NATAL-RN 2018
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Araújo, Jéssica Nayara Góes de.
Avaliação do HLA-G solúvel e do perfil de citocinas como potenciais biomarcadores plasmáticos do carcinoma papilífero da tireoide / Jéssica Nayara Góes de Araújo. - 2018.
134f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Natal, RN, 2018.
Orientadora: Vivian Nogueira Silbiger. Coorientador: André Ducati Luchessi.
1. Neoplasias da Glândula Tireoide - Dissertação. 2. Carcinoma papilífero da tireoide - Dissertação. 3. Biomarcadores -
Dissertação. 4. HLA-G solúvel - Dissertação. 5. Citocinas - Dissertação. I. Silbiger, Vivian Nogueira. II. Luchessi, André Ducati. III. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 616.441-006.6
AGRADECIMENTOS
À minha família, que sempre me apoiou e me incentivou, foram ouvidos para os momentos de insatisfação e frustação e me ajudaram a seguir perseverando até o final. O suporte e amor de vocês sempre me dá forças diante de todas as dificuldades e a isso sempre vou ser grata.
À minha orientadora, Vivian Nogueira Silbiger, e ao meu co-orientador, André Ducati Luchessi, por me guiarem todos esses anos de vida acadêmica e por sempre acreditarem no meu potencial para conseguir vencer os desafios até mesmo quando eu não acreditei em mim mesma. Sou muito grata por todos os ensinamentos e pela confiança que depositaram em mim.
Ao professor Eduardo Antônio Donadi, que forneceu todo o suporte para a realização deste estudo e fez valiosas contribuições para a escrita deste trabalho. Tenho muito a agradecer por ter me recebido em seu laboratório na FMRP-USP, no qual tive a oportunidade de executar os experimentos e aprender muito com seus alunos.
À doutoranda Bruna Cristina Bertol, pela parceria que foi formada durante o meu estágio na FMRP-USP e foi essencial para o sucesso e finalização desse estudo. Não tenho palavras para agradecer a altura toda a ajuda que você me deu durante todo o processo de execução e escrita deste trabalho, e eu espero que essa colaboração aqui formada possa render muitos mais frutos.
Ao pós-doutorando, Ibrahim Sadissou, por ter me acompanhado nos experimentos e análises para esse estudo. Não esqueço todas as palavras de motivação que me ajudaram a continuar perseverando e acreditando.
Ao pós-doutorando, Raul Hernandes Bortolin, por todo o apoio e contribuições para o exame de qualificação. Sua ajuda foi muito importante para me tranquilizar durante esse momento.
Às professoras, Janaína Cristiana de Oliveira Crispim Freitas e Norma Lucena Cavalcanti Licínio da Silva, por todo o suporte e apoio para a realização das missões do projeto PROCAD para Recife e Ribeirão Preto, foram experiências muito enriquecedoras para o meu mestrado. Também sou muito grata pelas contribuições expostas durante o exame de qualificação para aprimorar o trabalho.
Ao grupo PPGFriends, por todo o carinho e palavras de motivação durante o mestrado. Nossa amizade formada durante a pós-graduação foi um verdadeiro grupo
de apoio em todos os momentos, e cada conquista foi muito celebrada. Obrigada por caminharem junto comigo!
À todos do Laboratório de Bioanálises e Biotecnologia molecular (LBBM), por todo apoio sempre, principalmente as alunas de iniciação científica, Layse Raynara, Lorenna Larissa, Lorena Ivnyr e Katiene Macedo por assistência durante as coletas de sangue na LIGA. Sem vocês nada disso seria possível.
À toda equipe do hospital Liga Norte-Riograndense Contra o Câncer, em especial a Dr.a Sheila Ramos de Miranda Henrique Tarrapp que sempre deu muito suporte para a avaliação clínica dos pacientes oriundos do Rio Grande do Norte.
À todos que estiveram juntos comigo e contribuíram direta e indiretamente para a realização de trabalho. Foi uma longa jornada que não teria sido concluída sem a ajuda de todos vocês. Muito obrigada por tudo!
RESUMO
O carcinoma papilífero de tireoide (CPT) é o tumor maligno mais frequente da tireoide. Limitações no diagnóstico e determinação de prognóstico ainda representam um grande desafio para o manejo clínico do CPT, logo a busca por novos biomarcadores para o diagnóstico minimamente invasivo torna-se crucial. Considerando a reconhecida associação entre o CPT e a inflamação crônica, o objetivo do presente estudo foi investigar a concentração plasmática de citocinas e HLA-G solúvel como potenciais biomarcadores de diagnóstico e/ou prognóstico do CPT. Este estudo avaliou pacientes com CPT antes (n = 85) e após a realização da tireoidectomia (n = 77), e controles (n = 80). Os níveis plasmáticos de 13 citocinas foram mensurados por citometria de fluxo, e HLA-G solúvel foi mensurado por ELISA. Os dados foram avaliados por meio de análises univariada e multivariada, e curvas ROC. Os níveis de IL-4, IL-10, TNF, IFN-α e TGF-β1 estavam aumentados no pós-tireoidectomia comparado ao pré-pós-tireoidectomia. Comparado aos controles: i) os níveis de sHLA-G diminuíram pós-tireoidectomia, ii) os níveis de IL-6 aumentaram, enquanto os níveis de IL-1β, IFN-α e TGF-β1 diminuíram no pré-tireoidectomia, iii) Os níveis de IL-5 e IL-6 estavam aumentados, enquanto IFN-α e o TGF-β1 estavam diminuídos no pós-tireoidectomia. IFN-α e TGF-β1 foram capazes de discriminar de forma independente os pacientes com CPT de controles, e IFN-α apresentou a melhor performance diagnóstica (AUC: 0,94). Aumento de IL-1β e diminuição de IL-12p70 no plasma estava associado independentemente com tumores maiores (> 2,0 cm), enquanto a diminuição dos níveis de sHLA-G estava associada à presença de invasão. Pacientes com resposta bioquímica/estrutural incompleta apresentaram níveis mais altos de IL-5 e IFN-α em comparação aos pacientes de resposta excelente/indeterminada. Em conclusão, observou-se um perfil diferenciado de citocinas nos plasmas pré- e pós-tireoidectomia, e o níveis de IFN-α e o TGF-β1 mostraram-se bons candidatos a biomarcadores pré-cirúrgicos do CPT. Citocinas estavam associadas com fatores de pior prognóstico (IL-1β e IL-12p70) e de resposta insatisfatória ao tratamento (IFN-α e IL-5).No entanto, mais estudos são necessários para confirmar a relevância clínica dessas moléculas para o CPT.
Palavras-chave: carcinoma papilífero da tireoide; biomarcadores; HLA-G solúvel; citocinas; inflamação;
ABSTRACT
Papillary thyroid carcinoma (PTC) is the most common thyroid malignancy. Limitations in diagnosis and prognosis determination still represent a great challenge for clinical management of PTC. Thus, the search for new targets for minimally invasive diagnosis became crucial. Considering the recognized association between PTC and chronic inflammation, the aim of the present study was to investigate plasma levels of cytokines and soluble HLA-G as potential biomarkers for diagnosis and/or prognosis of CPT. We studied PTC patients before (n = 85) and after thyroidectomy (n = 77), and 80 controls. Plasma levels of 13 cytokines were measured by flow cytometry bead-based assays, and soluble HLA-G was measured by ELISA. Data were evaluated using univariate and multivariate analyses, and ROC curves. Compared to pre-thyroidectomy, IL-4, IL-10, TNF, IFN-α and TGF-β1 levels were increased in post-thyroidectomy. Compared to controls: i) sHLA-G levels were decreased after thyroidectomy, ii) IL-6 levels were increased, while IL-1β, IFN-α and TGF-β1 levels were decreased in pre-thyroidectomy, iii) IL-5 and IL-6 levels were increased, while IFN-α and TGF-β1 were decreased in post-thyroidectomy. IFN-α and TGF-β1 discriminated patients from controls after multiple logistic regression analysis, and IFN-α presented the best diagnostic performance. Increased IL-1β and decreased IL-12p70 levels presented independent associations with larger tumors (>2.0 cm), while decreased sHLA-G levels were associated with invasion. Patients presenting biochemical/structural incomplete response presented higher IL-5 and IFN-α levels when compared to patients with excellent/indeterminate response. In conclusion, a differential cytokine profile was observed in plasma before and after thyroidectomy, and IFN-α and TGF-β1 levels seems to be potential biomarkers candidates for PTC diagnosis. Cytokines were associated with factors of poor prognosis (IL-1β e IL-12p70) and unsatisfactory response to treatment (IFN-α e IL-5). However, further studies are needed to confirm the clinical relevance of these molecules for PTC.
Keywords: Papillary thyroid carcinoma; biomarkers; soluble HLA-G; cytokines; inflammation;
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 — Isoformas do HLA-G produzidas por splicing alternativo do transcrito primário ... 27 Figura 2 — Concentração plasmática das citocinas com expressão diferencial estatisticamente significante na comparação pareada entre pré- e pós-tireoidectomia dos pacientes com CPT, A: IL-4; B: IL-10; C: TNF; D: IFN-α; E: TGF-β1;... 38 Figura 3 — Gráfico de dispersão da correlação positiva baixa entre a concentração plasmática de IL-17A e IL-4 nos pacientes com CPT pré-tireoidectomia ... 41 Figura 4 — Gráficos de dispersão das correlações mais significativas entre as citocinas no plasma pós-tireoidectomia dos pacientes com CPT, A: 4 e 10; B: IL-1β; C: IL-12p70 e IL-13; ... 43 Figura 5 — Concentração plasmática do sHLA-G e citocinas com expressão diferencial estatisticamente significante na comparação de pacientes com CPT pré- e pós-tireoidectomia com controles, A: IL-6; B: IFN-α; C: TGF-β1; D: IL-1β; E: IL-5; F: sHLA-G;... 46 Figura 6 — Curvas ROC para avaliar a capacidade dos níveis plasmáticos de IFN-α e TGF-β1 em discriminar pacientes com CPT dos controles. ... 48 Figura 7 — Concentração plasmática pré-tireoidectomia das citocinas com expressão diferencial estatisticamente significante na comparação de acordo com o gênero dos pacientes com CPT, A: TNF; B: IL-13; ... 51 Figura 8 — Concentração plasmática pré-tireoidectomia das citocinas com expressão diferencial estatisticamente significante na comparação de acordo com a presença de metástase linfonodal nos pacientes com CPT, A: TNF; B: TGF-β1 ... 51 Figura 9 — Concentração plasmática pré-tireoidectomia da citocina (IFN-α) com expressão diferencial estatisticamente significante na comparação de acordo com a presença de extensão extratireoidiana nos pacientes com CPT ... 52 Figura 10 — Concentração plasmática pré-tireoidectomia de sHLA-G com expressão diferencial estatisticamente significante na comparação de acordo com a presença de invasão nos pacientes com CPT. ... 52 Figura 11 — Concentração plasmática pré-tireoidectomia de citocinas com expressão diferencial estatisticamente significante na comparação de acordo com o tipo de resposta ao tratamento dos pacientes com CPT, A: IL-5; B: IFN-α; ... 54
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 — Descrição das características dos pacientes com CPT incluídos no estudo ... 36 Tabela 2 — Análise pareada da concentração plasmática de citocinas e sHLA-G em pacientes com CPT pré- e pós-tireoidectomia ... 37 Tabela 3 — Correlação entre a concentração plasmática de sHLA-G e citocinas em pacientes com CPT pré-tireoidectomia ... 40 Tabela 4 — Correlação entre a concentração plasmática de sHLA-G e citocinas em pacientes com CPT pós-tireoidectomia ... 42 Tabela 5 — Concentração de sHLA-G e citocinas no plasma de controles, pacientes com CPT pré- e pós-tireoidectomia ... 45 Tabela 6 — Análise de regressão logística múltipla dos níveis de citocinas e sHLA-G pré-tireoidectomia para predizer CPT ... 47 Tabela 7 — Associação dos níveis plasmáticos de citocinas e sHLA-G com fatores clínico-histopatológicos do CPT ... 50 Tabela 8 — Análise de regressão logística múltipla para citocinas associadas a características clínico-histopatológicas de CPT ... 53 Tabela 9 — Concentração plasmática de sHLA-G e citocinas pré-tireoidectomia de acordo com o tipo de resposta ao tratamento de pacientes com CPT ... 54 Tabela 10 — Análise de regressão logística múltipla dos níveis plasmáticos de citocinas com o tipo de resposta ao tratamento ... 55
LISTA DE ABREVIATURAS
APC Células apresentadoras de antígeno
AJCC do inglês, American Joint Comission on Cancer ATA do inglês, American Thyroid Association
AUC do inglês, Area under the curve CT Câncer de tireoide
CDT Carcinoma diferenciado da tireoide CFT Carcinoma folicular da tireoide CPT Carcinoma papilífero da tireoide
ELISA do inglês, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay HGF Fator de crescimento do hepatócito
HLA-G Antígeno Leucocitário Humano G
IARC do inglês, International Agency for Research on Cancer INCA Instituto Nacional de Câncer
IFN Interferon IL Interleucina
MAPK Proteína quinase ativada por mitógeno MHC do inglês, Major Histocompatibility Complex
MIG monocina induzida por interferon-gama NK Célula Natural killer
NKT Célula T natural killer
PAAF Punção aspirativa com agulha fina PI3K Fosfatidilinositol 3-quinase
ROC do inglês, Receiver Operating Characteristic sHLA-G HLA-G solúvel
TGF-β Fator de crescimento tumoral β TH Tireoidite de Hashimoto
TH0 Linfócitos T CD4+ precursores TH1 Células T CD4+ do tipo 1 TH2 Células T CD4+ do tipo 2 TH17 Células T CD4+ do tipo 17
TNM do inglês, Tumor, Node, Metastasis Treg Célula T reguladora
TSH Hormônio tireoestimulante T3 Triiodotironina
T4 Tiroxina
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 14
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 16
2.1 Câncer de Tireoide ... 16
2.1 Diagnóstico e prognóstico do câncer de tireoide ... 17
2.2 Patogênese do câncer de tireoide ... 20
2.3 Inflamação e o câncer: o papel das citocinas ... 21
2.4 A molécula imunomoduladora HLA-G e o seu envolvimento com o câncer . 26 3 OBJETIVOS ... 29
3.1 Objetivo geral ... 29
3.2 Objetivos específicos ... 29
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 30
4.1 Comitê de Ética em Pesquisa ... 30
4.2 Casuística ... 30
4.3 Determinação dos níveis plasmáticos de HLA-G solúvel ... 32
4.4 Determinação da concentração plasmática de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias ... 33
4.5 Análise estatística ... 33
5 RESULTADOS ... 35
5.1 Características demográficas e clínico-histopatológicas ... 35
5.2 Análise da produção de citocinas e sHLA-G no plasma dos pacientes com CPT pré- e pós-tireoidectomia ... 37
5.3 Correlações entre os níveis plasmáticos de citocinas e sHLA-G em pacientes com CPT pré- e pós-tireoidectomia ... 39
5.4 Análise da produção de citocinas e sHLA-G no plasma dos pacientes com CPT pré- e pós-tireodectomia comparado aos controles. ... 44
5.5 Avaliação do potencial dos níveis plasmáticos de citocinas e sHLA-G para discriminar pacientes com CPT dos controles ... 47
5.6 Associação dos níveis plasmáticos de citocinas e sHLA-G com parâmetros clínico-histopatológicos do CPT ... 48
5.7 Associação dos níveis plasmáticos de citocinas com o tipo de resposta ao tratamento de pacientes com CPT ... 53
7 CONCLUSÕES ... 62
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 63
PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS ... 74
RESUMOS EM ANAIS DE CONGRESSO ... 74
ARTIGOS PUBLICADOS ... 77
aceitos para publicação ... 77
artigos submetidos ... 78
ANEXOS ... 79
ANEXO A ... 79
ANEXO B ... 81
1 INTRODUÇÃO
O câncer de tireoide (CT) é o tumor maligno mais comum do sistema endócrino, representando aproximadamente 90% das neoplasias malignas endócrinas (GALDIERO; VARRICCHI; MARONE, 2016). A International Agency for Research on Cancer (IARC) estimou para 2012 cerca de 298.102 novos casos de CT no mundo, correspondendo a 2,1% de todos os cânceres, e foram estimados 39.771 óbitos, representando 0,5% das mortes por câncer no mundo (FERLAY et al., 2015). A incidência de CT tem aumentado notavelmente nas duas últimas décadas, no entanto, a taxa de mortalidade tem se mantido estável. Acredita-se que isso se deve principalmente à melhoria nas técnicas para diagnóstico, que permitiram identificar com maior frequência até os nódulos < 1 cm (MORRIS et al., 2013; NIXON et al., 2017). No entanto, ainda se discute se essa tendência poderia ser um verdadeiro aumento relacionado a fatores ambientais como o aumento da exposição à radiação (NIXON et al., 2017; VIGNERI; MALANDRINO; VIGNERI, 2015). Segundo a última estimativa do Instituto Nacional de Câncer (INCA), o CT será a quinta neoplasia maligna mais frequente em mulheres no Brasil em 2018, e as regiões nordeste e sudeste apresentarão o maior número de novos casos (INCA, 2017). O carcinoma papilífero da tireoide (CPT) é um tipo de carcinoma diferenciado que corresponde a 80% de todos os casos de CT, que em sua maioria apresentam um bom prognóstico quando tratado adequadamente, com índices de mortalidade similares aos da população geral. A taxa de sobrevida em 10 anos desse tipo de malignidade excede 90%, mas alguns indivíduos com CPT apresentam tumores de comportamento mais agressivo e ainda não existem biomarcadores eficazes para diferenciar esses casos (MAIA et al., 2007; SONDERMANN et al., 2015). A análise citológica do nódulo tireoidiano por punção aspirativa com agulha fina (PAAF) é o método padrão-ouro para discriminar entre lesões benignas e malignas, porém aproximadamente 25% dos casos recebem diagnóstico indeterminado, necessitando da remoção da glândula tireoide para obter um diagnóstico definitivo através da análise histopatológica (NIXON et al., 2017). Dessa forma, torna-se imprescindível a busca de novos biomarcadores de malignidade, minimamente invasivos e precisos que auxiliem no diagnóstico de lesões malignas, assim como, na identificação de indivíduos com doença mais agressiva, detecção de doença
persistente ou recorrente e na predição da eficiência do tratamento (GRAHAM et al., 2015; NUNES et al., 2013).
Estudos recentes têm destacado uma associação importante entre inflamação crônica e câncer. Há relatos na literatura demonstrando que a inflamação relacionada ao câncer promove o desenvolvimento e progressão tumoral, estimulando a angiogênese, possibilitando a proliferação e sobrevivência celular, induzindo mutações gênicas e comprometendo a resposta imune antitumoral. As citocinas parecem ter um papel relevante nesse processo, através da promoção de inflamação ou imunossupressão (WANG; LI; HU, 2017). Neste contexto, a avaliação da produção de ambas citocinas pró-inflamatórias e anti-pró-inflamatórias é importante para entender a complexidade do desenvolvimento tumoral e a modulação da resposta imune no CT (CUNHA et al., 2016). Nos últimos anos, diversos estudos vêm investigando a concentração sérica de diferentes citocinas no contexto do câncer e algumas estão sendo apontadas como potenciais biomarcadores do CT. Esses estudos destacam a importância de continuar estudando essas moléculas na busca por uma melhor compreensão da interação global entre células tumorais e o sistema imune, assim como identificar novos biomarcadores não-invasivos do CT (KAMMOUN-KRICHEN et al., 2012; LINKOV et al., 2009; STANCIU et al., 2015; ZIVANCEVIC-SIMONOVIC et al., 2016).
A molécula do antígeno leucocitário humano G (HLA-G) também está atraindo atenção nos últimos anos no contexto de doenças tumorais, devido a sua capacidade de inibir a atividade citotóxica de células natural killer (NK) e linfócitos T CD8+ citotóxicos, e de induzir tolerância nas células apresentadoras de antígeno, células cruciais para o estabelecimento de uma resposta imune antitumoral (PISTOIA et al., 2007). Estudos investigando a concentração plasmática da forma solúvel do HLA-G (sHLA-G) relataram seu papel promissor como biomarcador de diagnóstico e prognóstico de diversas malignidades (CAO et al., 2011; LI et al., 2017b; PAN et al., 2016), incluindo o CPT (DARDANO et al., 2012). Porém, nenhum estudo se propôs a comparar a concentração de sHLA-G antes e após a remoção do tumor tireoidiano.
Considerando que a expressão de HLA-G modula o padrão de citocinas produzidas, e vice-versa (DONADI et al., 2011), e a necessidade de novos biomarcadores minimamente invasivos para auxiliar no diagnóstico e prognóstico de CPT, este estudo
teve como objetivo avaliar os níveis plasmáticos de sHLA-G e um painel de citocinas inflamatórias e regulatórias em pacientes com CPT e indivíduos controles, assumindo como desfechos principais: i) a presença do câncer de tireoide (diagnóstico do CPT) e ii) a existência de características clinico-histopatológicas desfavoráveis e/ou não responsividade ao tratamento (prognóstico do CPT). Como resultado, espera-se que a expressão diferencial de sHLA-G e/ou citocinas no plasma de pacientes com CPT seja capaz de distingui-los de indivíduos controles, bem como de caracterizar aqueles com pior prognóstico da doença, auxiliando os médicos numa melhor avaliação dos pacientes e planejamento do tratamento, reduzindo a realização de tireoidectomias desnecessárias.
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Câncer de Tireoide
As taxas de incidência de CT têm aumentado nas últimas décadas na maior parte do mundo. Esse tipo de neoplasia foi o oitavo câncer mais frequentemente diagnosticado entre as mulheres em todo o mundo, representando cerca de 3,5% de todos os novos casos de câncer diagnosticados em 2012, enquanto que em homens foi menos comum, representando < 1% do número total (SIERRA; SOERJOMATARAM; FORMAN, 2016; VEIGA et al., 2013). De acordo com a última estimativa do INCA, 9.610 novos casos de CT são esperados no Brasil para cada ano do biênio 2018-2019, com um risco estimado de 1,49/100 mil homens e 7,57/100 mil mulheres. Rio Grande do Norte e São Paulo estão entre os estados com as mais altas taxas de incidência por 100 mil mulheres, correspondendo a 6,82 e 9,48, respectivamente (INCA, 2017).
A glândula tireoide é composta principalmente de dois tipos celulares: as células foliculares e as células parafoliculares. A maioria dos tumores malignos da tireoide são carcinomas e mais de 90% desses carcinomas são derivados das células foliculares, que são responsáveis pela produção dos hormônios tireoidianos: triiodotironina (T3) e tiroxina (T4). Baseado em fatores histológicos e clínicos, os carcinomas derivados de células
foliculares podem ser divididos em bem diferenciados, pouco diferenciados e indiferenciados ou anaplásicos. Os carcinomas medulares são derivados das células parafoliculares e representam cerca de 5% dos casos, podendo ser esporádicos ou familiares (PALLANTE et al., 2014; YUAN; YANG; ZHENG, 2014).
Os carcinomas diferenciados da tireoide (CDT) são subdivididos em: carcinoma papilífero da tireoide (CPT) que corresponde a 80% dos casos e carcinoma folicular da tireoide (CFT) que representa 10% dos casos, aproximadamente (PALLANTE et al., 2014). Ambos podem se desdiferenciar por acúmulo de anormalidades genéticas, progredindo para carcinomas pouco diferenciados ou carcinoma anaplásico, que corresponde a menos de 5% dos carcinomas derivados de células foliculares, são muito agressivos com crescimento rápido e prognóstico desfavorável (LEONARDI et al., 2012; LIEBNER; SHAH, 2011; PALLANTE et al., 2014).
O CPT tem evolução lenta e acomete três vezes mais mulheres do que homens, ocorrendo em qualquer idade, mas principalmente entre a terceira e quarta década da vida. Dentre todos, geralmente é o menos agressivo e com melhor prognóstico, apresentando uma taxa de sobrevida de 10 anos superior a 90% (SONDERMANN et al., 2015). No entanto, metástases para linfonodos cervicais são encontradas em 20–50% dos casos e recorrência locorregional da doença é observada em até 5-20% dos pacientes que passaram pela remoção cirúrgica da glândula (HAUGEN et al., 2016; HU et al., 2017). O CFT também é mais comum em mulheres e tende a aparecer em idades mais avançadas do que o CPT. Em cerca de 20% dos casos ocorre metástase a distância, particularmente para o pulmão e ossos (PALLANTE et al., 2014).
2.1 Diagnóstico e prognóstico do câncer de tireoide
Os nódulos tireoidianos representam a principal manifestação clínica de uma série de doenças tireoidianas e são comumente encontrados incidentalmente, podendo ser vistos em até 50% dos pacientes com mais de 60 anos. Apesar da grande maioria representar lesões benignas, é necessário excluir a presença de CT, que corresponde a 5-10% dos casos(HSIAO; NIKIFOROV, 2014; MAIA et al., 2007)
O diagnóstico do CT envolve a investigação de fatores de risco associados à malignidade como histórico familiar de CT, sexo, idade e exposição à radiação ionizante, assim como a avaliação do hormônio tireoestimulante (TSH). Além disso, a ultrassonografia da glândula tireoide também é realizada para buscar sinais que indiquem maior chance de malignidade como nódulos sólidos, hipoecóicos, com presença de microcalcificações e margens irregulares, porém não é possível diferenciar a natureza do nódulo através desse método. Dessa forma, os nódulos > 1 cm que apresentam os sinais de possível malignidade são encaminhados para avaliação citológica por meio do PAAF (HAUGEN et al., 2016). A realização desse procedimento é o padrão ouro para diferenciação entre nódulos malignos e benignos, porém trata-se de um procedimento invasivo e de alta complexidade para execução, pois exige um bom treinamento e conhecimento de quem o executa.
Cerca de 15-25% dos nódulos avaliados por meio da análise citológica, não tem diagnóstico conclusivo, devido à erros de amostragem e dificuldade em discriminar lesões foliculares. Nesses casos, a aspiração pode ser repetida ou é realizada a tireoidectomia, cirurgia de retirada parcial ou total da tireoide, para obter o diagnóstico definitivo. No entanto, uma proporção significativa dos nódulos tem histopatologia benigna, logo, muitos indivíduos são submetidos a tireoidectomia sem necessidade, estando susceptíveis aos riscos que estão associados a esse procedimento, como lesão do nervo laríngeo e hipoparatireoidismo, e a necessidade de reposição hormonal contínua. Dessa forma, torna-se imperativa a busca de novos biomarcadores no sangue periférico, que sejam mais precisos e eficazes para um diagnóstico pré-cirúrgico, minimamente invasivo, mais reproduzível e seguro (NIXON et al., 2017; WEI et al., 2016). A American Thyroid Association (ATA) recomenda que o manejo do CPT seja baseado no estadiamento da doença e avaliação de risco dos pacientes. O tratamento consiste na remoção cirúrgica da glândula e demais linfonodos locorregionais com suspeita de malignidade, administração de doses ablativas de iodo radioativo (radioiodoterapia) quando necessário, e terapia de supressão do TSH através da administração contínua de levotiroxina, um análogo do T4. O acompanhamento da evolução clínica do paciente à longo prazo incluem a vigilância de doença recorrente ou
persistente através de dosagem sérica de tireoglobulina e anticorpo anti-tireoglobulina, e exames de imagem (HAUGEN et al., 2016).
Diversos sistemas de classificação são utilizados para avaliar o estadiamento do CPT, que auxiliam na predição de sobrevida e prognóstico, influenciando a escolha do tratamento. Para essas classificações, são avaliadas características como idade, gênero, e informações histopatológicas obtidas após a tireoidectomia como, por exemplo, tamanho do tumor, presença de extensão extratireoidiana e metástase distante (GONZALEZ-GONZALEZ et al., 2011). No entanto, esses sistemas não conseguem prever o risco de recorrência da doença (PACINI et al., 2012). Dessa forma, existem outras classificações para predição do risco de recorrência e persistência, como a recomendada pela ATA (HAUGEN et al., 2016), que avaliam não somente as características clinicopatológicas do indivíduo no momento do diagnóstico, mas também informações clínicas após o tratamento inicial com cirurgia e radioiodoterapia (TARASOVA; TUTTLE, 2016). O sistema de estadiamento mais amplamente utilizado é o TNM (do inglês Tumour, Node, Metastasis) da Union for International Cancer Control (UICC) e American Joint Comission on Cancer (AJCC). Esse sistema classifica os pacientes em estadios segundo o tamanho do tumor primário e presença de extensão extratireoidiana (T), presença de metástase em linfonodos regionais (N) ou a distância (M), visando estimar a severidade do caso e sobrevida relativa desses pacientes (ANEXO A) (GUO; WANG, 2014; SOBIN et al., 2009).
Entre as características clínicas que podem indicar o pior prognóstico do paciente com CPT estão a idade ao diagnóstico (>45 anos), sexo masculino, tamanho do tumor > 2 cm, presença de extensão extratireoidiana, metástase para linfonodos regionais ou à distância (GUO; WANG, 2014). Além disso, algumas variantes histológicas do CPT estão associadas com um comportamento mais agressivo do tumor. Entre elas, estão as variantes de células altas, variante esclerosante difusa, variante sólida e variante folicular (LIVOLSI, 2011). Entretanto, um comportamento agressivo do tumor ao diagnóstico não é necessariamente seguido por um resultado clínico negativo (DARDANO et al., 2012) e os sistemas de classificação para a estratificação de risco inicial representam apenas cerca de 15-20% da variabilidade no resultado clínico que eles estão tentando prever (MOMESSO; TUTTLE, 2014). Dessa forma, a estratificação inicial pode ser modificada
de acordo com a situação clínica do paciente durante o acompanhamento da resposta ao tratamento, que pode ser classificada em quatro categorias: excelente (sem evidência bioquímica, estrutural ou funcional de doença), bioquímica incompleta (persistência de valores anormais de tireoglobulina ou níveis de anticorpos anti-tireoglobulina aumentando na ausência de doença localizável), estrutural incompleta (identificação de persistência ou recindivas por metástases locorregionais ou distantes) e indeterminada (achados bioquímicos ou estruturais inespecíficos que não podem ser classificados com confiança como benignos ou malignos). Os critérios para cada categoria são definidos de acordo com a terapia inicial do paciente: tireoidectomia total e radioiodoterapia, somente tireoidectomia total, e somente tireoidectomia parcial (ANEXO B) (MOMESSO; TUTTLE, 2014).
Considerando todo esse contexto, observa-se que é muito importante prosseguir a busca por novos biomarcadores para auxiliar o diagnóstico de nódulos tireoidianos e na melhor predição do prognóstico dos pacientes com CPT. A identificação adequada dos casos que realmente são de alto risco, pode ajudar o médico de forma mais eficaz no planejamento do tratamento e levar a redução da realização de tireoidectomia quando ela é dispensável.
2.2 Patogênese do câncer de tireoide
Alguns fatores de risco estão relacionados a maior predisposição ao CT, como uma dieta com consumo insuficiente de iodo, exposição à radiação ionizante, obesidade e fatores hereditários. No entanto, a maioria das pessoas com CT não tem fatores de risco aparentes e outras pessoas com um ou mais fatores de risco podem não desenvolver a doença (LINKOV et al., 2009). O desenvolvimento de tumores tireoidianos envolve uma complexa interação entre predisposição genética, mutações somáticas e modulação epigenética contribuindo para a heterogeneidade e comportamento desses tumores (LIEBNER; SHAH, 2011)
A patogênese molecular da maioria dos CT está relacionada a mutações em genes que codificam moléculas que participam das vias de sinalização da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) e da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)/AKT (GALDIERO;
VARRICCHI; MARONE, 2016). A via MAPK é muitas vezes ativada através de mutações pontuais dos genes BRAF e RAS, assim como também os rearranjos genéticos RET/PTC e TRK (HSIAO; NIKIFOROV, 2014; LIEBNER; SHAH, 2011).
A ativação frequente da via MAPK por esses genes leva a ativação de um programa de transcrição pró-inflamatória que envolve citocinas, quimiciocinas e seus receptores. Essas moléculas por sua vez agem de forma autócrina e parácrina e tem o potencial de manter as características fenotípicas malignas dos tumores, por estimular a angiogênese, promover o recrutamento de células inflamatórias e o remodelamento tecidual. Dessa forma, as citocinas podem contribuir para a proliferação, sobrevivência e invasão tumoral (GUARINO et al., 2010).
2.3 Inflamação e o câncer: o papel das citocinas
A inflamação é uma resposta fisiológica protetora desencadeada pelo organismo em resposta a estímulos provocados por injúria tecidual e/ou infecção. Quando esse estímulo se torna persistente ou ocorre uma falha nos mecanismos em resposta a inflamação, caracteriza-se como um processo crônico, levando a um processo de estresse oxidativo no tecido causado pela liberação constante de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio pelos leucócitos no local. Esses metabólitos induzem a produção de agentes mutagênicos que podem provocar mutações pontuais e rearranjos genômicos em células que estão proliferando, resultando em uma maior probabilidade de um oncogene ser ativado ou de um gene supressor de tumor perder a função. Assim, esse estresse oxidativo pode levar ao desenvolvimento e progressão do câncer (BAN et al., 2012; BEKSAC et al., 2017; COUSSENS; WERB, 2002).
O microambiente tumoral compreende uma diversidade de células, como células estromais, endoteliais e células da imunidade inata e adquirida, que interagem entre si, formando o sistema complexo que envolve o tumor. Além disso, a diversidade fenotípica das células imunes infiltrantes no tumor podem influenciar de forma negativa ou positiva o desenvolvimento tumoral e o prognóstico do paciente (CARVALHO et al., 2017). Células T CD8+, células NK e células T natural killer (NKT) atuam como importantes supressores de tumor por causa da sua função citotóxica que leva a destruição de células
tumorais, enquanto células T reguladoras (Treg) ou células T CD4+ secretoras de interleucina (IL)-10 e fator de crescimento tumoral β (TGF-β), por exemplo, têm a habilidade de inibir o sistema imune, induzindo tolerância e permitindo que as células tumorais escapem a imunidade antitumoral (WEBER, 2014). As citocinas secretadas pelas células tumorais e imunológicas são mediadores da inflamação essenciais para a ativação, crescimento, diferenciação e recrutamento de células efetoras do sistema imune para o local do tumor (CARVALHO et al., 2017).
As células T CD4+ desempenham um papel muito importante na modulação do sistema imune. De acordo com citocinas e outros estímulos do microambiente tumoral, os linfócitos T CD4+ precursores (T
H0) podem se diferenciar em subpopulações que secretam citocinas funcionalmente distintas: células T CD4+ do tipo 1 (T
H1), tipo 2 (TH2), tipo 17 (TH17) ou células Treg, desencadeando um perfil de resposta característico (WEBER, 2014). O perfil de resposta TH1 é induzido pela presença da interleucina 12 (IL-12) e o fator de necrose tumoral (TNF) α, promovendo uma resposta celular e pró-inflamatória, através da produção das citocinas interferon (IFN)-γ, TNF-α e IL-2. As células TH2 são estimuladas pela presença da IL-4 e estabelece uma resposta imune humoral, secretando principalmente IL-4, IL-5 e IL-13 (CARVALHO et al., 2017; ZHU; YAMANE; PAUL, 2010). No contexto de células tumorais, a maioria dos estudos sugerem que a secreção de citocinas do perfil TH1 teria ação antitumoral, enquanto que secreção de citocinas do perfil TH2 contribuiriam para a progressão do tumor. Porém, não somente o TH1, como o perfil de resposta TH2 também já foi implicado no estabelecimento de uma resposta imune antitumoral através do estímulo da proliferação dos linfócitos T CD8+ citotóxicos (CARVALHO et al., 2017; ZIVANCEVIC-SIMONOVIC et al., 2015a).
As células Treg são caracterizadas pela presença do fator de transcrição FOXP3 e induzidas pela presença de IL-2 e TGF-β, levando a inibição da atividade antitumoral mediada por célula T. As células TH17 são induzidas através da presença de 6 e IL-21, assim como o TGF-β, e mantidas pela presença de IL-1β e IL-23. Essa subpopulação secreta as citocinas pró-inflamatórias: IL-17A, IL-17F e IL-22, que são responsáveis por aumentar a imunidade e as defesas do hospedeiro, mas por outro lado na literatura há relatos do envolvimento dessas citocinas com a promoção e progressão do câncer,
estimulando a angiogênese (CARVALHO et al., 2017; LEE et al., 2015; ZHU; YAMANE; PAUL, 2010).
A relação entre inflamação e CT é complexa e não está totalmente compreendida, porém frequentemente o CT ocorre associado a outras doenças autoimunes tireoidianas e o tecido tumoral encontra-se infiltrado por células inflamatórias (GUARINO et al., 2010). Acredita-se que cerca de 20-50% dos casos de CPT ocorrem no contexto de inflamação crônica (BEKSAC et al., 2017). A tireoidite de Hashimoto (TH) é a doença autoimune tireoidiana mais comum e sua associação com o CT, principalmente o CPT, é muito discutida na literatura. No entanto, ainda há informações conflitantes sobre essa associação, uma vez que alguns estudos sugerem que o CPT e o TH estão positivamente correlacionados, e outros não conseguiram encontrar essa associação (WEBER, 2014). O infiltrado linfocitário difuso que é um dos achados característicos do TH, quando presente em pacientes com CPT, já foi correlacionado a melhor sobrevida livre de doença e doença menos agressiva ao diagnóstico nesses pacientes. A incidência de infiltrado linfocitário é significativamente alta em pacientes com CPT, mesmo na ausência de outros sinais de tireoidite autoimune, como a produção de autoanticorpos. Além disso, alguns estudos reportam que CTs com pior prognóstico, como os carcinomas pouco diferenciado e o anaplásico, são caracterizados por uma redução significativa no infiltrado linfocitário quando comparado ao CPT, sugerindo que essas células podem desempenhar um papel protetor no CT (CARVALHO et al., 2017; GUARINO et al., 2010; UGOLINI et al., 2007; WEBER, 2014). Em contrapartida, a presença de células da imunidade inata no infiltrado inflamatório, como macrófagos e mastócitos, está associada a um prognóstico desfavorável e pode contribuir para a progressão do câncer (GUARINO et al., 2010). Duas subpopulações de macrófagos com funções diferentes já foram descritas, os macrófagos do tipo M1 cuja função principal é fagocitose em resposta a estímulo por bactérias ou citocinas do tipo TH1 e os macrófagos do tipo M2 cuja função principal é imunossupressão e atividade trófica em resposta a citocinas do tipo TH2 (CUNHA; MARCELLO; WARD, 2014). Um estudo que realizou uma análise fenotípica dos macrófagos associados ao CPT revelou uma expressão aumentada de genes relacionados ao perfil M2, e indicou um papel pro-tumorigênico dessas células, uma vez que a redução delas levavam a regressão do tumor (RYDER et al., 2013). Porém,
também há relato de que o infiltrado de macrófagos já foi associado a uma melhor sobrevida livre de doença (CUNHA et al., 2012), e acredita-se que esses resultados conflitantes estão relacionados ao fato de que o papel dos macrófagos no TC provavelmente depende de outros fatores do microambiente tumoral, destacando a complexidade da resposta imunológica envolvida no desenvolvimento do TC (CUNHA; MARCELLO; WARD, 2014).
Nesse contexto, as citocinas são secretadas principalmente pelas células imunes do infiltrado inflamatório, mas também são secretadas pelas células foliculares da tireoide, atuando como importantes mediadores da inflamação que favorecem vários aspectos da iniciação e crescimento do CT (LI et al., 2017a). Dessa forma, a análise de mudanças no perfil de citocinas na circulação sistêmica é uma alternativa atraente para entender melhor a patogênese desse tipo de câncer, assim como também identificar potenciais biomarcadores minimamente invasivos de diagnóstico e prognóstico.
Nas duas últimas décadas, estudos têm examinado a concentração sérica de determinadas citocinas em pacientes com CPT. Um estudo avaliando mudanças nos níveis séricos de IL-6 e TNF-α relacionadas ao tratamento com radioiodoterapia em 14 pacientes com CPT, foi observado que a IL-6 estava significativamente aumentada após a realização de tratamento (ÖZATA et al., 2000). Um outro estudo avaliando a concentração sérica de um painel de 19 citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento em 23 pacientes com CT e 24 pacientes com nódulos benignos, os autores observaram que a análise simultânea de IL-8, fator de crescimento do hepatócito (HGF), monocina induzida por interferon-gama (MIG) e IL-12p40, discriminavam satisfatoriamente entre doenças malignas e benignas da tireoide (LINKOV et al., 2009). Kobawala et al. (2011) avaliou 32 pacientes com CT, 21 com bócio adenomatoso e 16 com doenças autoimunes, e observaram que os níveis de IL-8 e IFN-α estavam aumentados em pacientes com doenças malignas e benignas da tireoide quando comparados a controles. IL-8 estava particularmente aumentado em pacientes nos estágios avançados do câncer. Em mais um estudo avaliando um painel de citocinas, porém agora 17 citocinas em diferentes distúrbios tireoidianos (115 pacientes, dentre eles apenas 15 com CPT), os autores observaram que a concentração sérica de IL-1β permitia discriminar entre tireoidites atróficas e CPT (KAMMOUN-KRICHEN et al., 2012). Um outro estudo avaliando um
painel de 10 citocinas em 20 pacientes com CT e 38 com doenças benignas da tireoide, demonstrou que IL-6, IL-7, IL-10 e IL-13 apresentaram níveis séricos significativamente aumentados, enquanto IL-8 estava significativamente diminuída no pré-operatório em ambas doenças benignas e malignas da tireoide (PROVATOPOULOU et al., 2014).
Stanciu et al. (2015) avaliaram 80 pacientes com CPT e 40 pacientes com CPT e TH antes da radioiodoterapia e observaram níveis significativamente mais elevados de IL-4 e IL-10 em pacientes com CPT ou CPT associado a TH que apresentaram recorrência ou persistência da doença. Outro estudo também avaliou a influência da associação entre CPT e TH (12 pacientes com CPT apenas e 4 com CPT e TH) no perfil de citocinas, mas as citocinas foram mensuradas no sobrenadante da cultura das células do sangue periférico dos pacientes. Esse estudo mostrou que pacientes com essas duas doenças apresentavam níveis significativamente mais altos de IL-4, IL-6, IL-9, IL-13 e IFN-γ do que pacientes com CPT sem TH (ZIVANCEVIC-SIMONOVIC et al., 2015b). Os mesmos autores, em um outro estudo agora avaliando 13 indivíduos com CPT em comparação a controles, demonstraram que o sobrenadante da cultura de sangue periférico de pacientes com CPT tinha níveis significativamente mais elevados de IL-5, IL-13 e IL-9 que controles no pós-tireoidectomia. Enquanto que, a radioiodoterapia levou a produção significativamente reduzida de IL-4, IL-5 e IL-13 (ZIVANCEVIC-SIMONOVIC et al., 2015a). Já em 2016, esses autores avaliaram 22 pacientes com CPT e reportaram que a concentração de TGF-β1 no sobrenadante de cultura do sangue periférico de pacientes com CPT é significativamente mais baixa que os controles. Tal resultado não foi observado ao comparar essa mesma citocina no soro desses pacientes. Kobawala et
al. (2016) reportou que a análise da concentração sérica de IL-6 conseguiria discriminar
eficientemente os pacientes com CPT, doenças benignas e controles, em um estudo que avaliou 83 pacientes com CPT e 67 indivíduos com doenças benignas. Por fim, Li et al. (2017a) avaliou 50 pacientes com CPT e 20 pacientes com doença benigna, observando que os níveis séricos de IFN-γ e IL-35 estavam significativamente aumentados em pacientes com CPT e TH concomitante. Além disso, esse marcador estava associado a fatores de pior prognóstico do CPT. A maioria desses estudos foram realizados em um tamanho de amostra pequeno, de forma que, mais estudos avaliando o perfil de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias à nível sistêmico em amostras maiores e em
diferentes populações são necessários para verificar o potencial dessas moléculas como biomarcadores de diagnóstico e prognóstico e o possível envolvimento delas com a patogênese do CT.
2.4 A molécula imunomoduladora HLA-G e o seu envolvimento com o câncer
O HLA-G é uma molécula não-clássica do MHC (do inglês, major histocompatibility
complex) de classe I que foi inicialmente descrita como expressa de forma seletiva na
interface materno-fetal pelas células do citotrofoblasto, contribuindo para a tolerância materno-fetal. Apesar do HLA-G não ser expresso na maioria dos tecidos adultos, sua expressão ectópica tem sido vista em condições patológicas, tais como infecções virais, doenças autoimunes e em vários tipos de câncer. O HLA-G difere de outras moléculas clássicas do complexo HLA de classe I (-A, -B e -C) por apresentar limitada variabilidade, possuir 7 diferentes isoformas geradas por splicing alternativo de seu transcrito primário e ter expressão constitutiva restrita a alguns tecidos saudáveis como o trofoblasto, timo, pâncreas, córnea e precursores eritróides e endoteliais (DE FIGUEIREDO-FEITOSA et al., 2017; DONADI et al., 2011; NUNES et al., 2013).
Tanto as formas ligadas a membrana (HLA-G1, -G2, -G3 e G4) quanto as formas solúveis do HLA-G (HLA-G5, -G6 e G7), exercem uma função imunomoduladora e supressora em relação a imunidade inata e adquirida, através da interação com os receptores inibidores presentes na superfície de células efetoras do sistema imune, ILT-2, ILT-4 (conhecidos também como LIR-1 e LIR-ILT-2, LILRB-1 e LILRB-2 e CD85j e CD85d, respectivamente) e KIR2DL4 (conhecido também como CD158d). Essas interações levam a inibição das funções citotóxicas de células NK e linfócitos T CD8+, assim como também indução de um perfil tolerogênico em células apresentadoras de antígeno (APC) (DARDANO et al., 2012; REBMANN et al., 2016; ZILBERMAN et al., 2012). Além disso, HLA-G também induz a apoptose de linfócitos T CD8+ ativados, suprime a proliferação da célula T CD4+ e estimula a secreção de citocinas que conduzem a polarização para o padrão TH2 de resposta imune (DE FIGUEIREDO FEITOSA et al., 2014; KEMP et al., 2003).
A estrutura do HLA-G1 e HLA-G5 é constituída de uma cadeia pesada formada por três domínios (α1, α2 e α3), ligada de forma não-covalente à cadeia leve β2-microglobulina. Entretanto, a primeira molécula está ligada a membrana, enquanto a segunda é solúvel. As outras isoformas (-G2, -G3, -G4, -G6, -G7) não possuem um ou dois domínios α e não estão associadas a β2-microglobulina. Por fim, todas as isoformas possuem o domínio α1. As principais isoformas de HLA-G encontradas no plasma são a HLA-G1, que pode ser gerada por clivagem proteolítica da porção transmembrana, e a HLA-G5 secretada pela célula como isoforma solúvel (Figura 1). Os monócitos, macrófagos e células dendríticas são os principais produtores de sHLA-G em condições fisiológicas (CAROSELLA et al., 2008; DONADI et al., 2011; PISTOIA et al., 2007).
Figura 1 — Isoformas do HLA-G produzidas por splicing alternativo do transcrito primário. Fonte: Adaptado de Cell. Mol. Life Sci. (2011) 68:369–395.
Diversos fatores do microambiente podem estar implicados na indução de expressão da molécula HLA-G, como os polimorfismos nas regiões 3’UTR e 5’UTR do gene HLA-G, o estresse, a escassez de nutrientes, hormônios e o padrão de expressão de citocinas (CAROSELLA et al., 2008). As citocinas IL-10, IFNs, TNF-α, TGF-β por exemplo, estão associadas com o aumento da expressão de HLA-G em diferentes tipos celulares (ABEDIANKENARI; GHASEMI; KIM, 2011; AMIOT; VU; SAMSON, 2014a; CAROSELLA et al., 2008; GREGORI et al., 2010). Por outro lado, o HLA-G também pode modular a expressão de citocinas. A presença de HLA-G já foi associada a diminuição da expressão das citocinas do perfil de resposta TH1, como IL-2 e IFN-γ, porém aumento da expressão de IL-10, IL-13 e IL-4, que correspondem ao perfil TH2 (AGAUGUÉ;
CAROSELLA; ROUAS-FREISS, 2011; NAJI et al., 2014; PISTOIA et al., 2007). No entanto, alguns estudos sugerem que sHLA-G, ao contrário do HLA-G ligado à membrana, estimularia a produção de citocinas do perfil TH1, como IFN-γ e TNF-α (KANAI et al., 2001; VAN DER MEER et al., 2007).
A expressão anormal de HLA-G em diferentes tipos de câncer tem sido relacionada a uma estratégia adicional das células tumorais para evasão da resposta imune do hospedeiro (PISTOIA et al., 2007). As células tumorais podem expressar o HLA-G na superfície, secretá-lo ou incorporá-lo em pequenas vesículas extracelulares (exossomos) derivadas de sua membrana. O transporte de HLA-G através de exossomos constitui um interessante mecanismo de imunomodulação ao redor do tumor, uma vez que células NK ao adquirir essas vesículas, passam a expressar o HLA-G e comportam-se como células reguladoras capazes de inibir a atividade citotóxica de outras células NK (CAROSELLA et al., 2008). Dessa forma, a expressão de HLA-G é fator notável na resistência a resposta antitumoral e manutenção da sobrevivência de células tumorais.
Na literatura há estudos descrevendo que a expressão do HLA-G e a presença de polimorfismos que induzem sua expressão está associada ao CT e a variáveis clínico-histopatológicas indicativas de pior prognóstico (DARDANO et al., 2012; DE FIGUEIREDO-FEITOSA et al., 2017; DE FIGUEIREDO FEITOSA et al., 2014; NUNES et al., 2013). Por meio de imunohistoquímica, Nunes et al. (2013) demonstraram que a expressão de HLA-G no tecido tumoral de pacientes com CPT estava associada ao aumento de metástase para linfonodos regionais e invasão capsular. Figueiredo-Feitosa
et al. (2014) também avaliaram a expressão de HLA-G por imunohistoquímica, mas,
desta vez, compararam tecido tumoral tireoidiano maligno, benigno e tecido normal da tireoide. Eles mostraram que o tecido normal tireoidiano não expressava HLA-G, mas havia um aumento gradual na expressão de HLA-G de acordo com a severidade da alteração histológica, regiões de bócio hiperplásico apresentaram uma expressão fraca, lesões benignas tinham expressão intermediária e lesões malignas de carcinoma tireoidiano tinham alta expressão. Dardano et al. (2012) avaliaram a concentração plasmática de sHLA-G em pacientes com CPT, porém apenas após eles já terem passado pela tireoidectomia, pacientes com TH, assim como em controles, mostrando que indivíduos com sHLA-G detectável apresentavam um comportamento mais agressivo
da doença. Por fim, um estudo mais recente de Figueiredo-Feitosa et al. (2017) também corrobora o papel desfavorável do HLA-G no CT, revelando que a presença de polimorfismos na região 3’UTR do gene do HLA-G, implicados na regulação de sua expressão, estão associados aos carcinomas diferenciados da tireoide e variáveis indicativas de pior prognóstico. Portanto, assim como as citocinas inflamatórias, o HLA-G pode representar uma importante estratégia para auxílio de diagnóstico e prognóstico do CT.
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Investigar o HLA-G solúvel e um painel de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias como possíveis biomarcadores plasmáticos de diagnóstico e/ou prognóstico do CPT.
3.2 Objetivos específicos
• Comparar a concentração plasmática do HLA-G solúvel e das citocinas pré- e pós-tireoidectomia.
• Investigar uma possível correlação entre as diferentes moléculas analisadas nos plasmas dos pacientes com CPT pré- e pós-tireoidectomia.
• Comparar a concentração plasmática do HLA-G solúvel e das citocinas entre pacientes com CPT e controles.
• Investigar uma possível relação entre as características demográficas e clínico-histopatológicas do CPT com os níveis plasmáticos das moléculas analisadas. • Investigar a possível associação das moléculas analisadas com o tipo de resposta
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Comitê de Ética em Pesquisa
O presente estudo seguiu às diretrizes regulamentadas da pesquisa envolvendo seres humanos, que constam na resolução do Conselho Nacional de Saúde nº 196/96 e nº340/04. Este estudo faz parte de um projeto multicêntrico aprovado pelo edital PROCAD da CAPES, intitulado: “Contribuição de Moléculas Imunoregulatórias HLA-G, HLA-E, Foxp3, PD-1, IL-17 no Câncer: Polimorfismo Gênico, Perfil de Expressão de mRNAs, Regulação por miRNAS e Perfil da Resposta Imune em Ensaios de Atividade Antitumoral de Compostos”, EDITAL N° 071/2013 - PROGRAMA NACIONAL DE COOPERAÇÃO ACADÊMICA – PROCAD, com parecer consubstanciado emitido pelo comitê de ética em pesquisa através da Plataforma Brasil, que encaminhou o mesmo para apreciação do comitê de ética local. A coleta de espécimes clínicos foi iniciada após aprovação pelos comitês de ética locais, CAAE: 39856714.2.2007.5292 e 39856714.2.1001.5440. Os indivíduos selecionados foram informados sobre o protocolo de estudo e somente participaram aqueles que assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e responderam a um questionário.
4.2 Casuística
Neste estudo, foram incluídos oitenta e cinco indivíduos submetidos à tireoidectomia total por suspeita de malignidade e que tiveram diagnóstico de CPT confirmado após análise histopatológica, sendo trinta e quatro indivíduos oriundos do Hospital LIGA NORTE RIOGRANDENSE CONTRA O CÂNCER (LNRCC), Natal-RN. Cinquenta e um indivíduos oriundos do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRPUSP), Ribeirão Preto-SP, em colaboração com o Prof. Dr. Eduardo Antônio Donadi. Pacientes com precedente ou diagnóstico simultâneo de alguma outra neoplasia foram excluídos. Oitenta doadores de sangue oriundos do Hemocentro de Ribeirão Preto-SP foram incluídos como controles. Todos os controles não tinham diagnóstico prévio de
câncer e tiveram resultado negativo para a presença de anticorpos antiperoxidase (anti-TPO). Características clínicas de pacientes e controles foram obtidas através de questionários e registros nos prontuários hospitalares.
As análises citopatológicas e histopatológicas do tumor foram realizadas nos respectivos hospitais por médicos patologistas como parte da rotina clínica de seguimento dos pacientes. O estadiamento tumoral e estratificação dos pacientes com CPT foi baseado na 7ª edição do sistema de classificação e estadiamento TNM (SOBIN et al., 2009), recomendado pela UICC e AJCC, no qual há a determinação da extensão do tumor (T), comprometimento de linfonodos regionais (N) e metástase à distância (M) (Anexo A). Informações relacionadas à evolução pós-operatória dos pacientes foram colhidas nos prontuários hospitalares. A resposta dos pacientes ao tratamento foi avaliada por pelo menos 18 meses pós-tireodectomia e foi classificada de acordo com critérios apresentados no ANEXO B (MOMESSO; TUTTLE, 2014). Essa classificação determina que a resposta ao tratamento corresponde ao excelente quando não existe evidência clínica, bioquímica ou estrutural da presença de doença, enquanto que bioquímica e estrutural incompleta correspondem a presença de alterações bioquímica e estruturais relacionadas a doença. Indivíduos indeterminados estão relacionados a evidências inespecíficas que não podem ser classificados como excelentes ou bioquímica e estrutural incompleta, inspirando continuação mais frequente do acompanhamento.
Os pacientes com CPT tiveram 10 mL de sangue periférico colhido em tubos contendo anticoagulante EDTA para obtenção de plasma em dois momentos: antes da tireoidectomia (pré-tireoidectomia) e em média trinta dias após a cirurgia, no retorno ao ambulatório de cirurgia de cabeça e pescoço (pós-tireodectomia). Apenas uma única coleta de 5 mL de sangue periférico em tubo contendo anticoagulante EDTA foi realizada para obtenção de plasma dos controles. O sangue total foi centrifugado em duas etapas a 1000 xg por 10 min cada (4°C) para minimizar ao máximo a presença de células no plasma e então este foi armazenado a -80ºC até o momento das análises laboratoriais.
4.3 Determinação dos níveis plasmáticos de HLA-G solúvel
Os níveis plasmáticos da molécula sHLA-G foram determinados por meio do ensaio imunoenzimático ELISA (do inglês, enzyme-linked immunosorbent assay) realizado no Laboratório multiusuário de biologia molecular da FMRP/USP-RP, coordenado pelo professor Dr. Eduardo Antônio Donadi, utilizando um protocolo validado (REBMANN et al., 2005). Placas de poliestireno de 96 poços (Corning, Nova Iorque, USA) foram incubadas overnight com o anticorpo primário de captura MEM-G/9 (EXBIO, Vestec, Czechia), na diluição 1:100. Esse anticorpo reconhece as isoformas mais abundantes da molécula no plasma: sHLA-G1, isoforma originalmente de membrana, liberada por degradação proteolítica e sHLA-G5, isoforma solúvel. Após a etapa de bloqueio com diluente DAKO por duas horas, 50 μL de plasma de pacientes (pré- e pós-tireoidectomia) e de indivíduos controles foram transferidas para as placas e incubadas por duas horas. Os complexos sHLA-G/anticorpo anti-HLA-G imobilizados na placa foram detectados por meio do anticorpo secundário de coelho anti-humano β2-microglobulina (DAKO) na diluição 1:10.000. Após uma hora de incubação sob agitação, adicionou-se um anticorpo anti-coelho conjugado com peroxidase (DAKO ENVISION System HRP rabbit) por uma hora. Todas as etapas de incubação foram realizadas a temperatura ambiente. Cada passo foi seguido de quatro etapas de lavagem com um tampão específico contendo água, PBS 1X e 0,1% de Tween 20 (SIGMA, Saint Louis, Missouri, EUA). Finalmente, os poços foram incubados com o substrato tetrametilbenzidina (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine Liquid Substrate, Supersensitive, for ELISA – SIGMA, Saint Louis, Missouri, EUA) em sala escura por cerca de 20 minutos e a reação foi interrompida com adição de solução ácida. A absorbância resultante da formação de um produto amarelo foi mensurada por espectofotometria a 450 nm. As concentrações da molécula HLA-G no plasma foram determinadas utilizando-se uma curva de calibração padrão de cinco pontos (6.25-100 ng/mL) com quantidades conhecidas de HLA-G5. O HLA-G5, utilizado para a construção da curva de calibração, foi obtido de cultura celular de linhagem de melanoma (M8) transfectada com pcDNA contendo o gene HLA-G, de forma que a molécula HLA-G5 é liberada no sobrenadante. Os testes foram realizados em duplicata e os resultados expressos em ng/ml. Como controle negativo, utilizou-se
sobrenadante de células M8 transfectadas com pcDNA vazio. Quando abaixo do limite detectável, o resultado foi considerado 0 ng/mL.
4.4 Determinação da concentração plasmática de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias
As citocinas pró- e anti-inflamatórias analisadas foram escolhidas com base no conhecimento da fisiopatologia da malignidade e alguns marcadores já relatados na literatura. A concentração plasmática de todas as citocinas foi mensurada no Laboratório multiusuário de biologia molecular da FMRP/USP-RP, utilizando o kit BD Cytometric Bead
Array (CBA) Human Soluble Protein Flex Set System (BD Biosciences, San Diego, CA)
de acordo com as instruções do fabricante. Um ensaio multiplex foi montado para a quantificação simultânea das seguintes citocinas: IFN-γ, TNF, IL-12p70, IL-1α, IL-4, IL-5, IL-13, IL-10, IL-17A, IL-1β, IL-6. Além disso, as citocinas IFN-α e TGF-β1 também foram quantificadas em ensaios single-plex. A fluorescência produzida pelo sistema CBA foi mensurada em citômetro de fluxo FACSCanto I e analisada usando o software FCAP Array (BD Biosciences).Os limites de detecção para essas citocinas são 1.5 pg/mL para IFN-α, 2.3 pg/mL para IL-1β, 1.1 pg/mL para IL-5, 0.6 pg/mL para IL-12p70, 1.4 pg/mL para IL-4, 1.0 pg/mL para IL-1α, 0.6 pg/mL IL-13, 1.6 pg/mL para IL-6, 1.2 pg/mL para TNF, 0.3 pg/mL IL-17A, 0.13 pg/mL para IL-10, 0.8 para IFN-γ e 14.9 pg/ml para TGF-β1. Quando a concentração da citocina estiva abaixo do limite de detecção, esta foi considerada 0 pg/mL.
4.5 Análise estatística
O programa Statistical Package for the Social Science v. 20.0 (SPSS Inc., Illinois, EUA) foi utilizado para a análise estatística. As variáveis categóricas foram apresentadas em frequências relativas e absolutas, enquanto que, as variáveis contínuas por apresentarem uma distribuição assimétrica foram apresentadas como mediana e intervalo interquartil. O teste não-paramétrico de Wilcoxon foi utilizado para a
comparação pareada dos níveis plasmáticos pré- e pós-tireoidectomia de citocinas e de sHLA-G dos pacientes com CPT. A correlação de Spearman foi adotada para verificar a existência de correlação entre as diferentes moléculas mensuradas pré- e pós-tireoidectomia. Os coeficientes de 0,3 a 0,5 foram considerados como baixa correlação, 0,5 até 0,7 moderados e acima de 0,7 alta correlação (MUKAKA, 2012). Os valores de p inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
O teste de Mann-Whitney foi utilizado para comparar os níveis plasmáticos de citocinas e sHLA-G entre pacientes e controles, em uma abordagem univariada. O mesmo foi realizado para analisar a associação de tais moléculas com variáveis clínicas e histopatológicas, e resposta ao tratamento dos pacientes com CPT.Resultados cujos valores de p foram inferiores a 0,15 foram considerados elegíveis para análise multivariada através de regressão logística múltipla, a fim de evidenciar o potencial dessas moléculas em diferenciar pacientes de controles, assim como também verificar associações independentes com características histopatológicas e a resposta ao tratamento (p < 0,05). Nos modelos multivariados investigou-se a presença de valores padronizados excedendo 3 desvios padrão.
A análise de curva ROC (do inglês, Receiver Operating Characteristic) foi realizada a partir dos achados nas análises multivariadas em uma ferramenta online baseada na linguagem R - EasyROC: a web-tool for ROC curve analysis (versão. 1.3) (GOKSULUK et al., 2016). O teste se baseia nos princípios de sensibilidade e especificidade para mensurar a performance de um teste diagnóstico e prognóstico, investigando a sua capacidade de distinguir pacientes de indivíduos controles e pacientes que respondem ou não ao tratamento, respectivamente. A área sob a curva (do inglês, Area under the
curve - AUC) é a medida do desempenho do teste, que pode ter valor de 0 a 1. Quanto
mais próximo for esse valor de 1, melhor a performance do teste, de forma que um teste ideal é aquele cuja AUC é igual a 1 (PARK; GOO; JO, 2004). Testes cujos valores de AUC são abaixo de 0.5 são considerados incapazes de distinguir os grupos. O ponto de corte (também chamado de ponto do cut-off) é o ponto que separa as duas populações, fornecendo o diagnóstico/prognóstico (UNAL, 2017). Para a determinação do ponto do
cut-off nos níveis plasmáticos das moléculas, o índice de Youden foi adotado (YOUDEN,
5 RESULTADOS
5.1 Características demográficas e clínico-histopatológicas
Um total de 85 pacientes com CPT tiveram o plasma pré-tireoidectomia analisado neste estudo, mas 8 desses pacientes não compareceram a coleta pós-tireoidectomia, de forma que, as análises pós-tireoidectomia foram realizadas em apenas 77 desses pacientes. A média etária dos pacientes com CPT foi de 48 ± 15 anos (máxima de 80 anos e mínima de 16 anos), enquanto que os controles tinham média de 34 ± 11 anos (máxima de 64 anos e mínima de 18 anos). O grupo de pacientes CPT consistiu de 75 mulheres e 10 homens, enquanto o grupo de controles consistiu de 65 mulheres e 15 homens. Não houve diferença na distribuição de gênero entre os grupos estudados (p = 0,211), contudo o grupo de indivíduos controles é composto por uma população em média mais jovem do que o grupo de indivíduos com CPT (p < 0,001). As características clínico-histopatológicas e de resposta ao tratamento dos pacientes com CPT estão resumidas na Tabela 1. De acordo com o sistema de estadiamento TNM, 50 pacientes com CPT foram estratificados em estágios iniciais (I e II) e 35 pacientes em estágios avançados (III e IV) neste estudo. Após acompanhamento da evolução clínica dos pacientes, foi possível classificar a situação de resposta ao tratamento de apenas 55 pacientes com CPT. Os demais pacientes ainda necessitavam de mais avaliações e exames para estabelecer uma conclusão sobre o caso.
Tabela 1 — Descrição das características dos pacientes com CPT incluídos no estudo
Pacientes com CPT N = 85
N %
Estadiamento TNMa Estágios iniciais (I e II) Estágios avançados (III e IV)
50 35 58,8 41,2 Tamanho do tumor ≤ 2 cm > 2 cm 57 28 67,1 32,9 Variante histológica Clássica Folicular Clássica e folicular Outrosb 49 15 7 14 57,6 17,6 8,3 16,5 Extensão extratireoidiana Sim Não 36 49 42,4 57,6 Invasãoc Sim Não 23 62 27,1 72,9 Multicentricidade Sim Não 35 50 41,2 58,8 Linfonodos metastáticosd Sim Não 25 60 29,4 70,6 Tireoidite de Hashimoto Sim Não 26 59 30,6 69,4 Resposta ao tratamentoe Excelente 23 25,9 Indeterminada 18 22,3 Bioquímica incompleta 10 11,8 Estrutural incompleta 4 4,7 Desconhecidaf 30 35,3
a Estabelecido ao diagnóstico inicial para todos os pacientes. Classificação de acordo com Sobin et al,
2009. TNM, T - tamanho do tumor, N - metástase para linfonodos, M - metástase distante
b Oxifílica e subtipos mistos
c Angiolinfática, vascular, capsular e perineural d Metástase apresentada ao diagnóstico inicial e Classificados de acordo com Momesso et al., 2014
