4.1 Comitê de Ética em Pesquisa
O presente estudo seguiu às diretrizes regulamentadas da pesquisa envolvendo seres humanos, que constam na resolução do Conselho Nacional de Saúde nº 196/96 e nº340/04. Este estudo faz parte de um projeto multicêntrico aprovado pelo edital PROCAD da CAPES, intitulado: “Contribuição de Moléculas Imunoregulatórias HLA-G, HLA-E, Foxp3, PD-1, IL-17 no Câncer: Polimorfismo Gênico, Perfil de Expressão de mRNAs, Regulação por miRNAS e Perfil da Resposta Imune em Ensaios de Atividade Antitumoral de Compostos”, EDITAL N° 071/2013 - PROGRAMA NACIONAL DE COOPERAÇÃO ACADÊMICA – PROCAD, com parecer consubstanciado emitido pelo comitê de ética em pesquisa através da Plataforma Brasil, que encaminhou o mesmo para apreciação do comitê de ética local. A coleta de espécimes clínicos foi iniciada após aprovação pelos comitês de ética locais, CAAE: 39856714.2.2007.5292 e 39856714.2.1001.5440. Os indivíduos selecionados foram informados sobre o protocolo de estudo e somente participaram aqueles que assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e responderam a um questionário.
4.2 Casuística
Neste estudo, foram incluídos oitenta e cinco indivíduos submetidos à tireoidectomia total por suspeita de malignidade e que tiveram diagnóstico de CPT confirmado após análise histopatológica, sendo trinta e quatro indivíduos oriundos do Hospital LIGA NORTE RIOGRANDENSE CONTRA O CÂNCER (LNRCC), Natal-RN. Cinquenta e um indivíduos oriundos do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRPUSP), Ribeirão Preto-SP, em colaboração com o Prof. Dr. Eduardo Antônio Donadi. Pacientes com precedente ou diagnóstico simultâneo de alguma outra neoplasia foram excluídos. Oitenta doadores de sangue oriundos do Hemocentro de Ribeirão Preto- SP foram incluídos como controles. Todos os controles não tinham diagnóstico prévio de
câncer e tiveram resultado negativo para a presença de anticorpos antiperoxidase (anti- TPO). Características clínicas de pacientes e controles foram obtidas através de questionários e registros nos prontuários hospitalares.
As análises citopatológicas e histopatológicas do tumor foram realizadas nos respectivos hospitais por médicos patologistas como parte da rotina clínica de seguimento dos pacientes. O estadiamento tumoral e estratificação dos pacientes com CPT foi baseado na 7ª edição do sistema de classificação e estadiamento TNM (SOBIN et al., 2009), recomendado pela UICC e AJCC, no qual há a determinação da extensão do tumor (T), comprometimento de linfonodos regionais (N) e metástase à distância (M) (Anexo A). Informações relacionadas à evolução pós-operatória dos pacientes foram colhidas nos prontuários hospitalares. A resposta dos pacientes ao tratamento foi avaliada por pelo menos 18 meses pós-tireodectomia e foi classificada de acordo com critérios apresentados no ANEXO B (MOMESSO; TUTTLE, 2014). Essa classificação determina que a resposta ao tratamento corresponde ao excelente quando não existe evidência clínica, bioquímica ou estrutural da presença de doença, enquanto que bioquímica e estrutural incompleta correspondem a presença de alterações bioquímica e estruturais relacionadas a doença. Indivíduos indeterminados estão relacionados a evidências inespecíficas que não podem ser classificados como excelentes ou bioquímica e estrutural incompleta, inspirando continuação mais frequente do acompanhamento.
Os pacientes com CPT tiveram 10 mL de sangue periférico colhido em tubos contendo anticoagulante EDTA para obtenção de plasma em dois momentos: antes da tireoidectomia (pré-tireoidectomia) e em média trinta dias após a cirurgia, no retorno ao ambulatório de cirurgia de cabeça e pescoço (pós-tireodectomia). Apenas uma única coleta de 5 mL de sangue periférico em tubo contendo anticoagulante EDTA foi realizada para obtenção de plasma dos controles. O sangue total foi centrifugado em duas etapas a 1000 xg por 10 min cada (4°C) para minimizar ao máximo a presença de células no plasma e então este foi armazenado a -80ºC até o momento das análises laboratoriais.
4.3 Determinação dos níveis plasmáticos de HLA-G solúvel
Os níveis plasmáticos da molécula sHLA-G foram determinados por meio do ensaio imunoenzimático ELISA (do inglês, enzyme-linked immunosorbent assay) realizado no Laboratório multiusuário de biologia molecular da FMRP/USP-RP, coordenado pelo professor Dr. Eduardo Antônio Donadi, utilizando um protocolo validado (REBMANN et al., 2005). Placas de poliestireno de 96 poços (Corning, Nova Iorque, USA) foram incubadas overnight com o anticorpo primário de captura MEM-G/9 (EXBIO, Vestec, Czechia), na diluição 1:100. Esse anticorpo reconhece as isoformas mais abundantes da molécula no plasma: sHLA-G1, isoforma originalmente de membrana, liberada por degradação proteolítica e sHLA-G5, isoforma solúvel. Após a etapa de bloqueio com diluente DAKO por duas horas, 50 μL de plasma de pacientes (pré- e pós- tireoidectomia) e de indivíduos controles foram transferidas para as placas e incubadas por duas horas. Os complexos sHLA-G/anticorpo anti-HLA-G imobilizados na placa foram detectados por meio do anticorpo secundário de coelho anti-humano β2-microglobulina (DAKO) na diluição 1:10.000. Após uma hora de incubação sob agitação, adicionou-se um anticorpo anti-coelho conjugado com peroxidase (DAKO ENVISION System HRP rabbit) por uma hora. Todas as etapas de incubação foram realizadas a temperatura ambiente. Cada passo foi seguido de quatro etapas de lavagem com um tampão específico contendo água, PBS 1X e 0,1% de Tween 20 (SIGMA, Saint Louis, Missouri, EUA). Finalmente, os poços foram incubados com o substrato tetrametilbenzidina (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine Liquid Substrate, Supersensitive, for ELISA – SIGMA, Saint Louis, Missouri, EUA) em sala escura por cerca de 20 minutos e a reação foi interrompida com adição de solução ácida. A absorbância resultante da formação de um produto amarelo foi mensurada por espectofotometria a 450 nm. As concentrações da molécula HLA-G no plasma foram determinadas utilizando-se uma curva de calibração padrão de cinco pontos (6.25-100 ng/mL) com quantidades conhecidas de HLA-G5. O HLA-G5, utilizado para a construção da curva de calibração, foi obtido de cultura celular de linhagem de melanoma (M8) transfectada com pcDNA contendo o gene HLA-G, de forma que a molécula HLA-G5 é liberada no sobrenadante. Os testes foram realizados em duplicata e os resultados expressos em ng/ml. Como controle negativo, utilizou-se
sobrenadante de células M8 transfectadas com pcDNA vazio. Quando abaixo do limite detectável, o resultado foi considerado 0 ng/mL.
4.4 Determinação da concentração plasmática de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias
As citocinas pró- e anti-inflamatórias analisadas foram escolhidas com base no conhecimento da fisiopatologia da malignidade e alguns marcadores já relatados na literatura. A concentração plasmática de todas as citocinas foi mensurada no Laboratório multiusuário de biologia molecular da FMRP/USP-RP, utilizando o kit BD Cytometric Bead
Array (CBA) Human Soluble Protein Flex Set System (BD Biosciences, San Diego, CA)
de acordo com as instruções do fabricante. Um ensaio multiplex foi montado para a quantificação simultânea das seguintes citocinas: IFN-γ, TNF, IL-12p70, IL-1α, IL-4, IL-5, IL-13, IL-10, IL-17A, IL-1β, IL-6. Além disso, as citocinas IFN-α e TGF-β1 também foram quantificadas em ensaios single-plex. A fluorescência produzida pelo sistema CBA foi mensurada em citômetro de fluxo FACSCanto I e analisada usando o software FCAP Array (BD Biosciences).Os limites de detecção para essas citocinas são 1.5 pg/mL para IFN-α, 2.3 pg/mL para IL-1β, 1.1 pg/mL para IL-5, 0.6 pg/mL para IL-12p70, 1.4 pg/mL para IL-4, 1.0 pg/mL para IL-1α, 0.6 pg/mL IL-13, 1.6 pg/mL para IL-6, 1.2 pg/mL para TNF, 0.3 pg/mL IL-17A, 0.13 pg/mL para IL-10, 0.8 para IFN-γ e 14.9 pg/ml para TGF-β1. Quando a concentração da citocina estiva abaixo do limite de detecção, esta foi considerada 0 pg/mL.
4.5 Análise estatística
O programa Statistical Package for the Social Science v. 20.0 (SPSS Inc., Illinois, EUA) foi utilizado para a análise estatística. As variáveis categóricas foram apresentadas em frequências relativas e absolutas, enquanto que, as variáveis contínuas por apresentarem uma distribuição assimétrica foram apresentadas como mediana e intervalo interquartil. O teste não-paramétrico de Wilcoxon foi utilizado para a
comparação pareada dos níveis plasmáticos pré- e pós-tireoidectomia de citocinas e de sHLA-G dos pacientes com CPT. A correlação de Spearman foi adotada para verificar a existência de correlação entre as diferentes moléculas mensuradas pré- e pós- tireoidectomia. Os coeficientes de 0,3 a 0,5 foram considerados como baixa correlação, 0,5 até 0,7 moderados e acima de 0,7 alta correlação (MUKAKA, 2012). Os valores de p inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
O teste de Mann-Whitney foi utilizado para comparar os níveis plasmáticos de citocinas e sHLA-G entre pacientes e controles, em uma abordagem univariada. O mesmo foi realizado para analisar a associação de tais moléculas com variáveis clínicas e histopatológicas, e resposta ao tratamento dos pacientes com CPT.Resultados cujos valores de p foram inferiores a 0,15 foram considerados elegíveis para análise multivariada através de regressão logística múltipla, a fim de evidenciar o potencial dessas moléculas em diferenciar pacientes de controles, assim como também verificar associações independentes com características histopatológicas e a resposta ao tratamento (p < 0,05). Nos modelos multivariados investigou-se a presença de valores padronizados excedendo 3 desvios padrão.
A análise de curva ROC (do inglês, Receiver Operating Characteristic) foi realizada a partir dos achados nas análises multivariadas em uma ferramenta online baseada na linguagem R - EasyROC: a web-tool for ROC curve analysis (versão. 1.3) (GOKSULUK et al., 2016). O teste se baseia nos princípios de sensibilidade e especificidade para mensurar a performance de um teste diagnóstico e prognóstico, investigando a sua capacidade de distinguir pacientes de indivíduos controles e pacientes que respondem ou não ao tratamento, respectivamente. A área sob a curva (do inglês, Area under the
curve - AUC) é a medida do desempenho do teste, que pode ter valor de 0 a 1. Quanto
mais próximo for esse valor de 1, melhor a performance do teste, de forma que um teste ideal é aquele cuja AUC é igual a 1 (PARK; GOO; JO, 2004). Testes cujos valores de AUC são abaixo de 0.5 são considerados incapazes de distinguir os grupos. O ponto de corte (também chamado de ponto do cut-off) é o ponto que separa as duas populações, fornecendo o diagnóstico/prognóstico (UNAL, 2017). Para a determinação do ponto do
cut-off nos níveis plasmáticos das moléculas, o índice de Youden foi adotado (YOUDEN,