UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MECICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
FRANCISCO BRUNO COSTA CEPP
DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO DE
TRANSTORNO BIPOLAR A PARTIR DE FATORES
AMBIENTAIS
FORTALEZA-CE 2019
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MECICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
FRANCISCO BRUNO COSTA CEPP
DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO DE
TRANSTORNO BIPOLAR A PARTIR DE FATORES
AMBIENTAIS
Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, da Universidade Federal do Ceará, como parte dos requisitos para obtenção do título de
Doutor em Farmacologia. Área de
concentração: Farmacologia.
Orientadora: Profª. Drª. Geanne Matos de Andrade
FORTALEZA-CE 2019
FRANCISCO BRUNO COSTA CEPP
DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO DE TRANSTORNO BIPOLAR A PARTIR DE FATORES AMBIENTAIS
Tese de doutorado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Farmacologia, da
Universidade Federal do Ceará, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Farmacologia. Área de concentração: Farmacologia.
Orientadora: Profª. Drª. Geanne Matos de Andrade
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________ Prof.ª Dr.ª Geanne Matos de Andrade (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
______________________________________________ Prof.ª Dr.ª Danielle Macêdo Gaspar
Universidade Federal do Ceará (UFC)
______________________________________________ Prof.ª Dr.ª Adriane Ribeiro Rosa
Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) ______________________________________________
Prof.º Dr.º José Eduardo Ribeiro Honório Júnior Unichristus
______________________________________________ Prof.º Dr.º João Ilo Coelho Barbosa
Universidade Federal do Ceará (UFC)
AGRADECIMENTOS
Agradeço a meus pais pela boa formação!
À profª Geanne pelo acolhimento a um outsider, mas principalmente pela paciência.
À profª Danielle pelas discussões e prontidão em atender minhas questões.
Aos professores da banca pela disponibilidade e contribuição intelectual.
Aos professores do programa de Farmacologia pela complementação de minha
formação acadêmica. Assim como, àqueles por quem já passei.
Aos amigos e companheiros de dentro ou fora do programa, antigos ou novos, próximos
ou distantes, que contribuíram com suporte operacional ou emocional.
Aos alunos pela compreensão diante das adversidades da profissão.
Por fim, mesmo não agradecendo um tanto quanto particularmente ou especificamente...
agradeço aos outros, para não ser injusto...
DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO DE TRANSTORNO BIPOLAR A PARTIR DE FATORES AMBIENTAIS
RESUMO
Transtornos mentais, especificamente o transtorno bipolar, representa um problema de saúde no mundo desde o início do século. Os modelos animais para transtorno bipolar têm induzido isoladamente os endofenótipos de mania e depressão. Com o objetivo de fornecer um modelo com fenótipo misto de mania e depressão, combinou-se dois modelos ambientais: privação de sono paradoxal (PSP), para fenótipo maníaco, e exposição inescapável a jato de ar quente (JAQ), para fenótipo depressivo. O delineamento experimental consistiu em duas fases: fase I (indução de estresse) e fase II (avaliação de efeito comportamental). O grupo Controle (N = 10) foi mantido apenas sob as condições de habitação-padrão durante as duas fases. No grupo PSP (N = 10), os animais foram expostos na Fase I a cinco sessões de privação de sono paradoxal (PSP) intercaladas diariamente durante dez dias. No grupo JAQ (N = 10), os animais foram expostos na Fase I a cinco sessões de jato de ar quente (JAQ) intercaladas diariamente durante dez dias. No grupo PSP+JAQ (N = 10), os animais foram expostos na Fase I por 10 dias a sessões de PSP e JAQ intercaladas entre si diariamente. Na Fase II, interrompeu-se as contingências indutoras, a fim de verificar os seus efeitos comportamentais. Dois testes comportamentais foram realizados: i) campo aberto para avaliar parâmetros locomotores, emocionais e de impulsividade; e ii) sensibilidade à estímulo apetitivo, a fim de avaliar a função motivacional de recompensa. Para sondar a fisiopatologia, foram realizados em amostras de hipocampo e córtex pré-frontal teste bioquímico e molecular para dano oxidativo, assim como quantificação de transportador de dopamina por imunoblotting. De acordo com os resultados, a exposição crônica dos animais aos estressores ambientais, isolados ou combinados (JAQ e/ou PSP), induziu alterações comportamentais pós-estresse semelhantes a alguns endofenótipos de transtornos de humor, com os estressores combinados (PSP+JAQ) especificamente induzindo um endofenótipo similar ao transtorno bipolar. Quanto aos testes biológicos, houve evidência de dano oxidativo no hipocampo e de aumento de expressão de transportador de dopamina no córtex pré-frontal dos animais submetidos a PSP+JAQ. A partir disso, um provável mecanismo neuroquímico, que explicaria a desregulação do sistema dopaminérgico poderia envolver o prejuízo da conexão córtico-límbica e do controle cortical sobre o sistema de recompensa, levando à alteração da sensibilidade comportamental a recompensas e corroborando uma hipótese motivacional/emocional do transtorno bipolar.
Palavras-chaves: modelo animal; estresse ambiental; privação de sono paradoxal; jato
DEVELOPING A BIPOLAR DISORDER MODEL FROM ENVIRONMENTAL FACTORS
ABSTRACT
Mental disorders, particularly bipolar disorder, is a health problem in the world since the beginning of this century. Animal models for bipolar disorder separately have induced endophenotypes of mania and depression. Two environmental models were combined to provide a model with a mixed phenotype of mania and depression: paradoxical sleep deprivation (PSD), for manic phenotype, and inescapable exposure to hot air blast (HAB), for depressive phenotype. The experimental design consisted of two phases: phase I (stress induction) and phase II (evaluation of behavioral effect). The Control group (N = 10) was maintained only under the standard housing conditions during the two phases. In PSP group (N = 10), animals in Phase I were exposed to five sessions paradoxical sleep deprivation (PSP) interspersed daily for ten days. In JAQ group (N = 10), animals in Phase I were exposed to five hot air jet sessions (JAQ) interspersed daily for ten days. In PSP + JAQ group (N = 10), the animals were exposed in Phase I for 10 days to PSP and JAQ sessions intercalated with each other daily. In Phase II, the inductive contingencies were interrupted in order to verify their behavioral effects. Two behavioral tests were performed: i) open field to evaluate locomotor, emotional and impulsivity parameters; and ii) sensitivity to appetitive stimulus, in order to evaluate the reward motivational function. To probe the pathophysiology, biochemical and molecular tests for oxidative damage were performed in hippocampus and pre-frontal cortex samples, as well as quantification of dopamine transporter by immunoblotting. According to the results, the chronic exposure of the animals to environmental stressors, isolated or combined (HAB and / or PSD), induced post-stress behavioral changes similar to some mood disorder endophenotypes with the combined stressors (PSD+HAB) specifically inducing an endophenotype similar to bipolar disorder. Regarding biological tests, there was evidence of oxidative damage in the hippocampus and increased expression of dopamine transporter in the prefrontal cortex of animals submitted to PSD+HAB. From this, a probable neurochemical mechanism that would explain the deregulation of the dopaminergic system could involve the loss of the cortico-limbic connection and the cortical control over the reward system, leading to the alteration of the behavioral sensitivity to rewards and corroborating a motivational/emotional hypothesis of bipolar disorder.
Keywords: animal model; environmental stress; paradoxical sleep deprivation; hot air
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Desenho Experimental...16
Figura 2 - Frequência de crossing...21
Figura 3 - Frequência de rearing...21
Figura 4 - Tempo de engajamento em respostas de self-grooming...22
Figura 5 - Tempo de permanência apenas nos cantos da arena...22
Figura 6 - Quantidade de bolos fecais depositados na arena...23
Figura 7. Frequência de entradas no quadrante central...23
Figura 8. Consumo de estímulo apetitivo e não apetitivo...24
Figura 9. Análise de estresse oxidativo...25
Figura 10. Expressão protéica por imunoblotting de transportador de dopamina (DAT) no hipocampo e córtex pré-frontal...26
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA Análise de variância BSA Albumina sérica bovina CA Campo aberto
CON Controle
DAT Transportador de dopamina HPA Hipotálamo-pituitária-adrenal JAQ Jato de ar quente
MIA Ativação imune materna PSP Privação de sono paradoxal PVDF Difloureto de polivinildieno TB Transtorno Bipolar
TBST Tampão salina Tris-hcl suplementado TS Teste de sensibilidade a estímulo apetitivo ROS Espécies reativas ao oxigênio
SDS Dodecil sulfato de sódio SOD Superóxido dismutase VTA Área tegmental ventral
SUMÁRIO INTRODUÇÃO...11 OBJETIVOS...16 Objetivos específicos...16 MÉTODO...17 Animais...17 Aparato e Materiais...17 Delineamento...17
Jato de Ar Quente (JAQ) – indução de depressão...18
Privação de Sono Paradoxal (PSP) – indução de mania...19
Campo Aberto...19
Teste de sensibilidade a estímulo apetitivo...19
Dissecação...19
Dosagem de substâncias reativas ao Nitrito...20
Determinação dos marcadores DAT e SOD por imunoblotting...20
ANÁLISE ESTATÍSTICA...22
RESULTADOS...23
Avaliação da atividade locomotora e exploratória...23
Avaliação de parâmetros comportamentais de ansiedade...23
Avaliação da impulsividade...25
Avaliação da sensibilidade à recompensa...26
Análise de estresse oxidativo...26
Expressão protéica por imunoblotting de transportador de dopamina (DAT) no hipocampo e córtex pré-frontal...28
DISCUSSÃO...29
CONCLUSÃO...34
INTRODUÇÃO
Transtornos psiquiátricos, juntamente com doenças neurológicas e de uso de substâncias, representam um conjunto significativo de problemas de saúde no mundo desde o início deste século (WHO, 2008). Mesmo em países desenvolvidos, nos quais há elevadas taxas de tratamento, geralmente tais distúrbios são tratados após anos desde o início da sintomatologia (WANG et al., 2007). Em 2010, transtornos mentais representaram a principal causa de anos vividos com uma incapacidade e, juntamente com uso de substâncias, a quinta causa principal de anos de vida ajustados por incapacidade (WHITEFORD et al., 2013). Além disso, transtornos mentais também representaram, no relatório mundial desse mesmo ano, a maior proporção de anos de vida ajustados por incapacidade dentre várias doenças do cérebro (WHITEFORD et al., 2015). O Transtorno Bipolar - TB têm prevalência estimada em cerca de 1% da população mundial, podendo chegar a 5% (AKISKAL et al, 2000). Especificamente, embora o TB não evidencie números alarmantes de anos perdidos por mortalidade prematura, o envelhecimento e aumento da população mundial têm elevado os anos vividos com essa incapacidade, chegando a um aumento de quase cinquenta por cento dos casos entre 1990 e 2013 (FERRARI et al., 2016). Portanto, a progressiva incidência do transtorno bipolar, a qual conduz a um aumento dos anos vividos com incapacidade, justifica o investimento em pesquisas pré-clínicas que mimetizam sua condição crônica por meio de evidências biológicas, cognitivas e comportamentais.
A partir de 2013, o critério diagnóstico aplicado a transtornos mentais mudou de uma perspectiva multiaxial para uma abordagem dimensional, tornando-se mais sensível aos endofenótipos compartilhados entre vários transtornos (APA, 2013). Aparentemente, isso pode ter facilitado a construção de modelos animais que focam nesses endofenótipos. No caso do transtorno bipolar, o quadro clínico é complexo e envolve episódios de mania (e.g., euforia, hiperatividade, distúrbio do sono, impulsividade e déficits cognitivos), hipomania ou eutimia (humor regulado) alternados a estados depressivos (e.g., disforia, fadiga, insônia e redução da capacidade cognitiva). No entanto, o endofenótipo comportamental mais investigado em modelos pré-clínicos com roedores tem sido o nível de atividade (i.e., hiperatividade), focando principalmente no episódio maníaco (MALKESMAN et al., 2009).
Sintomas em pacientes são amplos e variáveis, alguns aparentemente não manifestáveis pelos animais usados nos modelos, como sentimento de culpa e excesso de confiança. Além disso, tem sido quase impossível reproduzir a natureza cíclica
(EINAT, 2014), sendo os episódios investigados e reproduzidos separadamente (van ENKHUIZEN et al., 2015). De acordo com BEYER & FREUND (2017), os modelos animais para transtorno bipolar tem reproduzido endofenótipos relacionados a processos do ritmo circadiano, de neurotransmissão (principalmente dopaminérgica), do sistema imune e de estresse. E defendem que modelos em desenvolvimento devem: i) ser específicos para os sintomas do bipolar; ii) considerar a natureza cíclica do fenômeno; iii) demonstrar a troca espontânea entre episódios; iv) responder a tratamentos disponíveis, considerando a variação na responsividade; v) estabelecer uma linha de base para possibilitar uma análise intra-sujeito; vi) apresentar sensibilidade a fatores genéticos, ambientais e farmacológicos similares ao quadro clínico humano.
Sintomas de transtorno bipolar correlacionam-se com perturbações do ritmo circadiano e com polimorfismos do gene-Clock (BENEDETTI et al., 2003; SERRETTI
et al., 2003). Dois modelos transgênicos tem se mostrado promissores: camundongos knock-down para expressão de Clock na área tegmental ventral do mesencéfalo (VTA) e knock-out (ko) para Dbp-proteína de ligação a elemento albumina, um fator de
transcrição regulado pela Clock. Animais knock-down para Clock manifestam estados mistos a depender da fase claro/escuro e aumento da liberação de dopamina na VTA (MUKHERJEE et al., 2010). Já animais ko para Dbp mostram troca de fenótipo depressivo para maníaco quando submetidos a estresse ambiental (LE-NICULESCU et
al., 2008). No entanto, como mudanças das estações e a duração do fotoperíodo podem
desencadear alterações no humor, modelos com maior validade ecológica (i.e., idiossincráticos) por meio da manipulação da duração do dia tem sido construídos (DULCIS et al., 2013).
Modelos animais que envolvem sensibilização de sistemas de neurotransmissão são eminentemente farmacológicos, nos quais há administração de psicoestimulantes para simular o estado maníaco (SHARMA et al., 2016). Embora tais modelos geralmente investiguem um único endofenótipo (e.g., hiperatividade) e não sejam bipolar-específicos, a elucidação do papel da transmissão dopaminérgica tem sido crucial, pelo seu papel na motivação, sensação de prazer, impulsividade e cognição. De acordo com a hipótese dopaminérgica, o mecanismo cíclico ocorreria pela hiperdopaminergia na mania subregulada neurofisiologicamente para um estado de hipodopaminergia prevalente no episódio depressivo, que por sua vez seria sobreregulado novamente para mania hiperdopaminérgica (BERK et al., 2007). Acrescentam-se ainda, modelos knock-down para transportador de dopamina - DAT
(YOUNG et al., 2011), o qual carece de validade externa (BEYER & FREUND, 2017), e o promissor modelo com vetor viral, que demonstra uma troca de fenótipo induzida por meio da manipulação direta do sistema dopaminérgico no córtex pré-frontal medial (FREUND et al., 2016).
Estudos longitudinais e revisões apontam para relação entre respostas inflamatórias e ocorrência de transtorno bipolar (MODABBERNIA et al., 2013; PARBOOSING et al., 2013; PATEL & FREY, 2015). Nesse contexto, foram criados modelos animais de ativação imune materna (MIA) por moléculas que simulam infecção viral ou bacteriana, acarretando em prejuízos comportamentais, cognitivos, sócio-cognitivos e neurobiológicos na prole (DE COSSÍO et al., 2017; ROSE et al., 2017; ZUCKERMAN et al., 2003). Contudo, tem sido modelos selecionados para estudar endofenótipos relacionados a outros transtornos (e.g., esquizofrenia e autismo) sem direcionamentos para o transtorno bipolar (BEYER & FREUND, 2017; KNEELAND & FATEMI, 2013).
A partir de evidências clínicas, o estresse oxidativo tem sido relacionado à patogênese de transtornos afetivos, com estabilizadores do humor e antidepressivos apresentando propriedades antioxidantes (BEHR et al, 2012). Em adição a esse processo fisiopatológico, há evidências de que no TB enzimas antioxidantes apresentem maior atividade devido a prováveis disfunções mitocondriais (ANDREAZZA et al, 2008). Logo, o desequilíbrio entre espécies reativas ao oxigênio (ROS) e mecanismos antioxidantes pode contribuir para o dano oxidativo observado em pacientes com TB, com alguns achados mostrando baixas concentrações de glutationa no córtex pré-frontal e de superóxido dismutase (SOD) no hipocampo, ambas enzimas antioxidantes (BALMUS et al, 2016).
Experiências estressantes vividas precocemente, como maus-tratos, abuso sexual, negligência e perda materna, estão associados a transtornos de humor (MCLAUGHLIN et al., 2010). Basicamente, há dois modelos animais de estresse precoce, ambos envolvem a relação mãe-filhote. Em um, estresses à fêmea grávida induzem nos filhotes após o nascimento, alterações no sistema imune (DIZ-CHAVES et
al., 2012; ), no eixo HPA (hipotálamo-pituitária-adrenal), no ritmo circadiano, na
secreção de corticosterona (KOEHL et al., 1999), na neurogênese hipocampal (FATIMA et al., 2017), no comportamento (e.g., imobilidade no nado forçado, ansiedade), nos níveis de BDNF e plasticidade sináptica (JIA et al., 2015). No outro, separação materna pós-natal leva a alterações em funções vegetativas (e.g., frequência
cardíaca e níveis hormonais), no ritmo circadiano (VETULANI, 2013), no eixo HPA, no comportamento (e.g., estereotipia, hipoatividade, resposta de sobressalto, hipersensibilidade a estresse agudo), na memória, na aprendizagem (LIPPMANN et al., 2007) e na via dopaminérgica na VTA (YADID et al., 2001). Fenótipos de depressão e de mania também podem ser induzidos separadamente por estresse ambiental em animais adultos. Modelos comportamentais de desamparo aprendido, ou seja, exposição crônica a estímulos incontroláveis ou inescapáveis, tem sido usados como modelos animais bem validados para depressão (SHIRAYAMA et al., 2015). Por outro lado, privação de sono em animais induzem inerentemente alterações no ritmo circadiano e conduzem a um estado maníaco (ABRIAL et al., 2015).
Embora correlações entre as áreas afetadas e fatores ambientais sejam encontrados tanto em modelos pré-clínicos quanto na fenomenologia do transtorno em pacientes humanos, modelos transgênicos apresentam restrições quanto à generalidade, modelos farmacológicos são inespecíficos, fenótipos são produzidos isoladamente na maioria dos estudos e há carência de testes comportamentais mais amplos ou complexos. Mesmo estados mistos sendo produzidos, eles ocorrem em modelos de troca de fenótipo diretamente induzidos (FREUND et al., 2016; LE-NICULESCU et al., 2008).
Por essa razão, pretendeu-se desenvolver um modelo animal ambiental com validade ecológica, manipulando-se estressores com clássicos efeitos opostos sobre parâmetros comportamentais relacionados aos endofenótipos do transtorno bipolar. Há evidências de que eventos aversivos incontroláveis e perturbações do ciclo sono-vigília alteram, individualmente e em sentidos opostos, a atividade locomotora, comportamentos relacionados ao humor, função de recompensa e cognição (GOULD & EINAT, 2007; LOGAN & MCCLUNG, 2016; SHIRAYAMA et al., 2015). E também, há correlação entre eventos de vida negativos recentes e a primeira crise no paciente bipolar (SIMHANDL et al., 2015), assim como a correlação entre privação de sono e fases maníacas (LOGAN & MCCLUNG, 2016).
Para fazer isso, combinou-se dois modelos ambientais: privação de sono paradoxal (PSP), para fenótipo maníaco, e exposição inescapável a jato de ar quente (JAQ), para fenótipo depressivo (BENEDETTI et al, 2008; MYERS et al, 2005). Especificamente, objetivou-se: i) produzir características comportamentais do transtorno bipolar a partir de estresse ambiental; ii) induzir cronicamente uma condição
e de mania (privação de sono); iii) analisar marcadores neuroquímicos estresse oxidativo e expressão de proteínas relacionadas a neurotransmissão dopaminérgica e estresse oxidativo. Portanto, hipotetiza-se que esses estressores ambientais combinados cronicamente poderiam produzir fenótipos específicos do bipolar, associados a alterações do sistema dopaminérgico de recompensa.
OBJETIVOS
Objetivo geral
Recriar alguns fatores etiológicos ambientais relacionados à clínica do transtorno bipolar por meio de uma história de exposição crônica a contingências de privação de sono e exposição a jato de ar quente em ratos machos albinos adultos.
Objetivos específicos
Expor os animais a estresse crônico manipulando-se duas contingências aversivas isoladamente ou conjuntamente, uma indutora de estado maníaco (privação de sono paradoxal) e outra indutora de depressão (jato de ar quente incontrolável);
Realizar testes comportamentais em campo aberto e em labirinto em T após a exposição aos estresses, a fim de avaliar atividade locomotora, ansiedade e impulsividade;
Realizar ensaio bioquímico e imunoblotting para avaliar dano oxidativo em amostras de hipocampo e córtex pré-frontal;
Realizar imunoblotting para quantificar transportador de dopamina (DAT) em amostras de hipocampo e córtex pré-frontal, a fim de avaliar alterações neurofisiológicas no sistema dopaminérgico de recompensa;
MÉTODO Animais
Foram utilizados 40 animais (Rattus norvegicus, Wistar), machos adultos aos 4 meses de vida, pesando entre 300-325g, experimentalmente ingênuos e nascidos no Biotério Central da Universidade Federal do Ceará (BIOCEN-UFC). Durante todo o estudo os animais foram mantidos sob um ciclo claro-escuro de 12h (luz acesa das 7h às 19h), exceto aqueles que sofreram perturbação do ciclo claro/escuro, em ambiente com umidade e temperatura controladas (22 – 23ºC). Os animais só saíram das gaiolas-viveiro para a realização das manipulações experimentais, foram pesados diariamente e observados clinicamente a fim de acompanhar qualquer alteração em sua saúde geral. Os animais foram mantidos e tratados de acordo com as diretrizes do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), sob aprovação da Comissão de Ética em Pesquisa Animal – UFC (protocolo nº 96/2013).
Aparato e materiais
Para o modelo de desamparo aprendido, foi utilizado um secador de cabelo da marca BRITANIA, modelo Travel Black Bivolt, com potência elétrica de 1200W e potência sonora de 85dB, dois níveis de temperatura e dois níveis de velocidade, operado manualmente e um mini termômetro digital da marca AKSO. Para o modelo de privação de sono, um tanque (28cm x 28cm) com cinco plataformas (6cm x 6cm). Para os testes comportamentais, aparato para Campo Aberto e labirinto em T.
Delineamento
O delineamento experimental consistiu em duas fases: Fase I (indução de estresse) e Fase II (avaliação de efeito comportamental). O grupo controle (N = 10) foi mantido apenas sob as condições de habitação-padrão durante as duas fases. No grupo PSP (N = 10), os animais foram expostos na Fase I a cinco sessões de privação de sono paradoxal (PSP) intermitentes diariamente durante dez dias. No grupo JAQ (N = 10), os animais foram expostos na Fase I a cinco sessões de jato de ar quente (JAQ) intermitentes diariamente durante dez dias. No grupo PSP+JAQ (N = 10), os animais foram expostos na Fase I por 10 dias a sessões de PSP e JAQ alternadas entre si diariamente. Em seguida, os animais foram distribuídos em cinco grupos de acordo com o modelo de indução de transtorno utilizado: i) controle, ii) PSP, iii) JAQ e iv) PSP+JAQ (Tabela 1). Na Fase II, interrompeu-se as contingências indutoras, a fim de verificar os seus efeitos comportamentais.
Tabela 1. Distribuição dos grupos experimentais.
Grupo Modelo Ambiental de Mania Modelo Ambiental de Depressão
Controle - -
PSP + -
JAQ - +
PSP+JAQ + +
Dessa forma, os animais foram expostos cronicamente, de acordo com o grupo, a duas condições ambientais (jato de ar quente e/ou privação de sono) combinadas ou isoladas. Os efeitos comportamentais dessas condições ambientais foram avaliados na arena do campo aberto dois dias depois do fim da indução de estresse e em um labirinto em T um dia após a última sessão no campo aberto ao longo de quatro dias (Figura 1).
Figura 1. Desenho experimental. CON: controle; JAQ: jato de ar quente; PSP: privação de sono paradoxal; CA: campo aberto; TS: Teste de sensibilidade a estímulo apetitivo.
Jato de Ar Quente (JAQ) – indução de depressão
Jatos de ar quente foram utilizados como estímulo aversivo inescapável. Foram realizadas cinco sessões intercaladas diariamente de JAQ com o grupo no aparato de campo aberto, as quais tiveram duração de quatro minutos cada e as rajadas de ar tendo ocorrido de cinco em cinco segundos alternados sem desligar o aparelho, apenas deslocando-o para o lado. As rajadas foram direcionadas aos animais. Alternar as rajadas de cinco em cinco segundos evitou que a temperatura no aparato ultrapassasse 49 ± 0.5 º C, pois, em testes de analgesia como o hot plate, verifica-se que o processo de
lesão tecidual inicia-se após a exposição do animal a uma temperatura de 54ºC por trinta segundos (CASARRUBEA et al., 2012).
Privação de Sono Paradoxal – indução de mania
O procedimento de privação de sono paradoxal (PSP) envolveu por dois grupos de cinco animais simultaneamente em dois tanques (28cm x 28cm), durante 23h em cinco dias intercalados, com água a uma altura de um centímetro contendo quatro pequenas plataformas (6cm x 6cm) distribuídas de maneira equidistante. Para tentar dormir, os animais usavam as plataformas, mas quando começavam a entrar no sono REM o tônus dos músculos antigravitacionais de todo o corpo e, principalmente, da cabeça e pescoço, diminuía, fazendo com que o animal deslizasse para dentro da água e despertasse (FISHBEIN & GUTWEIN, 1977).
Campo Aberto
O campo aberto consiste de uma arena de acrílico quadrada (50 x 50 cm) com o piso dividido em nove quadrantes iguais. Após habituação, os animais eram postos individualmente na arena a fim de explorá-la livremente durante 5 minutos. Foi registrado o número de quadrantes atravessados pelo animal (crossing), o número de explorações verticais (rearing), o tempo gasto lambendo, arranhando ou limpando qualquer parte de sua cabeça ou corpo (autogrooming), o tempo de permanência apenas nos cantos da arena (tigmotaxia), quantidade de bolos fecais (defecação) e a frequência de entradas no quadrante central (impulsividade), a fim de avaliar respectivamente atividade locomotora, atividade exploratória, ansiedade e impulsividade dos animais.
Teste de sensibilidade a estímulo apetitivo
Foi realizado um teste de preferência em um labirinto em T, utilizando banana como alimento de alto valor calórico e cenoura como alimento de baixo valor calórico, a fim de avaliar o grau de sensibilidade à recompensa dos animais (DOLIVO & TABORSKY, 2015). Esse teste ocorreu por quatro dias consecutivos, com sessão diária de cinco minutos para cada animal, no qual cada tipo de alimento era posto em braços opostos do labirinto com o animal posicionado no início do braço central. Para evitar viés de lado, havia alternância aleatória entre as posições.
Dissecação
Os animais foram sacrificados, seus cérebros removidos rapidamente e os hipocampos e córtices pré-frontais retirados, pesados e congelados a -80ºC a fim de posterior análise bioquímica e molecular.
Dosagem de substâncias reativas ao Nitrito
O estresse oxidativo foi analisado por meio do ensaio reativo de Griess (N-1-naftiletilenodiamina a 0,025% e sulfanilamida a 0,25% em ácido fosfórico 2,5%), que revelou presença de nitrito nas amostras cerebrais dissecadas (GREEN et al, 1982).
Para realização do ensaio de Griess, os homogenatos (10% em tampão fosfato) de córtex pré-frontal e hipocampo foram centrifugados a 12000 rpm por 15 min a 4°C e 100 μL de cada sobrenadante foi adicionado a 100 μL do reagente de Griess. Para o branco, foi utilizado 100 μL do tampão fosfato e 100 μL reagente de Griess. Após 10 minutos, foi feita a leitura das absorbâncias em 540nm. A curva padrão foi obtida mediante leitura de várias concentrações de nitrito padrão e os resultados foram expressos em concentração (μM). As leituras da absorbância dos padrões (y) foram plotadas contra a concentração de cada padrão (x), então foi feita a determinação da equação da reta, que foi usada para a determinação da concentração de nitrito em cada amostra.
Determinação dos marcadores DAT e SOD por meio da técnica de Western Blotting
A técnica consiste na detecção de proteínas específicas em amostras de lisados celulares ou de tecidos, seguindo cinco etapas: i) extração e quantificação das proteínas; ii) fracionamento das proteínas da amostra em gel de poliacrilamida; iii) transferência das proteínas para uma membrana; iv) incubação da membrana com um anticorpo específico para detectar a proteína-alvo; e v) revelação da membrana com a proteína marcada (TOWBIN, 1993). Essa técnica foi realizada com a finalidade de determinar marcadores de transportador de dopamina (DAT) e superóxido dismutase (SOD) nas amostras de hipocampo e córtex pré-frontal.
As amostras foram homogeneizadas separadamente em potter com 2 mL de tampão de sacarose 32 mM, EDTA 1 mM, Hepes 10 mM e BSA 1 mg/mL. As amostras homogeneizadas foram centrifugadas a 3.000 G durante 10 min a 4ºC, para remoção de
debris. O sobrenadante foi submetido a uma nova centrifugação a 25.000 G durante 90
min a 4ºC. Após a centrifugação, o sobrenadante foi desprezado e o pellet ressuspenso em 100μL de uma solução de SDS a 5% com inibidor de protease (5μL/mL). Após a centrifugação, o sobrenadante foi desprezado e o pellet ressuspendido em 100μL de uma solução de SDS a 5%. A quantidade de proteína total presente na amostra foi
determinada usando o método de Lowry, e a albumina sérica bovina foi utilizada como padrão.
As amostras foram desnaturadas por adição de um tampão contendo – Tris 125 mM, glicerol 20%, DTT 100 mM, SDS 4%, e de Azul de Bromofenol 0,02% - seguida de aquecimento a 90ºC durante 5 min. Quantidades iguais de proteínas totais (25 μg) foram aplicadas em cada poço de gel de poliacrilamida-SDS 12,5 %, utilizando-se o sistema Mini Protean®3Cell (Bio-Rad, EUA). Adicionou-se tampão de corrida (Tris 25 mM; Glicina 192 mM e SDS 0,1%) e em seguida iniciou-se a corrida em condições constantes de voltagem (120 V) e variável de miliamperagem (80 mA) por 1 hora e 45 min. Após a separação protéica, deu-se início a transferência (por 3 horas,100 V, 395 mA) para a membrana de difloureto de polivinildieno (PVDF) (Bio-Rad), previamente ativada por imersão em metanol durante 5 s, seguida de uma imersão de 5 min em água, e finalmente em tampão de eletrotransferência (Tris 25mM; Glicina 192mM e Metanol 20%) durante 5 min.
A transferência foi verificada corando-se as membranas com solução de Ponceau S, para verificação da qualidade do processo. Logo em seguida, as membranas foram lavadas (descoradas) com água destilada e bloqueadas com leite desnatado a 5% em TBS-T por uma hora sob agitação à temperatura ambiente. Em seguida as membranas foram incubadas por um período de 1 hora em TBS-T contendo os seguintes anticorpos: anti-α tubulina produzido em camundongo (1:5000; Sigma), anti-SOD2 produzida em camundongo (1:2000; Santa Cruz Biotechnology) e anti-DAT produzido em rato (1:2000; Santa Cruz Biotechnology). A seguir, as membranas foram lavadas com TBS-T (3 lavagens) e incubadas com os anticorpos secundários marcados com peroxidase: anti-IgG de camundongo (1:2000; Millipore) por 1 hora.
Após a incubação por 1 h, a membrana foi novamente lavada com TBS-T (3 lavagens) e a reação de desenvolvimento da cor se processou com a mistura de 5mg do cromógeno DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride-Sigma) em 15 mL de TBS-T e 50 μL de peróxido de hidrogênio por 5 min. Para interrupção da reação de degradação enzimática, a membrana foi lavada com água deionizada e posteriormente secada em temperatura ambiente e, no final, guardada ao abrigo da luz.
Para a análise densitométrica, as bandas foram quantificadas por análise computadorizada de imagem (com auxílio do software Image J versão 1.32j) onde a densidade óptica de cada banda foi detectada. Inicialmente, o sistema de análise calcula
a média dos valores de densidade ótica para a região delimitada pelo operador. Esta região deve ter uma área suficiente para abrigar todas as bandas (uma de cada vez) visíveis no filme, não devendo ser alterada, quando se passa a analisar outra banda, sendo feita a relação proteína-alvo com α-tubulina para apresentação dos resultados.
Análise Estatística
Os dados foram analisados usando o GraphPad Prism v. 6.0. O teste de Kolmogorov-Smirnov aplicado aos dados a fim de avaliar a normalidade dos mesmos, os quais sempre serão apresentados como média (M) ± erro-padrão (SEM). Para o teste de campo aberto foi aplicada one-way ANOVA em grupos de dados paramétricos, com teste post hoc Tukey, e teste de Kruskal-Wallis em grupos de dados não-paramétricos, com teste post hoc Dunn. Para o teste de sensibilidade a estímulo apetitivo foi aplicada
two-way ANOVA, usando o consumo como variável dependente e estabelecendo como
fatores fixos o tipo de estresse crônico e o dia de consumo. Para comparar a média entre os grupos, a two-way ANOVA foi seguida pelo teste post hoc Bonferroni. Para os ensaios bioquímicos e quantificação protéica por blotting foi aplicado o teste t não-pareado em grupos de dados paramétricos e teste de Mann-Whitney em grupos de dados não-paramétricos. O nível de significância adotado para todos os testes foi de p < 0.05.
RESULTADOS
Avaliação da atividade locomotora e exploratória
A Fig. 2 mostra que houve efeito do tipo de estresse crônico sobre a frequência de crossings através dos grupos (1-way ANOVA, F3, 40 = 9,378. p < 0,0001). De acordo
com o teste post hoc Tukey, os grupos PSP (69±5,76) e PSP+JAQ (67,42±3,65) apresentaram significativamente maior frequência de crossing em comparação aos grupos controle (41,67±4,44) e JAQ (48,28±4,23).
Figura 2. Frequência de crossing. 1-way ANOVA, F3, 40= 9,378. p < 0,0001.
A Fig. 3 mostra que houve efeito do tipo de estresse crônico sobre a frequência de rearing através dos grupos (1-way ANOVA, F3, 39 = 7,597. p = 0,0004). De acordo
com o teste post hoc Tukey, o grupo PSP+JAQ (40,92±3,06) demonstrou significativamente maior frequência de rearing em comparação aos demais grupos (controle, 28,33±2,82; JAQ, 29,33±2,80; PSP, 23,80±1,63).
Figura 3. Frequência de rearing. 1-way ANOVA, F3, 39 = 7,597. p = 0,0004.
Em resumo, observou-se que os animais submetidos cronicamente a PSP e PSP+JAQ induziram hiperatividade locomotora pós-estresse em relação aos animais não-estressados, embora JAQ não tenha se diferenciado do controle. E uma hiperatividade exploratória pós-estresse foi observada apenas nos animais submetidos a PSP+JAQ crônico.
Avaliação de parâmetros comportamentais de ansiedade
A Fig. 4 mostra que não houve efeito do tipo de estresse crônico sobre o tempo de engajamento em respostas de self-grooming através dos grupos (1-way ANOVA, F3, 38 = 2,590. p = 0,0670), não havendo diferença entre as médias dos grupos (controle,
22,58±2,99; JAQ, 7,60±3,17; PSP, 11,70±2,73; PSP+JAQ, 15,75±3,65).
Figura 4. Tempo de engajamento em respostas de self-grooming. 1-way ANOVA, F3, 38
= 2,590. p = 0,0670.
A Fig. 5 mostra que houve efeito do tipo de estresse crônico sobre o tempo de permanência apenas nos cantos da arena através dos grupos (1-way ANOVA, F3, 40 =
11,20. p < 0,0001). De acordo com o teste post hoc Tukey, o grupo controle (247±8,62) demonstrou significativamente maior tempo nos cantos da arena de campo aberto em comparação aos demais grupos (JAQ, 214,7±6,23; PSP, 181,4±7,31; PSP+JAQ, 206,5±9,09), tendo havido diferença entre as médias dos grupos submetidos a JAQ e a PSP.
Figura 5. Tempo de permanência apenas nos cantos da arena. 1-way ANOVA, F3, 40 =
11,20. p < 0,0001.
A Fig. 6 mostra que houve efeito do tipo de estresse crônico sobre a quantidade de bolos fecais depositados através dos grupos (Kruskal-Wallis, p = 0,0006). De acordo
com o teste post hoc Dunn, os grupos JAQ (3,9±0,57) e PSP (4,8±0,77) demonstraram significativamente maior defecação na arena de campo aberto em comparação ao grupo controle (0,33±0,25). Já o grupo PSP+JAQ (3,08±1,07) não apresentou média estatisticamente diferente de nenhum outro grupo, embora mostre tendência a também se diferenciar do grupo controle.
Figura 6. Quantidade de bolos fecais depositados na arena. Kruskal-Wallis, p = 0,0006.
Em resumo, observou-se resultados contraditórios referente ao grau de ansiedade apresentado pelos grupos nos três parâmetros diferentes. No self-grooming, não houve diferença entre o nível de ansiedade dos animais, ao passo que o controle apresentou maior ansiedade evidenciada pela tigmotaxia do que os grupos submetidos a estresse, oposto do que ocorreu com a defecação, que indicou maior nível de ansiedade nos grupos estressados.
Avaliação da impulsividade
A Fig. 7 mostra que houve efeito do tipo de estresse sobre a frequência de entradas no quadrante central da arena de campo aberto através dos grupos (Kruskal-Wallis, p = 0,0049).
Figura 7. Frequência de entradas no quadrante central. Kruskal-Wallis, p = 0,0049.
De acordo com o teste post hoc Dunn, os grupos PSP (5,3±0,79) e PSP+JAQ (4,92±1,07) demonstraram significativamente maior frequência de entradas na zona
central em comparação ao grupo controle (1,67±0,55), mas não em relação ao grupo submetido ao JAQ (3,1±0,48).
Avaliação da sensibilidade à recompensa
A Fig. 8 mostra que houve efeito do tipo de estresse (F7, 80 = 5,633, p <
0,0001), do dia de consumo (F3, 240 = 10,46, p < 0,0001) e da interação entre eles (F21, 240
= 4,020, p < 0,0001) sobre o consumo de estímulo apetitivo em comparação a estímulo não apetitivo.
Figura 8. Consumo de estímulo apetitivo e não apetitivo. ϕ: vs. não apetitivo-CON (p < 0,05); δ: vs apetitivo-PSP+JAQ (p < 0,001).
A análise post hoc pelo teste de Bonferroni mostra que houve preferência do grupo controle e do grupo PSP+JAQ pelo estímulo apetitivo em detrimento do estímulo não apetitivo (controle, p < 0,05; PSP+JAQ, p < 0,001). E que o grupo submetido a PSP+JAQ apresentou o maior consumo de estímulo apetitivo dentre todos (p < 0,001).
Análise de estresse oxidativo
A Fig. 9 mostra evidência de dano oxidativo às áreas cerebrais dos animais expostos ao estresse ambiental combinado (PSP+JAQ) em comparação aos animais não submetidos a estresse (Controle). Observou-se aumento significativo nas concentrações de nitrito no hipocampo dos animais submetidos a PSP+JAQ (13,96±1,28) em comparação ao grupo Controle (7,46±0,64), mas apenas uma tendência a maior expressão de SOD no grupo PSP+JAQ (3,76±1,18) em comparação ao Controle (1,60±0,30). Esta mesma tendência na concentração de SOD foi observada no córtex pré-frontal dos animais submetidos a PSP+JAQ (5,03±1,16) em comparação ao
Controle (3,38±0,56), porém sem diferenças na concentração de nitrito entre ambos os grupos (Controle: 9,99±0,97; PSP+JAQ: 8,91±1,22).
a)
b)
Figura 9. a) dosagem de nitrito nas amostras de hipocampo (esquerda) e córtex pré-frontal (direita), respectivamente, p = 0,0061 (teste de Mann-Whitney) e p = 0,5 (teste t não-pareado). b) análise densiométrica após imunoblotting referente à expressão de SOD nas amostras de hipocampo (esquerda) e córtex pré-frontal (direita), respectivamente, p = 0,22 e p = 0,5 (teste de Mann-Whitney).
Expressão protéica por imunoblotting de transportador de dopamina (DAT) no hipocampo e córtex pré-frontal
A Fig. 10 mostra uma maior expressão de transportador de dopamina (DAT) no córtex pré-frontal de animais do grupo PSP+JAQ (4,14±1,59) em comparação ao controle (1,30±0,26), embora a diferença entre as médias não tenha sido significativa. No hipocampo, não houve diferença na expressão de DAT entre os grupos (Controle: 1,43±0,48; PSP+JAQ: 1,86±0,29).
Figura 10. Análise densiométrica após imunoblotting referente à expressão de DAT nas amostras de hipocampo (esquerda) e córtex pré-frontal (direita), respectivamente, p = 0,87 e p = 0,23 (teste de Mann-Whitney).
DISCUSSÃO
No geral, a exposição crônica dos animais aos estressores ambientais, isolados ou combinados (JAQ e/ou PSP), induziu alterações comportamentais pós-estresse semelhantes a alguns endofenótipos de transtornos de humor e ansiedade, com os estressores combinados (PSP+JAQ) induzindo em algum grau dano oxidativo ao hipocampo e córtex pré-frontal dos animais.
O primeiro endofenótipo avaliado foi a atividade locomotora e exploratória, respectivamente por meio da frequência de crossing e rearing emitidos pelos animais. Observou-se que a exposição crônica ao estresse alterou a atividade locomotora dos animais, especificamente aumentando o número de quadrantes cruzados no campo aberto pelos animais submetidos a PSP e PSP+JAQ. Essa hiperatividade tem sido descrita em vários protocolos de indução de estado maníaco por meio de privação de sono paradoxal (ABRIAL et al., 2015; MUKHERJEE et al., 2010; LOGAN & MCCLUNG, 2016), mas ainda é desconhecida no caso da combinação inovadora desses dois estressores manipulada no presente experimento. Já o grupo de animais expostos a JAQ apresentou atividade locomotora semelhante ao grupo controle (não exposto ao estresse). Esse resultado foi inesperado, pois a exposição crônica a jato de ar quente foi estabelecida a fim de produzir um estado depressivo que poderia ser evidenciado por uma hipoatividade (HUNZIKER, 2005). É sabido que o modelo de desamparo aprendido tem sido um dos que mais se aproxima de uma análise funcional do comportamento depressivo com validade ecológica, permitindo investigações em nível comportamental, neuroquímico e farmacológico (DO NASCIMENTO et al., 2017; HUNZIKER, 2006; PETERSON, MAIER & SELIGMAN, 1993).
Outra forma de avaliar atividade locomotora é por meio da mensuração do comportamento exploratório (SEIBENHENER & WOOTEN, 2015). Aqui, apenas o grupo PSP+JAQ apresentou hiperatividade exploratória, não havendo diferença entre a frequência de rearing entre os demais grupos. Embora haja evidências na literatura científica de hipoatividade em animais submetidos a JAQ e hiperatividade naqueles submetidos PSP, quando se manipula tais contingências isoladamente (LOGAN & MCCLUNG, 2016; HUNZIKER, 2006).
O segundo endofenótipo investigado foi a emocionalidade dos animais. Para isso, três parâmetros foram avaliados no campo aberto: self-grooming, permanência nos cantos da arena e bolos fecais expelidos (MCCALL et al., 2015; POPOVIĆ et al., 2014). Algum grau de ansiedade foi detectado nos grupos submetidos a JAQ e PSP
isoladamente por meio da presença mais elevada de bolos fecais ao final da sessão de campo aberto. Contudo, o grupo controle foi o que demonstrou maior tigmotaxia, ao passo que não houve diferença no self-grooming emitido entre os grupos. A contradição observada entre esses parâmetros tem sido apontada como decorrente de diferenças nos critérios de análise ou diferenças nos procedimentos de teste (RAMOS, 2008), por isso o mais indicado tem sido acrescentar testes de ansiedade mais específicos, comportamentais como o labirinto em cruz, ou mesmo marcadores fisiológicos como a corticosterona (CAROLA et al., 2002).
O terceiro endofenótipo investigado, a impulsividade, foi avaliado por meio da exposição espontânea dos animais a zona central da arena, pois este parâmetro tem sido utilizado como medida de tomada de risco ou comportamento impulsivo (PADILLA et
al., 2010). Os animais dos grupos PSP e PSP+JAQ demonstraram maior exposição ao
risco em relação aos grupos controle e HAB. Exceto pela originalidade do resultado encontrado devido a exposição aos estressores combinados, que até o momento não foi descrito em outros estudos, os resultados sobre impulsividade apresentados aqui corroboram várias pesquisas básicas com manipulação desses estressores isoladamente (MYERS et al., 2005; YIN et al., 2017).
O último endofenótipo avaliado foi a sensibilidade à recompensa por meio da mensuração do consumo de um estímulo apetitivo em uma situação de escolha, que envolve a avaliação de processos motivacionais de incentivo. Vários estudos apontam que estímulos apetitivos podem funcionar como recompensas mais atrativas em procedimentos comportamentais envolvendo processos de tomada de decisão, condicionamento operante e controle discriminativo (DOLIVO & TABORSKY, 2015; KIRKPATRICK et al., 2013; RUTTE & TABORSKY, 2007). Assim como descrito na literatura, ratos sob condições saudáveis, representado aqui pelo grupo controle, tendem a preferir alimentos mais calóricos ao forragear, maximizando a taxa de retorno energético (STEVENS & HAUSER, 2004). Já os estressores ambientais isolados (PSP ou JAQ) apresentaram um efeito disruptivo sobre esse padrão, efeito oposto ao dos estressores combinados (PSP+JAQ), que induziu uma hipersensibilidade dos animais para consumir o estímulo apetitivo.
Uma possível hipótese neuroquímica para esse tipo de hipersensibilidade à recompensa pode estar relacionada a algum tipo de disfunção no sistema de recompensa dopaminérgico, a qual compõe parte da fisiopatologia do TB (KAPCZINSKI et al, 2008). Um importante marcador molecular dessa desregulação é o transportador de
dopamina (DAT), cuja expressão gênica anormal tem sido relacionada ao aumento de suscetibilidade ao TB (GREENWOOD et al, 2006) e redução de sua expressão protéica em hipocampo relacionada a estado hiperdopaminérgico e fenótipo maníaco, como comportamento de risco e impulsividade (YOUNG et al, 2011; de QUEIROZ et al, 2018). Contudo, no presente estudo encontrou-se um aumento, embora não significativo, da expressão de DAT no córtex pré-frontal, mas não no hipocampo, dos animais submetidos aos estressores combinados (PSP+JAQ). A partir disso, um provável mecanismo neuroquímico, que explicaria a desregulação do sistema dopaminérgico (hipo ou hiperdopaminergia), poderia envolver o prejuízo da conexão cortico-límbica e do controle cortical sobre o sistema de recompensa, levando à
alteração da sensibilidade comportamental a recompensas (hipótese
motivacional/emocional) e ao endofenótipo similar ao bipolar (WESSA et al, 2014). Modelos animais de TB que induzem estado maníaco farmacologicamente, administrando cronicamente baixas doses de anfetamina, evidenciam dano oxidativo em hipocampo e córtex pré-frontal (FREY et al, 2006a; FREY et al, 2006b). O presente modelo de indução ambiental de um conjunto de endofenótipos relacionados ao TB, mostrou indícios de dano oxidativo nessas mesmas áreas cerebrais, com maior evidência no hipocampo, nos animais submetidos aos estressores combinados (PSP+JAQ). O procedimento de privação de sono paradoxal utilizado aqui (i.e., plataforma múltipla) tem mostrado potencial translacional para a clínica do TB enquanto modelo de mania, além de produzir evidências consistentes de estresse oxidativo em roedores, especialmente no córtex e hipocampo (ZHANG et al, 2013; ALZOUBI et al, 2012; KHADRAWY et al, 2011). Por outro lado, há relativa escassez de achados sobre estresse oxidativo em modelos de depressão por desamparo aprendido (BALMUS et al, 2016). O protocolo funcionalmente mais próximo ao utilizado na presente pesquisa (i.e., JAQ) é o de estresse moderado crônico por causa de sua natureza inescapável, o qual tem algumas evidências de estresse oxidativo em roedores (EJCHEL-COHEN et al, 2006; DE SOUZA et al, 2006).
Considerando todos os resultados encontrados, pode-se afirmar que a combinação dos estressores ambientais apresentada alternadamente ao longo de dez dias promoveu alterações comportamentais e neuroquímicas após a interrupção da exposição aos estresses. Vale lembrar, que o teste de campo aberto ocorreu dois dias após a última sessão de estresse ambiental e o teste de sensibilidade à recompensa ocorreu ao longo de quatro dias um dia após o campo aberto. É notável o fato de que o efeito sobre a
sensibilidade à recompensa, observado nos animais submetidos a estresse, foi observado seis dias após a indução ambiental ter sido encerrada. Assim como, a dissecação para imediato congelamento das áreas cerebrais ocorreu após cinco dias da interrupção dos estresses. Esses efeitos relativamente de longo-prazo não são comumente relatados em modelos animais de transtornos afetivos (EINAT, 2014; BEYER & FREUND, 2017).
Outro aspecto relevante é o conjunto específico de endofenótipos produzido apenas pela combinação de PSP e JAQ. O grupo PSP+JAQ demonstrou hiperatividade nos dois parâmetros locomotores, comportamento de risco e hipersensibilidade à recompensa. Tomados juntos, esses endofenótipos podem corresponder a um correlato pré-clínico dos sintomas apresentados por pacientes com transtorno bipolar em estado maníaco, principalmente em relação à hipersensibilidade à recompensa que clinicamente se correlaciona com estados maníacos (ALLOY et al., 2016). Modelos animais mais recentes tem conseguido induzir estados maníacos e depressivos em um mesmo animal a depender do ciclo claro-escuro ou da exposição a estresse (MCCLUNG, 2011; LE-NICULESCU et al., 2008). No entanto, tais modelos são com
camundongos geneticamente modificados, que podem elucidar aspectos
neurobiológicos, mas não representar a etiologia idiossincrática do transtorno. Além disso, eles possuem elevado custo, o que pode ser uma barreira crítica à pesquisa pré-clínica (HELENE & RIBEIRO, 2013).
Apesar do modelo ambiental de indução do fenótipo bipolar apresentado aqui não ter evidenciado endofenótipo depressivo (e.g., ansiedade) e o delineamento impossibilitar evidência de ciclagem, ele apresenta evidência de indução estados comportamentais relacionados ao transtorno bipolar, tendo como principal vantagem a manipulação de condições experimentais com potencial translação clínica exigida em revisões sistemáticas mais atuais sobre o tema (HARRISON et al, 2016; VAN ENKHUIZEN et al., 2015).
O presente estudo apresenta outras limitações, que devem ser superadas em investigações futuras relacionadas à validade de face, preditiva e de constructo. Primeiro, deve-se acrescentar testes comportamentais, tanto com modelos de avaliação cognitiva como de avaliação afetiva, a fim de ampliar a validade de face. Segundo, o tratamento dos grupos com estabilizadores do humor, pelo menos dois deles tem sido bastante utilizados, o ácido valpróico e o carbonato de lítio (Beyer & Freund, 2017). Terceiro, investigar mais aspectos etiológicos neurobiológicos a fim de tornar as evidências comportamentais mais robustas em termos da validade de constructo, por
exemplo, investigando neurotransmissão dopaminérgica nas vias neurais da recompensa, usando marcadores bioquímicos e biomoleculares de estresse fisiológico e neuroinflamação, quantificando transcrição de genes relacionados a distúrbios do ciclo circadiano, dentre outros. Além disso, será valioso investigar diferenças de sexo neste modelo (DIFLORIO & JONES, 2010).
CONCLUSÃO
Este estudo apresenta um modelo que mimetiza transtorno bipolar, ou pelo menos um modelo que reproduz endofenótipos do estado maníaco, estabelecido por contingências estritamente ambientais que induzem alterações comportamentais pós-estresse, estendendo sua capacidade de translação com a clínica do transtorno bipolar.
Outro fator crítico é o baixo custo apresentado pelo modelo, já que não se utiliza aparatos ou insumos de valor elevado para induzir as alterações observadas nos animais, além de compor procedimentos executáveis em um período médio de tempo de 20 dias desde a separação dos grupos experimentais até os testes comportamentais finais.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABRIAL, E., BÉTOURNÉ, A., ETIÉVANT, A., LUCAS, G., SCARNA, H., LAMBÁS-SEÑAS, L., & HADDJERI, N. (2015). Protein kinase C inhibition rescues manic-like behaviors and hippocampal cell proliferation deficits in the sleep deprivation model of mania. International Journal of Neuropsychopharmacology, 18(2).
AKISKAL, H. S., BOURGEOIS, M.I., ANGST, J., MÖLLER, H.J.; HIRSCHIFIELD, R. (2000.) Re-evaluating the prevalence of and diagnostic comparision within the broad clinical spectrum of bipolar disorder. J Affec Disord, 59 (suppl. 1): 5-30.
ALLOY, L. B., OLINO, T., FREED, R. D., & NUSSLOCK, R. (2016). Role of reward sensitivity and processing in major depressive and bipolar spectrum disorders. Behavior
therapy, 47(5), 600-621.
AMERICAN PSYCHIATRY ASSOCIATION (2013). Diagnostic and Statistical Manual of Mental disorders - DSM-5. 5th.ed. Washington: American Psychiatric Association.
ANDREAZZA, A.C., KAUER-SANT'ANNA, M., FREY, B.N., BOND, D.J., KAPCZINSKI, F., YOUNG, L.T., & YATHAM, L.N. (2008). Oxidative stress markers in bipolar disorder: a meta-analysis. Journal of affective disorders, 111(2-3), 135-144.
ALZOUBI, K.H., KHABOUR, O.F., RASHID, B.A., DAMAJ, I.M., & SALAH, H.A. (2012). The neuroprotective effect of vitamin E on chronic sleep deprivation-induced memory impairment: the role of oxidative stress. Behavioural Brain Research, 226(1), 205-210.
BALMUS, I.M., CIOBICA, A., ANTIOCH, I., DOBRIN, R., & TIMOFTE, D. (2016). Oxidative stress implications in the affective disorders: main biomarkers, animal models relevance, genetic perspectives, and antioxidant approaches. Oxidative medicine and
cellular longevity, 2016, 1-25.
BENEDETTI F, SERRETTI A, COLOMBO C, BARBINI B, LORENZI C, CAMPORI E, et al. (2003). Influence of CLOCK gene polymorphism on circadian mood
fluctuation and illness recurrence in bipolar depression. Am J Med Genet Part B
Neuropsychiatr Genet., 123B(1):23–6.
BENEDETTI F, FRESI F, MACCIONI P, SMERALDI E. (2008). Behavioural sensitization to repeated sleep deprivation in a mice model of mania. Behav Brain Res., 187(2):221–7.
BEHR, G.A., MOREIRA, J.C., & FREY, B.N. (2012). Preclinical and clinical evidence of antioxidant effects of antidepressant agents: implications for the pathophysiology of major depressive disorder. Oxidative medicine and cellular longevity, 2012, 1-13.
BERK M, DODD S, KAUER-SANT’ANNA M, MALHI GS, BOURIN M, KAPCZINSKI F, et al. (2007). Dopamine dysregulation syndrome: implications for a dopamine hypothesis of bipolar disorder. Acta Psychiatr Scand., 116:41–9.
BEYER, D. K., & FREUND, N. (2017). Animal models for bipolar disorder: from bedside to the cage. International journal of bipolar disorders, 5(1), 35.
CAROLA, V., D’OLIMPIO, F., BRUNAMONTI, E., MANGIA, F., RENZI, P. (2002). Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behavior in inbred mice. Behav. Brain Res. 134, 49-57.
DE COSSÍO, L. F., GUZMÁN, A., VAN DER VELDT, S., & LUHESHI, G. N. (2017). Prenatal infection leads to ASD-like behavior and altered synaptic pruning in the mouse offspring. Brain, behavior, and immunity, 63, 88-98.
DE QUEIROZ, A. I. G., CHAVES FILHO, A.J.M., DA SILVA ARAÚJO, T., LIMA, C.N.C., MACHADO, M.D.J.S., CARVALHO, A.F., & MACEDO, D. (2018). Antimanic activity of minocycline in a GBR12909-induced model of mania in mice: Possible role of antioxidant and neurotrophic mechanisms. Journal of affective
disorders, 225, 40-51.
DE SOUZA, F.G., RODRIGUES, M.D., TUFIK, S., NOBREGA, J.N., & D'ALMEIDA, V. (2006). Acute stressor-selective effects on homocysteine metabolism
and oxidative stress parameters in female rats. Pharmacology Biochemistry and
Behavior, 85(2), 400-407.
DIFLORIO A, & JONES I. (2010). Is sex important? Gender differences in bipolar disorder. Int Rev Psychiatry., 22, 437-52.
DIZ-CHAVES Y, PERNÍA O, CARRERO P, GARCIA-SEGURA LM. (2012). Prenatal stress causes alterations in the morphology of microglia and the inflammatory response of the hippocampus of adult female mice. J Neuroinflamm., 20(9), 71.
DOLIVO, V., TABORSKY, M. (2015). Norway rats reciprocate help according to the quality of help they received. Biology letters, 11(2), 20140959.
DO NASCIMENTO GS, MONTEIRO PCM, GOUVEIA A Jr, CARVALHO NETO MB. (2012). Subchronic effects of fluoxetine on conditioned suppression produced by a hot air blast. Psychol Neurosci., 5, 117-22.
DULCIS D, JAMSHIDI P, LEUTGEB S, SPITZER NC. (2013). Neurotransmitter switching in the adult brain regulates behavior. Science, 340(6131):449–53.
EINAT H. (2014). New ways of modeling bipolar disorder. Harv Rev Psychiatry., 22(6), 348–52.
EJCHEL-COHEN, T.F., WOOD, G.E., WANG, J.F., BARLOW, K., NOBREGA, J.N., MCEWEN, B.S., & YOUNG, L.T. (2006). Chronic restraint stress decreases the expression of glutathione S-transferase pi2 in the mouse hippocampus. Brain
research, 1090(1), 156-162.
FATIMA M, SRIVASTAV S, MONDAL AC. (2017). Prenatal stress and depression associated neuronal development in neonates. Int J Dev Neurosci., 4(60):1–7.
FERRARI, A. J., STOCKINGS, E., KHOO, J. P., ERSKINE, H. E., DEGENHARDT, L., VOS, T., & WHITEFORD, H. A. (2016). The prevalence and burden of bipolar
disorder: findings from the Global Burden of Disease Study 2013. Bipolar disorders, 18(5), 440-450.
FISHBEIN W, GUTWEIN BM. (1977). Paradoxical sleep and memory storage processes. Behav. Biol , 19, 42-64.
FREY, B.N., MARTINS, M.R., PETRONILHO, F.C., DAL‐PIZZOL, F., QUEVEDO, J., & KAPCZINSKI, F. (2006a). Increased oxidative stress after repeated amphetamine exposure: possible relevance as a model of mania. Bipolar Disorders, 8(3), 275-280.
FREY, B.N., VALVASSORI, S.S., GOMES, K.M., MARTINS, M.R., DAL-PIZZOL, F., KAPCZINSKI, F., & QUEVEDO, J. (2006b). Increased oxidative stress in
submitochondrial particles after chronic amphetamine exposure. Brain
Research, 1097(1), 224-229.
FREUND N, THOMPSON BS, SONNTAG K, MEDA S, ANDERSEN SL. (2016). When the party is over: depressive-like states in rats following termination of cortical D1 receptor overexpression. Psychopharmacology., 233(7):1191–201.
GARCIA, V. A., HIROTSUC, C., MATOS, G., ALVARENGA, T., PIRESC, G. N., KAPCZINSKI, F., SCHRÖDERA, N., TUFIKC, S., ANDERSEN, M. L. (2013). Modafinil ameliorates cognitive deficits induced by maternal separation and sleep deprivation. Behavioural Brain Research. 274-279.
GOULD, T. D., EINAT, H. (2007). Animal models of bipolar disorder and mood stabilizer efficacy: A critical need for improvement. Neuroscience & Biobehavioral
Reviews, 31(6):825-31.
GREEN, L.C., WAGNER, D.A., GLOGOWSKI, J., SKIPPER, P.L., WISHNOK, J.S., & TANNENBAUM, S.R. (1982). Analysis of nitrate, nitrite, and [15N] nitrate in biological fluids. Analytical biochemistry, 126(1), 131-138.
GREENWOOD, T.A., SCHORK, N.J., ESKIN, E., & KELSOE, J.R. (2006). Identification of additional variants within the human dopamine transporter gene
provides further evidence for an association with bipolar disorder in two independent samples. Molecular psychiatry, 11(2), 125.
HARRISON, P. J., CIPRIANI, A., HARMER, C. J., NOBRE, A. C., SAUNDERS, K., GOODWIN, G. M., & GEDDES, J. R. (2016). Innovative approaches to bipolar disorder and its treatment. Annals of the New York Academy of Sciences, 1366(1), 76-89.
HELENE, A. F., & RIBEIRO, P. L. (2013). Brazilian scientific funding agency budgets have not matched the country's economic growth. Brazilian Journal of Medical and
Biological Research, 46(2), 117-120.
HUNZIKER, M. H. L. (2005). O Desamparo aprendido revistado: Estudos com animais. Psicologia: Teoria e Pesquisa, 21, 131-139.
HUNZIKER, M. H. L. (2006). O estudo experimental da depressão. In: Helio Guilhardi; Noreen Aguirre. (Org.). Sobre Comportamento e Cognição. 1 ed. Santo André (SP): ESETec Editores Associados, v. 18, 156-165.
JIA N, LI Q, SUN H, SONG Q, TANG G, SUN Q, et al. (2015). Alterations of group I mGluRs and BDNF associated with behavioral abnormity in prenatally stressed offspring rats. Neurochem Res., 40(5):1074–82.
KAPCZINSKI, F., VIETA, E., ANDREAZZA, A.C., FREY, B. N., GOMES, F.A., TRAMONTINA, J., & POST, R.M. (2008). Allostatic load in bipolar disorder: implications for pathophysiology and treatment. Neuroscience & Biobehavioral
Reviews, 32(4), 675-692.
KHADRAWY, Y.A., NOUR, N.A., & EZZ, H. S.A. (2011). Effect of oxidative stress induced by paradoxical sleep deprivation on the activities of Na+, K+-ATPase and acetylcholinesterase in the cortex and hippocampus of rat. Translational
KIRKPATRICK, K., MARSHALL, A. T., CLARKE, J., & CAIN, M. E. (2013). Environmental rearing effects on impulsivity and reward sensitivity. Behavioral
neuroscience, 127(5), 712.
KOEHL M, DARNAUDÉRY M, DULLUC J, VAN R, MOAL ML, MACCARI S. (1999). Prenatal stress alters circadian activity of hypothalamo-pituitary- adrenal axis and hippocampal corticosteroid receptors in adult rats of both gender. J Neurobiol., 40(3):302–15.
KNEELAND RE, FATEMI SH. (2013). Viral infection, inflammation and schizophrenia. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry., 5(42):35–48.
LE-NICULESCU H, MCFARLAND MJ, OGDEN CA, BALARAMAN Y, PATEL S, TAN J, et al. (2008). Phenomic, convergent functional genomic, and biomarker studies in a stress-reactive genetic animal model of bipolar disorder and co-morbid alcoholism.
Am J Med Genet Part B Neuropsychiatr Genet., 147B(2):134–66.
LIPPMANN M, BRESS A, NEMEROFF CB, PLOTSKY PM, MONTEGGIA LM. (2007). Long-term behavioural and molecular alterations associated with maternal separation in rats. Eur J Neurosci., 25(10):3091–8.
LOGAN, RW, MCCLUNG CA. (2016). Animal models of bipolar mania: the past, presente and future. Neuroscience., 3(321):163–88.
MACHADO-VIEIRA, R., KAPCZINSKI, F., SOARES, J. C. (2004). Perspectives for the development of animal models of bipolar disorder. Progress in
Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry, 28, 209– 224.
MALKESMAN O, AUSTIN DR, CHEN G, MANJI HK. (2009). Reverse translational strategies for developing animal models of bipolar disorder. Dis Model Mech., 2(5–6), 238–45.
MCCALL, N., MAHADEVIA, D., CORRIVEAU, J. A., & GLENN, M. J. (2015). Adult emotionality and neural plasticity as a function of adolescent nutrient supplementation in male rats. Pharmacology Biochemistry and Behavior, 132, 125-135.
MCLAUGHLIN KA, GREEN JG, GRUBER MJ, SAMPSON NA, ZASLAVSKY AM, KESSLER RC. (2010). Childhood adversities and adult psychiatric disorders in the national comorbidity survey replication II: associations with persistence of DSMIV disorders. Arch Gen Psychiatry., 67(2):124–32.
MCCLUNG, C.A. (2011). Circadian rhythms and mood regulation: insights from pre-clinical models. Eur. Neuropsychopharmacol. 21(Suppl. 4): S683–S693.
MODABBERNIA A, TASLIMI S, BRIETZKE E, ASHRAFI M. (2013). Cytokine alterations in bipolar disorder: a meta-analysis of 30 studies. Biol Psychiatry., 74(1):15– 25.
MUKHERJEE S, COQUE L, CAO J-L, KUMAR J, CHAKRAVARTY S, ASAITHAMBY A, et al. (2010). Knockdown of Clock in the ventral tegmental area through RNA interference results in a mixed state of mania and depression-like behavior. Biol Psychiatry., 68(6):503–11.
MYERS TM, COHN SI, CLARK MG. (2005). Acquisition and performance of two-way shuttlebox avoidance: Effects of aversive air intensity. Learn Motiv., 36(3):312–21.
PADILLA, E., SHUMAKE, J., BARRETT, D. W., HOLMES, G., SHERIDAN, E. C., & Gonzalez-Lima, F. (2010). Novelty-evoked activity in open field predicts susceptibility to helpless behavior. Physiology & behavior, 101(5), 746-754.
PARBOOSING R, BAO Y, SHEN L, SCHAEFER CA, BROWN AS. (2013). Gestational influenza and bipolar disorder in adult offspring. JAMA Psychiatry., 70(7):677–85.
PATEL JP, FREY BN. (2015). Disruption in the blood-brain barrier: the missing link between brain and body inflammation in bipolar disorder? Neural Plast., 2015:708306.
