PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS
APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE CROMATOGRAFIA NO DIAGNÓSTICO TOXICOLÓGICO
Daniel Silva Goulart Orientador: Maria Clorinda Soares Fioravanti
GOIÂNIA 2012
DANIEL SILVA GOULART
APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE CROMATOGRAFIA NO DIAGNÓSTICO TOXICOLÓGICO
Seminário apresentado junto à Disciplina Seminários Aplicados do Programa de Pós- Graduação em Ciência Animal da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás. Nível: Doutorado
Área de concentração:
Patologia Clínica e Cirurgia Animal
Linha de Pesquisa:
Alterações clínicas, metabólicas e toxêmicas dos animais e meios auxiliares de diagnóstico
Orientador:
Prof. Dr. Maria Clorinda Soares Fioravanti - UFG Comitê de Orientação:
Prof. Dr. Emmanuel Arnhold - UFG
Prof. Dr. Franklin Riet-Correa Amaral - UFCG
GOIÂNIA 2012
LISTA DE ABREVIATURAS
CCD cromatografia em camada delgada
CG cromatografia gasosa
CG-MS cromatografia gasosa acoplada a espectrofotometria de massa HPLC cromatografia líquida de alta eficiência
HPLC-FI cromatografia líquida de alta eficiência com detecção de fluorescência
HPLC-IR cromatografia liquida de alta eficiência acoplada a espectrofotometria de infravermelho
HPLC-MS cromatografia liquida de alta eficiência acoplada a espectrofotometria de massa
LC-MS cromatografia liquida acoplada a espectrofotometria de massa LC-MS/MS cromatografia liquida acoplada a espectrofotometria de massa
acoplada a espectrofotometria de massa MF monofluoroacetato de sódio
U-HPLC cromatografia líquida de ultra eficiência
U-HPLC-MS/MS cromatografia liquida de alta eficiência acoplada a espectrofotometria de massa acoplada a espectrofotometria de massa
UV ultravioleta
WADA Word Anti-Doping Agency
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 1
2 REVISÃO DE LITERATURA ... 3
2.1 Breve histórico ... 3
2.2 Principais tipos de cromatografia ... 4
2.2.1 Cromatografia em papel ... 4
2.2.2 Cromatografia em camada delgada ... 5
2.2.3 Cromatografia gasosa ... 5
2.2.4 Cromatografia líquida de alta eficiência... 6
2.2.5 Cromatografia multidimensional ... 7
2.3 Principais usos da cromatografia ... 8
2.4 Uso da cromatografia na toxicologia ... 9
2.4.1 A cromatografia na toxicologia forense ... 9
2.4.2 A cromatografia na toxicologia veterinária ... 13
2.4.3 A cromatografia para identificação de substâncias nocivas em alimentos .. 19
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 23
REFERÊNCIAS ... 24
A cromatografia é uma técnica relatada cientificamente há pouco mais de cem anos e baseia-se na migração de componentes de uma mistura entre duas fases: a fase estacionária que retém elementos e a fase móvel que conduz a mistura por meio de um soluto através da fase estacionária. É uma técnica que pode ser utilizada para purificação de substâncias, na detecção de substâncias ou auxiliar a separação de substâncias indesejáveis.
As técnicas cromatográficas podem ser divididas principalmente em cromatografia em papel, cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia gasosa (CG), cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), e mais atualmente a cromatografia líquida de ultra-eficiência (U-HPLC). Os métodos cromatográficos podem ser utilizados separadamente ou em conjunto dependendo dos componentes a serem separados ou identificados.
A cromatografia tem sido desenvolvida e utilizada em diversos meios da ciência. A química é a área mais atuante no desenvolvimento de métodos cromatográficos, mas outras áreas da ciência também utilizam dessas técnicas, sendo elas muito difundidas na área farmacêutica e médica.
Devido à alta precisão e confiabilidade dessas técnicas, elas são muito utilizadas na detecção ou separação de substâncias que estão em pequenas quantidades em uma mistura. Assim, na área médica a cromatografia tem grande utilização na toxicologia, seja para monitorar o uso de medicamento ou para o seu uso na ciência forense, dosando drogas de abuso e auxiliando a elucidar crimes.
Da mesma forma que ocorre na medicina, na medicina veterinária as técnicas cromatográficas podem ser empregadas no diagnóstico de doenças e em estudos de farmacocinética, mas é na toxicologia que a técnica ganha maior destaque. O estudo toxicológico envolve a identificação de substâncias, seja após a intoxicação ou em estudos experimentais quando essa identificação pode ser realizada previamente, certificando que a quantidade de princípio ativo a ser utilizada esteja correta.
Outro grande interesse para o uso das técnicas cromatográficas na medicina veterinária é na identificação de resíduos de drogas em produtos de origem animal. Sabe-se que esses resíduos podem prejudicar o consumidor final,
e causar descrédito à cadeia produtiva, assim o monitoramento destes produtos torna-se de fundamental importância.
Diante da versatilidade do uso da cromatografia e do potencial de sua utilização na toxicologia, essa revisão teve o intuito de relatar as diferentes aplicações de métodos cromatográficos no diagnóstico toxicológico, bem como esclarecer seus usos na toxicologia veterinária.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Breve histórico
A cromatografia foi relatada pela primeira vez há pouco mais de 100 anos por Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919). No período de 1899 à 1901 Tswett trabalhou em sua primeira pesquisa com a estrutura físico-química da clorofila das plantas, sendo que no ano de 1903 relatou uma nova categoria de análise adsortiva (ETTRE, 2000). O trabalho de Tswett foi apresentado em forma de tratado para a Sociedade de Ciências de Varsóvia, no qual descreveu os resultados preliminares de suas pesquisas com extrato de folhas, utilizando uma coluna de vidro recheada com carbonato de cálcio, separando os constituintes do extrato pela passagem de éter dietílico (COLLINS, 2006).
No entanto, as denominações de cromatografia e cromatograma somente surgiram no segundo trabalho de Tswett, publicado em 1906. A palavra cromatografia designava o processo de separação, tendo sua origem do grego chroma, com o significado de ―cor‖, e também do grego graphe, significando
―escrever‖. Já a palavra cromatograma refere-se às bandas separadas na coluna (COLLINS, 2006; NOGUEIRA, 2006).
Durante os cem anos que se seguiram da publicação de Tswett a cromatografia passou por grande evolução. Em decorrência da técnica ser baseada em duas fases (móvel e estacionária) e da possibilidade de utilização de diferentes componentes nestas fases, a cromatografia demonstrou sua grande flexibilidade. O controle do fluxo da fase móvel por gravidade, pressão, ação capilar, eletro-osmose, aliado ao fato de o processo poder ser realizado em diferentes temperaturas, permitiu que a técnica de separação pudesse ser aplicada desde pequenos átomos a grandes quantidades de substâncias (ETTRE, 2000).
Assim, a evolução da técnica iniciou-se na cromatografia líquida de adsorção seguida pela cromatografia de partição. Posteriormente surgiu a análise de gases e amostras vaporizadas, seguida pelas trocas iônicas, separação por tamanho molecular e eletrocromatografia (ETTRE, 2000).
Mais recentemente a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) tem sido a técnica analítica mais desenvolvida, difundida e utilizada nos laboratórios de análises químicas e farmacêuticas. Desta forma, nos últimos 40 anos muitos avanços em relação a esta técnica foram alcançados, impulsionados pelo desenvolvimento contínuo de novas partículas de fase estacionária, capazes de gerar colunas mais seletivas, eficientes e química e mecanicamente estáveis (MALDANER & JARDIM, 2009).
A expansão da HPLC tem sido direcionada ao desenvolvimento de análises mais rápidas, sem o comprometimento do desempenho cromatográfico.
Assim com a redução do tamanho das partículas da fase estacionária e das colunas, com partículas menores que 2 µm, surgiu a cromatografia líquida de ultra eficiência (U-HPLC), sendo esta uma das mais recentes evoluções da técnica cromatográfica (MALDANER & JARDIM, 2009).
2.2 Principais tipos de cromatografia
2.2.1 Cromatografia em papel
A cromatografia em papel é uma técnica de partição líquido–líquido, estando um deles fixado a um suporte sólido. Baseia-se na diferença de solubilidade das substâncias entre duas fases imiscíveis (DEGANI et al. 1998;
ETTRE, 2000). A cromatografia em papel é uma das técnicas mais simples e que requer menos instrumentos para sua realização, sendo muito útil para a separação de compostos polares (PERES, 2002).
O papel é composto por moléculas de celulose que possuem afinidade pela água, mas muito pouca afinidade pela fase orgânica, atuando como suporte inerte contendo a fase estacionária aquosa (polar). À medida que o solvente contendo o soluto flui ao longo do papel, uma partição deste composto ocorre entre a fase móvel (pouco polar) e a fase estacionária. Com o fluxo contínuo de solvente, o efeito desta partição entre as fases móvel e estacionária possibilita a transferência do soluto do seu ponto de aplicação no papel para outro ponto
localizado a alguma distância do local de aplicação no sentido do fluxo de solvente (PERES, 2002).
2.2.2 Cromatografia em camada delgada
A cromatografia em camada delgada é uma técnica de adsorção líquido-sólido, na qual a separação se dá pela diferença de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionária (DEGANI et al., 1998). A CCD está embasada na separação de substâncias por meio das suas diferentes velocidades de migração em razão da afinidade relativa com solventes, fixando-se numa fase sólida (XAVIER et al., 2007). A CCD é um método simples, rápido e econômico, sendo a técnica predominantemente escolhida para o acompanhamento de reações orgânicas (DEGANI et al., 1998).
Neste método a fase estacionária é uma camada fina formada por um sólido granulado (sílica, alumina e poliamida) depositado sobre uma placa que deve atuar como suporte inerte. Na CCD gotas da solução a ser separada são aplicadas em um ponto próximo ao extremo inferior da placa. Após a secagem da placa, ela é colocada em um recipiente contendo a fase móvel, de modo que somente sua base fique submersa. O solvente começa a molhar a fase estacionária e sobe por capilaridade. Após o deslocamento da fase móvel deixa- se a placa secar, e posteriormente é realizada a revelação da placa com reativos que dêem cor as substâncias de interesse (PERES, 2002).
O parâmetro de maior importância na CCD é o fator de retenção, que é a razão entre a distância percorrida pela substância e a distância percorrida pela fase móvel. Esse fator determinará se a substância analisada confere com a substância padrão (DEGANI et al., 1998).
2.2.3 Cromatografia gasosa
A cromatografia gasosa (CG) é uma técnica com alto poder de resolução, possibilitando a análise de várias substâncias em uma mesma
amostra. Dependendo da substância a ser analisada e do tipo de detector empregado pode-se detectar cerca de 10-12g do composto por mL-1, o que permite que pequenas quantidades da amostra sejam analisadas (PERES, 2002).
Esta técnica está baseada na partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel gasosa e a fase estacionária líquida ou sólida, que propiciam a separação da mistura por meio de processos físicos e químicos (DEGANI et al., 1998; PERES, 2002). A grande limitação deste método é a necessidade de que a amostra seja volátil ou termicamente estável (PERES, 2002).
2.2.4 Cromatografia líquida de alta eficiência
A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é uma técnica responsável por grandes avanços na área cromatográfica. A HPLC utiliza suporte com partículas diminutas responsáveis pela alta eficiência, sendo um método adequado para separação de espécies iônicas e macromoléculas (DEGANI et al., 1998). Devido à utilização de colunas com grande capacidade de separação a realização da HPLC requer a utilização de equipamentos específicos, com o uso de bombas e colunas que suportem altas pressões necessárias para eluição da fase móvel. Assim a realização da HPLC necessita da utilização de um cromatógrafo composto de bomba, coluna cromatográfica, detector e registrador (DEGANI et al., 1998; PERES, 2002).
Na HPLC a fase móvel deve ser um solvente que dissolva a amostra sem que qualquer interação química ocorra entre ambas. A fase estacionária dever ser compatível com o detector, possuindo polaridade adequada para permitir a separação adequada dos componentes da amostra. Já a coluna cromatográfica deve ser confeccionada de material inerte e que resista a altas pressões. Por fim os detectores devem apresentar ampla faixa de aplicação, sendo que os mais utilizados são os espectrais (PERES, 2002).
Recentemente a evolução das colunas e da fase estacionária permitiu o uso de partículas muito pequenas, desenvolvendo assim a cromatografia líquida de ultra eficiência (U-HPLC). A U-HPLC é um método cromatográfico com
análises mais rápidas, consumo menor de solventes e com eficiência muito mais elevada que a HPLC. No entanto, apesar de todas as vantagens da U-HPLC, o custo do equipamento e a manutenção requerida devido a utilização de condições extremas de pressão requer ainda maior desenvolvimento da técnica (MALDANER & JARDIM, 2009).
2.2.5 Cromatografia multidimensional
A cromatografia multidimensional é a utilização de técnicas de separação associadas a técnicas de detecção. Na cromatografia multidimensional é comum a utilização de hífen para associar as técnicas utilizadas, assim é comum o surgimento de diferentes siglas para denominar as técnicas (MÜHLEN et al., 2006).
A cromatografia multidimensional, também denominada de cromatografia hifienizada em outros países, combina técnicas cromatográficas e métodos espectrais, de forma que as vantagens de ambos possam ser aproveitadas. A cromatografia produz frações puras ou próximas da pureza de substâncias químicas. Já a espectrofotometria pode produzir informações seletivas para identificação destas substâncias usando padrões ou bibliotecas espectrais (PATEL et al., 2010). Desta forma a combinação dessas duas técnicas tem melhorado substancialmente a análise de substâncias nas últimas duas décadas (CHINCHOLE et al., 2012).
Diante do acoplamento da cromatografia a técnicas espectrais várias siglas surgiram, sendo as mais utilizadas listadas a seguir a: cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrofotômetro de massa (HPLC-MS), cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectroscopia de infravermelha (HPLC-IR), cromatografia gasosa acoplada a espectrofotometria de massas (GC-MS), entre inúmeras outras que surgem a cada método publicado (PATEL et al., 2010; CHINCHOLE et al., 2012).
2.3 Principais usos da cromatografia
A cromatografia tem sido utilizada em diferentes áreas do conhecimento. A grande sensibilidade de técnicas cromatográficas possibilitou o seu uso de forma rotineira em análise de substâncias em baixa concentração, como no caso do doping, controle de alimentos e medicamentos, contaminação ambiental, na toxicologia entre muitas outras aplicações (NAKASHIMA, 2005;
ANVISA, 2012; CHINCHOLE et al., 2012; GILBERT-LÓPEZ et al., 2012; XU et al., 2012).
A química é a área na qual as técnicas cromatográficas são mais utilizadas, sendo muitos os trabalhos publicados que a empregam. Pode ser utilizada para dosar compostos em alimentos (GILBERT-LÓPEZ et al. 2012; XU et al., 2012), no monitoramento de componentes tóxicos no meio ambiente (MARRIOTT et al., 2003) ou mesmo na indústria petroquímica (MÜHLEN et al., 2006). Dessa forma é difícil definir em qual área dentro dessa ciência que mais se utiliza das técnicas cromatográficas.
Na área farmacêutica a cromatografia também tem vasto campo de utilização. Pode ser empregada para dosar princípios ativos de drogas em medicamentos (ANVISA, 2012), isolar componentes medicinais de plantas (LÜ et al., 2012), auxiliar em estudos de farmacocinética (AMORIM et al., 2008; GIORGI et al., 2009), validar técnicas de identificação de agentes (AMORIM et al., 2008), entre inúmeros outros usos.
Na medicina a cromatografia é utilizada para realização de exames anti-doping (NAKASHIMA, 2005; CHINCHOLE et al., 2012), monitorar níveis de drogas em pacientes que estejam em tratamento (VERDIER et al., 2012), realizar diagnóstico de enfermidades (JELLUM, 1988; JEONG et al., 2009), em estudos forenses e na toxicologia (NAKASHIMA, 2005; CHINCHOLE et al., 2012).
Na medicina veterinária a cromatografia tem a possibilidade de ser utilizada em diversos meios, como em estudos de farmacocinética (AMORIM et al., 2008), para monitorar resíduos de drogas em produtos de origem animal (CARDOSO et al., 1999; FELTRIN et al., 2007; ANVISA, 2009), na toxicologia (KAISER et al., 2010; OLIVEIRA-FILHO et al., 2010; LEE et al., 2012), entre outros.
2.4 Uso da cromatografia na toxicologia
2.4.1 A cromatografia na toxicologia forense
O termo ―ciência forense‖ abrange profissões envolvidas na aplicação de ciências sociais e físicas no sistema de justiça criminal. O cientista forense precisa esclarecer, com mínimos detalhes, os fatos ocorridos no sistema criminal utilizando para isso técnicas especializadas para se chegar a conclusões (WOOD et al., 2006). Deste modo a análise de traços de substâncias exige métodos que garantam um alto nível de confiabilidade, pois os resultados finais exercem influência direta sobre o destino de um determinado indivíduo. Assim, o uso da cromatografia associada a técnicas espectrais é de grande importância para a detecção de drogas de abuso, para análises toxicológicas sistemáticas (WOOD et al., 2006; CHINCHOLE et al., 2012), para identificação de drogas utilizadas em doping (CHINCHOLE et al., 2012) e para identificar a causa mortis (MAURER, 1999).
As metodologias para identificação do consumo de drogas ilícitas têm sido desenvolvidas com o auxilio da cromatografia associada a diferentes técnicas espectrais, devido à possibilidade da utilização destas para identificação de pequenas quantidades de inúmeras substâncias em diferentes matrizes.
Exemplos de matrizes que podem ser utilizadas na identificação de drogas de abuso são sangue, urina, fluidos orais, cabelo e o mecônio, utilizado para monitoração do uso de drogas durante a gravidez (CHINCHOLE et al., 2012).
A urina é a matriz biológica mais comumente utilizada nas análises toxicológicas (ABRAHAM & LUTY, 2010). Assim, testes cromatográficos podem determinar inúmeras substâncias nesta matriz. Em teste toxicológico em urina humana, com o intuito de avaliar técnicas cromatográficas, pesquisadores identificaram simultaneamente oito diferentes drogas de abuso ou seus metabólitos, entre elas estavam metanfetamina, anfetamina, morfina, cocaína e seu principal metabólito a bezoilecgonina (TATSUNO et al., 1996).
Em um estudo mais recente foi possível identificar simultaneamente 13 substâncias de abuso e seus metabólitos em amostras de urina humana. Os
pesquisadores utilizaram a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao espectrofotômetro de massa (HPLC-MS). Eles ainda ressaltaram a importância da técnica por eliminar a necessidade de testes de triagem e confirmatórios (DUXBURY et al., 2010).
Apesar de a urina ser comumente utilizada, outra matriz biológica muito utilizada na toxicologia forense é o sangue. Pesquisadores estudaram a identificação das principais drogas de abuso utilizadas em festas ―Rave‖ em amostras de sangue humano preparadas com princípios ativos e em amostras provenientes do Forensic Pathology Department ou do Medico-Legal Department of the North Branch of the National Institute of Legal Medicine. No estudo pôde-se identificar por meio da cromatografia gasosa acoplada a espectrofotometria de massa a metadona, cetamina, buprenorfina, entre outras drogas de abuso (CASTRO et al., 2012).
Em outra pesquisa utilizando a CG-MS, empregando amostras de sangue humano preparadas com os princípios ativos a serem estudados, os pesquisadores puderam identificar simultaneamente sete tipos de anfetaminas.
Para comprovar a aplicação do teste na toxicologia forense, os pesquisadores utilizaram uma amostra de sangue obtida de um cadáver humano que teve a urina positiva para a presença de anfetamina. Nessa amostra utilizou-se a mesma técnica utilizada no experimento isolando simultaneamente duas anfetaminas, demonstrando a eficácia da técnica (KUMAZAWA et al., 2012).
No entanto, há testes que podem utilizar tanto o sangue como a urina, como ocorreu em estudo no qual se identificaram nove tipos de fentanila e 16 outros opioides nessas duas matrizes biológicas de forma confiável em casos de morte, óbitos que ocorrem durante a hospitalização e em mortes súbitas em jovens (GERGOV et al., 2009).
O cabelo também pode ser utilizado como matriz biológica na pesquisa do uso de drogas de abuso. Em um trabalho foi relatado à determinação quantitativa de 13 drogas de abuso e de seus metabólitos em amostras de cabelo humano, por meio da HPLC-MS. Os pesquisadores enriqueceram as amostras de cabelo, provenientes de indivíduos que não eram usuários de drogas, com os princípios ativos que seriam posteriormente pesquisados. Após, as amostras foram extraídas e as substâncias alvo da pesquisa puderam ser identificadas.
Apesar de as amostras de cabelo do estudo terem sido enriquecidas com os princípios ativos, os pesquisadores relataram que utilizam a mesma técnica na rotina do laboratório, obtendo eficácia semelhante à atribuída no estudo (DI CORCIA et al., 2012).
Em outro estudo envolvendo carabinoides, os quais são substâncias que induzem efeitos semelhantes ao tetraidrocanabinol (principal substância psicoativa encontrada nas plantas do gênero Cannabis), os pesquisadores conseguiram isolar 22 substâncias dessa classe em cabelo humano. Foram utilizadas tanto amostras embebidas com substâncias padrão como amostras de usuários crônicos de substâncias com carabinoides em sua composição. Nas amostras preparadas foi possível isolar os 22 carabinoides envolvidos na pesquisa, e nas amostras dos usuários foi possível também isolar carabinoides em todas as oito amostras testadas (HUTTER et al., 2012).
Outra utilização da cromatografia na toxicologia forense são os casos em que se utiliza drogas para a prática de crimes. A vítima recebe determinada substância que cause sonolência, amnésia ou inconsciência e é roubada ou até mesmo sofre abuso sexual. Assim, métodos cromatográficos acoplados a espectrofotometria de massa podem identificar simultaneamente 128 ou mais drogas. Em um estudo, pesquisadores conseguiram isolar de uma amostra de urina enriquecida com 128 padrões das drogas utilizadas nestes crimes, entre elas estavam opioides, anfetaminas, barbitúricos, alucinógenos, benzodiazepínicos, relaxantes musculares e outras drogas (ADAMOWICZ &
KALA, 2010).
Testes semelhantes ao descrito anteriormente podem também serem aplicados no sangue. Pesquisadores utilizaram da U-HPLC associada ao espectrômetro de massa para identificar 46 compostos utilizados na facilitação de crimes ou de drogas de abuso no sangue de vítimas de abuso sexual (BIRKLER et al., 2012).
Apesar do uso de matrizes biológicas como o sangue e a urina, algumas vezes não há a disponibilidade de tecidos em bom estado de conservação, como no caso de corpos que são encontrados em avançado estado de decomposição. Nestes casos, a detecção de substâncias que possam estar envolvidas na causa da morte pode ser realizada em larvas de insetos (BEYER et
al., 1980; GOSSELIN et al., 2010), que se alimentam dos tecidos em decomposição, a qual pode ser realizada por meio da cromatografia (BEYER et al., 1980).
O primeiro trabalho que relatou o uso da cromatografia para identificação de compostos relacionados com a morte do indivíduo em larvas de insetos, foi publicado em 1980. O trabalho descreveu um caso de um corpo que foi encontrado aproximadamente 14 dias após a morte e estava em avançado estado de decomposição. Havia a suspeita de suicídio pelo consumo de uma alta dose de fenobarbital, no entanto não havia tecido humano para se realizar os testes toxicológicos. Os pesquisadores coletaram larvas de insetos que se alimentavam do cadáver, extraíram a amostra e realizaram a CG e CCD, confirmando a overdose por fenobarbital (BEYER et al., 1980).
Em outro trabalho semelhante os pesquisadores utilizaram de tecido cerebral de ratos e suínos e de larva de Lucilia sericata. Inicialmente eles administraram metilfenidato por via intravenosa nos ratos e posteriormente realizaram a eutanásia, separando o cérebro no qual foram colocadas as larvas de insetos. No tecido cerebral de suínos o metilfenidato foi adicionado diretamente, com posterior colocação das larvas. Nas larvas dos dois tipos de tecido testado foi possível o isolamento do metilfenidato por cromatografia líquida associada ao espectrofotômetro de massa. Assim o método mostrou-se como alternativa toxicológica para o estudo do metilfenidato em larvas encontradas em corpos em decomposição (BUSHBY et al., 2012).
No controle do doping em atletas o principal objetivo do emprego das técnicas de cromatografia é a monitorização do uso ou do abuso de drogas que podem estimular o crescimento muscular, aumentar a resistência em competições, reduzir o peso corporal ou reduzir a dor causada por esforço excessivo. (MAURER, 1999; BRABANTER et al., 2011; THOMAS et al. 2011;
DESHMUCK et al. 2012; THOMAS et al., 2012; WADA, 2012).
O uso de desmopressina é proibido entre atletas de elite, por mascarar a ação de drogas diuréticas (WADA, 2011). Diante disto pesquisadores desenvolveram, por meio da cromatografia acoplada ao espectrofotômetro de massa, um teste para detecção de demospressina na urina humana, e
consideraram a técnica adequada para laboratórios que trabalham com o controle de doping (THOMAS et al., 2011).
Além da desmopressina inúmeros outros compostos são proibidos para atletas de elite e estão listados na The 2012 Prohibited List da World Anti-Doping Agency (WADA, 2011). A WADA foi criada em 1999 como agência independente, financiada pelo movimento desportivo de diferentes governos do mundo, e estabelece que muitos dos testes anti-doping utilizem da cromatografia acoplada a técnicas espectrométricas. Ela tem como objetivo a pesquisa científica, desenvolvimento de métodos de detecção de doping e acompanhamento do código mundial anti-doping (WADA, 2012), demonstrando assim a importância das técnicas cromatográficas neste tipo de exame.
2.4.2 A cromatografia na toxicologia veterinária
Na medicina veterinária a cromatografia tem larga utilização em estudos que trabalham com intoxicações, seja para monitorar princípios ativos (LEE et al., 2012) ou para identificar substâncias causadoras de intoxicações em animais (KAISER et al., 2010; OLIVEIRA-FILHO et al., 2010; RIVERO et al., 2011).
Nos casos das intoxicações, é de fundamental importância identificar os princípios ativos envolvidos, com o intuito de evitar que novos episódios ocorram, que a terapêutica a ser utilizada seja a mais adequada e é indispensável em situações que envolvam litígio. Nas intoxicações, os animais podem, muitas vezes, apresentar sinais agudos e morte rápida, sem que o agente causador seja identificado. No entanto, a identificação da droga ou veneno pode preservar a vida de outros animais (XAVIER et al., 2007).
Em intoxicações causadas intencionalmente a cromatografia pode auxiliar e até mesmo servir como prova da causa mortis. Em um estudo que envolveu 50 amostras do conteúdo gástrico de cães e gatos, que possuíam como hipótese diagnóstica a intoxicação exógena por aldicarb, foi realizada a cromatografia em camada delgada como teste qualitativo quanto à presença desta substância. O estudo envolveu ainda 50 amostras de alimentos que
continham material sugestivo do agente tóxico, as quais tinham sido utilizadas como iscas para intoxicar animais. Todas as amostras testadas por CCD, tanto o conteúdo gástrico como os alimentos, foram positivas para a presença do aldicarb, que demonstrou a adequação da técnica para o auxílio no diagnóstico de intoxicações (XAVIER et al., 2007).
Em outro estudo, em amostrais estomacais de cães e gatos, envolvendo a intoxicação por pesticidas domésticos e raticidas, 68 amostras foram analisadas por meio da CCD para detecção de carbamatos, warfarina e estricnina, e por HPLC para detecção de diferentes carbamatos. As amostras eram provenientes do Laboratório de Toxicologia da Universidade Federal de Santa Maria, e foram recebidas como casos fatais suspeitos de intoxicações. No estudo foi possível confirmar que em 54,4% das amostras havia substâncias tóxicas, sendo 39,9% carbamato, 4,4% warfarina, 8,8% estricnina e 1,4%
fluoroacetato de sódio (BULCÃO et al., 2010).
Apesar de muitas vezes as intoxicações em pequenos animais serem causadas intencionalmente (XAVIER et al., 2007; BULCÃO et al., 2010) muitas podem ocorrer ao acaso, sem causa aparente, de forma aguda, o que pode rapidamente causar a morte dos animais. Em um caso em que dois cães apresentaram sinais de intoxicação aguda, com morte de um dos animais poucas horas após o aparecimento dos sintomas, foi diagnosticada a intoxicação por pentobarbital por meio da CG-MS. Neste caso após a morte de um dos animais foi realizada a necropsia quando foi encontrando grande quantidade de carne crua e pêlos de cavalo, material o qual foi utilizado para o diagnóstico toxicológico. A urina do animal que sobreviveu e do que veio a óbito foram submetidos a CG-MS, o que revelou a presença de pentobarbital. Ao investigar as proximidades da propriedade o proprietário dos animais encontrou um equino parcialmente enterrado que tinha sido submetido a eutanásia, dois anos antes, com grande quantidade do fármaco. Parte da carcaça do animal foi submetida a CG-MS quando foi encontrada concentração de 4.000 ppm de pentobarbital no tecido muscular do animal. Além do equino, outra carcaça de cão foi encontrada em local próximo, da qual também foi detectada a presença de pentobarbital no conteúdo gástrico. Assim os autores concluíram que a causa das intoxicações dos
animais foi pelo consumo da carne do animal que foi submetido a eutanásia (KAISER et al., 2010).
Além dos pesticidas domésticos serem causas de intoxicações em pequenos animais, outras causas seriam a ingestão de plantas que contém toxinas (MOUSER et al., 2007) ou quando atacam animais venenosos (SONNE et al., 2008).
Os cães, principalmente, têm o histórico de atacarem sapos do gênero Bufo, que possuem toxinas que podem ocasionar o óbito do animal (REEVES, 2004). Em um caso, um cão foi encontrado morto pelo proprietário e o corpo do animal foi encaminhado para o Setor de Patologia Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. No exame macroscópico e microscópico as alterações foram inespecíficas, achados comumente encontrados em diferentes tipos de intoxicações. O conteúdo gástrico, estômago, fígado e rins foram coletados para a análise toxicológica. Para isso, foi utilizada a CCD e cromatografia gasosa com detector de ionização de chama. As análises foram negativas para a detecção de cumarínicos, arsênico, estricnina, organofosforados, carbamato, cianeto e nitritos. No entanto, no ambiente onde o animal habitava, foram encontrados sapos do gênero Bufo e por isso se desconfiou de um possível envenenamento por toxinas expelidas pelo anfíbio. Assim os pesquisadores realizaram a análise toxicológica por meio da utilização do veneno retirado das glândulas do sapo como padrão de referência, confirmando o diagnóstico pela CCD e pela CG (SONNE et al., 2008).
Plantas tóxicas presente nos quintais, utilizadas como plantas ornamentais, como a Ricinis communis (mamona), podem estar envolvidas nas intoxicações em pequenos animais (MOUSER et al., 2007). A R. communis é considerada um das mais fortes plantas tóxicas e é listada na categoria B de agente de bioterrorismo pela Center for Disease Control and Prevention (CDC, 2000). Em um relato envolvendo um cão Mastiff de 12 semanas, que morreu após ingerir sementes de R. communis, foi utilizado LC-MS para confirmar o diagnóstico por meio de amostras do conteúdo estomacal na qual foi confirmada a presença de ricinina (MOUSER et al., 2007).
Em animais de produção as intoxicações geralmente ocorrem em forma de surtos e é de grande interesse que a causa do surto seja esclarecida,
nesses casos, o emprego da cromatografia pode ser muito útil. Neste sentido a cromatografia tem sido utilizada para detecção dos agentes envolvidos nestes surtos. Os organofosforados são inseticidas que podem ser utilizados no combate a ectoparasitas, no entanto a não observância da recomendação do fabricante pode causar intoxicações em animais. Um relato de atendimento clínico a 26 animais pulverizados com uma sobredose de diazinon, no qual 11 animais vieram à óbito, obteve-se o diagnóstico confirmado por meio da CCD. Apesar do histórico e dos sinais clínicos dos animais, durante a necropsia de dois bovinos adultos não foi possível constatar nenhuma alteração nos exames macro e microscópicos que fossem dignos de nota. Mas os pesquisadores conseguiram detectar, por meio da CCD, o princípio ativo em amostras de fígado e cérebro de um dos animais necropsiados (CASTRO et al., 2007).
Em outro surto de intoxicação por organofosforados envolvendo 26 animais dos quais 20 vieram a óbito, foi feito o uso da cromatografia em camada delgada como método qualitativo e a cromatografia gasosa como método quantitativo. Este surto ocorreu em uma propriedade vizinha de uma empresa de pulverização agrícola. Devido aos sinais clínicos dos animais e ao histórico relatado pôde-se realizar técnicas cromatográficas para confirmar a suspeita, após isolamento de carbamato e organofosforado dos órgãos dos animais. A análise quantitativa por cromatografia gasosa para carbamato e organofosforados no conteúdo do abomaso de um animal detectou 0,93 µg/g de mancozebe e 0,07µg/g de forato (OLIVEIRA-FILHO et al., 2010).
No Uruguai houve um surto de intoxicação por organoclorados (endosulfan) com a morte de 51 bovinos, o qual pôde ser totalmente esclarecido por meio das técnicas cromatográficas. O surto ocorreu após um avião de pulverização agrícola ter perdido acidentalmente sua carga com solução contendo o princípio. Na tarde do dia do incidente os animais foram liberados para o pasto contaminado com a solução. Após 24 horas, os animais apresentaram os sinais clínicos de intoxicação e os técnicos do Laboratório Regional Noroeste da Direção de Laboratórios Veterinários do Ministério de Agricultura e Pesca do Uruguai foi chamado para visitar a propriedade e colher amostras de água, peixes mortos e de seis animais que foram necropsiados para determinação dos metabólitos tóxicos. Nas amostras utilizou-se a técnica de cromatografia gasosa,
identificando-se o endosulfan no tecido adiposo, fígado, conteúdo ruminal dos bovinos, nos peixes mortos e na água de um riacho que também foi atingido (RIVERO et al., 2011).
A cromatografia pode também ser utilizada em estudos experimentais na qual muitas vezes há a necessidade de dosar princípios ativos dos agentes envolvidos na pesquisa. Em estudo com Bacharis megapotamica var. weirii, em búfalos, os pesquisadores conseguiram induzir a intoxicação em todos os cinco animais do experimento, sendo que quatro morreram com 18-49 horas após a ingestão da planta. Neste estudo uma subamostra de B. megapotamica var. weirii foi separada para dosagem de tricotecenos macrocíclicos. Para tanto foi utilizada a U-HPLC com espectrometria de tempo-de-vôo de alta resolução e espectrometria de massa. Por esta técnica foi possível dosar 51 tricotecenos macrocíclicos, e os pesquisadores chegaram à conclusão que a técnica utilizada provou ser uma técnica eficaz para dosagem desses compostos (OLIVEIRA- FILHO et al., 2012).
O consumo de plantas tóxicas é responsável por grande número de morte em animais (RIET-CORREA & MEDEIROS, 2001), e estudos são norteados na tentativa de esclarecer as causas da morte (KUPPER et al., 2010) ou os princípios envolvidos na intoxicação (MOUSER et al., 2007).
Pesquisadores de Zurique, Suíça, relataram um caso em que uma novilha apresentou sinais de intoxicação. O animal foi tratado com carvão vegetal e fluidoterapia intravenosa. Após leve melhora a novilha foi a óbito três dias após o início dos sintomas. No histórico do animal sabia-se que o mesmo teve acesso a um pasto úmido pertencente à área de conservação da propriedade, o qual tinha presença de Colchicum autumnale, uma planta tóxica da região. Ao inspecionar a pastagem pôde-se observar que essas plantas haviam sido pastejadas. Para confirmar o diagnóstico a urina e sangue do animal foram colhidos, dois dias após o início dos sintomas, e submetidos a LC-MS/MS, quando foi confirmada a presença da principal toxina dessa planta, a colchicina (KUPPER et al., 2010).
No Brasil várias plantas são incriminadas de causar morte súbita nos animais. Dentre estas plantas encontram-se as Mascagnia rigida hoje nomeada de Amorimia rigida (CUNHA et al., 2012) e a Pallicourea marcgravii (BARBOSA et
al., 2003). Muitos autores associam a morte súbita à presença da substância tóxica monofluoroacetato de sódio (MF) ou ácido monufluoracético, o qual tem sido identificado em diversos estudos por meio de técnicas cromatográficas (CUNHA et al., 2012; LEE et al., 2012).
Em estudo recente os pesquisadores conseguiram isolar o MF, por meio de HPLC acoplada a um espectrômetro de massa, com interface APCI (ionização química à pressão atmosférica), de amostras de folhas maduras P.
marcgravii provenientes dos Estados de Goiás e São Paulo, nas concentrações de 0,10 e 0,17% respectivamente. Neste mesmo estudo utilizando a mesma técnica também foi possível isolar o MF de algumas espécies Amorimia, no entanto em concentrações bem menores que a descrita para P. marcgravii. (LEE et al., 2012). Em outro estudo envolvendo A. rigida, amostras da planta foram colhidas no município de Cabeceira, Estado da Paraíba. Neste também foram identificados o MF, no entanto, foi eles utilizada a CCD e a espectofotometria de infravermelho como técnicas para avaliação da presença de MF (CUNHA et al., 2012).
Além das plantas que causam intoxicações agudas nos animais (BARBOSA et al., 2003; CUNHA et al., 2012), há um outro grupo de plantas no Brasil que causam fotossensibilização e intoxicações crônicas nos animais (ALBERNAZ et al., 2010; SOUZA et al., 2010). Uma das teorias é que a saponina, produzida por espécies de gramíneas utilizadas em pastagens, esteja envolvida na patogenia da doença (BRUM et al., 2007).
O Panicum dichotomiflorum é uma das plantas, que contêm saponinas, incriminadas de causarem fotossensibilização hepatógena nos animais. Em um surto de fotossensibilização em três rebanhos de ovinos no município de Casa Nova, no Estado da Bahia, foi utilizada da HPLC acoplada a espectrofotometria para avaliarem a presença de saponinas no P. dichotomiflorum. No surto de 365 animais, que foram alocados na pastagem, 81 foram afetados pela fotossensibilização e 39 morreram. Foram colhidas duas amostras da pastagem e realizaram CCD e a HPLC acoplada a espectrofotômetro. Após a análise os autores puderam identificar a presença de protodioscina e metilprotodioscina, o que sugeriu que o surto de fotossensibilização foi causado por estas saponinas (RIET-CORREA et al., 2009).
O gênero Brachiaria também tem sido associado a casos de intoxicação crônica causando uma perda progressiva de peso nos animais ou casos de fotossensibilização (SOUZA et al., 2010). Em uma pesquisa envolvendo a intoxicação por Brachiaria, em que foram avaliados dois surtos de intoxicação em um experimento com cordeiros em pastagem com a mesma gramínea, foi determinada a presença de saponinas por meio da CCD como meio qualitativo e HPLC acoplado a um detector de evaporação por dispersão de luz como análise quantitativa. Os pesquisadores encontraram valores de metilprotodioscina que variaram de 0,92 a 1,13%, e de protodioscina de 0,88 a 1,62% (ALBERNAZ et al., 2010).
Além dos casos em que a intoxicação por Brachiaria já esteja instalada, a cromatografia tem auxiliado pesquisas para que seja determinado os fatores envolvidos na produção de saponinas. Em estudo realizando a CCD como método qualitativo e a espectrofometria como método quantitativo, foi possível estabelecer que, no período de 2002 a 2003, em canteiros plantados com B.
brizantha e B. decumbens, os maiores níveis de saponinas ocorreram na fase mais madura da planta, sugerindo que os animais estão mais sujeitos a intoxicação durante esta fase (BRUM et al., 2009).
2.4.3 A cromatografia para identificação de substâncias nocivas em alimentos
A ausência de Boas Práticas Veterinárias na criação de animais de produção pode acarretar o uso indiscriminado de medicamentos sem a preocupação do resíduo destes no produto final o que pode significar risco à saúde pública (ANVISA, 2006; ANVISA, 2009). Esses riscos podem ser traduzidos pela ocorrência de resistência bacteriana (ANVISA, 2006; ANVISA, 2009), reações alérgicas que podem ocasionar choque anafilático (ANVISA, 2009), entre outros. Assim a utilização da cromatografia tem auxiliado na detecção destas substâncias em produtos de origem animal (CARDOSO et al., 1999; FELTRIN et al., 2007; ANVISA, 2009).
Os resíduos de antibióticos são quaisquer substâncias, mistura de antibióticos, derivados específicos, metabólitos ou produtos de reação dos
antibióticos presentes nos alimentos para o homem ou para os animais, que possam ser considerados de importância toxicológica (MANJARREZ et al., 2012).
No entanto, há relativamente poucos métodos analíticos capazes de medir as concentrações residuais de muitos antibióticos. A baixa solubilidade de alguns antibióticos em solventes orgânicos torna difícil o desenvolvimento de técnicas para extrair seus resíduos de matrizes biológicas. Outros antibióticos são demasiadamente instáveis termicamente ou insuficientemente voláteis para serem processados por CG ou CG-MS. Dessa forma várias técnicas de detecção de resíduos de antibióticos foram desenvolvidas utilizando HPLC. Apesar disso, muitas vezes somente a HPLC não é suficiente para detecção de traços desses medicamentos, sendo necessário associar a espectrofotometria de massas (KENNEDY et al., 1998). Assim, muitos pesquisadores têm publicado trabalhos que descrevem a detecção de antibióticos por técnicas cromatográficas (FELTRIN et al., 2007; PIETRÓN et al., 2011; MANJARREZ et al., 2012).
Em um estudo que trabalhou com resíduos de sulfadimetoxina, os pesquisadores detectaram resíduos do referido medicamento por HPLC. No estudo as amostras de leite foram enriquecidas com solução padrão de sulfadimetoxina, posteriormente foi realizada a extração com cartucho comercial específico. Após a extração, as amostras foram submetidas a um cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector ultravioleta (UV). Por meio dessa técnica foi possível recuperar entre 76 a 90% do padrão comercial adicionado à amostra (FELTRIN et al., 2007).
Outro grupo de antibióticos muito utilizado em animais de produção são as penicilinas. Estima-se que 3 a 10% da população sejam susceptíveis a reações alérgicas quando expostas à alimentos contendo esse grupo de medicamentos (ANVISA, 2009). Deste modo a cromatografia tem sido utilizada como ferramenta de apoio na detecção de penicilinas em produtos de origem animal.
Pesquisadores utilizaram amostras de leite e carne enriquecidas com penicilina G, oxacilina e cloxacilina. As amostras foram extraídas e posteriormente submetidas a HPLC com detector UV. Os autores puderam concluir que os métodos para determinação simultânea de penicilinas no leite e carne apresentaram resultados favoráveis (KUKUSAMUDE et al., 2012).
Além dos antibióticos, outras drogas podem ser utilizadas no tratamento dos animais de produção, como os antiinflamatórios e antihelmínticos, no entanto elas também podem deixar resíduos nos produtos finais (SOUZA et al., 2003; LOBATO et al., 2006; GENTILI et al., 2012). Recentemente foi utilizado a cromatografia líquida acoplada ao espectofotômetro de massa, o que permitiu a detecção simultânea de 15 diferentes agentes antiinflamatórios não esteroidais, no leite e músculo de bovinos (GENTILI et al., 2012).
Já em relação aos antihelmínticos, pesquisadores utilizaram a HPLC ligada a detector de fluorescência para dosar resíduos de ivermectinas no fígado de bovinos. Os pesquisadores utilizaram fígado livre de resíduos dessas drogas, separaram as amostras e posteriormente enriqueceram-nas com abamectina, doramectina e ivermectina. Após a extração das amostras, o extrato derivativo foi analisado por HPLC-FI. A taxa de recuperação para as amostras adicionadas de solução padrão foi de 101,1; 101,0 e 96,7%, com coeficientes de variação de 11,2; 9,2 e 12,5% para abamectina, doramectina e ivermectina, respectivamente (SOUZA et al., 2003). Em outro estudo pesquisadores colheram 168 amostras de leite que estavam sendo comercializadas em supermercados de Campinas – SP e da região metropolitana do Rio de Janeiro. Essas amostras foram analisadas por HPLC com detector por fluorescência, e foi detectado que 17,8% das amostras eram positivas para ivermectinas, no entanto as amostras não continham resíduos em quantidade superior aos estabelecidos pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (LOBATO et al., 2006).
Outros agentes tóxicos comuns de alimentos de origem animal são as micotoxinas. Essas toxinas podem ser transmitidas para os alimentos após o consumo de rações contaminadas. Devido a isso pesquisadores têm utilizado de métodos cromatográficos para detecção desses contaminantes (NETTO et al., 2002). Em um estudo realizado com 75 amostras de queijo foram detectadas, por meio de HPLC usando detector de fluorescência, que 56 (74,7%) estavam contaminados com aflotoxina M1 (PRADO et al., 2000). Em outra pesquisa foi realizado teste para detectar as aflotoxinas no leite de bovinos. A HPLC foi utilizada e puderam constatar que 19 (52,8%) amostras estavam contaminadas, mas os níveis da aflotoxina M1 estavam dentro dos padrões tolerados pela legislação brasileira (PEREIRA et al., 2005).
Por fim, há drogas que por vezes são utilizadas, mas sem autorização para seu emprego no Brasil. Dentre elas estão os esteroides anabolizantes, os quais também podem deixar resíduos nos produtos de origem animal. Diante disto, métodos cromatográficos são importantes ferramentas para a análise dessas drogas (DUARTE et al., 2002). Com auxílio da cromatografia líquida de ultra eficiência associada a espectrofotometria de massa pesquisadores puderam desenvolver metodologia para detectar simultaneamente 34 anabolizantes esteroides em músculo bovinos. No estudo, amostras de tecido muscular bovino, livres destas drogas foram enriquecidas com padrões das mesmas, posteriormente as amostras foram extraídas e submetidas a U-HPLC-MS/MS, quando os esteroides anabolizantes foram identificados (VANHAECKE et al., 2012).
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O uso da cromatografia abrange muitas áreas do conhecimento, e suas funcionabilidades são inumeráveis. Os trabalhos envolvendo essas técnicas multiplicam-se dia a dia, o que torna difícil acompanhar sua evolução nas diferentes áreas.
Na medicina veterinária, apesar do uso estar relatado em diferentes áreas, seu emprego está restrito a área toxicológica e na detecção de contaminantes de alimentos de origem animal. Mesmo na área toxicológica a quantidade de trabalhos que utilizam diretamente a cromatografia é pouca, a grande parte utiliza-a como uma ferramenta muitas vezes apenas citada, descrevendo muito sucintamente qual método cromatográfico foi utilizado, o que torna difícil a repetibilidade da metodologia.
Apesar da grande utilidade da cromatografia, os equipamentos empregados nas técnicas mais modernas têm alto custo e demanda de pessoal especializado para operá-los. Assim o uso dessas técnicas fica restrita e muitas vezes há a impossibilidade de realizá-las, e por vezes diagnósticos toxicológicos não podem ser estabelecidos com precisão.
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