UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
KELLY ROSE TAVARES NEVES
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA PENTOXIFILINA EM MODELO EXPERIMENTAL DA DOENÇA DE PARKINSON: UMA ABORDAGEM COMPORTAMENTAL, NEUROQUÍMICA E IMUNOHISTOQUÍMICA
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA PENTOXIFILINA EM MODELO EXPERIMENTAL DA DOENÇA DE PARKINSON: UMA ABORDAGEM COMPORTAMENTAL, NEUROQUÍMICA E IMUNOHISTOQUÍMICA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Farmacologia.
Orientador (a): Profa. Dra. Glauce Socorro de
Barros Viana
Co-Orientadora: Profa. Dra. Geanne Matos de
Andrade
Fortaleza
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Ciências da Saúde
N422a Neves, Kelly Rose Tavares.
Avaliação dos efeitos da pentoxifilina em modelo experimental da doença de Parkinson: uma abordagem comportamental, neuroquímica e imunohistoquímica / Kelly Rose Tavares Neves. – 2014.
101 f. : il.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Doutorado em Farmacologia, Fortaleza, 2014.
Área de Concentração: Farmacologia.
Orientação: Profa. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana. Coorientação: Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade.
1. Pentoxifilina. 2. Doença de Parkinson. 3. Oxidopamina. 4. Ratos. I. Título.
À minha orientadora profa Dra Glauce Viana, obrigada por todos os ensinamentos, pelo seu compromisso na orientação cientifica e efetiva participação neste trabalho.
À profa Dra Geanne de Matos Andrade, obrigada por ter aberto as portas do Laboratório de Neurociências e Comportamento para mim, e pela cooperação em várias etapas no desenvolvimento deste trabalho.
À profa Dra Maria da Graça Naffah-Mazzacoratti, obrigada por ter me recebido em seu laboratório na UNIFESP, onde fiz pare da tese. Um agradecimento especial à pós-doutoranda Sandra Regina Perosa que me ajudou e me ensinou imunohistoquimica e microscopia.
À profa Dra Gerly Anne de Castro Brito pelas contribuições valiosas nas técnicas de imunohistoquimicas, e às técnicas do Laboratório de Morfologia: Socorro e Josyane.
As professoras Dra. Flávia Almeida Santos e Dra. Nylane Maria Nunes de Alencar por participarem do meu exame de qualificação.
Ao pessoal do Laboratório de Neurofarmacologia, pela ajuda nos experimentos e pela amizade, em especial às técnicas Vilani e Lena.
Aos meus pais, José Caldas e Antonia Tavares, pelo constante incentivo aos meus estudos, pelo amor, dedicação, renuncia, proteção e apoio dedicados a mim durante toda minha vida.
Às minhas irmãs Suyane Britto e Karisia Caldas, pela amizade, mesmo a distância, sempre me apoiando e celebrando comigo as minhas vitorias.
Aos amigos do Laboratorio de Neurociencias e Comportamento, pela ajuda nos experimentos, apoio nos momentos difíceis e pelas alegrias nos momentos de distração: Ana Paula, Julliana Catharina, Analu, Juliana Fernandes, Marta Regina, Carolina Sousa, Ana Carla, Diego Fernandes, Amanda, Rafaelly, Patricia e Arnaldo.
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA PENTOXIFILINA EM MODELO EXPERIMENTAL DA DOENÇA DE PARKINSON: UMA ABORDAGEM COMPORTAMENTAL, NEUROQUÍMICA E IMUNOHISTOQUÍMICA
(marcador de astrócitos) reduziu-se no mesencéfalo do grupo lesionado e tratado com PTX, em relação ao lesionado e não-tratado, e para OX-42 (marcador de micróglia) foi reduzida no corpo estriado. Ensaios imunohistoquímicos para TNF-alfa mostraram que o aumento da imunomarcação, no corpo estriado do grupo lesionado (lado direito), foi atenuado após PTX. Observaram-se resultados semelhantes nas áreas CA1 e CA3 do hipocampo. Estes dados mostram que, pelo menos parte, a ação neuroprotetora da PTX deve-se à inibição de TNF-alfa, resultado este reforçado pelos efeitos anti-COX-2 e anti-iNOS, vistos no estriado e hipocampo dos grupos lesionados, após tratamento com PTX. Por fim, PTX em células SH-SY5Y mostrou efeitos citoprotetor, anti-inflamatório e antioxidante. Nossos resultados sugerem, assim, potencial efeito neuroprotetor da PTX, possivelmente decorrente de sua propriedade anti-inflamatória e da atuação benéfica nos sistemas dopaminérgico, glutamatérgico e glicinérgico, tornando-a uma opção terapêutica para o tratamento de doenças neurodegenerativas como a DP.
EVALUATION OF THE EFFECTS OF PENTOXIFYLLINE IN AN
EXPERIMENTAL MODEL OF PARKINSON'S DISEASE: BEHAVIORAL,
NEUROCHEMICAL AND IMMUNOHISTOCHEMICAL APPROACHES
Pentoxifylline (PTX) is a methylxanthine derivative that produces pharmacological effects by mechanisms as phosphodiesterase inhibition, increase in cAMP and cGMP levels and antagonism of A2A adenosine receptors. The drug also shows anti-inflammatory properties, due to the inhibition of TNF-alpha synthesis. The present work studied, by behavioral, neurochemical, histological and immunohistochemical methods,
the possible neuroprotective PTX effects in an experimental model of Parkinson’s
of the 6-OHDA-PTX-treated groups. Similar results were observed for DAT. As far as immunohistochemistry data are concerned, we showed that, while the immunoreactivity for GFAP (astrocyte marker) was reduced in the mesencephalic tissue of the lesioned group after PTX treatments, as related to the untreated lesioned group, the same effect occurred with the immunoreactivity for OX-42 (microglia marker) in the striatum. Furthermore, the increase in the number of immunopositive cells for TNF-alpha (a pro-inflammatory cytokine) in the right lesioned striatum was attenuated, after PTX treatments. Similar results were seen in the CA1 and CA3 hippocampal areas, suggesting that PTX is possibly a neuroprotective drug and that this action is, at least in part, due to its TNF-alpha inhibitory activity. These results were supported by anti-COX-2 and anti-iNOS effects on the hippocampus and striatum of the lesioned group, after PTX treatments. Additionally, in SH-SY5Y cells (an in vitro model of PD), PTX also presented cytoprotective, anti-inflammatory and antioxidant effects. In conclusion, our results showed that the potential neuroprotective effects of PTX are a consequence of its anti-inflammatory activity and beneficial action on the dopaminergic, glutamatergic and glycinergic systems. Thus, our data suggest that PTX is a potential drug to be included into clinics, as a new therapeutic strategy for PD treatment.
Figura 1 Representação esquemática dos fatores etiológicos e patogênicos 18 envolvidos da Doença de Parkinson e alvos potenciais de drogas neuroprotetoras
Figura 2 Mecanismos de neurotoxicidade induzida por 6-OHDA 29
Figura 3 Estrutura Química da Pentoxifilina 31
Figura 4 Tempo da resposta inflamatória no parkinsonismo 37 Figura 5 Animal no teste rotacional induzido por apomorfina 44
Figura 6 Animal no teste do Campo Aberto 45
Figura 7 Labirinto aquático sinalizado e o animal sobre a plataforma 46 Figura 8 Desenho esquemático do Protocolo utilizado para o teste do Nado 47 Forçado
Figura 9 Efeito da PTX sobre o comportamento rotacional induzido por 56 apomorfina (0,6 mg/kg, i.p.) em modelo de DP em ratos
Figura 10 Efeito da PTX na atividade locomotora avaliada do teste do Campo 58 aberto, em relação ao número de cruzamentos/ 5 minutos
Figura 11 Efeito da PTX no comportamento de rearing avaliado no teste do 59 Campo aberto em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA
Figura 12 Efeito da PTX sobre a memória operacional avaliado através do 61 Labirinto Aquático Sinalizado (Teste Cued Water Maze)
Figura 13 Efeito da PTX sobre o desespero comportamental avaliado através do 63 teste do Nado Forçado
Figura 14 Efeito do PTX sobre as concentrações estriatais de DA 65 Figura 15 Efeito do PTX sobre as concentrações estriatais de DOPAC 66 Figura 16 Efeito do PTX sobre as concentrações estriatais de Glutamato 70 Figura 17 Efeito do PTX sobre as concentrações estriatais de Glicina 70 Figura 18 Fotomicrografias representativas da coloração com Cresil Violeta em 72 áreas estriatais (400X)
Figura 19 Fotomicrografias representativas da coloração com Cresil Violeta em 74 hipocampo e córtex temporal (100X)
Figura 20 Fotomicrografias representativas da coloração com Fluoro Jade em 76 corpo estriado direito
Figura 23 Densidade óptica em cortes estriatais lesionados com 6-OHDA e quanto 80 a imunoreativiade para TH
Figura 24 Fotomicrografias representativas da imunomarcação para TH em cortes 81 mesencefálicos (40X).
Figura 25 Fotomicrografias representativas da imunomarcação para DAT em 83 cortes estriatais
Figura 26 Densidade óptica em cortes estriatais lesionados com 6-OHDA e quanto 84 a imunoreativiade para DAT
Figura 27 Fotomicrografias representativas da imunomarcação para GFAP em 86 área mesencefálica (40X)
Figura 28 Fotomicrografias representativas da imunomarcação para GFAP de 87 áreas mesencefélicas (400X)
Figura 29 Fotomicrografias representativas da imunomarcação para GFAP de 88 hipocampo (100X)
Figura 30 Fotomicrografias representativas da imunomarcação para OX-42 em 90 corpo estriado (400X)
Figura 31 Fotomicrografias representativas da imunomarcação para TNF-α em 92 corpo estriado (400X)
Figura 32 Fotomicrografias representativas da imunomarcação para TNF-α em 93 hipocampo (100X)
Figura 33 Fotomicrografias representativas da imunomarcação para COX-2 em 95 corpo estriado (400X)
Figura 34 Fotomicrografias representativas da imunomarcação para iNOS em 97 hipocampo e córtex temporal (400X)
Figura 35 Fotomicrografias representativas da imunomarcação para iNOS em 98 corpo estriado (400X)
Figura 36 Efeito da PTX na viabilidade celular no ensaio de MTT em cultura de 99 células SH-SY5Y expostas a 6-OHDA
Quadro 1 Efeitos da Pentoxifilina 34
Quadro 2 Protocolo de tratamento experimental 43
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Efeito da PTX sobre o comportamento rotacional contra-lateral induzido por 57 apomorfina (0,6 mg/kg, i.p.)
Tabela 2 - Efeito da PTX nos números de cruzamentos e rearings avaliados pelo teste do 60 Campo Aberto
Tabela 3 - Efeito da PTX sobre a memória espacial avaliado através do Labirinto 62 Aquático versão Sinalizada
Tabela 4 - Efeito da PTX no teste do Nado Forçado em modelo de DP em ratos 64
Tabela 5 - Efeito do PTX sobre as concentrações estriatais de DA e DOPAC 67
μg Micrograma 6-OHDA 6-hidroxidopamina COX-2 Cicloxigenase 2
DA Dopamina
DAT Transportador de Dopamina DOPAC Ácido diidroxifenilacético DP Doença de Parkinson
FO Falso operado
g Grama
GABA Ácido gama amino butírico
GAD Descarboxilase do ácido glutâmico GDNF Fator neurotrófico derivado da glia GFAP Glial fibrillary acidic protein GSH Glutationa reduzida
GSK Glicogênio sintase quinase HDAC Histona desacetilases HSP Heat shock protein IL Interleucina
iNOS Oxido Nítrico ~sintetase induzida ip Intraperitoneal
kg Kilograma
LDH Desidrogenase láctica L-DOPA Levodopa
MAPK Proteína quinase ativada por mitógeno MCP Monocyte chemotactic protein
mg Miligrama
MIP Macrophage inflammatory protein
ml Mililitro
mM Milimol
MMP-9 Matriz metalopeptidase 9 MPO Mieloperoxidase
nm Nanômetro
NMDA N-Metil-D-aspartato
NO Óxido nítrico
PG Prostaglandina PKC Proteína quinase PTX Pentoxifilina RNA Ácido ribonucleico
ROS Espécies reativas ao oxigênio SNC Sistema nervoso central
SNc Substância negra pars compacta SOD Superóxido dismutase
TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico TH Tirosina hidroxilase
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
1 INTRODUÇÃO 17
1.1 Doença de Parkinson 17
1.1.1 Estresse oxidativo e a Doença de Parkinson 19
1.1.2 Neuroinflamaçao e a Doença de Parkinson 20
1.1.3 Manifestações não motoras da Doença de Parkinson 24
1.2 Tratamento da Doença de Parkinson 25
1.3 Modelos Experimentais de DP 26
1.3.1 Células de neuroblastoma humano SH-SY5Y 27
1.3.2 A neurotoxina 6-OHDA 28
1.4 Pentoxifilina: características físico-quimicas e farmacocinéticas 31 1.4.1 Pentoxifilina: efeitos farmacológicos e mecanismos de ação 32
1.4.2 Pentoxifilina e doenças neurodegenerativas 35
1.5 Problemática e justificativa 39
2 OBJETIVOS 41
2.1 Gerais 41
2.2 Específicos 41
3 MATERIAIS E MÉTODOS 42
3.1 Animais 42
3.2Drogas 42
3.3 Injeção estereotáxica de 6-OHDA 42
3.4 Testes Comportamentais 44
3.5 Determinação dos níveis de DA, DOPAC e de aminoácidos com HPLC 48
3.6 Análises Histológicas e Imunohistológicas 50
3.7 Testes in vitro 53
4 ANÁLISE ESTATÍSTICA 55
5 RESULTADOS 56
5.1 Efeitos da PTX no comportamento do rato com lesão unilateral estriatal por 6- 56 OHDA
5.1.2.2 Efeitos do PTX no comportamento de rearing avaliado pelo teste de Campo 59 Aberto
5.1.3 Efeito da PTX sobre a memória operacional avaliado através do Labirinto 61 Aquático de Morris – Versão com Pista
5.1.4 Efeito da PTX sobre o desespero comportamental avaliado através do teste do 63 Nado Forçado
5.2 Estudos neuroquímicos 64
5.2.1 Efeito da PTX nas concentrações estriatais de DA e DOPAC no modelo de 64 DP em ratos (ng/g tecido)
5.2.2 Efeito da PTX na relação entre as concentrações estriatais de Aminoácidos 68 (nmol/g tecido)
5.3 Estudos histológicos e imuno-histoquímicos com PTX no modelo de DP 71 5.3.1. Efeito da PTX em corpo estriado e hipocampo no modelo de DP avaliado 71 pela coloração de Nissl (violeta de cresil)
5.3.2. Efeito da PTX sobre a degeneração neuronal avaliado através da coloração 75 com Fluoro Jade
5.3.3. Efeito da PTX sobre a atividade da enzima tirosina hidroxilase no corpo 78 estriado em modelo de DP
5.3.4. Efeito da PTX sobre a atividade da enzima tirosina hidroxilase no 81 mesencéfalo em modelo de DP
5.3.5. Efeito da PTX sobre a atividade do transportador de dopamina (DAT) no 82 corpo estriado
5.3.6. Efeitos do PTX sobre células GFAP positivas no mesencéfalo e hipocampo 85 5.3.7 Efeitos da PTX sobre células OX-42 positivas no corpo estriado no modelo 89 5.3.8. Efeitos da PTX sobre células TNF- positivas em corpo estriado e no 91 hipocampo
5.3.9. Efeitos da PTX sobre células COX-2 positivas no corpo estriado 94 5.3.10. Efeitos da PTX sobre células iNOS positivas no corpo estriado e no 96 hipocampo
5.4.2. Efeito da PTX sobre a produção de nitrito em células SH-SY5Y expostas a 6- 100 OHDA
6 DISCUSSÃO 101
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 112
1. INTRODUÇÃO
1.1 Doença de Parkinson
Em 1817 o médico inglês James Parkinson descreveu pela primeira vez a doença que receberia seu nome no futuro. Mas foi o médico francês Jean-Martin Chacot quem desempenhou um papel decisivo na descrição da Doença de Parkinson (DP), acrescentando várias contribuições descrição do quadro clínico, definindo a presença dos chamados quatro sinais cardinais da doença, que são: tremor, bradicinesia, rigidez e dificuldades do equilíbrio, apresentando critérios para o diagnóstico diferencial e também sugerindo o primeiro tratamento para a doença (GOETZ, 2011).
A DP atinge cerca de 0,1 a 0,3% da população mundial (WIRDEFELDT et al, 2011). A média da idade para o aparecimento da DP é de 55 anos (HALD, LANTHARIUS, 2005) e a média de duração da doença do diagnóstico ao óbito é de 15 anos (KATZENSCHLANGER et al, 2008). O numero estimado de casos de DP no mundo em 2005 era de 4,1 a 4,6 milhões, e a previsão para 2030 é que esse número fique entre 8,7 a 9,3 milhões de pessoas (DORSEY et al, 2007). Apesar de a DP afetar ambos os sexos, dados mostram uma maior proporção de homens afetados, numa razão de homens para mulheres de 1,49 (WOOTEN et al, 2004). A Associação Brasileira de Parkinson estima a existência de cerca de 200 mil casos de DP no Brasil, sendo a maior parte concentrada nas regiões Sudeste e Sul, responsável por um total estimado de 64 mil casos (BRASIL, 2006).
patogênese da DP, com bloqueio do sistema ubiquitina-proteossona, e prejuízo da função da mitocôndria, que culminam na morte neuronal (DAWSON et al, 2010).
A origem da degeneração neuronal é desconhecida e provavelmente envolve muitos eventos celulares e moleculares (DAUER & PRZEDBORSKI, 2003). A etiopatogenia da doença envolve diversos mecanismos: estresse oxidativo, anormalidades mitocondriais, excitotoxicidade, fatores gliais e inflamatórios, neurotoxinas ambientais e fatores genéticos (SHAPIRA A. H, OLANOW C. W, 2004) A Figura 2 sintetiza uma representação esquemática dos fatores etiológicos e patogênicos envolvidos na DP, bem como alguns alvos potenciais de drogas neuroprotetoras.
Figura 1. Representação esquemática dos fatores etiológicos e patogênicos
envolvidos da Doença de Parkinson e alvos potenciais de drogas neuroprotetoras
ETIOLOGIA Fatores genéticos Fatores ambientais Interação genético-ambiente PATOGENESE
Antioxidantes (ex. vit E, vit C) Estresse oxidativo
Inibidores de MAO B (ex. selegilina, rasagilina) Disf. mitocondrial Agentes bioenergéticos (ex. coenzima Q10)
Agentes antiglutamatérgicos Excitotoxicidade
(ex. antagonista dos receptores NMDA) Bloqueadores de canais de cálcio
Inflamação Anti-inflamatórios (ex. inibidores COX-2)
Agregação proteica com Potencializadores proteossomais corpos de Lewy Proteínas de choque térmico
Fatores tróficos (ex. GNDF) Disfunção neuronal
Agentes antiapoptóticos (ex. agonistas
Apoptose
dopaminérgicos, inibidores de caspases)
Em 1997, foi confirmada a primeira evidência genética ligada à DP através da identificação de uma mutação no gene SNCA que codifica a proteína α-synucleina, no lócus PARK1, gerando formas mutantes desta proteína, que adotam uma propensão à deformação e aceleram a formação de agregados (DAWSON e DAWSON, 2003). Embora a maioria dos casos de DP seja esporádica, observam-se correlação entre a ocorrência da doença e mutações em 5 a 10% dos casos de DP, o que constitui a forma familiar da doença, que geralmente acomete os indivíduos ainda na juventude (HALD e LOTHARIUS, 2005).
Alterações genéticas que afetam genes como os que codificam α-sinucleína, parkina e ubiquitina hidrolase C-terminal da L1 (UCH-L1) foram encontrados na forma familiar da DP, que pode ser autossômica dominante ou recessiva (LEE; LIU, 2008). Mutações no lócus PARK1 levam a formação de agregados de α-sinucleína e formação de corpos de Lewy, enquanto mutações no lócus PARK2 causam deficiência na proteína parkina, com perda da capacidade de ubiquinização, e degeneração nigroestriatal predominante sem corpos de Lewy (CALNE, 2005). Uma mutação na enzima UCH-L1, que está envolvida no sistema de degradação ubiquitina-proteossoma, leva a uma perda parcial da atividade catalítica dessa enzima, que pode desencadear agregação de proteínas (LEROY et al, 1998).
1.1.1. Estresse Oxidativo
Existe um grande número de evidências correlacionando estresse oxidativo e DP (DRECHSEL E PATEL, 2008). O estresse oxidativo é descrito como um desequilíbrio entre a formação e a eliminação de espécies reativas de oxigênio (EROs) e espécies reativas de nitrogênio (ERNs) (BARNHAM et al., 2004). As espécies oxidantes que mais promovem estresse oxidativo no SNC são: - O•2, - OH• e - H2O2,
respectivamente radical superoxido, radical hidroxila e peróxido de hidrogênio, e a ERN com maior potencial reativo é peróxido nitrito – ONOO-. Existem evidências mostrando o dano oxidativo ao DNA, a proteínas e a lipídeos na DP, além da diminuição dos níveis de antioxidantes, como glutationa (GSH), que constitui o principal sistema redox de controle do estresse oxidativo (TAIRA et al, 2004).
Neurônios dopaminérgicos favorecem a produção de EROs. O metabolismo da DA pela MAO-A leva à produção de DOPAC e de H2O2, enquanto a auto-oxidação
resíduos de cisteína (DAUER e PRZEDBORSKI, 2003). O H2O2 produzido durante o
metabolismo da DA pode ser convertido em radicais hidroxila (OH
·
) pela reação de Fenton na presença de ferro ferroso (Fe2 +). Esta reação pode ser um dos mecanismos patogênico que contribui para o estresse oxidativo na DP. Radicais hidroxila (OH·
) são espécies altamente reativas capazes de reagir com praticamente todas as macromoléculas celulares (GERLACH et al, 1994).A mitocondria também contribui para a produção de EROs. Aproximadamente 100% do oxigênio molecular é consumido pela respiração mitocondrial formando como subprodutos espécies oxidantes como - O•2, - OH• e -
H2O2. Portanto, a inibição do complexo I mitocondrial aumenta a produção de
superóxidos, que formam radicais -OH• ou reagem com o óxido nítrico (NO) formando peroxinitritos; estes causam danos celulares por reagirem com ácidos nucléicos, proteínas e lipídios (DAUER e PRZEDBORSKI, 2003). Além disso, a deficiência energética relacionada à mitocôndria pode levar ao rompimento de vesículas que armazenam DA, aumentando sua concentração no citossol ocasionando danos em macromoléculas (DAUER e PRZEDBORSKI, 2003). Dessa forma, a disfunção mitocondrial tem sido amplamente relacionada com a patogênese da DP (ABOU-SLEIMAN et al., 2006).
O NO é um neurotransmissor que em certas condições pode atuar como radical livre de vida curta (1-5 s), altamente permeável às membranas biológicas por ser uma molécula gasosa, tendo sido implicado em várias condições fisiológicas e patológicas, incluindo a morte celular (CALABRESE et al., 2007). Em determinadas condições o NO e o O2 podem interagir, resultando em peroxinitrito. Importantes
evidências têm demonstrado o envolvimento do NO na degeneração de neurônios dopaminérgicos da via nigroestriatal (DUNCAN e HEALES, 2005).
1.1.2 Neuroinflamação
encontraram diversos marcadores inflamatórios, normalmente ausentes na população de idosos normais (AKIYAMA et al, 2000). Além disso, resultados de estudos epidemiológicos também reforçam o papel essencial da inflamação na patogênese dessa doença (LIU et al, 2006). Corroborando com esses resultados, estudos com antiinflamatórios não esteroidais (AINES) demonstraram que o uso dessas drogas reduz o risco de desenvolvimento da DP (CHEN et al., 2003b).
A neuroinflamação é caracterizada pela ativação de células da glia no cérebro, principalmente micróglia e astrócitos, que liberam mediadores pró-inflamatórios, tais como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), as interleucinas 1β e 6 (IL-1β- e IL-6) e enzimas como as cicloxigenases (COX 1 e 2) e a óxido nítrico sintase indutiva (iNOS) (MOSLEY et al., 2006; MACCIONI et al, 2009). A presença de células da glia ativadas têm sido constantemente relatada em muitos estudos de DP (MIRZA, 2000; IMAMURA, 2003; HIRSCH et al., 2005). Micróglia são células do sistema imune presentes no cérebro que têm sido associadas a danos neuronais em doenças neurodegenerativas (FUXE, 2008). Micróglia são sensíveis a mudanças no microambiente e facilmente se tornam ativados em resposta a determinadas circunstâncias, como infecção ou inflamação. A ativação da micróglial envolve a transformação morfológica característica de repouso (ramificada) para o estado ativado amebóides (BANATI et al, 2003). Na DP, a ativação da micróglia está diretamente associada com a morte dos neurônios dopaminérgicos, podendo até mesmo ser usada como marcador biológico para a doença (CHEN et al., 2003). Portanto, os inibidores da ativação de micróglia podem desempenhar um importante papel nas doenças nerodegenerativas para a inibição da resposta inflamatória e podem resultar em uma poupança de viabilidade neuronal.
Astrócitos são as células da glia mais abundantes, são diretamente responsáveis pela sustentação e isolamento do neurônio e, portanto, fundamentais para a sobrevivência destes (McGEER e McGEER, 2008). Na injuria os astrócitos adquirem função fagocitária. A ativação de astrócitos é outra característica neuropatológica importante na neurodegeneração, embora com menor participação que as micróglias (VILA, 2001).
receptores celulares, o TNF-α ativa diferentes cascatas intracelulares que regulam diversas funções celulares, incluindo respostas inflamatórias, diferenciação e apoptose (PALLADINO et al., 2003). Ao nível celular, a principal função atribuída ao TNF-α é sinalizar para a ativação da transcrição de outras proteínas envolvidas na resposta inflamatória, incluindo as interleucinas (IL-1, -6 e -8), as quimiocinas e as moléculas de adesão (MEDEIROS, 2007).
Estudos indicam que o TNFα é altamente tóxico para neurônios dopaminérgicos tanto in vitro (McGUIRE, 2001, CLARKE, 2002) como in vivo
(CARVEY, 2003). De acordo com McCoy e Tansey (2008) a combinação de dados histopatológicos, epidemiológicos e estudos farmacológicos sugerem um papel importante para o TNFα na degeneração de neurônios dopaminérgicos nigroestriatal, sugerindo que a neurotoxicidade provocada pelo TNF-α pode ser a base da perda progressiva que ocorre em humanos com DP. HIRSCH et al., (2005) analisaram os efeitos do TNF-α através do seus dois tipos de receptores TNFR-1 e TNFR-2 em camundongos tratados com 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), uma toxina derivada da heroína usada experimentalmente em modelo animal de DP, e mostraram que os animais nocauteados para um dos receptores do TNF-α ou para ambos foram protegidos contra a intoxicação por MPTP. A presença deste potente fator inflamatório nos locais de lesão o torna um alvo atraente para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento de condições neurodegenerativas. Inibidores de TNFα, como a talidomida e minociclina, tem sido estudados em modelos animais de DP, mostrando neuroproteção em alguns estudos (FERGER et al, 2004; TOMAS-CAMARDIEL, 2004) mas não em outros (SRIRAM, 2006).
equilíbrio crítico entre fatores envolvidos no reparo celular e fatores pró-inflamatórios determina a taxa de progressão e os resultados finais do processo neurodegenerativo (RAMESH et al., 2013).
Acredita-se que a natureza progressiva da DP é caracterizada pela neurodegenração, induzida pela inflamação crônica de neurônios dopaminérgicos na substância negra e no corpo estriado. A iniciação e propagação da neuroinflamação parecem estar associadas à interação entre glia, células imunes e neurônios, embora as conecções glias-células imunes ainda sejam motivo de controvérsia. Células da glia, em particular micróglia, apresentam atividade aumentada em vias nociceptivas, em resposta a injúria periférica e, em casos de inflamaçção grave, ocorrem mecanismos sinalizadores para o cérebro, levando a alterações no metabolismo e comportamento (SKAPER et al., 2012). Atualmente, está bem documentado que a ativação da micróglia resulta na morte de neurônios dopaminérgicos, em pacientes com DP (PETERSON; FLOOD, 2012).
Células da glia são responsáveis pela progressão da DP e exercem importante papel na iniciação da resposta tecidual precoce. Em particular, a disfunção precoce e o acúmulo de alfa-sinucleína em astrócitos causam recrutamento de micróglia fagocítica que ataca determinados neurônios em áreas cerebrais, causando os sintomas clínicos da DP (HALLIDAY; STEVENS, 2011). Historicamente, acreditava-se que astrócitos exerciam apenas uma função de suporte para neurônios. Contudo, atualmente, sabe-se que as funções de astrócitos incluem desde homeostase celular até gliotransmissão, Estas células possuem diferentes tipos de receptores e transportadores que ajudam na mediação de sua função homeostática predominante. Importante ressaltar a presença em astrócitos de transportadores de glutamato e aspastato (GLAST) e do transportador de glutamato (GLT-1) (ALMAD; MARAGAKIS 2012). .
A inibição de qualquer passo da resposta inflamatória pode ser útil para atenuar suas consequências prejudiciais na progressão das doenças neurodegenerativas. Dessa forma, agentes anti-inflamatórios que inibem a ativação da micróglia ou interferem com a produção de fatores neurotóxicos ativados por micróglia são candidatos para a intervenção terapêutica dessas condições.
1.1.3 Manifestações não-motoras da DP
O comprometimento motor aparece em um estágio mais avançado da doença com a degeneração dos neurônios dopaminérgicos da SNc em torno de 70%-85% (MAYO et al, 2005). Além dos sintomas motores, a PD caracteriza-se também por diversos sintomas não-motores, como os distúrbios cognitivos, a perda do olfato, os distúrbio do sono e a depressão, por exemplo (MIZUNO et al., 2008). Outros distúrbios de comportamento são: tendência ao isolamento, ansiedade, distúrbios do sono e fadiga (LAUTERBACH, 2004).
Estas manifestações não-motores comprometem a qualidade de vida do pacientes. São comuns também alterações sensoriais como dor, queimação e dormência no lado corpo mais comprometidos pela doença, bem como distúrbios autonômicos, como sialorreia, sudorese excessiva, pele oleosa e fria, constipação, disfunção urinária, disfunção sexual, hipotensão postural, distúrbios na fala, na escrita e na expressão facial (SABATÉ, et al, 2008). Alguns destes, como depressão e ansiedade, podem se manifestar bem antes do aparecimento dos sintomas motores (CHAUDHURI, HEALY, SCHAPIRA, 2009). De tal forma que alguns estudos sugerem que estes sintomas neuropsiquiátricos podem ser considerados fatores de risco para o desenvolvimento de DP (WEINTRAUB et al, 2008).
Disfunções cognitivas também estão presentes em todos os estágios da DP. Nas fases iniciais e intermediárias ocorrem déficits cognitivos moderados, enquanto nas fases avançadas tem sido relatada a ocorrência de demência em 11 a 36% dos pacientes com DP (GILADI et al, 2000). A presença de disfunções cognitivas na DP deve-se provavelmente a uma disfunção das conexões fronto-estriatais (BRAND et al, 2004).
pode estar associada ao quadro de depressão (LEMKE, et al, 2008). Os sintomas depressivos são notados em todos os estágios da doença, e podem preceder o surgimento de sintomas motores em até 2 ou 3 anos (MIYASAKI et at, 2006). A depressão na DP parece possuir uma base biológica resultante não somente de alterações dopaminérgicas (BARONE et al, 2010) mas também no sistema serotoninérgico hipocampal (BALLANGER et al, 2012).
Cada vez mais vem surgindo evidencias do papel do hipocampo relacionado aos sintomas não-motores da DP (CALABRESI, et al, 2013). O hipocampo é uma estrutura do lobo temporal relacionado com os processos de aprendizagem e memória. Tradicionalmente, o hipocampo não era considerado como tendo algum papel na DP, exceto por uma possível associação com a demência, entretanto, dados recentes provenientes de estudos experimentais com modelos animais e com pacientes, tem alterado essa visão, e sugerido que algum desequilíbrio entre o sistema dopaminérgico e o hipocampo pode estar implicado não somente na demência, mas também em outros aspectos neuropsiquiátrico da DP (GHIGLIERI et al, 2011) . Muitos estudos mostraram existência de atrofia hipocampal em pacientes com DP, com e sem demência, associado a alterações de memória (BURTON et al, 2004). As regiões CA1 e CA3 do hipocampo estão mais envolvidas nas alterações cognitivas na DP (BEYER et al, 2014).
1.1.4 Tratamento da DP
O tratamento padrão ouro para o DP é a Levodopa, no entanto, a exposição crônica está associada com discinesias, um efeito grave caracterizada por movimentos involuntários. Enquanto os sintomas não-motores são tratados isoladamente, sem direcionamento específico.
1.2 Modelos Experimentais de DP
A busca por agentes neuroprotetores que venham a diminuir ou mesmo anular a progressão da neurodegeneração continua tendo importância primordial nos estudos da DP (SCHAPIRA, 2008). O emprego de modelos experimentais da DP tem contribuído não só para os avanços no conhecimento da fisiopatologia da doença como também tem possibilitado a pesquisa por novos agentes terapêuticos. Entretanto, a escolha do modelo experimental para DP é um assunto controverso devido à dificuldade de mimetizar a sintomatologia do distúrbio in vivo e das limitações dos modelos in vitro.
É importante ressaltar que muitos dos avanços obtidos até o momento pelos cientistas no tratamento e compreensão da fisiopatologia da DP só foram possíveis graças à utilização de modelos animais. Assim como tantas outras, a DP é uma doença exclusivamente humana, ainda não identificada naturalmente em nenhum outro animal. No entanto, existem algumas características da doença que podem ser simuladas em roedores através da administração de diferentes compostos: reserpina, 6-hidroxidopamina (6-OHDA), 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), paraquat, maneb, rotenona e ferro (BEAL, 2001; SHIMOHAMA et al., 2003).
Os modelos in vivo com o uso de Drosofila, macacos ou ratos, são amplamente utilizados. Alguns modelos genéticos usando camundongos transgênicos já estão disponíveis, entretanto os que usam neurotoxinas específicas conseguem reproduzir algumas características específicas da doença, são mais simples e mais baratos e por este motivo são mais utilizados (BEAL, 2010). No entanto, com relação aos modelos in vivo, é difícil transpor os resultados desses modelos para mecanismos moleculares e celulares da DP. Alem disso há uma grande variabilidade intra-especie e muitos fatores podem influenciar os estudos, por exemplo, o estresse em que o animal fica submetido (BOVE et al 2005).
intervenções gerais e farmacológicas, a facilidade de usar essas culturas de células em diversos testes bioquimicos, a possibilidade de aplicar um screenig altamente confiável, e, além disso, eles diminuem a necessidade do uso de animais nos experimentos (FALKENBURGER E SCHULZ, 2006). Os modelos experimentais de PD in vitro incluem principalmente a linhagem de células tumorais não neuronais de feocromocitoma (PC12), a linhagem de células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) e células primárias mesencefalicas nuronais (XIE et al, 2010). Estas células mimetizam muitos aspectos da morte de neurônio dopaminérgico obervados na DP quando tratadas com neurotoxinas como a MPTP, 6-hidroxidopamina (6-OHDA) ou a rotenona. A exposição da linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y à 6-hidroxidopamina (6-OHDA) é o modelo in vitro mais utilizado para estudos de DP, por ser um método rápido e confiável para testar agentes neuroprotetores (YONG-KEE; SALOMONCZYK; NASH, 2011).
1.3.1 Células de neuroblastoma humano SH-SY5Y
A linhagem celular SH-SY5Y é composta por células de neuroblastoma humanas. Os neuroblastomas são tumores malignos neuroendócrinos, mais frequentes durante a infância, e que tem como sitio primário principal as glândulas adrenais. Estas células são subclones derivados do neuroblastoma SK-N-SH, isoladas de sítio metastático de medula óssea (BIEDLER et al.,1978). As células SK-N-SH contem células com três diferentes fenótipos: Neuronal, Schwanniano e Intermediário (JOSHI et al, 2006), sendo as células SH-SY5Y do tipo Neuronal. Elas exibem propriedades bioquímicas e funcionais de neurônios humanos e tem sido usada como modelo celular in vitro para estudo das propriedades neuronais e de possíveis mecanismos de neurotoxicidade (LOPES et al., 2010).
presente somente em neurônios dopaminérgicos do SNC (TAKAHASHI it al, 1994). Em terceiro lugar, expressam receptores de DA, mesmo que em baixos níveis.
1.3.2 A neurotoxina 6-OHDA
A 6-OHDA é a neurotoxina mais utilizada experimentalmente em modelos de DP, tanto in vitro como in vivo (SCHOBER, 2004; JACKSON-LEWIS et al, 2012). Apresenta similaridade estrutural com as catecolaminas e foi o primeiro composto a ser descoberto com a capacidade de induzir morte seletiva em células catecolaminérgicas (BLUM et al., 2001). O primeiro registro do efeito biológico da 6-OHDA foi feito por Poter e cols em 1963, que demonstraram a capacidade de depletar noradrenalina de nervos simpáticos do coração, e em 1968 Ungersedt mostrou que a injeção da 6-OHDA na SNcp provoca uma degeneração anterógrada do sistema nigroestriatl dopaminérgico, criando assim, o primeiro modelo animal de DP (BLANDINI et al, 2008).
Figura 2. Mecanismos de neurotoxicidade induzida por 6-OHDA
Fonte: SIMOLA et al., 2007.
Ratos com lesão unilateral por 6-OHDA na via nigroestriatal apresenta comportamento estereotipado, que são rotações contralaterais em relação ao lado lesionado quando tratados com agonistas D1/D2 da dopamina, como a apomorfina (KIM et al., 1998). Esse comportamento pode ser explicado pela hiperexpressão dos receptores dopaminérgicos na porção lesada do estriado. Ou seja, as drogas agonistas terão seu efeito potencializado pela hipersensibilização dos receptores (GERLACH & RIEDERER, 1996). Este comportamento rotatório tem sido utilizado para avaliar a extensão da lesão sendo uma ferramenta útil para testar a eficácia de potenciais agentes terapêuticos na DP (JACKSON-LEWIS et al, 2012)
O modelo da 6-OHDA não produz e nem induz a formação de corpus de Lewi, entretanto, esta neurotoxina tem efeitos importantes sobre a proteína α-sinucleína, que, juntamente com a ubiquitina, é um dos principais componentes dos corpos de Lewi, agregados citoplasmáticos. A 6-OHDA desencadeia duas alterações neuroquímicas que impactam diretamente na α-sinucleína, primeiro impedem a sua degradação via inibição de proteossoma e isso faz com que a proteina se acumule e, em segundo lugar, promove a sua agregação (COSTA et al, 2006).
Apesar de ser um modelo antigo, a injeção com 6-OHDA ainda é a ferramenta mais frequentemente usada para obter uma lesão nigroestriatal em animais por ser um procedimento de relativa baixa complexidade e custo e também, o mais importante, por ser altamente reprodutível, em contraste com os modelos mais recentes que apresentam uma considerável variabilidade inter-individuo (BLANDINI et al, 2008).
6-OHDA pode ser formado a partir de DA por hidroxilação não enzimática na presença de Fe e H2O2. Foi detectado 6-OHDA endógeno em amostras de urina de
1.4 . Pentoxifilina: Características físico-químicas e farmacocinéticas
A Pentoxifilina (PTX) é quimicamente denominada de 3,7-diidro-3,7-dimetil-1-(5-oxoexil)-1H-purina-2,6-diona e derivada da metilxantina. A droga é solúvel em água e etanol e pouco solúvel em tolueno; possui peso molecular igual a 278,31 e fórmula molecular: C13H18N4O3. A estrutura química da PTX apresenta-se abaixo (Fig. 4).
Figura 3. Estrutura Química da Pentoxifilina
Após a administração oral de solução aquosa de PTX, em seres humanos, esta é quase totalmente absorvida. A droga sofre efeito de primeira passagem e vários metabólitos aparecem no plasma, pouco tempo após sua absorção. Pico de níveis no plasma da PTX e seus metabólitos são encontrados, após 1 h da administração. Os principais metabólitos são: Metabólito I: 1 (1-[5-hidroxihexil]-3,7-dimetilxantina) e Metabólito V: (1-[3-carboxipropil]-3,7-dimetilxantina).
Os níveis plasmáticos destes metabólitos são 5 a 8 vezes, respectivamente, mais elevados do que aqueles da PTX. A meia-vida da PTX varia entre 0,4 e 0,8 h e a meia-vida dos metabólitos varia entre 1 e 1,6 h. Não existe nenhuma evidência de acúmulo da droga ou indução enzimática (citocromo P450), após a administração de doses múltiplas da PTX (SMITH et al., 1986).
A excreção da PTX é quase totalmente via renal e o principal produto de biotransformação é o metabólito V. De modo geral, a PTX não é encontrada na urina. Uma concentração abaixo de 4% da droga encontra-se nas fezes. A ingestão de alimentos antes da administração da PTX retarda o processo de absorção.
a PTX é rapidamente absorvida. Contudo, preparações orais apresentam apenas 20 a 30% de biodisponibilidade, por causa do alto clearance de primeira passagem.
A PTX e seus metabólitos melhoram o fluxo sanguíneo, pela diminuição de sua viscosidade. Em pacientes com doença arterial periférica, este aumento do fluxo sanguíneo para regiões com microcirculação afetada melhora a oxigenação tecidual. O exato mecanismo de ação da PTX e a sequência de eventos que levam à melhora clínica do paciente, não está ainda bem definida. A administração da PTX produz efeitos hemorreológicos dose-dependentes, diminuindo a viscosidade do sangue e melhorando a flexibilidade eritrocitária. Além disso, as propriedades de leucócitos de importância hemorreológica foram estudadas em experimentos in vivo e in vitro. Mostrou-se que a PTX aumenta o grau de deformação leucocitária e inibe a adesão e ativação de neutrófilos. Mostrou-se também que os níveis de oxigênio teciduais aumentaram, de modo significativo, com doses terapêuticas de PTX em pacientes com doença arterial periférica.
Em cavalos, a administração oral de 10 mg/kg de PTX resulta em concentrações sanguíneas equivalentes àquelas observadas quando da administração de doses terapêuticas em seres humanos. Neste caso, o esquema de administração mais apropriado foi o de 2 vezes ao dia (LISKA et al., 2006). Em cães, a administração oral de 15 mg/kg de PTX resultou em concentrações plasmáticas também semelhantes àquelas resultantes da administração de doses terapêuticas em seres humanos e, neste caso, o esquema mais apropriado consistiu da administração da droga 3 vezes ao dia (MARSELLA et al., 2000).
1.4.1 Pentoxifilina: Efeitos farmacológicos e mecanismos de ação
A pentoxifilina apresenta propriedades semelhantes às de outras metilxantinas, como teobromina, cafeína e teofilina (ZABIEL et al., 1989). Ao contrário das outras metilxantinas, porém, apresenta poucos efeitos cardiovasculares (WARD & CLISSOLD, 1987). Em geral, este grupo de drogas atua inibindo várias famílias das enzimas fosfodiesterases. Como estas hidrolisam os nucleotídeos cíclicos, sua inibição resulta em concentrações mais altas de monofosfato cíclico da adenosina
A PTX é um agente hemorreológico ativo por via oral, para o tratamento de doenças vasculares periféricas e cerebrais e de outras condições patológicas envolvendo microcirculação deficiente. Possui efeito hemodinâmico primário, devido a sua capacidade de reduzir a viscosidade do sangue e do plasma, pela redução da agregação plaquetária e das concentrações plasmáticas de fibrinogênio. Tudo isto acaba por diminuir o potencial de formação de trombos, melhorando a perfusão na circulação microvascular (WARD & CLISSOLD, 1987).
Assim, há bastante tempo, a PTX tem sido utilizada na clínica, em doenças oclusivas arteriais periféricas e distúrbios de natureza aterosclerótica ou diabética, como claudicação intermitente, alterações circulatórias cerebrais, estados isquêmicos e pós-apopléticos (WARD & CLISSOLD, 1987; BOMBINI et al., 2004).
A elevação das concentrações de AMPc no espaço intracelular, bem como dos níveis de Ca+2, explicam, pelo menos em parte, o aumento da fluidez das membranas das células, os efeitos imunomoduladores e anticoagulantes, a estimulação da fibrinólise e a alteração da função de fibroblastos, induzidos pelo tratamento com a droga. Já o aumento da deformabilidade dos eritrócitos envolve o aumento do trifosfato de adenosina (ATP) e de nucleotídeos nos eritrócitos (WARD & CLISSOLD, 1987; SAMLASKA & WINFIELD, 1994).
Experimentos in vitro e in vivo já demonstraram os efeitos anti-inflamatórios e imunomoduladores da PTX (TEIXEIRA et al, 1997; HADDAD et al, 2002). Resultados de pesquisas não demoraram a demonstrar que a PTX e seus metabólitos aumentam o índice de migração de neutrófilos e exercem efeito protetor em modelos animais de infecção como, por exemplo, sepse por micro-organismos Gram-negativos, peritonite e meningite (SALAMSKA et al., 1994).
A propriedade anti-inflamatória da PTX baseia-se na capacidade de suprimir a produção de citocinas pro-inflamatórias, como a interleucina 1 e o fator de necrose tumoral alfa (IL-1 e TNF-α) (KWIECIER et al., 2004). Vários estudos têm demonstrado que a PTX reduz os níveis de TNF-α, por inibir a transcrição do seu gene (DOHERTY et al, 1991), resultante possivelmente do aumento da geração intracelular de AMPc.
aumentar a expressão de citocinas anti-inflamatórias, como IL-4 e IL-10 (MARCINKIEWCZ et al, 2000; JI et al, 2004). Além disso, a PTX causa inibição de vários mecanismos anti-inflamatórios, incluindo-se a cascata do complemento, a capacidade de afetar a aderência de neutrófilos, modular a adesão de leucócitos polimorfonucleares (PMN) e sua degranulação (SULLIVAN et al,1988).
Quadro I. Efeitos da Pentoxifilina
Fonte: Fonte: LAYSECA-ESPINOSA et al, 2003
BESHAY et al, 2001), diminuir a atividade citotóxica das células natural killer (NK) (NAGY et al,1999) e reduzir a ativação de apoptose induzida por linfócitos T (GRUPTA et al,1999), entre outras atividades importantes.
1.4.2. A Pentoxifilina e doenças neurodegenerativas
A PTX penetra rapidamente na barreira hematoencefálica, após sua administração sistêmica. Recentes estudos têm demonstrado efeito neuroprotetor da PTX, em vários distúrbios neuro-comportamentais, como isquemia cerebral (KIM et al, 1999; EVANS et al, 1999; BANFI et al, 2004; BRUNO et al, 2009), neurotrauma, demência e epilepsia (EUN et al, 2000, TARIQ et al, 2008). A PTX também reverte o déficit de memória provocado pelo glutamato, em ratos (CUNHA et al, 2000), e melhora o déficit de memória espacial provocado pela isquemia cerebral, em modelo animal (MOVASSAGHI et al, 2012).
Ademais, a PTX previne a morte celular, induzida por LPS em células PC12 (MUCHHALA & BEZEROUAL, 2012), modelo in vitro de doença neurodegenerativa. A cafeína e a PTX são capazes de diminuir os efeitos tóxicos provocados pelos metabólitos da neurotoxina dopaminérgica MPTP (ULANOWSKA et al., 2007), sugerindo a potencial utilização destas duas metilxantinas no tratamento da DP. Cada uma dessas novas descobertas aumenta a probabilidade do uso da PTX, no tratamento de diferentes distúrbios, incluindo-se os neurológicos.
Como a inflamação está presente em diversas doenças neurodegenerativas (LIMA et al., 2007), o efeito anti-inflamatório da PTX principalmente o resultante da inibição da TNF-α pode ser responsável, ao menos em parte, pela atividade neuroprotetora potencial desta droga. De acordo com AKWA et al. (1998), o aumento da expressão de TNF-α pode resultar em neurodegeneração, gliose e doença neurológica progressiva. A ativação de micróglias, que são células de defesa do SNC, pode contribuir para aumentar o dano neural, pela liberação de fatores pro-inflamatórios e neurotóxicos, como TNF-α, IL-1, espécies reativas de oxigênio, espécies reativas de nitrogênio, proteases, aminoácidos excitatórios, e eicosanoides (GORDON, 2001).
modulam a neurotransmissão dopaminérgica (FUXE et al., 1998, 2005) e muitos fenômenos neuronais, como o controle motor (ELYACOUBI et al., 2000). O bloqueio destes receptores, por drogas como as metilxantinas, produziu uma melhora na atividade motora em modelos animais (MANDRYK et al, 2005; AGUIAR et al, 2007). Por isso, as metilxantinas surgem como drogas promissoras no tratamento terapêutico para a doença de Parkinson (FREDHOLM e SVENNINGSSON, 2003; AGUIAR et al., 2006, 2007).
Vários estudos epidemiológicos e experimentais estabeleceram a relação inversa entre a cafeína e o risco do desenvolvimento de DP. O potencial efeito neuroprotetor da cafeína está relacionado com o bloqueio farmacológico dos receptores da adenosina, o que diminui a neurotoxicidade dopaminérgica. A cafeína, assim como outros antagonistas dos receptores A2A da adenosina, é capaz de atenuar a degeneração
dos neurônios dopaminérgicos nigroestriatais e, assim, reduzir os riscos de desenvolvimento de DP (KALDA et al., 2006). Estas drogas produzem um aumento da atividade motora, em roedores, com depleção de DA (RICHARDSON et al., 1999), além de potencializarem o estímulo locomotor dos agonistas dos receptores dopaminérgicos (SCHENK et al., 1994). Vários estudos com outras metilxantinas positivamente testadas na DP, principalmente a cafeína, podem ser encontrados na literatura (AGUIAR et al., 2006).
Com relação ao uso da PTX na DP em seres humanos, há mais de 3 décadas atrás, foi feito um estudo, em que os autores relataram que, apesar do resultado positivo da PTX em modelo animal com lesão por 6-OHDA no estriado e área mesolímbica (dados não mostrados), quando testada em pacientes, esta droga desenvolveu ou piorou os movimentos involuntários (GODWIN-AUSTEN et al, 1980). Este estudo foi realizado em 11 pacientes com DP que faziam uso da Levodopa ou de outras drogas, por mais de 6 anos.
envolvido na sua ação anti-inflamatória (HADDAD et al., 2002b). Os efeitos benéficos de inibidores de fosfodiesterase estão associados com a diminuição da secreção de citocinas pró-inflamatórias, da aderência de leucócitos ao endotélio, e da inibição de ativação de leucócitos (KLEMM et al., 1995; SEKUT et al., 1995). Assim, pelo menos nos casos de pancreatite aguda os efeitos benéficos da PTX são decorrentes da prevenção de redução dos níveis de AMPc e da atividade da A2A como também de complexos modificadores que ocorrem precocemente na pancreatite aguda.
A neuroinflamação tem recebido cada vez mais atenção como alvo em potencial para terapias neuroprotetoras na DP. Dois protótipos de citocinas pro-inflamatórias IL-1B e TNF-alfa aparecem como principais efetores das consequências funcionais da neuroinflamação sobre a neurodegeneração em modelos de DP. Durante o processo de neuroinflamação aguda ou crônica altos níveis de TNF-alfa ocorrem no liquor e cérebro de pacientes com DP como também em animais tratados com neurotoxinas dopaminérgicas como MPTP e 6-OHDA utilizadas nos modelos de degeneração em primatas não humanos e em roedores (BOKA et al., 1994, HUNOR et al., 1999, MOGI et al., 2000, SRIRAM et al., 2002, BARCIA et al., 2005, NAGATSU & SAWADA, 2005). As elevadas expressões de TNF-alfa nos locais onde ocorrem danos neurológicos sugerem que esta citocina pró-inflamatoria possa ser um mediador de injuria neuronal tornando-se possível alvo para o tratamento da DP.
Figura 4. Tempo da resposta inflamatória no parkinsonismo.
Como se pode observar na Fig. 6, dentro de 24 h, a liberação de citocinas e ativação de micróglia podem ser claramente observadas. De acordo com o protocolo de indução da morte de neurônios dopaminérgicos, a liberação de citocinas e ativação de micróglia podem ser normalizadas em torno de 72 h. Pico máximo de infiltração de células T pode ser alcançado em 48 h após a degeneração dopaminérgica. Já a ativação de astrócitos alcança níveis máximos em 72 h. A resposta inflamação pode ser normalizada dentro de 72 h, dependendo também do protocolo utilizado para induzir morte celular (BARCIA, 2013).
Eventos neuroinflamatórios mediados por TNF-alfa causam progressiva neurodegeneração em neurônios dopaminérgicos e exercem papel importante na patogênese da DP. Evidências recentes demonstraram a presença de TNF-alfa na secreção lacrimal de pacientes com DP (ÇOMOGLU et al., 2013). Em modelos animais, TNF-alfa e outras citocinas pro-inflamatórias podem causar morte de neurônios dopaminérgicos (BLOCK et al., 2006; BARCIA, 2013). Estudos pós-mortem em pacientes com DP identificaram imunoreatividade pata TNF-alfa em células da glia na substancia negra (OUCHI et. al., 2005; CHEN et al., 2008), elevados níveis de TNF-alfa em regiões dopaminérgicas estriatais e no liquor e indicaram que o TNF-TNF-alfa é liberado a partir de células da glia na substancia negra (HISCH & HUNOT, 2009).
Por outro lado uma correlação significante entre densidade de receptores de adenosina A2A no putamen e níveis plasmáticos de TNF-alfa foi observada em pacientes com PD nos quais acredita-se que TNF-alfa induza superexpressão de receptores de adenosina A2A (GOMES et al., 2008; VARANI et al., 2010). Assim, o TNF-alfa é alvo potencial para intervenções terapêuticas em doenças degenerativas associadas à neuroinflamação crônica como é o caso da DP (LEAL et al., 2013).
Sabe-se que o TNF-alfa é uma citocina pro-inflamatória envolvida na resposta imune. A ligação do TNF-alfa com um de seus receptores TNF-R1 ou TNF-R2 modula processos fundamentais no cérebro incluindo-se a formação e regulação de sinapses, neurogênese e processos de regeneração e manutenção geral do SNC. Durante estados de neuroinflamação crônica, grande número de evidencias experimentais mostram ser o TNF-alfa mediador chave da progressão de doenças, gliose, desmielinização, inflamação, deterioração da barreira hematoencefálica e morte celular (MONTGOMERY et al., 2012).
do TNF-alfa 1 (TNFRI) é expresso em muitos tipos celulares e pode ser ativado pela ligação ou do TNF-alfa solúvel (solTNF) ou do TNF transmembrana (tmTNF) com preferência pelo solTNF. Já o TNFR2 é expresso primordialmente na micróglia e células endoteliais e é preferenciamnente ativado pelo tmTNF. A elevação dos níveis de solTNF é uma característica da neuroinflamação crônica e aguda como também em condições neurodegenerativas e entre elas a DP. A presença deste fator inflamatório potente nos locais de injuria torna-o mediador do dano neuronal e da patogênese de doenças. Assim o TNF-alfa é alvo terapêutico atraente para tratamento de condições neurodegenerativas crônica e aguda (MCCOY et al., 2008).
1.5. Problemática e Justificativa
Atualmente a doença de Parkinson constitui um importante problema de saúde pública no mundo e o seu impacto aumenta na medida em que aumenta a expectativa de vida. A DP é caracterizada por manifestações motoras e não motoras progressivas e que levam em última análise muitos pacientes a tornarem-se refratários ao tratamento farmacológico. É uma doença neurodegenerativa e um dos problemas neurológicos mais comuns da atualidade.
De acordo com a Fundação Oswaldo Cruz, RJ (FIOCRUZ), estima-se que existam de 100 a 200 casos para cada 100 mil habitantes. Dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) mostram que 1% da população acima dos 65 anos de idade sofre com a doença, que geralmente surge a partir dos 50 anos de idade. No Brasil, a estimativa é que ao menos 200 mil pessoas possuam Parkinson. O tratamento previne o avanço da doença, apesar de não ter cura, a degeneração dos neurônios é controlada pelos medicamentos utilizados. O gasto anual com a DP é substancial e, relacionando os custos diretos e indiretos, é estimado em vinte bilhões de dólares e tende a dobrar devido ao aumento do numero de indivíduos afetados (WEINTRAUB et al., 2008).
mortalidade mais alta entre os pacientes e a expectativa de vida mais baixa que a da população geral (SIMUNI, 2007; LEIBSON et al., 2006).
Apesar de extensas pesquisas, ainda não há nenhum tratamento definitivo para a DP levando cada vez mais pesquisadores em todo o mundo a buscar novas terapias capazes de retardar ou, idealmente, parar a neurodegeneração de neurônios dopaminérgicos. É evidente a necessidade de mais estudos sobre a levodopa, sobre a própria DP, e sobre novas opções terapêuticas que venham a refinar ou mesmo substituir a terapia com levodopa.
Tendo-se em vista as opções terapêuticas limitadas para o tratamento de DP, drogas neuroprotetoras estão atualmente sendo estudadas, com a finalidade de tornar mais lenta a progressão da doença. Assim, várias drogas que têm como alvos estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e inflamação são candidatos primordiais como neuroprotetores. Muitas destas drogas já estão sendo submetidas a ensaios clínicos (FASE III) e uma delas é a cafeína que como a pentoxifilina é também uma metilxantina (SEIDI & POTASHKIN, 2011).
2.
OBJETIVOS
2.1. Geral
Investigar os possíveis efeitos da Pentoxifilina (PTX) utilizando modelos experimentais de DP.
2.2.
Específicos
Avaliar os efeitos da PTX em modelo experimental de DP o In Vivo
Em ratos com lesão unilateral de 6-OHDA no que se refere a:
Efeitos comportamentais: teste rotacional por apomorfina, teste do campo aberto, teste de labirinto aquático com sinalização e teste do nado forçado.
Efeitos neuroquímicos: dosagem de dopamina, DOPAC e aminoácidos.
Estudos histológicos e imunohistoquimicos: Nissl, Fluoro Jade, TH, DAT, GFAP, OX-42, TNF-α, COX-2 e iNOS.
o In Vitro
Em cultura de células SH-SY5Y após a aplicação de 6-OHDA no que se refere a:
Citotoxicidade: ensaio com MTT.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais
Foram utilizados ratos Wistar, machos, com peso variando entre 200-250, mantidos em caixas de prolipropileno com no máximo 6 animais, à temperatura média de 24 ± 2°C em ciclos de alternância claro/escuro de 12 horas, recebendo ração padrão e água a vontade.
No que se refere aos cuidados com os animais, este estudo seguiu os princípios éticos da experimentação animal, estabelecidos pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). O estudo foi submetido e aprovado pelo comitê de ética em pesquisa animal da Universidade Federal do Ceará sob o número de registro 23/2010 (Anexo 1).
3.2 Drogas
As seguintes drogas foram utilizadas: 6-hidroxidopamina (Sigma Aldrich, USA), Pentoxifilina (Tentral – Sanofi-aventis - Brasil), Quetamina (König, Argentina), Xilazina (König, Argentina), Apomorfina (Sigma Aldrich, USA). Os demais reagentes foram de grau analítico.
A Pentoxifilina foi utilizada por via oral nas doses 10, 25 e 50 mg/kg e administrada uma hora após da injeção estereotáxica de 6-OHDA e por 14 dias após a mesma. O veículo utilizado foi água destilada.
3.3 Injeção estereotáxica unilateral com 6-OHDA
0,2% de ácido ascórbico na concentração de 6 μg/μl) com auxilio de uma Hamilton de 5μl, unilateralmente, dentro do corpo estriado direito, perfazendo um total de 12 μg/2μl de 6-OHDA. A seringa foi deixada no local de aplicação por 5 minutos para assegurar que o seu conteúdo seja injetado corretamente (KIM et al, 1998).
Quadro 2: Protocolo de tratamento experimental
GRUPOS Tratamento
1- Falso operado Salina 2 L, intrastriatal + Veículo v.o. durante 15 dias.
2- Controle (6-OHDA) 6-OHDA (12 g/2 L, intrastriatal) + Veículo, v.o., 15 dias.
3– 6-OHDA+PTX10 6-OHDA (12 g/2 L, intrastriatal) + PTX 10 mg/Kg, v.o., 15 dias.
4 – 6-OHDA+PTX25 6-OHDA (12 g/2 L, intrastriatal) + PTX 25 mg/Kg, v.o., 15 dias.
3.4 TESTES COMPORTAMENTAIS
- Teste rotacional com Apomorfina
Esta avaliação é realizada duas semanas após a lesão com 6-OHDA (0,6 mg/kg ip) através do monitoramento do número de rotações completas em torno do próprio eixo durante 60 minutos (KIM et al, 1998). Estes dados são obtidos de maneira simples, barata, não exige treinamento do animal e nem interação deste com o pesquisador. Todas as drogas atualmente utilizadas no tratamento sintomático da doença de Parkinson foram primeiramente estudadas na sua capacidade de induzir rotações (FUKUZAKI et al., 2000).
Quando os animais com lesão unilateral com 6-OHDA são desafiados com agonistas diretos dos receptores dopaminérgicos, como apormorfina, são observadas rotações contralaterais a lesão. Este comportamento rotacional induzido pela apormorfina relaciona-se com alterações funcionais no receptor de dopamina (DA). Isso ocorre devido a uma estimulação induzida por desnervação dos receptores dopaminérgicos D2 supersensibilizados no estriado lesado (SCHWARTING e HUSTON, 1996).
Figura 5. Animal no teste rotacional induzido por apomorfina
- Teste do campo aberto (Open-field) (BROADHURST, 1957)
O teste do Campo Aberto tem o objetivo de analisar as atividades locomotora e exploratória do rato, e consiste de uma arena de 50 x 50 cm, confeccionado em acrílico com fundo preto, dividida em quatro quadrantes iguais. No teste os animais foram colocados na arena e deixados para explorar o ambiente por 5 (cinco) minutos. Os parâmetros avaliados foram: número de vezes que o rato cruzou as linhas do campo aberto (crossing) e o número de vezes que o animal se levantou e ficou apoiado nas duas patas traseiras para explorar visualmente a arena (rearing). A arena era limpa com uma solução de álcool a 20% e secada com toalhas de papel, antes de cada animal ser posicionado, para evitar que o cheiro de urina e fezes interferissem no teste. O ambiente foi iluminado com luz vermelha.
Figura 6. Animal no teste do Campo Aberto
- Teste do labirinto aquático com plataforma sinalizada (Cued Water Maze)
(PACKARD & McGAUH, 1992; MIYOSHI et al 2002)
O labirinto consiste de um tanque circular branco com 180 cm de diâmetro e 60 cm de profundidade, preenchido com água adicionada de tinta branca não toxica. O tanque é dividido imaginariamente em quatro quadrantes que passavam pelos pontos cardinais: Norte, Sul, Leste e Oeste. No centro de cada um dos quadrantes, existe encaixe para uma plataforma retangular de acrílico transparente com 11 cm × 14 cm de comprimento, que quando instalada, fica a 2 cm abaixo do nível da água, invisível para o rato. Presa no topo da plataforma e saliente a água foi colocada uma bola de 7 cm de diâmetro. Os animais foram submetidos a 4 treinos por dia, durante 4 dias, no labirinto aquático. Em cada treino os animais foram liberados dos 4 pontos de partida diferentes, e a plataforma visível foi sendo trocada de posição em cada treino entre os 4 diferentes quadrantes (Nordeste, Noroeste, Sudeste, Sudoeste). O animal foi liberado para nadar até encontrar a plataforma ou até um tempo máximo de 60 s. Caso o animal não encontrasse a plataforma nesse tempo, ele era gentilmente guiado até a plataforma onde permanecia por 20 s. Os tempos de latência até o animal encontrar a plataforma foram registrados. Após os 20 s, o animal era retirado da plataforma e colocado em uma caixa fora do labirinto aquático por 30 s. Nesse intervalo era efetuada a troca de posição da plataforma para o treino seguinte. A posição de partida e a posição da plataforma foram arranjadas de modo que as distâncias (proximal e distal) fossem contrabalançadas entre os treinos.
Figura 7: Labirinto aquático sinalizado e o animal sobre a plataforma
- Teste do Nado Forçado-TNF (forced swimming test) (PORSOLT et al., 1977)
O TNF é um dos modelos comportamentais mais utilizados para detectar atividade antidepressiva de fármacos. O método original foi descrito por Porsolt et al (1977, 1978) e baseia-se na observação de que quando os animais são submetidos a uma situação onde não há possibilidade de escape, após um período de agitação inicial eles adotam uma postura de imobilidade. Os ratos foram colocados, individualmente, em cilindros de acrílico (40 cm de altura e 23 cm de diâmetro) contendo água limpa e profundidade de 25 cm, por um período de 5 minutos, no qual foi registrado o tempo total de imobilidade para cada animal. Foi realizado um treinamento 24 h antes do teste, numa sessão de 15 minutos de natação. O animal é considerado imóvel quando flutua ou faz apenas movimentos necessários para manter sua cabeça acima da água. A redução no tempo de imobilidade é o efeito observado após a administração aguda de várias classes de fármacos antidepressivos (PORSOLT et al., 1977), já o aumento deste tempo caracterizara um estado “depressivo” dos animais ou um efeito depressogênico de fármacos.
Figura 8: Esquema do Protocolo utilizado para o teste do Nado Forçado
3.5 DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE DA, DOPAC E DE AMINOÁCIDOS
Após 24 horas dos testes comportamentais, os animais são decapitados com uma guilhotina (Harvard, USA), os cérebros retirados rapidamente e colocados sobre papel alumínio numa placa de Petri com gelo. Em seguida, as áreas cerebrais (corpo estriado) foram retiradas com uma tesoura de microdissecação sob gelo, estocada isoladamente em um ependoff, pesada e armazenada a -70 °C para uso posterior.
Foi utilizada a técnica da cromatografia líquida de alta eficiência (do inglês high performance liquid cromatography – HPLC) para detecção de catecolaminas e de aminoácidos. É uma técnica quantitativa, pela qual, compostos passíveis de oxidação ou de redução podem ser dosadas com alta sensibilidade. No caso de monoaminas, a oxidação é dada pela aplicação de um potencial positivo; os elétrons são transferidos para o eletrodo, sendo a corrente resultante diretamente proporcional ao numero de moléculas oxidadas. A cromatografia em fase reversa compreende uma fase estacionária de sílica ligada a grupamentos alquila formando compostos alquilsilil com superfície hidrofóbica (coluna de carbono), e uma fase móvel, polar, normalmente uma mistura de água e metanol, acetonitrila e/ou outros solventes orgânicos miscíveis em água. A eludição, remoção do soluto da fase estacionaria pela fase móvel, ocorre em ordem decrescente de polaridade, com dependência direta do teor do componente polar.
Os tecidos (corpo estriado) foram homogeneizados em uma solução de ácido perclórico (HCLO4) por 30 segundos e centrifugados por 15 minutos em
centrífuga refrigerada a 15000 rpm. Uma alíquota de 20 L do sobrenadante foi então injetada no equipamento de HPLC. Foi utilizada uma coluna CLC-ODS(M) com comprimento de 25 cm, calibre 4,6cm e diâmetro da partícula de 3m, da Shimadzu Japão.
FASE MÓVEL
