ANÁLISES HISTOLÓGICAS E IMUNOHISTOLÓGICAS

- Histoquímica Violeta de Cresil (BITTENCOURT, 2007)

A coloração de Nissl é uma das técnicas mais utilizadas para investigação do sistema nervoso. Ela permite a evidenciação da substância de Nissl, material granular constituído por DNA ribossomal, o qual se concentra principalmente no nucléolo, possibilitando a discriminação desta estrutura celular específica.

Cortes de cérebro dos ratos foram fixados em formalina e montados em blocos de parafina. Depois disso, foram cortadas em fatias de 5 µm montadas em lâminas. Para a coloração de Nissl, os cortes foram desparafinizados, por imersão em xil ol (2 vezes, por 5 min cada) e depois reidratados em imersão de etanol de concentrações diferentes (absoluto, 90%, 70% e 50%) por 3 min cada, e, finalmente, em água destilada por 1 (um) minuto duas vezes. Em seguida, ocorre a incubação na solução de violeta de cresil 0,5%, por um período de 3 (três) minutos. Em seguida, as lâminas foram desidratadas em álcool (50, 70 e 100%), diafanizadas e montadas em meio à base de xilol (Entelan®).

- Histoquímica Fluoro Jade

Após desparafinização e hidratação, as lâminas foram transferidos para uma solução de permanganato de potássio a 0,06% por 15 min, lavados em água destilada, e transferidos para uma solução de coloração fluoro-jade onde foram mantidos sob agitação leve por 30 min. Depois de corados, os cortes foram lavados com água destilada (3 vezes, 2min cada vez). O excesso de água foi retirado e os cortes foram secos e montados em meio Fluoromount. Os cortes foram, então, examinados em um microscópio de fluorescência.

- Imunohistoquimica para Tirosina Hidroxilase (TH)

A TH é uma enzima limitante no processo de síntese de DA, que catalisa a hidroxilação de L-tirosina para DOPA, por isso é um importante marcador molecular de neurônios dopaminérgicos. A detecção imunohistoquímica foi realizada no corpo estriado e no mesencéfalo.

O protocolo seguido para as reações de imunohistoquimica foi o seguinte: os cortes foram lavados três vezes com tampão fosfato (PBS, pH 7.4) por 5 (cinco)

minutos, o bloqueio da peroxidase endógena foi feito com peróxido de hidrogênio 0,3% (H2O2) durante 10 (dez) minutos e depois lavados com PBS. O bloqueio de ligações

inespecíficas foi feito com o Proteíne Block (DAKO) por 20 minutos. Em seguida, os cortes foram incubados com o anticorpo primário (1:100, anti-TH; “antibody produced

in rabbit”, Milipore, USA) durante 2h. Após esse período, as lâminas foram lavadas 3

(três) vezes em PBS por 5 (cinco) minutos, em seguida os cortes foram incubados com um Polímero HRP (DAKO) por 30 (trinta) minutos, e enxaguados novamente 3 (três) vezes com PBS. A revelação foi feita com DAB (diaminobenzidine 0,05% em 0.03% H2O2) por 5–10 min, e contracorados com hematoxilina. Após lavagem com água

destilada, os cortes foram montados em meio aquoso e cobertos com lamínula para posterior exame.

- Imunohistoquimica para Transportador de Dopamina (DAT)

DAT é o transportador transmembrana de dopamina que fica localizado na terminação nervosa pré-sináptica, onde é responsável por finalizar a atividade de dopamina através da recaptação pré-sináptica desse neurotransmissor, ou seja, o transporte de dopamina para o sítio pré-sináptico (recaptação). Os receptores dopaminérgicos parecem apresentar alterações na DP. A perda de dopamina na doença de Parkinson é acompanhada de uma perda de DAT (RACHAKONDA et al., 2004). O procedimento segue o mesmo para TH, sendo o anticorpo utilizado foi anti-DAT (1:100).

Embora DAT seja seletivo para DA, ele também pode transportar análogos estruturais sintéticos ou naturais do neurotransmissor, como a 6-OHDA. No caso desses compostos interagirem com as funções vitais ou estruturas intracelulares, a sua penetração na célula através do DAT pode ter consequências significativas.

Na DP há redução na densidade de DAT no neoestriado devido à perda dos terminais dopaminérgicos. A redução na densidade de DAT ocorre mesmo antes do início dos sintomas da DP, pois se evidencia redução de 40 a 60% na atividade dopaminérgica quando os primeiros sintomas aparecem e, com a evolução da doença, os níveis diminuem em até 90% (STORCH et al, 2004). É por este motivo que a concentração de DAT na avaliação da perda de neurônios dopaminérgicos no estriado, mais especificamente no putâmen, tem-se mostrado um parâmetro útil tanto no

diagnóstico precoce da DP quanto no diagnóstico diferencial com outras doenças que induzem sintomas extrapiramidais (SIDEROWF et al, 2000).

- Imunohistoquimica para GFAP e OX-42

O GFAP (Glial fibrillary acidic protein), é expresso por numerosos tipos de células do SNC, incluindo os astrócitos, e as células ependimais, é utilizado para detectar atividade inflamatória no SNC percebida pela infiltração astrocitária no tecido. A imunohistoquímica para OX-42 revela a presença de micróglias imunorreativas. As técnicas seguem o mesmo protocolo do item anterior, sendo modificado apenas os anticorpos primários anti-GFAP pronto para uso (DAKO®), e anti-OX-42 (Milipore®) na diluição 1:200.

- Imunohistoquimica para TNF-α, COX-2 e iNOS

Pesquisas indicam que os níveis de TNF-α, COX-2 e iNOS encontram-se aumentados em cérebros de pacientes com PD, e isso pode ser reproduzido também no modelo de 6-OHDA. As técnicas de imunohistoquimica seguiram o mesmo protocolo descrito anteriormente. Os anticorpos primários anti-TNF-α, anti-COX-2 e anti-iNOS foram usados na diluição 1:200.

- Protocolo seguido na Imunohistoquimica para COX-2

Após a incubação com o anticorpo primário (anti-COX-2; “antibody

produced in goat”, Milipore®

) na diluição 1:200, durante 2h os cortes foram incubados com um anticorpo secundário (“biotinylated goat anti-rabbit” IgG – ABC, Santa Cruz®) por 30 (trinta) minutos. Em seguida, foram cobertos com o conjugado enzimático avidina/biotina (AB) durante 30 (trinta) minutos, enxaguados novamente 3 (três) vezes com PBS por 5 (cinco) minutos, e revelados com diaminobenzidine 0,05% em 0.03% H2O2 por 5–10 min. Após lavagem com água destilada, os cortes foram montados em

meio aquoso e cobertos com lamínula para posterior exame. - Cálculo da Densidade Óptica

Foram realizadas análises semiquantitativa de densidade óptica (DO) das imagens digitalizadas dos cortes histológicos imunomarcados para TH e DAT através

do software imageJ 1.45s (National Institutes of Health, USA). O valor final da DO de cada grupo advém de uma média das DOs de cada animal.