Estudo químico de fungos endofíticos associados a plantas do bioma caatinga.

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CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÂNICA E INORGÂNICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

FRANCISCO CARLOS DE OLIVEIRA

ESTUDO QUÍMICO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS A PLANTAS DO BIOMA CAATINGA

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FRANCISCO CARLOS DE OLIVEIRA

ESTUDO QUÍMICO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS À PLANTAS DO BIOMA CAATINGA

Tese submetida apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal do Ceará, como requisito para obtenção do título de doutor em Química. Área de Concentração em Química Orgânica.

Orientador: Prof. Dr. Francisco Geraldo Barbosa.

Co-orientador: Prof. Dr. Jair Mafezoli.

FORTALEZA

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FRANCISCO CARLOS DE OLIVEIRA

ESTUDO QUÍMICO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS À PLANTAS DO BIOMA CAATINGA

Tese submetida apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal do Ceará, como requisito para obtenção do título de doutor em Química. Área de Concentração em Química Orgânica.

Aprovada em: 16/01/2017.

BANCA EXAMINADORA

____________________________________ Prof. Dr. Francisco Geraldo Barbosa (Orientador)

Universidade Federal do Ceará (UFC)

____________________________________ Profa. Dra. Ângela Martha Campos Arriaga

Universidade Federal do Ceará (UFC)

____________________________________ Prof. Dr. Aluísio Marques da Fonseca

Universidade da Integração Internacional da Lusofonia Afro-Brasileira (UNILAB)

____________________________________ Dr. Francisco das Chagas de Oliveira Freire

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa/CE)

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A Deus, por me conceder disposição, força, saúde, amor, paz e fé para superar os obstáculos da vida.

À minha amada esposa Elieuda, que sempre com muito amor e carinho, me incentivou para a realização deste trabalho, simplesmente muito obrigado.

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AGRADECIMENTOS

A Deus, por estar sempre comigo, me orientando e auxiliando em todos os momentos da minha vida.

Ao meu orientador Prof. Dr. Francisco Geraldo Barbosa, pela orientação, dedicação, atenção, sugestões e muitos conhecimentos que foram transmitidos, que foram fundamentais para a realização deste trabalho.

Aos colegas do LABFITO (Adriano, Alex, Diana Kelly, Aierta), pela amizade. Ao Prof. Jair Marfezoli, pela co-orientação e ajuda nas determinações estruturais. Aos colegas e amigos de Pós-graduação: Felipe, André, Sebastião, João Vitor, Irvila, Diego, Paula, Bruno, Carol, Daniele, Reinaldo, entre outros.

À Profa. Dra. Mary Anne pela disponibilidade do equipamento de CLAE e a profa. Antonia pela ajuda na operação do mesmo.

Ao Prof. Dr. Edilberto pela disponibilidade dos equipamentos de RMN do CENAUREMN.

Aos operadores dos equipamentos de RMN: Renata, Regivaldo e Prof. Dr. Daniel, pela obtenção dos espectros de RMN.

Aos Drs. Freire e Francisco, da EMBRAPA, pelo isolamento e identificação das cepas fungicas.

À Profa. Dra. Leticia pela realização dos ensaios de atividade anticâncer.

Aos demais professores do programa de Pós-Graduação em Química da UFC, queue contribuíram com minha formação.

Aos funcionários da UFC (Laurilane –“Lana”, Célia e Orlando).

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O estudo químico de fungos endofíticos associados a plantas do bioma Caatinga foi realizado através da identificação de compostos orgânicos voláteis (COVs) e do isolamento de metabolitos não voláteis produzidos por dez fungos da família Botryosphaeriaceae e um da família Nectriaceae. Na identificação de COVs produzidos pelo fungo Albonectria rigidiuscula (Nectriaceae) foram utilizados quatros meios de cultura diferentes (BD, BDA, peptona e arroz) e em três períodos de incubação (7, 14 e 21 dias), empregando-se as mesmas técnicas de extração e análise. No estudo de identificação de COVs, os fungos Lasiodiplodia citricola, L. gonubiensis, L. parva, L. pseudotheobromae, L. theobromae, Neosicoccum ribis, N. cordaticola, N. parvum, Botrysphaeria mamane e Pseudofusicoccum stromaticum foram cultivados em BD, sob as mesmas condições. Como técnica de extração e análise, utilizou-se a micro-extração em fase sólida por headspace (HS-MEFS), aliada à cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM). Os dados das análises foram ainda submetidos a tratamentos estatísticos de ACP e AAH. A identificação de COVs fúngicos se mostrou adequada para discriminar dez espécies da família Botryosphaeriaceae. A discriminação do complexo N. parvum/N. ribis apontou a importância de COVs como uma ferramenta quimiotaxonômica auxiliar. Além disso, o α-bisabolol que foi produzido em alto teor (88,83%) pelo fungo P. stromaticum, pode ser apontado como um marcador químico para a espécie. A produção de COVs pelo fungo A. rigidiuscula mostrou maiores variações qualitativas e quantitativas nos meios de cultura mais pobres em nutrientes. Os fungos N.parvum, L. gonubiensis e A. rigidiuscula apresentaram potencial citotóxico e o estudo de compostos não voláteis apontou variações significativas nos ácidos graxos produzidos nos micélios e meios líquidos extraídos. A partir dos extratos fúngicos ativos foram isolados os metabólitos (3S, 4S)-4-hidroximeleina, ciclo (Leu-Pro), ciclo (S-Phe-S-Pro), (3S, 4R)-4-hidroximeleína, (R)-meleina, pestalopirona, xilitol, ciclo (L-Pro-L-Tyr) e tirosol. O isolamento de dicetopiperazinas sugere uma relação destes compostos com o potencial citotóxico dos extratos ativos, uma vez que o potencial anticâncer desta classe é relatada na literatura.

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ABSTRACT

The chemical study of endophytic fungi associated with plants of the Caatinga biome was carried out through the identification of volatile organic compounds (VOCs) and the isolation of non-volatile metabolites produced by ten fungi of the family Botryosphaeriaceae and one of the family Nectriaceae. In the identification of VOCs produced by the fungus Albonectria rigidiuscula (Nectriaceae), four different culture media (BD, BDA, peptone and rice) and three incubation periods (7, 14 and 21 days) were used, using the same techniques of extraction and analysis. In the study of identification of VOCs, the fungi were: L. gonubiensis, L. parva, L. pseudotheobromae, L. theobromae, Neosicoccum ribis, N. cordaticola, N. parvum, Botrysphaeria mamane and Pseudofusicoccum stromaticum cultivated in BD under the same conditions. As extraction and analytical technique, headspace solid phase microextraction (SPME-HS), coupled with gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), was used. The data of the analyzes were also submitted to statistical treatments of PCA and HCA. The identification of fungal VOCs was adequate to discriminate ten species of the family Botryosphaeriaceae. The discrimination of the N. parvum / N. Ribis pointed out the importance of VOCs as an auxiliary chemotaxonomic tool. In addition, α-bisabolol, which was produced at high level (88.83%) by the P. stromatium fungus, can be identified as a chemical marker for this specie. The production of VOCs by the A.rigidiuscula fungus showed greater qualitative and quantitative variations in nutrient poor media. The fungi N.parvum, L. gonubiensis and A. rigidiuscula presented cytotoxic potential and the study of non-volatile compounds showed significant variations in the fatty acids produced in the mycelia and extracted liquid media. The metabolites (3S, 4S)-4-hydroxymellein, cyclic (Leu-Pro), cyclic (S-Phe-S-(Leu-Pro), (3S, 4R)-4-hydroxymellein mellein, pestalopyrone, xylitol, cyclo (L-Pro-L-Tyr) and tyrosol. The isolation of diketopiperazines suggests a relationship of these compounds with the cytotoxic potential of active extracts, since the anticâncer potential of this class is reported in the literature.

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Figura 1 -  Fungos da família Botryosphaeriaceae: L. theobromae, N. parvum, B. dothidea e D. mutila, Dothiorella iberica, Neoscytalidium hyalinum, Pseudofusicoccum stromaticum, Sphaeropsis citrigena... 32

Figura 2  F. decemcellulare (A), Sintomas de cancrose em tronco em pinha (B) e A. rigidiuscula (C)... 34

Figura 3  Cepas fúngicas de isolados dos fungos endofíticos estudados... 35

Figura 4  _{Relação das estruturas dos metabólitos secundários isolados de fungos do} gênero Lasiodiplodia, segundo a literatura... 39 Figura 5  _{Relação das estruturas dos metabólitos secundários isolados de fungos do}

gênero Neofusicoccum, segundo a literatura... 42

Figura 6  _{Relação de metabólitos secundários isolados de fungos do gênero} Botryosphaeria, segundo a literatura... 47 Figura 7  Relação das estruturas dos metabólitos secundários isolados de fungos do

gênero Diplodia, segundo a literatura... 51 Figura 8  _{Relação das estruturas dos metabólitos secundários isolados de fungos do}

gênero Dothirela, segundo a literatura... 52

Figura 9  _{Relação das estruturas metabólitos secundários isolados de fungos do} gênero Guignardia segundo a literatura... 53

Figura 10  Relação das estruturas dos metabólitos secundários isolados de fungos do gênero Guignardia, segundo a literatura... 56

Figura 11  _{Via metabólica para produção de compostos orgânicos voláteis liberados} após crescimento em duas fontes diferentes de carbono (glicose e octacosano)... 67

Figura 12  _{Esquema geral da MEFS... 69}

(10)

Figura 15  _{Utilização da ACP na triagem de compostos bioativos... 75}

Figura 16  _{Utilização da ACP na avaliação do ciclo de vida... 75}

Figura 17  Utilização da ACP com ferramenta para auxiliar o rastreio da composição química de espécies... 76

Figura 18  _{Utilização da AAH para auxiliar na identificação de gases nocivos... 78}

Figura 19  Utilização da AAH para ajudar a avaliar a lipolificidade de compostos farmacologicamente importantes... 79

Figura 20  _{Utilização da AAH para avaliar a influência das nos parâmetros sensoriais} dos cultivares de marcieiras... 79

Figura 21  _{Utilização da AAH para auxiliar no da composição química de espécies... 80}

Figura 22  _{Cepas fungos endofíticos estudados... 82}

Figura 23  _{Cultivo do fungo}_{A. rigidiuscula}_{em quatro meios de cultura diferentes} (BD, BDA, peptona e arroz)... 85

Figura 24  Gráfico do efeito dos valores mínimos e máximos de cada parâmetro (A – temperatura e B - tempo) e gráfico de Pareto (C) das condições de otimização para extração de COVs por HS-MEFS dos fungos endofíticos da família Botryosphaeriaceae... 86

Figura 25  _{Gráfico do efeito dos valores mínimos e máximos de cada parâmetro (A -} temperatura, B – tipo de fibra e C - tempo) e gráfico de Pareto (D) das condições de otimização para extração de COVs por HS-MEFS do fungo A. rigidiuscula... 87

Figura 26  _{Gráfico dos escores das 34 variáveis das dez amostras de ACP dos dados}

de CG-EM de dez fungos da família Botryosphaeriaceae... 93

Figura 27  Dendrograma de AAH dos dados de CG-EM de dez fungos da família Botryosphaeriaceae... 93

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fungo A. rigidiuscula em diferentes condições de cultivo... 97

Figura 30  _{Espectro de massas do isobutanol... 98}

Figura 31  _{Espectro de massas do álcool isopentílico... 99}

Figura 32  _{Espectro de massas do 2-metilbutan-1-ol... 99}

Figura 33  _{Espectro de massas do octan-1-ol... 99}

Figura 34  _{Espectro de massas do álcool feniletílico... 99}

Figura 35  _{Espectro de massas do 2-butiloctan-1-ol... 99}

Figura 36  _{Espectro de massas do 2-etildecan-1-ol... 100}

Figura 37  _{Espectro de massas do decan-1-ol... 100}

Figura 38  _{Espectro de massas do undecan-2-ona... 100}

Figura 39  _{Espectro de massas do}α_{-copaeno... 100}

Figura 40  _{Espectro de massas do -elemeno... 100}

Figura 41  _{Espectro de massas do aristoleno... 101}

Figura 42  _{Espectro de massas do calareno... 101}

Figura 43  _{Espectro de massas do eremofileno... 101}

Figura 44  Espectro de massas do δ_{-amorfeno... 101}

Figura 45  _{Espectro de massas do germacreno D... 101}

Figura 46  _{Espectro de massas do aristoloqueno... 102}

Figura 47  _{Espectro de massas do valenceno... 102}

Figura 48  Espectro de massas do α_{-selineno... 102}

(12)

Figura 51  _{Espectro de massas do zonareno... 103}

Figura 52  Espectro de massas do trans_{-cadina-1(2), 4-dieno... 103}

Figura 53  _{Espectro de massas do palustrol... 103}

Figura 54  _{Espectro de massas do globulol... 103}

Figura 55  Espectro de massas do α_{-cedreno epóxido... 103}

Figura 56  _{Espectro de massas do -cedren-9-ona... 104}

Figura 57  _{Espectro de massas do}α_{-cadinol... 104}

Figura 58  _{Espectro de massas do junipercanfor... 104}

Figura 59  _{Espectro de massas do 5-neo-cedrenol... 104}

Figura 60  _{Espectro de massas do}α_{-bisabolol... 104}

Figura 61  _{Espectro de massas do acetato de guaiol... 105}

Figura 62  _{Espectro de massas do 13-hidroxi-valenceno... 105}

Figura 63  _{Espectro de massas do hexadecan-3-ona... 105}

Figura 66  _{Espectro de massas do octano... 106}

Figura 67  _{Espectro de massas do etilbenzeno... 106}

Figura 68  _{Espectro de massas do acetato de 3-metilbutila... 106}

Figura 69  _{Espectro de massas do acetato de 2-metilbutila... 107}

Figura 70  _{Espectro de massas do acetato de estireno... 107}

Figura 71  _{Espectro de massas do heptan-1-ol... 107}

(13)

 Espectro de massas do eucaliptol... 108

Figura 75  Espectro de massas do (E_{)-oct-2-enal... 108}

Figura 76  _{Espectro de massas do 4-etilanisol... 108}

Figura 77  _{Espectro de massas do 2-feniletanol... 109}

Figura 78  _{Espectro de massas do acetato de octan-3-ol... 109}

Figura 79  _{Espectro de massas do 4-metoxi-estireno... 109}

Figura 80  _{Espectro de massas do 4-etilfenol... 109}

Figura 81  _{Espectro de massas do borneol... 110}

Figura 82  _{Espectro de massas do naftaleno... 110}

Figura 83  _{Espectro de massas do 2-metilisoborneol... 110}

Figura 84  _{Espectro de massas do decan-3-ona... 110}

Figura 85  _{Espectro de massas do isoborneol... 111}

Figura 86  _{Espectro de massas do decanal... 111}

Figura 87  _{Espectro de massas de composto não identificado... 111}

Figura 88  _{Espectro de massas do 4-etilguaiacol... 111}

Figura 90  _{Espectro de massas do (5Z, 7E}_{)-1,5,7-dodecatrieno... 112}

Figura 91  _{Espectro de massas do (5E}_{)-5-dodecen-7-ino... 112}

Figura 92  _{Espectro de massas do (5Z}_{)-5-dodecen-7-ino... 112}

Figura 94  _{Espectro de massas do 4-etil-1,2-dimetilbenzeno... 113}

(14)

Figura 97  _{Espectro de massas do decanoato de etila... 114}

Figura 98  Espectro de massas de _{-cariofileno... 114}

Figura 101  _{Espectro de massas do geranilacetona... 115}

Figura 102  Espectro de massas do _{-muuroleno... 115}

Figura 103  _{Espectro de massas do -selineno... 115}

Figura 104  _{Espectro de massas do valenceno... 115}

Figura 105  _{Espectro de massas do epizonareno... 116}

Figura 106  _{Espectro de massas do}α_{-muuroleno... 116}

Figura 107  _{Espectro de massas do -cadineno... 116}

Figura 108  _{Espectro de massas do trans}_{- -cadineno... 116}

Figura 109  Espectro de massas do acetato do cis_{-nerolidol... 117}

Figura 111  _{Espectro de massas do hexanodecanoato de etila... 117}

Figura 112  _{Espectro de massas do linoleato de etila... 117}

Figura 113  _{Espectro de massas do linoleato de etila... 118}

Figura 114  _{Sistema utilizado para reação de saponificação das frações hexânicas... 132}

Figura 115  _{Cromatograma de análise da fração 474-p3 por CLAE... 135}

(15)

 Estrutura da dicetopiperazina ciclo (Leu-Pro), 474-p5b... 140

Figura 121  _{Espectro na região de infravermelho de 474-p5... 141}

Figura 122  _{Espectro de massas (IE, 70 eV) de 474-p5a... 141}

Figura 123  _{Espectro de massas (IE, 70 eV) de 474-p5b... 141}

Figura 124  Espectro de RMN 1_{H de 474-p5 (MeOD, 600 MHz)... 142}

Figura 125  _{Espectro de RMN}13_{C de 474-p5 (MeOD, 150 MHz)... 142}

Figura 126  _{Espectro de RMN}1 H, 1_{H-COSY de 474-p5 (MeOD, 600 MHz)... 143}

Figura 127  _{Espectro de RMN}1 H, 13_{C-HSQC de 474-p5 (MeOD, 600 x 150 MHz)... 143}

Figura 128  _{Espectro de RMN}1 H, 13_{C-HMBC de 474-p5 (MeOD, 600 x 150 MHz)... 144}

Figura 129  _{Principais correlações de COSY e HMBC da substância 474-p6... 146}

Figura 130  _{Estrutura da dicetopiperazina ciclo (S-Phe-S}_{-Pro)... 146}

Figura 132  _{Espectro de massas (IE, 70 eV) de 474-p6... 147}

Figura 133  Espectro de RMN 1_{H de 474-p6 (MeOD, 600 MHz)... 148}

Figura 134  Espectro de RMN 13_{C de 474-p6 (MeOD, 150 MHz)... 148}

Figura 135  _{Espectro de RMN}1_H,1_{H-COSY de 474-p6 (MeOD, 600 MHz)... 149}

Figura 136  _{Espectro de RMN}1_H,13_{C-HSQC de 474-p6 (MeOD, 600 x 150 MHz)... 149}

Figura 137  _{Espectro de RMN}1_H,13_{C-HMBC de 474-p6 (MeOD, 600 x 150 MHz)... 150}

Figura 138  _{Principais correlações de COSY da substância 474-p7... 152}

Figura 139  _{Principais correlações de HMBC da substância 474-p7... 153}

Figura 140  _{Estrutura da isocumarina de trans-(3S, 4R}_{)-4-hidroximeleina... 153}

(16)

Figura 143  _{Espectro de RMN}1

H de 474-p7 (MeOD, 300 MHz)... 155

Figura 144  Espectro de RMN 13_{C de 474-p7 (MeOD, 75 MHz)... 155}

Figura 145  Espectro de RMN 13_{C - DEPT 135º de 474-p7 (MeOD, 75 MHz)... 156}

Figura 146  Espectro de RMN 1H, 1_{H-COSY de 474-p7 (MeOD, 300 MHz)... 156}

Figura 147  Espectro de RMN 1H, 13_{C-HSQC de 474-p7 (MeOD, 300 x 75 MHz)... 157}

Figura 148  _{Espectro de RMN}1_H,13_{C-HMBC de 474-p7 (MeOD, 300 x 75 MHz)... 157}

Figura 151  _{Estrutura da isocumarina (R}_{)-meleina... 160}

Figura 154  _{Espectro de RMN}1 H de 474-p12 (CDCl3, 300 MHz)... 162

Figura 155  Espectro de RMN 13C de 474-p12 (CDCl3, 75 MHz)... 162

Figura 156  Espectro de RMN 13C - DEPT 135º de 474-p12 (CDCl3, 75 MHz)... 163

Figura 157  Espectro de RMN 1H, 1H-COSY de 474-p12 (CDCl3, 300 MHz)... 163

Figura 158  _{Espectro de RMN}1_H,13_{C-HSQC de 474-p12 (CDCl}₃_{, 300 x 75 MHz)... 164}

Figura 159  _{Espectro de RMN}1_H,13_{C-HMBC de 474-p12 (CDCl}₃_{, 300 x 75 MHz)... 164}

Figura 162  _{Estrutura do policetídeo pestalopirona... 167}

(17)

 , 75 MHz)... 169

Figura 167  Espectro de RMN 13C - DEPT 135º de 474-p13 (CDCl3, 75 MHz)... 169

Figura 168  Espectro de RMN 1H, 1H-COSY de 474-p13 (CDCl3, 300 MHz)... 170

Figura 169  Espectro de RMN 1H, 13C-HSQC de 474-p13 (CDCl3, 300 x 75 MHz)... 170

Figura 170  Espectro de RMN 1H, 13C-HMBC de 474-p13 (CDCl3, 300 x 75 MHz)... 171

Figura 171  _{Estrutura do poliol xilitol... 172}

Figura 172  _{Espectro de RMN}1 H de 474-BD-M (CDCl3, 300 MHz)... 173

Figura 173  _{Espectro de RMN}13 C de 474-BD-M (CDCl3, 75 MHz)... 173

Figura 174  _{Espectro de RMN}13 C – DEPT 135º de 474-BD-M (CDCl3, 75 MHz)... 174

Figura 175  _{Principais correlações de COSY e HMBC da substância 533-p1... 175}

Figura 176  _{Estrutura da dicetopiperazina ciclo (L-Pro-L}_{-Tyr)... 176}

Figura 178  Espectro de RMN 1H de 533-p1 (DMSO-d6, 500 MHz)... 177

Figura 179  Espectro de RMN 13 APT de 533-p1 (DMSO-d6, 125 MHz)... 178

Figura 180  Espectro de RMN 1H, COSY de 533-p1 (DMSO-d6, 500 x 500 MHz)... 178

Figura 181  _{Espectro de RMN}1_H,13_{C-HSQC de 533-p1 (DMSO-d}₆_{, 500 x 125 MHz).. 179}

Figura 182  _{Espectro de RMN}1_H,13_{C-HMBC de 533-p1 (DMSO-d}₆_{, 500 x 125 MHz).. 179}

Figura 184  _{Estrutura química do tirosol... 181}

Figura 186  _{Espectro de RMN}1 H de 533-p2 (DMSO-d6, 500 MHz)... 182

(18)

Figura 189  _{Espectro de RMN}1

H, 13C-HMBC de 533-p2 (DMSO-d6, 500 x 125 MHz).. 183

Figura 190  Gráfico dos escores das 36 variáveis e das doze amostras da ACP, de CG-EM e CG-DIC dos fungos N. parvum, L. gonubiensis e A. rigidiuscula... 186

Figura 191  _{Gráfico dos escores das 36 variáveis e das doze amostras da AHC de} CG-EM e CG-DIC dos fungos N. parvum, L. gonubiensis e A. rigidiuscula... 187

Figura 192  _{Espectro de massas de butanoato de octila... 189}

Figura 193  _{Espectro de massas de 2-metilpropanoato de 2-etil-3-hidroxihexila... 190}

Figura 194  _{Espectro de massas de 9-oxononanoatode metila... 190}

Figura 195  _{Espectro de massas de acetato de} 1-metil-3-(2,6,6-trimetil-1-ciclohexen-1-il)propila... 190

Figura 196  _{Espectro de massas de acetato de nonanedioatode dimetila... 190}

Figura 197  _{Espectro de massas de meleina... 191}

Figura 198  _{Espectro de massas de jasmonato de metila... 191}

Figura 199  _{Espectro de massas de}_{miristoleato de metila...}₁₉₁

Figura 200  _{Espectro de massas de tetradecanoato de metila... 191}

Figura 201  _{Espectro de massas de cis}_{-10-pentadecenoato de metila... 192}

Figura 202  _{Espectro de massas de pentadecanoato de metila... 192}

Figura 203  _{Espectro de massas de palmitoleato de metila... 192}

Figura 204  _{Espectro de massas de hexadecanoato de metila... 192}

Figura 205  _{Espectro de massas de 14-metilhexadecanoato de metila... 193}

Figura 206  _{Espectro de massas de hexadecanoato de etila... 193}

Figura 207  Espectro de massas de cis_{-10-heptadecenoato de metila... 193}

(19)

 Espectro de massas de linoleato de metila... 194

Figura 211  _{Espectro de massas de elaidato de metila... 194}

Figura 212  _{Espectro de massas de oleato de metila... 194}

Figura 213  _{Espectro de massas de estearato de metila... 195}

Figura 214  _{Espectro de massas de oleato de etila... 195}

Figura 215  _{Espectro de massas de nonadecanoate de metila... 195}

Figura 216  _{Espectro de massas de araquidonato de metila... 195}

Figura 217  _{Espectro de massas de 8,11,14-eicosanotrienoato de metila... 196}

Figura 218  _{Espectro de massas de cis-11,14,17-eicosanotrienoato de metila... 196}

Figura 219  _{Espectro de massas de araquidato de metila... 196}

Figura 220  _{Espectro de massas de docosanoato de metila... 196}

(20)

Tabela 1  Fungos endofíticos isolados de plantas da Caatinga... 35

Tabela 2  Relação dos metabólitos secundários isolados de fungos do gênero

Lasiodiplodia e suas respectivas espécies... 36

Tabela 3  _{Relação dos metabólitos secundários isolados de fungos do gênero} Neofusicoccum e suas respectivas espécies, segundo a literatura... 41

Tabela 4  _{Relação dos metabólitos secundários isolados de fungos do gênero} Botryosphaeria e suas respectivas espécies, segundo a literatura... 42

Tabela 5  _{Relação das estruturas dos metabólitos secundários isolados de fungos do} gênero Diplodia e suas respectivas espécies, segundo a literatura... 50

Tabela 6  Relação dos metabólitos secundários isolados de fungos do gênero Dothiorela e suas respectivas espécies, segundo a literatura... 51

Tabela 7  _{Relação dos metabólitos secundários isolados de fungos do gênero} Fusicoccum e suas respectivas espécies, segundo a literatura... 52

Tabela 8  Relação dos metabólitos secundários isolados de fungos do gênero Sphaeropsis e suas respectivas espécies, segundo a literatura... 53

Tabela 9  _{Relação dos metabólitos secundários isolados de fungos do gênero} Guignardia e suas respectivas espécies, segundo a literatura... 54

Tabela 10  _{Fungos endofíticos isolados de plantas da Caatinga...} ₈₂

Tabela 11  _{Matriz de planejamento experimental 2}2 _{e respostas para otimização das} condições de extração de COVs dos fungos da família Botryosphaeriaceae 85

Tabela 12  _{Matriz de planejamento experimental 2}3_{e respostas para otimização das} condições de extração de COVs do fungo A. rigidiuscula... 87

Tabela 13  Composição de COVs produzidos por fungos endofíticos da família Botryosphaeriaceae... 91

Tabela 14  _{Composição química volátil do fungo} _{A. rigidiuscula em diferentes} condições de cultivo... 96

(21)

extratos obtidos cultivo em pequena escala dos fungos estudados... 129

Tabela 17  Massas dos extratos obtidos dos fungos 600, 474 e 533, cultivados em grande escala nos meios de cultura BD, peptona e arroz... 130

Tabela 18  _{Massas das frações acetonitrila oriundas do desengorduramento dos} extratos obtidas cultivo em grande escala dos fungos 600, 474 e 533... 130

Tabela 19  Massas das frações hexânicas oriundas do desengorduramento dos extratos obtidas do cultivo em grande escala dos fungos 600, 474 e 533... 131

Tabela 20  _{Massas dos ácidos graxos livres dos fungos 600, 474 e 533... 132}

Tabela 21  _{Massas dos ésteres metílicos dos ácidos graxos obtidos dos fungos 600,} 474 e 533... 133

Tabela 22  _{Porcentagem de ésteres metílicos dos ácidos graxos obtidos dos fungos} 600, 474 e 533... 133

Tabela 23  Dados do fracionamento cromatográfico dos extratos obtidos do cultivo em grande escala dos fungos 600, 474 e 533... 134

Tabela 24  Dados espectroscópicos de RMN 1H, 13C, HSQC e HMBC (MeOD) de 474-p5, comparado com dados da literatura (HOLKER e SIMPSON, 1981 – CDCl3)... 138

Tabela 25  _{Dados espectroscópicos de RMN}1_H,13_{C, HSQC e HMBC (MeOD) de} 474-p5b, comparado com dados da literatura (CAMILLO, 2007)... 140 Tabela 26  _{Dados espectroscópicos de RMN}1_H,13_{C, HSQC e HMBC (MeOD) de}

474-p6, comparado com dados da literatura (WANG et al., 2010 – CDCl3) 146

Tabela 27  Padrão de hidrogenação dos carbonos determinada através da análise comparativa entre os espectros de RMN 13C e DEPT 135º 474-p7... 152

(22)

comparativa entre os espectros de RMN 13C e DEPT 135º 474-p12... 159

Tabela 30  _{Dados espectroscópicos de RMN}1

H, 13C, HSQC e HMBC (CDCl3) de

474-p12, comparado com dados da literatura (ISLAM et al., 2007 – CDCl3)... 160

Tabela 31  Padrão de hidrogenação dos carbonos determinada através da análise comparativa entre os espectros de RMN 13C e DEPT 135º 474-p13... 165

Tabela 32  Dados espectroscópicos de RMN 1H, 13C, HSQC e HMBC (MeOD) de 474-p13, comparado com dados da literatura (XU et al., 2011 - MeOD)... 166 Tabela 33  _{Dados espectroscópicos de RMN} 1

H e 13C (DMSO) de 474-BD-M, comparados com dados da literatura (MISRA et al., 2011 – D2O)... 172

Tabela 34  Dados espectroscópicos de RMN 1H, 13C, (DMSO-d6) de 533-p1, comparado com dados da literatura (ZANARDI, 2010 – MDSO-d6)... 176

Tabela 35  _{Dados espectroscópicos de RMN} 1

H, 13C, (DMSO-d6) de 533-p2, comparado com dados da literatura (DASCALIUC et al., 2008 - (DMSO-d6)... 181

Tabela 36  _{Composição de ácidos graxos dos fungos N. parvum; L. gonubiensis}_{e A.} rigidiuscula em diferentes condições de cultivo... 185

(23)

Botryosphaeriaceae, obtenção, extração e análise dos COVs... 84

Fluxograma 2  Obtenção dos extratos dos fungos a partir dos meios de cultivo... 127

Fluxograma 3  Obtenção dos extratos dos fungos a partir do meio de cultivo em arroz... 127

(24)

IV Infravermelho

RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13 EM-IE Espectrometria de Massas por Impacto Eletrônico

p.f Ponto de fusão

J Constante de Acoplamento

Δ Deslocamento químico

d Dubleto

Dd Duplo dubleto

Hz Hertz

S Singleto

COSY Correlated Spectroscopy

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

BB Broad Band decoupling

1D Unidimensional

2D Bidimensional

M Multipleto

IK Indice de Kolvats

CG-DIC Cromatografia Gasosa acoplada a Detector por Ionização de Chama CG-EM Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas

CCD Cromatografia em Camada Delgada

Rf Índice de Retenção

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CENAUREMN Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear

Θ Ângulo de nutação

ºC/min Grau Celsius por Minuto

eV ElétronVolt

MTT 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-brometo tetrazolina

Ф Diâmetro

(25)

HS Headspeace

PDMS Polidimetilsiloxano

DBV Divenilbenzeno

rDNA Ribossomal Deoxiribo Nucleico Ácido COVs Compostos orgânicos voláteis

BD Batata dextrose

DBA Batata dextrose agar

Pep Peptona

AR Arroz

LSU Large subunit

ITS Internal transcribed spacer

BT Beta tubulin

ACT Actin

TEF Translocation elongation factot pH Potencial hidrogeniônico GUI

R

(26)

1 CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO: ASPECTROS GERAIS E OBJETIVOS DO TRABALHO...

26 1.1 1.1 Aspectos gerais... 27 1.2 Objetivos e estrutura do trabalho... 28 REFERÊNCIAS... 29 2 CAPÍTULO 2 - CONSIDERAÇÕES TAXONÔMICAS E LEVANTAMENTO

BIBLIOGRÁFICO...

30 2.1 Considerações taxonômicas sobre a família Botryosphaeriaceae...

31 2.2 Considerações taxonômicas sobre a família Nectriaceae e a espécie Albonectria

rigidiuscula...

32 2.3 Fungos endofitícos estudados...

34 2.4 Levantamento bibliográfico...

36

2.4.1 Gênero Lasiodiplodia... 36

2.4.2 Gênero Neofusicoccum... 40

2.4.3 Gênero Botryosphaeria... 42

2.4.4 Gênero Diplodia... 50

2.4.5 GêneroDothiorela...

51

2.4.6 Gênero Fusicoccum... 52

2.4.7 Gênero Sphaeropsis...,,... 53

2.4.8 Gênero Guignardia... 54 2.5 Considerações finais... 57 REFERÊNCIAS... 58

3 CAPÍTULO 3 - COMPOSTOS ORGÂNICOS VOLÁTEIS (COVS) DOS

FUNGOS ENDOFÍTICOS... 65 3.1 Produção de COVs por fungos... 66 3.2 Considerações sobre metodologias para estudo de COVs fúngicos... 68

3.2.1 Microextração em fase sólido (MEFS)... 68

3.2.2 Planejamento experimental... 71

(27)

plantas da Caatinga... 80

3.3.1 Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM)... 80

3.3.2 Fungos endofíticos estudadas... 81

3.3.3 Reagentes e materiais... 83

3.3.4 Cultivo dos fungos da família Botryosphaeriaceae e obtenção dos compostos orgânicos voláteis (COVs)... 83

3.3.5 Cultivo do fungo A. rigidiuscula e obtenção dos compostos orgânicos voláteis (COVs)... 84

3.3.6 Otimização das condições de HS-MEFS para extração dos COVs dos fungos da família Botryosphaeriaceae... 85

3.3.7 Otimização das condições de HS-MEFS para extração dos COVs do fungo A. rigidiuscula... 86

3.3.8 Análise multivariada de dados de CG-EM dos fungos da família Botryosphaeriaceae... 88

3.3.9 Análise multivariada de dados de CG-EM do fungo A. rigidiuscula... 88 3.4 Resultados e discussão... 89

3.4.1 Identificação e análise de dados multivariados de fungos da família Botryosphaeriaceae... 89

3.4.2 Identificação de COVs e análise multivariada de dados do fungo A. rigidiuscula em diferentes condições de cultivo... 94 3.5 Considerações finais... 98 REFERÊNCIAS... 119 4 CAPÍTULO 4 - COMPOSTOS ORGÂNICOS NÃO VOLÁTEIS DOS FUNGOS

ENDOFÍTICOS ESTUDADOS...

122 4.1 Produção de metabólitos secundários por fungos endofíticos... 123 4.2 Metodologia do estudo... 124

4.2.1 Métodos cromatográficos... 124 4.2.1.1 Cromatografia de adsorção... 124 4.2.1.2 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)... 124

(28)

4.2.2.3 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho (IV)... 126

4.2.3 Obtenção dos extratos fúngicos... 126 4.2.3.1 Estudo químico dos fungos endofíticos da família Botryosphaeriaceae... 126 4.2.3.2 Processo de desengorduramento dos extratos obtidos dos 11 fungos cultivados

em BD e peptona... 128 4.2.3.3 Obtenção dos extratos em grande escala... 129 4.2.3.4 Processo de desengorduramento dos extratos obtidos do cultivo em grande

escala dos fungos 600, 474 e 533... 130

4.2.4 Estudo dos ácidos graxos dos fungos endofíticos... 132 4.2.4.1 Reação de saponificação... 132 4.2.4.2 Reação de esterificação dos ácidos graxos (metilação em meio ácido)... 133 4.2.4.3 Purificação dos ésteres metílicos dos ácidos graxos em micro-coluna

cromatográfica... 133 4.2.4.4 Análise dos ésteres metilícos dos ácidos graxos dos fungos 600, 474 e 533... 134

4.2.5 Fracionamento cromatográfico dos extratos dos fungos 600,474 e 533...

134

4.2.6 Ensaio de atividade de citotoxicidade in vitro frente à linhagem de células cancerígenas... 137 4.3 Resultados e Discussão... 137

4.3.1 Determinação estrutural de p5 como uma mistura (p51 e 474-p5b)... 137

4.3.2 Determinação estrutural de 474-p6... 145

4.3.6 Determinação estrutural de 474-BD-M... 172

4.3.9 Ácidos graxos... 184 4.3.9.1 Resultados da analise multivariada de dados e identificação dos ácidos

graxos dos fungos N. parvum, L, gonubiensis A. rigidiuscula em diferentes condições de cultivo... 184

(29)

(30)

CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO: ASPECTROS GERAIS E

OBJETIVOS DO TRABALHO

OH N N H

O

(31)

1.1 Aspectros gerais

Os fungos endofíticos vivem nos órgãos internos de plantas, mas sem causar efeitos patogênicos aparentes ao hospedeiro. Nessa associação simbiótica, a planta hospedeira abriga e fornece nutrientes para o desenvolvimento do fungo, que por sua vez ajuda na proteção contra herbívoros e patógenos da planta. Os fungos endofíticos, também são responsáveis pela adaptação das plantas aos estresses bióticos e abióticos (GUNATILAKA, 2006).

Cada vez mais, fungos endofíticos tem despertado interesse para estudos (GUTIERREZ, GONZALEZ e RAMIRREZ, 2012). Neste contexto, espécies de fungos da família Botryosphaeriaceae possuem grande ocorrência e distribuição em plantas endêmicas do bioma Caatinga, onde as espécies mais frequentes são as pertencentes aos gêneros Lasiodiplodia, Neofusicoccum e Pseudofusicoccum (GONÇALVES, 2014). Devido a grande diversidade de espécies fúngicas, endofíticas e fitopatógenas, a taxonomia da família Botryosphaeriaceae é bastante confusa, principalmente, devido à sobreposição de características morfológicas (CROUS et al., 2006).

Rico em espécies fúngicas da família Botryosphaeriaceae, o bioma Caatinga é bastante heterogêneo e apresenta grande biodiversidade de espécies endêmicas com um patrimônio biológico não encontrado em nenhum outro local do planeta. Compreendendo uma área de 935 mil km2, totalizando 11% do território brasileiro, esse ecossistema estenden-se pelos estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Paraíba, Pernambuco, Piaui, Rio Grande do Norte, Sergipe e o norte de Minas Gerais (MAIA, 2004).

Especialistas em biodiversidade, principalmente, aqueles que estudam fungos endofíticos tem demonstrado que plantas pertencentes ao bioma Caatinga são mais ricas em espécies fúngicas. Freire e Gonçalves (2012), relataram a ocorrência de 332 espécies de fungos endofíticos, associados a plantas do bioma Caatinga, somente no estado do Ceará.

(32)

linhagens fora da família Botryosphaeriaceae. De acordo com PHILLIPS et al (2013), estudos isolados de caracteres morfológicos são inadequados para definir gêneros ou identificar espécies fúngicas, e que os táxons mais antigos relacionados com Botryosphaeriaceae, para os quais os dados de sequenciamento de DNA não estão disponíveis, não devem ser agrupados dentro dessa família.

Portanto, estudos de quimiotaxonomia utilizando os compostos orgânicos voláteis de microrganismos (COVs) como biomarcadores podem auxiliar na identificação de espécies da família Botryosphaeriaceae.

Apartir da produção de COVs, a interação entre fungos endofíticos e plantas possibilita o surgimento de uma ampla gama de metabólitos secundários de diversas classes químicas. Estudos tem demostrado que os fungos endofíticos representam uma fonte para busca de novas moléculas biologicamente ativas, pois, eles habitam ambientes ecológicos ainda pouco explorados (GUTIERREZ, GONZALEZ e RAMIRREZ, 2012). Desta forma, estudos químicos de fungos endofíticos associados a plantas do bioma Caatinga poderão contribuir para um melhor conhecimento do potencial dessa microbiota, além de auxiliarem na quimiotaxonomia da família Botryosphaeriaceae.

1.2 Objetivos e estrutura do trabalho

Considerando-se a disposição de fungos endofíticos da família Botryosphaeriaceae em plantas do bioma Caatinga, este trabalho teve como objetivo principal realizar um estudo de investigação química de fungos endofíticos, a partir da obtenção e análise de COVs e ésteres metílicos de ácidos graxos; isolamento e caracterização estrutural de metabólitos secundários; além da investigação de atividade citotóxica de extratos e substâncias isoladas.

Para facilitar o entendimento, o trabalho foi estruturado em quatro capítulos. No primeiro capítulo é feita uma introdução geral e apresentação do trabalho. No segundo capítulo são apresentados dados relativos às considerações taxonômicas e levantamento bibliográfico de metabólitos secundários dos fungos estudados. Já no terceiro capítulo são discutidos aspectros teóricos e práticos da produção e análise de COVs pelos fungos investigados. No quarto e último capítulo são apresentados os dados de isolamento e caracterização estrutural dos metabólitos secundários dos fungos endofíticos estudados.

(33)

REFERÊNCIAS

CROUS, P. W.; SLIPPERS, B.; WINFIELD, M. J.; RHEEDER, J.; MARASAS, W. F. O.; PHILIPS, A. J. L.; ALVES, A.; BURGESS, T.; BARBER, P.; GROENEWALD, J. Z. Phylogenetic lineages in the Botryosphaeriaceae. Stud. Mycol., Netherlands, v. 55 p. 235-256, 2006.

FREIRE, F. C. O.; GONÇALVES, F. J. T. A diversidade microbiológica da Caatinga cearence. Essentia, Sobral,v. 14, p.11-34, 2012.

GONÇALVES, F. J. T. Identificação de espécies de Botryosphaeriaceae endofíticas de plantas da Caatinga do estado do Ceará e patogenicidade em manga e ramos de umbu-cajá. 2014. 88 f. Tese (Doutorado em Fitopatologia) – Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, 2014.

GUNATILAKA, A. A. L. Natural products from plant-associated microorganisms: distribution, structural diversity, bioactivity, and implications of their occurrence. J. Nat. Prod., Washington, v. 69, p. 509-526, 2006.

GUTIERREZ, R. M. P; GONZALE, A. M. N., RAMIREZ, A. M. Compounds derived from endophytes: A review de phytochemistry and pharmacology. Curr. Med. Chem., Cambridge, v. 19, p. 2992-3030, 2012.

MAIA, G. N. Caatinga: árvores e arbustos e suas utilidades. 1ª ed. São Paulo: D&Z Computação Gráfica e Editora, 2004. 413 p.

(34)

CAPÍTULO 2

CONSIDERAÇÕES TAXONÔMICAS E

LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO

N N H

O

N N H

O

(35)

2.1 Considerações taxonômicas sobre a família Botryosphaeriaceae

Fungos da família Botryosphaeriaceae constituem um grupo bastante diverso, incluindo espécies endofíticas, fitopatógenas ou saprófitas com distribuição mundial sobre uma grande variedade de hospedeiros (CROUS et al., 2006; PHILLIPIS et al., 2013). Embora os fungos endofíticos desenvolvam uma relação mutualista no interior dos tecidos de plantas sem causar danos aparentes, sob certas condições, eles podem desenvolver uma relação parasitária com o hospedeiro e tornarem-se fitopatógenos (SCHULZ et al., 2005). Desta forma, fungos da família Botryosphaeriaceae são comumente encontrados em plantas de importância agroeconômica como fitopatogênicos e são bastante estudados (PHILLIPIS et al., 2013; HANTAO et al., 2013). Dentre esses fungos estão Lasiodiplodia theobromae, Neofusicoccum luteum, N.parvum, N.australe, Botryosphaeria dothidea, Diplodia mutila, D.seriata, Dothiorella iberica e D.viticola (Figura 1, p. 32). Esses fungos são altamente patogênicos para a espécie Vitis vinifera, causando cancros e descoloração vascular (ÚRBEZ-TORRES et al., 2009). Os fungos dessa família também são responsáveis por doenças em plantas como Eucalyptus globulus (HANTAO et al., 2013) E.urophylla (MOHALI et al., 2009) e Mangifera indica (SLIPPERS et al., 2005), dentre outras.

A idenficação de espécies e gêneros da família Botryosphaeriaceae, com base apenas nas características morfológicas é inadequado, e causa confusão na identificação. Assim, muitos táxons mais antigos relacionados à Botryosphaeriaceae, para os quais as culturas ou dados de sequências de DNA não estejam disponíveis não podem ser agrupados nesta família. Portanto, as descrições morfológicas devem ser complementadas apenas por ITS ou ITS + EF1-α, para as espécies de cada gênero (PHILLIPS et al., 2013).

A classificação taxonomica de anamorfos tem gerado muitas discordâncias ao longo do tempo, principalmente, devido a sobreposição de características. Sutton (1980) coloca o gênero Macrophoma como sinônimo de Sphaeropsis. Já a distinção entre Sphaeropsis e Diplodia também não tem sido bem evidente. Segundo Sutton (1980), proliferação de célula conidiogênica percorrente tem sido considerada mais típica para o gênero Sphaeropsis do que para Diplodia. No entanto, Phillips (2002), afirma que a proliferação percorrente também é encontrada em isolados de Diplodia.

(36)

Botrospharia com características morfológicas intermediários entre Diplodia e Fusicoccum (CROUS et al., 2006).

Embora os estudos filogenéticos utilizando dados de biologia molecular terem contribuído significativamente para a taxonomia da família Botryosphaeriaceae, alguns problemas ainda persistem (CROUS et al., 2006; PHILLIPS et al., 2013 e SLIPPERS, WINGFIELD, 2007). Por exemplo, as espécies Neofusicocum parvum e Neofusicocum ribis estão intimamente relacionadas e sua diferenciação é bastante confusa, sendo classificadas como um complexo N. parvum/N. ribis (POLIZZI et al., 2012). Até mesmo os dados de biologia molecular, utilizados na diferenciação dessas duas espécies geram resultados inconsistentes (POLIZZI et al., 2012; PAVLIC et al., 2009; PILLAY et al., 2013).

Figura 1 – Fungos da família Botryosphaeriaceae: L. theobromae, N. parvum, B. dothidea e D. mutila, Dothiorella iberica, Neoscytalidium hyalinum, Pseudofusicoccum stromaticum, Sphaeropsis citrigena

Fonte: PHILLIPS et al., 2013.

2.2 Considerações taxonômicas sobre a família Nectriaceae e a espécie Albonectria rigidiuscula

(37)

quatro espécies conhecidas: A. rigidiuscula, A. albosuccinea, A. verrucosa e A. albida (GUU, JU, HSIEH, 2007).

A espécie A. rigidiuscula tem como anamorfo o fungo Fusarium decemcellulare (Figura 2A, p. 34). Esse fungo tem outros nomes, como o ascomiceto Calonectria rigidiuscula e Nectria rigidiuscula (ROSSMAN et al., 1999). É considerado fitopatógeno e ataca espécies de plantas da família Anacardiaceae, Annonaceae, Sterculiaceae, Malvaceae, Apocynaceae, Euphorbiaceae, Meliaceae, Moraceae e Myrtaceae, causando, principalmente a morte de ponteiras, cancro, galhos, podridão dos frutos, cancro-do-ramo, superbrotamento (ROSSMAN et al., 1999).

Esse fungo já foi relatado como fitopatógeno em vários países, tais como China (QI et al., 2013), Cuba (VICENTE et al., 2012), México, Marrocos, Camarrões (SFALSIN, 2012) e Equador (LOMBARD et al., 2008). No Brasil foi isolado em diversas espécies de plantas coletadas na Bahia, Amazonas, Espírito Santo, Minas Gerais, Paraná (SFALSIN, 2012), Goiás e Distrito Federal (JUNQUEIRA et al., 2001).

(38)

Figura 2 – F. decemcellulare (A) e sintomas de cancrose em tronco em pinha (B); A. rigidiuscula (C).

Fonte: BRIOSO, 2012 Fonte: JUNQUEIRA et al., 2012

2.3 Fungos endofitícos estudados neste trabalho

Os fungos endofíticos estudados neste trabalho foram isolados a partir de plantas dispersas no bioma Caatinga no estado do Ceará e encontram-se depositados no laboratório de Fitopatologia da Embrapa Agroindústria Tropical - CNPAT sob a supervisão do Dr. Francisco das Chagas Oliveira Freire. Todos os fungos foram identificados por estudos filogenéticos de biologia molecular, com sequenciamento da região ITS e foram identificados como Lasiodiplodia theobromae (71); L. pseudotheobromae (277); L. citricola (258); L. gonubiensis (474); L. parva (511); Neofusicoccum cordaticola (434); N. parvum (600); N. ribis (683); Botryosphaeria mamane (20) e Pseudofusicoccum stromaticum (477) Tabela 1 e Figura 3, p. 35.

Já o fungo Albonectria rigidiuscula (533) foi identificado com sequenciamento de DNA das regiões LSU, ITS, BT, ACT e TEF. O DNA a partir da estirpe foi extraído a partir do micélio utilizando os laboratórios Bio-Mo; Kit de isolamento de DNA UltraClean Microbial. Fragmentos contendo os genes do RNA ribossomal 26S, Subunidade Grande D1 e D2 região (LSU) foram amplificados utilizando os iniciadores LR0R (ACCCGCTGAACTTAAGC) e LR5 (TCCTGAGGGAAACTTCG). Os fragmentos contendo o Espaçador Interno Transcrito 1 e 2 e o gene 5.8.S (STI) foi amplificado utilizando

os iniciadores LS266 (GCATTCCCAAACAACTCGACTC) e V9G

(TTACGTCCCTTTGTA). Os fragmentos contendo o fragmento parcial do gene da beta tubulina (BT) foi amplificado utilizando os iniciadores BT2a (GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC) e BT2b (ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC). Os fragmentos contendo o fragmento parcial do gene da actina (TCA) foi amplificado

(39)

utilizando os iniciadores de ACT-512F (ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC) e ACT-783R (TACGAGTCCTTCTGGCCCAT). Fragmentos contendo a translocação fator de elongação 1 alfa (TEF) foi amplificado utilizando os iniciadores EF1-728F (CATCGAGAAGTTCGAGAAGG) e EF2 (AACTTGCAGGCAATGTGG). Os fragmentos foram sequenciados com o v.3.0 pronto Reação Kit seqüenciamento Ciclo ABI Prim® Big DyeTM Terminator. As amostras foram analisadas em um ABI PRISM 3700 Genetic Analyzer e contigs foram montadas utilizando as sequências direto e inverso, com o programa do pacote SeqMan Lasergene. Uma análise de multigenes foi efetuada por comparação destas sequências em GenBank, em http://www.cbs.knaw.nl/ e na base de dados interna de CBS com as últimas espécies.

Tabela 1 – Fungos endofíticos isolados de plantas da Caatinga

Hospedeiro Endofítico associado Cód.

Espécie vegetal Nome comum

Croton campestris Velame-do-campo Lasiodiplodia citricola 258

Croton sp. - Lasiodiplodia gonubiensis 474

Spondias lútea Cajá Lasiodiplodia parva 511

Auxemma oncocalyx Pau branco Lasiodiplodia pseudotheobromae 277 Croton sonderianus Marmeleiro Lasiodiplodia theobromae 71

Psidium guajava Goiabeira Neofusicoccum ribis 683

Centrolobium microchaete Putumuju Neofusicocum cordaticola 434 Psidium guyanensis Araçá azedo Neofusicoccum parvum 600

Licania rígida Oiticica Botryosphaeria mamane 20

Schinopsis brasiliensis Pau-preto Pseudofusicoccum stromaticum 477

Psidium guajava Goiabeira Albonectria rigidiuscula 533

Fonte: Próprio autor.

Figura 3 – Cepas fúngicas de isolados dos fungos endofíticos estudados

(40)

2.4 Levantamento bibliográfico

Este levantamento bibliográfico apresenta os dados de estudos químicos realizados com espécies de fungos endofíticos da família Botryosphaeriaceae, mostrando os metabólitos secundários isolados. Os dados foram coletados através de pesquisa em bases de dados Scirus, SciFinder e Science Direct, usando os nomes dos gêneros dos fungos como palavras-chave de entrada, em artigos publicados no períodos de 1986 a 2016. Foram encontrados 246 compostos, que estão compilados nas Tabelas de 2-7. Já as estruturas dos respectivos compostos encontram-se agrupados nas Figuras de 4-12.

Os metabólitos secundários isolados de fungos endofíticos podem ser reunidos em diversas classes química, incluindo policetídeos, alcalóides, terpenos, isocumarinas, quinonas, fenilpropanóides, lignanas, ácidos fenólicos, benzopiranos, tetralonas, ciclopeptídeos entre outros. De acordo com o levantamento realizado para o gênero Botryospheria foi encontrada a maior quantidade de metabólitos secundários (114). Deste total, foram isolados 44 compostos do fungo B. rhodina. Além disso, várias dicetopiperazinas foram isoladas desses fungos; sendo que esta classe de substâncias apresenta uma ampla gama de atividades biológicas relatadas.

2.4.1 Gênero Lasiodiplodia

Dentro do perfil químico de fungos do gênero Lasiodiplodia, foram relatados 64 compostos, divididos em vários tipos de metabólitos secundários. O ácido jasmônico e seus derivados foram as substâncias mais descritas, seguidas de alguns policetídeos, tais como lasiodiplodina, lasioplinas e isocumarinas (Tabela 2, Figura 4).

Tabela 2- Relação de metabólitos secundários isolados de fungos do gênero Lasiodiplodia e suas respectivas espécies, segundo a literatura

Nº Nome Fungo Referência

1 Lasiodiplodina L. theobromae SULTAN et al., 2014

XU et al., 2014 KASHIMA et al., 2009

2 de-O-Metil-lasiodiplodina L. theobromae SULTAN et al., 2014 3

(3R,4R)-4-Hidroxi-de-O-metil-lasiodiplodina

L. theobromae SULTAN et al., 2014

4 (3R),(4S)-4-Hidroxilasiodiplodina L. theobromae YANG et al., 2000 5 (3R),(6R)-6-Hidroxi-de-O- L. theobromae YANG et al., 2000

(41)

metillasiodiplodina SULTAN et al., 2014 6

(3R),(5R)-5-Hidroxi-de-O-metillasiodiplodina

L. theobromae YANG et al., 2000

7 5-Oxo-Lasiodiplodina L. theobromae MATSUURA et al.,

1998

8 (3R),(5S)-5-Hidroxilasiodiplodina L. theobromae MATSUURA et al., 1998

9 (3R),(5R)-5-Hidroxilasiodiplodina L. theobromae MATSUURA et al., 1998

10 6-Oxo-de-O-metil-lasiodiplodina L. theobromae SULTAN et al., 2014 11 (E)-9-Eteno-lasiodiplodina L. theobromae SULTAN et al., 2014 12 (E)-9-Eteno-de-O-metil-lasiodiplodina L. theobromae SULTAN et al., 2014 13 (3R),(6S)-6-Hidroxilasiodiplodina L. theobromae LI et al., 2005

14 (3R),(5S)-5-Hidroxi-de-O-metillasiodiplodina

L. theobromae KASHIMA et al., 2009

15 (3S),(4R)-3-Carboxi-2-metileno-heptan-4-olido

L. theobromae HE et al., 2004

16 Ácido decumbico L. theobromae HE et al., 2004

17 (1S,4R,5S,6R)-7,9-Dioxa-3-metil-8-oxobiciclo[4.3.0.]-2 nonena-4,5-diol

L. theobromae MATSUURA et al., 1998

18 2-Octeno-t5-lactona L. theobromae MATSUMOTO et al.,

1994 19

(6'R)-2,4-diidroxi-6-(6'-hidroxiheptil)benzoato de etila

20 (6'R)-2,4-diidroxi-6-(6'-hidroxiheptil)-benzoato de isobutila

21 Ergosterol L. theobromae NUNES et al., 2008

22 Ácido 2,4,6-trimetiloct-2-enoico, 1,2,6,8a-tetrahidro-7-hidroxi-1,8a-dimetil-6-oxo-2-naftalenil éster

L. theobromae NUNES et al., 2008

23 cis-4-Hidroximeleina L. theobromae NUNES et al., 2008 LIM et al., 1998 24 Colestanol glicosídeo L. theobromae JINU et al., 2015

25 Taxol L. theobromae PANDI et al., 2011

26 4,5-Diidroxi-3-metil-ciclohex-2-ona L. theobromae KITAOKA et al., 2009

27 (1S,2R,5S,6R)-30-Metil-7-oxa-biciclo-[4.1.0]hept-3-en-2,5-diol

L. theobromae KITAOKA et al., 2009

28 (1S,4R,5S,6R)-7,9-Dioxa-3-metil-8-oxobiciclo[4.3.0.]-2-nonena-4,5-diol

29 (4S,5S)-4,5-Diidroxi-2-metil-ciclohex-2-enona

30 Ácido jasmônico

L. theobromae

ANDOLFI et al., 2014 DHANDHUKIA et al., 2008

DHANDHUKIA et al., 2007

NAKAMORI et al., 1994

(42)

MIERSCH, 1991 ALDRIDGE et al., 1967

31 Meleina L. theobromae

QIAN et al., 2014 NAKAMORI et al., 1994

ALDRIDGE et al., 1967

LIM et al., 1998

32 Teobroxido L. theobromae NAKAMORI et al.,

1994

33 trans-Resorcilídeo L. theobromae XU et al., 2014

34 Ácido 5ȕ-cucurbico L. theobromae MIERSCH, 1989

35 Etil (+)-7-iso-jasmônico L. theobromae MIERSCH, 1989 36 Etil (-)-7-iso-jasmônico L. theobromae MIERSCH, 1989 37 Ácido (+)-4,5-desidro-7-iso-jasmônico L. theobromae MIERSCH, 1989 38 Ácido (-)-4,5-desidro-7-iso-jasmônico L. theobromae MIERSCH, 1989 39 Ácido (11S)-(-)- hidroxijasmônico L. theobromae MIERSCH, 1991 40 Ácido (11R)-(-)- hidroxijasmônico L. theobromae MIERSCH, 1991 41 Ácido (-)-12-hidroxijasmônico L. theobromae MIERSCH, 1991

42 Lasiodiplina A L. pseudo

theobromae

WEI et al., 2014

43 Lasiodiplina B L. pseudo

theobromae

WEI et al., 2014

44 Lasiodiplina C L. pseudo

theobromae

WEI et al., 2014

45 Lasiodiplina D L. pseudo

theobromae

WEI et al., 2014

46 Lasiodiplina E L. pseudo

theobromae

WEI et al., 2014

47 Lasiodiplina F L. pseudo

theobromae

WEI et al., 2014

48 Ciclo-(Trp-Ala) L. pseudo

theobromae

WEI et al., 2014 QIAN et al., 2014

49 Palmarumicina LP1 L. pseudo

theobromae

LU et al., 2014

50 Cladospirona B L. pseudo

theobromae

LU et al., 2014

51 Ascocitatina L. pseudo

theobromae

LU et al., 2014

52 Sch 50676 L. pseudo

theobromae

LU et al., 2014

53 Lasiojasmonato A Lasiodiplodia sp. ANDOLFI et al., 2014 54 Lasiojasmonato B Lasiodiplodia sp. ANDOLFI et al., 2014 55 Lasiojasmonato C Lasiodiplodia sp. ANDOLFI et al., 2014 56 16-O-Acetilbotriosfaerilactona A Lasiodiplodia sp. ANDOLFI et al., 2014 57 16-O-Acetilbotriosfaerilactona C Lasiodiplodia sp. ANDOLFI et al., 2014 58 Botriosfaerilactona A Lasiodiplodia sp. ANDOLFI et al., 2014 59 (1R,2R)-Metil jasmonato Lasiodiplodia sp. ANDOLFI et al., 2014 60 (3S,4R,5R)-4-Hidroximetil-3,5- Lasiodiplodia sp. ANDOLFI et al., 2014 Continuação

(43)

dimetildiidro-2-furanona

61 (3R,4S)-Botriodiplodina Lasiodiplodia sp. ANDOLFI et al., 2014 62 Ácido indol-3-carboxílico Lasiodiplodia sp. QIAN et al., 2014 63 Indol-3-carbaldeido Lasiodiplodia sp. QIAN et al., 2014

64 2-Feniletanol Lasiodiplodia sp. QIAN et al., 2014

Figura 4 - Relação das estruturas dos metabólitos secundários isolados de fungos do gênero Lasiodiplodia, segundo a literatura

O OMe O H O OH _O OMe O H O OH O OMe O H O OH

4 5 ₆

O OMe O H O O 7 O OMe O H O OH 8 O OMe O H O OH 9 O OR1 O H O R₂ OR₃ O OMe O H O O 10 O OMe O H O 11 O OH O H O 12 O OMe O H O OH 13 O OMe O H O OH 14 O O COOH 15 O O COOH 16 O O OH OH O

17 O₁₈ O

O OH O O H OH O OH O O H OH 19

20 HO 21

O OH O O 22 O OH O OH 23 O O H OzB

cAO O OH

O OcA O OH Ph NH O Ph O O OH OH O H OH 24 25 OH OH O26 OH OH O 27 OH OH O O O 28 O OH OH 29 O COOH 30 OH OH O 32 O O O O H OH 33 OH COOH 34 O

COOC2H5

35

O

COOC₂H₅

(44)

O

COOH 38

39 40 41

NH N O X O R2 R₁ S N H N S N H O H O O 45 N H N H N S O S O 46 N H NH S NH O O

47 N_H

N H N H O O 48 49 OH OH O OH O _O OH 50 OH OH O OH O _O 51 OH OH OH O _O OH O 52 OH OH O _O O O O O O O 53 O O O O R O O O

54 R = -H

55 R = -H

56 R1 = -H, R2 = Ac

57 R₁ = -H, R₂ = Ac 58 R1 = -H, R2 = H

O

O O

O R1

OR2 COOMe

O 59 O O OH 60 O O H O

61 N_H

OH O 62 N H H O 63 OH 64 α β β β α O COOH OH O COOH OH O COOH OH

2.4.2 Gênero Neofusicoccum

(45)

derivados da meleina sugerem também, a ocorrência de biossíntese via rota policetídica para metabólitos deste gênero. (Tabela 3, Figura 5).

Tabela 3 - Relação de metabólitos secundários isolados de fungos do gênero Neofusicoccum, segundo a literatura

65 (-)-Terremutina N. parvum ABOU et al., 2015

66 (+)-Terremutina hidratada N. parvum ABOU et al., 2015 67 (+)-epi-Esfaeropsidona N. parvum ABOU et al., 2015 68 (-)-4-Cloro-terremutina hudratada N. parvum ABOU et al., 2015 69 (+)-4-Hidroxisuccinato-Terremutina

hidratada

N. parvum ABOU et al., 2015

70 (6S,7R)-Asperlina N. parvum ABOU et al., 2015

71 (6R,7S)-dia-Asperlina N. parvum ABOU et al., 2015

31 (R)-(-)-Meleina N. parvum ABOU et al., 2015

72 (3R,4R)-4-Hidroximeleina N. parvum ABOU et al., 2015 EVIDENTE et al., 2010 73 (3R,4S)-4-Hidroximeleina N. parvum ABOU et al., 2015

EVIDENTE et al., 2010 74 (R)(-)-3-Hidroximeleina N. parvum ABOU et al., 2015 75 Ácido 6-metil-salicílico N. parvum ABOU et al., 2015 76 Ácido 2-hidroxipropil salicílico N. parvum ABOU et al., 2015

77 Isosclerona N. parvum EVIDENTE et al., 2010

78 Tirosol N. parvum EVIDENTE et al., 2010

79 Ciclobotrióxido N. australe ANDOLFI et al., 2012

80 Ciclobotrióxido acetil N. australe ANDOLFI et al., 2012

81 3-Metilcatecol N. australe ANDOLFI et al., 2012

78 Tirosol N. australe ANDOLFI et al., 2012

82 Botriosfaerona D N. australe ANDOLFI et al., 2012

83 (3S,4S)-3,4,8-Triidroxi-6-metoxi-3,4-diidro-1(2H)-naftalenona

N. australe ANDOLFI et al., 2012

(46)

Figura 5 - Relação das estruturas dos metabólitos secundários isolados de fungos do gênero Neofusicoccum, segundo a literatura

65 O OH OH O 66 O OH OH O H O H 67 O OMe OH O 68 O OH Cl O H O H 69 O OH O O H O H O O OH O AcO O 70 O AcO O 71 O OH O OH 72 O OH O OH 73 O OH O OH OH O OH 75 OH O OH OH 76 O OH

OH77 _OH

OH 78 OH OMe O O 79 OAc OMe O O 80 O H OH 81 MeO OH O OH OH 83 MeO OH O OH OH 83 74

2.4.3 Gênero Botryosphaeria

Dentro do perfil químico de fungos do gênero Botryosphaeria, foram relatados 114 compostos pertencentes à diversas classes químicas (Tabela 4 e Figura 6). A diversidade estrutural dos metabólitos variou desde compostos mais simples, passando por compostos aromáticos, alcalóides, diterpenos e esteroides.

Tabela 4 - Relação de metabólitos secundários isolados de fungos do gênero Botryosphaeria e suas respectivas espécies, segundo a literatura

84 Botriorodina A B. rhodina ABDOU et al., 2010

85 Botriorodina B B. rhodina ABDOU et al., 2010

86 Botriorodina C B. rhodina ABDOU et al., 2010

87 Botriorodina D B. rhodina ABDOU et al., 2010

88 Ácido indol-ȕ-carboxílico B. rhodina ABDOU et al., 2010

89 Botriosfaerilactona A B. rhodina RUKACHAISIRIKUL et

al., 2009

90 Botriosferilactona B B. rhodina RUKACHAISIRIKUL et

al., 2009

(47)

91 Botriosfaerilactona C B. rhodina RUKACHAISIRIKUL et al., 2009

92 Botriosfaeridiona B. rhodina RUKACHAISIRIKUL et

al., 2009

93 Botriosfaerihidrofurana B. rhodina RUKACHAISIRIKUL et

al., 2009

94 Botriosfaerinona B. rhodina RUKACHAISIRIKUL et

al., 2009 95

Diidro-4-(hidroximetil)-3,5-dimetil-2(3H)-furanona

B. rhodina RUKACHAISIRIKUL et al., 2009

96 Botriosfaeriodiplodina B. rhodina RUKACHAISIRIKUL et

al., 2009

8 (5S)-Hidroxilasiodiplodina B. rhodina RUKACHAISIRIKUL et al., 2009

98 (R)-(-)-5-Hidroximeleina B. rhodina RUKACHAISIRIKUL et

al., 2009

31 (R)-(-)-Meleina B. rhodina RUKACHAISIRIKUL et

al., 2009 72 cis-(3R,4R)-(-)-4-

Hidroximeleina

74 trans-(3R,4S)-(-)-4-Hidroximeleina

99 (R)-(-)-2-Octeno-d- lactona B. rhodina RUKACHAISIRIKUL et al., 2009

100 tetraidro-4-hidroxi-6-propilpiran-2-ona

101 Ácido 6-metilsalicílico B. rhodina RUKACHAISIRIKUL et

al., 2009

1 Lasiodiplodina B. rhodina VEIGA et al., 2007

SILVA, 2007 102 p-Hidroxifeniletanol B. rhodina VEIGA et al., 2007

103 Inosina B. rhodina VEIGA et al., 2007

21 Ergosterol B. rhodina VEIGA et al., 2007

SILVA, 2007

104 Desmetil-lasiodiplodina B. rhodina SILVA, 2007

72 Trans-hidromeleina B. rhodina SILVA, 2007

74 Cis-hidroximeleina B. rhodina SILVA, 2007

105 5 -Propil-4-carboxi-3-metil-Ȗ-butirolactona

B. rhodina SILVA, 2007

106 5-Propil-4-metil-3-carboxi--but-3-enlactona

B. rhodina SILVA, 2007

107 Ácido 11-hidroxijasmônico B. rhodina SILVA, 2007

108 5-Hidroximetilfurfural B. rhodina SILVA, 2007

78 Tirosol B. rhodina SILVA, 2007

110 Peróxido de ergosterol B. rhodina SILVA, 2007

111 Estigmastenona B. rhodina SILVA, 2007