UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO
LIGIANE SOUZA DOS SANTOS
A AÇÃO DA LASERTERAPIA DE BAIXA POTÊNCIA E DO DICLOFENACO SOBRE OS ASPECTOS
MORFOMÉTRICOS, HISTOLÓGICOS E FUNCIONAIS EM LONGO PRAZO APÓS LESÃO MUSCULAR POR
TRAUMA EM RATOS DIABÉTICOS
BAURU
2018
LIGIANE SOUZA DOS SANTOS
A AÇÃO DA LASERTERAPIA DE BAIXA POTÊNCIA E DO DICLOFENACO SOBRE OS ASPECTOS
MORFOMÉTRICOS, HISTOLÓGICOS E FUNCIONAIS EM LONGO PRAZO APÓS LESÃO MUSCULAR POR
TRAUMA EM RATOS DIABÉTICOS
Dissertação apresentada à Pró-reitoria de Pesquisa e Pós-graduação da Universidade do Sagrado Coração, como parte dos requisitos para obtenção do título de mestre em Fisioterapia, área de concentração: Saúde Funcional, sob orientação do Prof. Dr. Rodrigo Leal De Paiva Carvalho.
BAURU
2018
Santos, Ligiane Souza dos S2375a
A ação da laserterapia de baixa potência e do diclofenaco sobre os aspectos morfométricos, histológicos e funcionais em longo prazo após lesão muscular por trauma em ratos diabéticos / Ligiane Souza dos Santos. – 2018.
56f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Leal de Paiva Carvalho.
Dissertação (Mestrado em Fisioterapia em Saúde Funcional) - Universidade do Sagrado Coração - Bauru - SP
1. Ferimentos e lesões. 2. Sistema Musculoesquelético. 3.
Terapia Combinada. 4. Terapia a Laser de Baixa Intensidade. 5.
Diabetes Mellitus. I. Carvalho, Rodrigo Leal de Paiva. II. Título.
LIGIANE SOUZA DOS SANTOS
A AÇÃO DA LASERTERAPIA DE BAIXA POTÊNCIA E DO DICLOFENACO SOBRE OS ASPECTOS MORFOMÉTRICOS, HISTOLÓGICOS E FUNCIONAIS EM LONGO PRAZO APÓS LESÃO
MUSCULAR POR TRAUMA EM RATOS DIABÉTICOS
Dissertação apresentada à Pró-reitoria de Pesquisa e Pós-graduação da Universidade do Sagrado Coração, como parte dos requisitos para obtenção do título de mestre em Fisioterapia, área de concentração: Saúde Funcional, sob orientação do Prof. Dr. Rodrigo Leal De Paiva Carvalho.
Banca examinadora:
_________________________________
Prof. Dr. Geraldo Marco Rosa Junior Universidade do Sagrado Coração
_________________________________
Prof. Dr. Rodrigo Labat Marcos Universidade Nove de Julho
_________________________________
Prof. Dr. Rodrigo Leal de Paiva Carvalho Universidade do Sagrado Coração
Bauru, 28 de fevereiro de 2018.
Dedico à minha mãe Ivone, minha irmã Vânia, ao Gabriel, a minha família e amigos pelo apoio e motivação. Por estarem sempre presentes quando precisei, me incentivando a cada passo.
AGRADECIMENTOS
A Deus e à Maria por sempre me guiarem e fortalecer em todos os momentos.
À minha mãe por sempre me incentivar, apoiar e nunca deixar desistir nos momentos difíceis.
Ao meu orientador Prof. Dr. Rodrigo Leal de Paiva Carvalho, pela paciência, incentivo e confiança.
RESUMO
Pacientes com Diabetes Mellitus (DM) realizam como forma de prevenção, tratamento e até mesmo redução de outros fatores de risco, exercícios físicos aeróbios e de resistência. Porém lesões musculares traumáticas são comuns durante a prática de atividade física, podendo provocar perda funcional, alterações histológicas e morfológicas em graus variáveis. Diferentes tipos de terapias, farmacológicas e não farmacológicas, são prescritas no tratamento e recuperação de lesões do musculoesquelético, como drogas anti-inflamatórias e a laserterapia de baixa potência. Fisiologicamente, após uma lesão, o processo de reparo do musculoesquelético em ratos dura aproximadamente 28 dias até sua finalização, no entanto pouco se sabe a respeito da recuperação morfológica, histológica e funcional ao final desse processo de reparo do tecido muscular, no quadro de diabetes. O objetivo desse estudo foi avaliar a recuperação do tecido muscular, durante e ao final do processo de reparo (14 e 28 dias), através de análise morfométrica, histológica e funcional após lesão muscular por trauma em ratos diabéticos, utilizando como tratamento a laserterapia de baixa potência e o diclofenaco, de forma isolada ou combinada. Para a indução da lesão os animais receberam um único trauma no membro posterior direito. Os tratamentos ocorreram uma hora após o protocolo de lesão. A irradiação com laser foi realizada em apenas um ponto na região do trauma, na dose de energia de 3 J, por 30s. O diclofenaco foi aplicado, na dose de 11.6 mg/g -1 (miligrama grama) topicamente. Foram realizadas análises morfométricas, histológicas e funcionais do tecido muscular 14 e 28 dias após a indução da lesão. Os resultados obtidos mostram que nos aspectos morfométricos com 14 dias, o grupo Laser demonstrou maior área de fibra muscular, quando comparado ao grupo Laser+Diclo e semelhante ao grupo hígido (94.42±2.1).
Com 28 dias os resultados foram semelhantes ao grupo de 14 dias. Na análise funcional com 14 dias pode se observar que os grupos Laser (-6.8±0.3) e Laser+Diclo (-8.67±0.3) mostraram melhorar padrão de marcha quando comparados aos demais grupos, e o grupo Laser obteve melhor padrão da marcha, quando comparado ao grupo Laser+Diclo, demonstrou padrão da marcha semelhante ao grupo hígido (-6.67±0.2). Com 28 dias os grupos obtiveram padrão semelhante de marcha aos grupos de 14 dias. Nos aspectos histológicos, o grupo que recebeu apenas o Laser mostrou uma melhora qualitativa, com melhor organização das
células do tecido muscular e menor quantidade de hemácias, quando comparado aos demais grupos, mesmo não evitando o surgimento dos sinais típicos de lesão.
Concluindo-se então que o Laser foi o tratamento mais eficaz no reparo do tecido muscular no tempo de 14 e 28 dias e obteve resultados positivos na regeneração funcional, morfométrica e histológica do tecido muscular.
Palavras-chave: Ferimentos e lesões. Sistema Musculoesquelético. Terapia Combinada. Terapia a Laser de Baixa Intensidade. Diabetes Mellitus. Diclofenaco.
Fotobiomodulação.
ABSTRACT
Patients with Diabetes Mellitus (DM) perform as a form of prevention, treatment and even reduction of other risk factors, aerobic physical exercises and resistance. However, traumatic muscular injuries are common during the practice of physical activity, which can cause functional loss, histological and morphological changes in varying degrees. Different types of pharmacological and non- pharmacological therapies are prescribed in the treatment and recovery of musculoskeletal injuries, such as anti-inflammatory drugs and low-power laser therapy. Physiologically, after a lesion, the process of musculoskeletal repair in rats lasts approximately 28 days until its completion, however little is known about the morphological, histological and functional recovery at the end of this process of muscle tissue repair, in the case of diabetes. The objective of this study was to evaluate the recovery of muscle tissue during and at the end of the repair process (14 and 28 days), through morphometric, histological and functional analysis after traumatic muscle injury in diabetic rats, using laser therapy low potency and diclofenac, alone or in combination. To induce the lesion, the animals received a single trauma to the right hind limb. Treatments occurred one hour after the lesion protocol. Laser irradiation was performed at only one point in the trauma region, at the energy dose of 3 J, for 30 s. Diclofenac was applied at the dose of 11.6 mg / g -1 (milligram gram) topically. Morphometric, histological and functional analyzes of the muscle tissue were performed 14 and 28 days after the induction of the lesion. The results obtained show that in the morphometric aspects at 14 days, the Laser group showed a greater muscle fiber area when compared to the Laser + Diclo group and similar to the healthy group (94.42 ± 2.1). At 28 days the results were similar to the group of 14 days. In the 14-day functional analysis, it can be observed that the Laser (-6.8 ± 0.3) and Laser + Diclo (-8.67 ± 0.3) groups showed improved gait pattern when compared to the other groups, and the Laser group obtained a better walking pattern, when compared to the Laser + Diclo group, demonstrated gait pattern similar to the healthy group (-6.67 ± 0.2). At 28 days, the groups obtained a similar pattern of gait in the 14-day groups. In the histological aspects, the group that received only the Laser showed a qualitative improvement, with better organization of the cells of the muscular tissue, less amount of red blood cells and extracellular matrix with less wave profile, when compared to the other groups, not even avoiding the appearance
of the signs typical of injury.It was concluded that the Laser was the most effective treatment in the repair of the muscular tissue in the time of 14 and 28 days and obtained positive results in the functional, morphometric and histological regeneration of the muscular tissue.
Keywords: Injuries and injuries. Musculoskeletal System.CombinedTherapy.Low Level Laser Therapy.Diabetes Mellitus. Diclofenac. Photobiomodulation.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Divisão dos grupos experimentais. ... 22
Figura 2 – Miniguilhotina utilizada para realizar o trauma. ... 23
Figura 3 – Equipamento Laser utilizado para a irradiação dos animais ... 24
Figura 4 – Avaliação funcional ... 26
Figura 5 – Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Hígido. ... 32
Figura 6 - Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Diabetes. 33 Figura 7 – Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; ... 34
Figura 8 – Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; ... 35
Figura 9 - Foto Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Diclofenaco 14 dias. ... 36
Figura 10 – Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Diclofenaco 28 dias. ... 37
Figura 11 – Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Laser 14 dias. ... 38
Figura 12 – Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Laser 28 dias. ... 39
Figura 13 – Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Laser+Diclo 14 dias. ... 40
Figura 14 – Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Laser+Diclo 28 dias. ... 41
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 – Média ± Desvio Padrão das Áreas das Fibras do Músculo Tibial Anterior 14 dias após a indução da lesão. ... 28 Gráfico 2 – Média ± Desvio Padrão das Áreas das Fibras do Músculo Tibial Anterior 28 dias após a indução da lesão. ... 29
Gráfico 3 – Índice funcional do Músculo Tibial Anterior dos animais 14 dias após a indução da lesão. ... 30
Gráfico 4 – Índice funcional do Músculo Tibial Anterior dos animais 28 dias após a indução da lesão. ... 31
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Parâmetros do equipamento de Laser de Baixa Potência (LBP)... 23
LISTA DE ABRAVIATURAS / SIGLAS
AINE – Anti-Inflamatório Não Esteroide ATP - Adenosina trifosfato
CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais DM – Diabetes Mellitus
HE – Hematoxilina-Eosina
EROS - Espécies Reativas de Oxigênio ITS - IntermediaryToSpready
LBP – Laser de Baixa Potencia Pl - Print Length
STZ -Streptozotocina TS- Toe Spready
USC – Universidade do Sagrado Coração
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 15
1.1 JUSTIFICATIVA ... 19
2 OBJETIVO ... 20
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ... 20
3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 21
3.1 ANIMAIS ... 21
3.3 PROCEDIMENTOS ... 22
3.4 MODELO DE LESÃO MUSCULAR POR CONTUSÃO ... 22
3.5 LASERTERAPIA DE BAIXA POTÊNCIA ... 23
3.6 TERAPIA FARMACOLÓGICA (AINE): DICLOFENACO ... 24
3.7 ANÁLISE MORFOMÉTRICA ... 24
3.8 ANÁLISE HISTOLÓGICA ... 25
3.9 ANÁLISE FUNCIONAL ... 25
3.10 ANÁLISE ESTATÍSITCA ... 27
4 RESULTADOS ... 28
4.1 ANÁLISE MORFOMÉTRICA ... 28
4.2 ANÁLISE FUNCIONAL ... 29
4.3 ANÁLISE HISTOLÓGICA ... 32
5 DISCUSSÃO ... 41
REFERENCIAS ... 49
ANEXOS ... 54
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1 INTRODUÇÃO
O Diabetes Mellitus (DM) é um grupo de distúrbios metabólicos que apresentam em comum hiperglicemia resultante de resposta secretória inadequada de insulina, defeitos na ação da insulina, ou ambos (1). A crescente prevalência da doença representa uma preocupação significativa para a saúde pública, devido às complicações em longo prazo (2). Dentre essas graves complicações é comum o aparecimento de feridas crônicas que ocorrem geralmente nos membros inferiores levando a diminuição da qualidade de vida(3).
As estimativas confirmam que o DM vem crescendo em todo o mundo, sendo mais comum em países em desenvolvimento. Nos últimos 24 anos o número de pessoas com diabetes quadruplicou: em 2014 havia 422 milhões de adultos no mundo (8,5% da população) com diabetes; em 1980, eram 108 milhões (4,7%). Já nas Américas, uma em cada doze pessoas vive com diabetes, sendo a quarta causa de morte na região, vindo atrás do infarto, demências e acidente vascular cerebral.
Caso nenhuma intervenção/prevenção seja realizada, pode-se chegar a 110 milhões de pessoas com diabetes até 2040, apenas no continente Americano (4).
Devido à sua característica crônica, às suas complicações e à dificuldade de controlá-las, a DM traz gastos tanto para as famílias como para o sistema de saúde:
no Brasil os gastos variam entre 2,5 e 15% do orçamento anual da saúde do país.
Com isso, os custos do DM afetam o indivíduo, a família e a sociedade, tanto nos aspectos econômicos quanto nos intangíveis como, por exemplo, dor, ansiedade e perda de qualidade de vida, gerando um impacto difícil de quantificar (1).
O DM é considerado uma das principais causas de prejuízo na cicatrização de lesões, gerando casos de amputação como resultado de feridas que não cicatrizam (5). Sabe-se que na medicina esportiva o DM está relacionado com infecções, atraso no processo de reparo tecidual e falha cirúrgica. Ainda, durante o processo cicatricial pode atrasar o fechamento e contração da lesão tecidual, atuar negativamente nos granulócitos, sobre a quimiotaxia de leucócitos e macrófagos, afetar o metabolismo do colágeno, as células vermelhas do sangue e as características biomecânicas(6,7). Pode, também, causar no paciente outras graves consequências como a neuropatia diabética além de problemas em arteríolas periféricas(8).
Atualmente são prescritas diferentes condutas, tanto farmacológicas quanto não farmacológicas, para a prevenção e também no tratamento do paciente
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diabético. Uma delas bastante usada é a atividade física, que é de grande importância, onde estudos mostram que o seu aumento diminui as chances de se desenvolver o diabetes mellitus. Assim, são recomendados exercícios físicos aeróbios e de resistência para pacientes com DM devido à melhora no controle da glicose e redução de outros fatores de risco (9).
A atividade física como terapia na diabetes pode reduzir o estresse oxidativo e os danos nas células β, podendo ainda aumentar o conteúdo de insulina e também a secreção basal de insulina. Os mesmos autores relatam em seu estudo que o exercício físico aumenta a viabilidade das células β pancreáticas, através da sinalização da interleucina-6 (IL-6) (10). Por outro lado, lesões musculares são muito comuns durante prática de atividade física, podendo causar na maioria das vezes, dor e incapacidade funcional, levando a um comprometimento tanto nas atividades ocupacionais quanto nas atividades do dia a dia e de lazer. Contudo, pouco se sabe a respeito do processo histológico, morfométrico e da recuperação funcional após uma lesão musculoesquelética no quadro de diabetes (11).
De acordo com estudos realizados nos Estados Unidos, as lesões por contusão e por estiramento muscular correspondem a aproximadamente 90% de todas as lesões relacionadas ao esporte (12), podendo provocar perda funcional em graus variáveis, dependendo de algumas características, como: tipo tamanho e localização da lesão (13). Contudo, nas contusões mais profundas ou graves/severas, que atingem os tecidos musculares, pode haver perda igual ou superior a 50% da função muscular, diminuição de força e dor(14,15).
As lesões musculares muitas vezes levam a um longo tempo de imobilização, retirando do paciente a possibilidade de realizar atividades físicas e interrompendo assim, o tratamento ou a prevenção da DM. Devido aos grandes períodos de inatividade ocasionados por lesões musculares, as drogas anti-inflamatórias acabam sendo largamente utilizadas, podendo provocar efeitos adversos secundários como aumento nos números de fibras colágenas bem como diminuição da quantidade de fibras musculares, contribuindo para alterações nas propriedades biomecânicas do músculo (16).
A regeneração muscular é um processo originado por diversos fatores que irão contribuir para o desenvolvimento da resposta do tecido muscular à lesão.
Destacam-se a expressão de genes musculares específicos, fatores glicoproteicos produzidos pela matriz extracelular, as células tronco, fatores tróficos e as células
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satélites (17,18). Na fase inflamatória da lesão inicialmente chegam os neutrófilos e macrófagos, sendo que os macrófagos irão se diferenciar em tipo 1 (pró- inflamatório) e tipo 2 (anti-inflamatório). Tal diferenciação marca o inicio da fase de proliferação onde aparecem neutrófilos e posteriormente monócitos e linfócitos que produzem enzimas proteolíticas para a limpeza e reparo do tecido lesionado.
Fatores quimiotáticos estimulam a infiltração de neutrófilos que fagocitam a fibra muscular lesionada(19,20,21). Os macrófagos tipo 2 secretam algumas substancias como IGF-1 que favorecem a proliferação e diferenciação das células satélite, que formarão novas fibras musculares (21). Já nas últimas fases da regeneração, os núcleos estão mais centralizados e à prevalência de fibras musculares entorno do 14° ao 28°dia (22).
A cicatrização ou reparo tecidual de lesões musculares segue um padrão razoavelmente similar em indivíduos normais, independente dos diferentes mecanismos indutores da lesão (contusão, estiramento ou ruptura) (23). Contudo, em um quadro diabético, a lesão muscular pode apresentar características diferentes: em trabalho caracterizando a lesão muscular em ratos diabéticos foi observado que o DM é um estado pró-inflamatório com persistente expressão de TNF-α e elevada expressão de miostatina. Da mesma forma, em teste de caminhada, foi observado que a recuperação desses animais mostrou-se retardada (24).
A Laserterapia de Baixa Potência (LBP) e terapias farmacológicas – como Anti-Inflamatórios Não Esteroides (AINEs) (diclofenaco, miloxicam, ibuprofeno) – são rotineiramente utilizadas no tratamento e recuperação de lesões do sistema musculoesquelético. Entre os medicamentos comumente prescritos em todo o mundo os AINEs têm sido amplamente indicados para pacientes com doença reumática e outras doenças musculoesqueléticas (25).
Os AINEs tópicos são administrados para o tratamento de diversas condições e sua administração tópica oferece como benefício menor incidência de efeitos adversos sistêmicos (25). A maioria dos efeitos anti-inflamatórios do diclofenaco sódico é devida à inibição da síntese de prostaglandinas, sendo considerado um potente inibidor da ciclooxigenase in vivo e in vitro, além de diminuir a síntese de tromboxano e prostaciclina (26).
O laser, com sua capacidade de alterar o metabolismo celular por ser absorvido pelas mitocôndrias e citocromo C oxidase, demonstra ser positivo no
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reparo muscular por promover a modulação do processo inflamatório (27). A Laserterapia de Baixa Potência,como uma terapia não farmacológica, tem como alguns dos seus principais efeitos fisiológicos relacionados ao metabolismo em tecidos moles, o aumento da microcirculação, o aumento da síntese de ATP e a estimulação da cadeia respiratória mitocondrial e da função mitocondrial(28,29,30).
Diminuições na liberação de Espécies Reativas De Oxigênio (EROS) na atividade da creatinofosfoquinase e o aumento da produção de antioxidantes e proteínas de choque térmico também foram relatados como mecanismo de ação em estudos prévios(31,32).
Nos últimos anos, inúmeros estudos clínicos randomizados, placebo controle tem sido realizados e publicados com ótimos resultados, fazendo com que a LBP já seja considerada como alternativa terapêutica para várias disfunções osteomusculares. Entre elas destacam-se estudos que avaliaram diversos parâmetros no reparo da lesão muscular, demonstrando resultados positivos sobre menor tempo de resolução do processo inflamatório em lesões do tecido muscular, reparo tecidual do musculoesquelético em um menor tempo e aumento da absorção do diclofenaco em musculoesquelético, após lesão, utilizando a dose de 3J em uma única sessão de tratamento (33,34), caracterização do processo inflamatório, modulação da atividade mitocondrial de macrófagos (35), formação de novas fibras musculares (36).
A LBP também vem demonstrando resultados positivos quando utilizada em disfunções no sistema osteomuscular como melhora em tendinopatias e dor (37), angiogênese e aumento da síntese de colágeno para promover a cicatrização de feridas (38). Entretanto, pouco se conhece a respeito da recuperação muscular por trauma em animais diabéticos, utilizando terapias não farmacológicas e farmacológicas como a LBP, atuando de forma isolada ou combinada. Tendo em vista os dados apresentados anteriormente, se mostra extremamente necessário o entendimento do processo de recuperação muscular até sua fase final, visando melhorar um possível retardo relatado, em ambiente com quadro hiperglicêmico.
Ainda, a importância da utilização de terapias não medicamentosas pode representar um fator altamente relevante para o sistema de saúde brasileiro, especialmente em países subdesenvolvidos, visando diminuir custos financeiros com a aplicação de tratamentos somente com AINEs. No entanto, o estabelecimento de parâmetros clínicos para a utilização desta técnica se faz ainda extremamente
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necessário. É sabido que os estágios finais do processo de reparo do tecido muscular após indução de lesão em ratos ocorrem aproximadamente após 28 dias (22). Entretanto, em animais diabéticos tal processo parece não ocorrer dessa maneira: estudos vêm demontrando que o reparo tecidual no quadro de hiperglicemia pode apresentar atraso ou dificuldades de regeneração(6,7).
1.1 JUSTIFICATIVA
De acordo com os dados apresentados anteriormente, se mostra extremamente necessário o conhecimento do processo de recuperação muscular até a sua fase final, visando diminuir o retardo da cicatrização tecidual relatado em ambiente com quadro hiperglicêmico, proporcionando a volta à atividade física (prevenção/tratamento) mais rápida para os pacientes diabéticos.
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2 OBJETIVO
Avaliar o tecido muscular, durante e ao final do processo fisiológico de reparo (14 e 28 dias), através de análise Morfométrica, Histológica e Funcional após lesão muscular por trauma em ratos diabéticos, utilizando como tratamento a laserterapia de baixa potência e o diclofenaco, de forma isolada ou combinada.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Analisar ação da LBP sobre morfologia muscular na fase final da lesão muscular na vigência do estado de hiperglicemia.
Analisar a função do membro pélvico lesado, após tratamento com LBP até a fase final do processo de reparo muscular.
Avaliar a possível existência do efeito sinérgico entre os tratamentos com LBP e AINE
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3 MATERIAS E MÉTODOS
Foi realizado um ensaio experimental randomizado. O projeto foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade do Sagrado Coração (USC). nº 3380120216, nº 9629230216 e n° 3380120216.
3.1 ANIMAIS
Foram utilizados ratos da linhagem Wistar, machos, pesando em torno de 300g provenientes do biotério da USC. Os animais foram mantidos em condições padrão de temperatura (22-24ºC), umidade relativa (40-60%), ciclo de 12 horas claro-escuro com água e ração ad libitum. Os ratos foram randomizados e divididos em grupos de sete animais. Os sacrifícios ocorreram 14 e 28 dias após a indução da lesão, totalizando 77 animais. O grupo hígido foi utilizado apenas uma vez.
3.2 ESQUEMA DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS
Foram seis grupos, totalizando 77 animais, analisados em dois tempos distintos (14 e 28 dias). Grupo Hígido, Grupo diabético sem lesão, Grupo Lesão diabéticos não tratados, Grupo Lesão tratado com LBP, Grupo Lesão tratado com diclofenaco, Grupo Lesão tratado com LBP e com diclofenaco. As amostras do tecido muscular foram retiradas nos tempos: 14 e 28 dias para as análises histológicas, morfométrica após a avaliação funcional (Figura 1).
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Figura 1 - Divisão dos grupos experimentais.
Fonte: Elaborada pela autora
3.3 PROCEDIMENTOS
A indução de DM foi realizada por meio da administração intraperitoneal de estreptozotocina (STZ), em dose única, na concentração de 50 mg/kg de peso corporal, diluída em tampão citrato 0,1M pH 4,5(39,40,41). Nos grupos controle foi injetado somente tampão citrato. As amostras de sangue foram retiradas, após 5 e 15 dias, por punção da cauda e a glicemia foi determinada através de glicosímetro.
Os animais que apresentaram concentração de glicose acima de 220 mg/dL foram considerados diabéticos(42).
3.4 MODELO DE LESÃO MUSCULAR POR CONTUSÃO
Os ratos foram anestesiados com cetamina/xilazina (100 e 20 mg kg -1, respectivamente). O membro pelvico direito de cada animal foi posicionado com o joelho extendido e tornozelo em dorsiflexão 90º. Em seguida, um único trauma foi aplicado, utilizando uma mini-guilhotina, que compreende um bloco de peso de 200g, com uma ponta de 2 milímetros de largura, que foi deixado cair de uma altura de 20 cm, guiado por suportes(43) (Figura 2).
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Figura 2 – Miniguilhotina utilizada para realizar o trauma.
Fonte: Elaborada pela autora
3.5 LASERTERAPIA DE BAIXA POTÊNCIA
Foi utilizado um laser de baixa potência operando no comprimento de onda de 808 nm em modo contínuo, na dose de energia de 3 Joules, potência de 100mW, diâmetro de feixe com 0,04cm2 e tempo de irradiação de 30s (33) (Tabela 1).
Tabela 1 – Parâmetros do equipamento de Laser de Baixa Potência (LBP).
Fonte: Elaborada pela autora
A irradiação com laser foi realizada no modo de contato, em apenas um ponto na região média do músculo tibial anterior dos ratos, uma hora após a indução da lesão muscular. No grupo tratado com Laser + Diclofenaco, a irradiação foi realizada cinco minutos antes da aplicação da droga. Este protocolo foi realizado como tratamento para os grupos 14 e 28 dias. Após esses tempos os animais foram sacrificados para a retirada do músculo lesado e posterior análise (Figura 3).
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Figura 3–Equipamento Laser utilizado para a irradiação dos animais
Fonte: Elaborada pela autora
3.6 TERAPIA FARMACOLÓGICA (AINE): DICLOFENACO
Grupos tratados receberam Diclofenaco, uma hora após o protocolo da lesão, na dose de 11.6 mg/g -1 (miligrama grama) topicamente, no local da lesão(33). Esse protocolo foi realizado como tratamento para os grupos 14 e 28 dias. Após esses tempos os animais foram sacrificados, para a retirada do músculo lesado e posterior análise.
3.7 ANÁLISE MORFOMÉTRICA
A captura das imagens foi realizada com auxílio de um micro computador com software de captura e análise de imagem, acoplado a um microscópio óptico (LeicaDMLS). Todas as imagens foram analisadas com auxílio do programa analisador de imagem Sigma Scan Pro 5.0. Para análise dos músculos foram mensuradas 220 fibras musculares por animal. As variáveis morfométricas estudadas foram: área e diâmetro mínimo da fibra muscular. Esta análise foi realizada para todos os grupos 14 e 28 dias após a indução da lesão.
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3.8 ANÁLISE HISTOLÓGICA
As amostras do tecido foram fixadas em formol 10% por um período de 72 horas. Posteriormente, as amostras foram desidratadas e submetidas a uma série gradativa de banhos de álcool, começando com 50% e progredindo até o álcool absoluto 100%(SYNTH). Em seguida, os músculos foram diafanizados com Xilol por quatro horas (SYNTH) para impregnação (embebição) e inclusão em Paraplast® das amostras. A seguir, estas foram colocadas em recipientes de alumínio adequados com Paraplast® fundido por quatro horas. Após a impregnação, as amostras foram colocadas em um pequeno recipiente coberto com parafina fundida e deixadas para endurecer, formando um bloco contendo o tecido. Para a microtomia foram realizados cortes com 5µm de espessura em micrótomo LEICA RM 2125 RT, lavados e colocados em banho-maria. Uma vez precedido o preparo das amostras os cortes foram colocados em lâminas onde foram corados com o corante Hematoxilina-Eosina (H.E.). Após a coloração os cortes foram montados em lâminas permanentes para posterior análise ao microscópio óptico e fotografados através de sistema de microfotografia (Olympus System MicroscopeModel CX 41 – Olympus PM10SP AutomaticPhotomicrographic System). Após este protocolo, foi realizada a análise morfológica descritiva do músculo tibial anterior para os grupos sacrificados 14 e 28 dias após a indução da lesão. A captura das imagens foi realizada com auxílio de um micro computador com software apropriado, acoplado a um microscópio óptico (Leica DMLS). Esta avaliação analisou os sinais típicos de lesão muscular normalmente observada como descontinuidade de acidofilia, rompimento de fibras, deslocamento nuclear para o centro da célula e desorganização celular.
3.9 ANÁLISE FUNCIONAL
A avaliação funcional foi realizada utilizando a walkingtrackanalysis, descrita por De Medinacelli, 1982. O animal foi colocado em um corredor de acrílico transparente com acesso a um ambiente escuro e sob ele uma régua para calibração de medida em centímetros (cm). As pegadas no assoalho foram registradas por uma filmadora, acoplada a um tripé, mantendo sempre a mesma distância do equipamento ao corredor de acrílico. As imagens foram captadas utilizadas para a análise funcional, por meio de um software de computador. Este
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procedimento foi repetido duas vezes com cada animal sendo que todos eles tiveram uma adaptação e exploração do local, bem como o registro da normalidade antes do procedimento de lesão.
As análises foram realizadas após o protocolo de contusão, antes do sacrifício nos tempos de 14 e 28 dias após a lesão. As seguintes medidas foram coletadas e analisadas através do software: 1) o espaço entre a segunda e a quarta falange distal (IntermediaryToeSpready - ITS); 2) o espaço entre a primeira e a quinta falange distal (Toe Spready– TS) e 3) o espaço entre a borda proximal do pé e a terceira falange distal (PrintLength– PL) (Figura 4).
Figura 4 – Avaliação funcional
Fonte: Elaborada pela autora
Legenda: (A)Medição dos parâmetros numa pegada de um rato normal.
(B)Face plantar do pé de um rato para ilustrar a correspondência anatômica dos parâmetros avaliados. PL = Comprimento da Pegada; TS; = Largura da Pegada; e ITS = Largura Intermédia da Pegada. (C) Teste Funcional.
A B
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3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos como médias ± EPM e submetidos ao teste Shapiro-Wilk para verificação de normalidade e após, ao teste de análise de variância (ANOVA), seguido da aplicação de pós-teste de Tukey para múltiplas comparações. Valores de p< 5% foram considerados estatisticamente significantes.
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4 RESULTADOS
4.1 ANÁLISE MORFOMÉTRICA
Na análise morfométrica das fibras do músculo tibial anterior com o tempo de 14 dias da variável área da fibra muscular observa-se que os grupos Laser (95.04±2.5) e Laser+Diclofenaco (Laser+Diclo) (74.94±1.9) apresentaram diferenças estatísticas na variável área da fibra muscular, demonstrando maior área da fibra muscular, quando comparados com o grupo Lesão não tratado (NT) (29.23±1,1) e ao grupo tratado apenas com diclofenaco (Diclo) (60.62±1.0). O grupo irradiado com Laser obteve resultados significativamente estatísticos, também com maior área da fibra muscular, quando comparado ao grupo Laser+Diclo. Os valores apresentados do grupo Laser demonstram áreas das fibras musculares semelhantes ao grupo Hígido (94.42±2.1) (Gráfico 1).
Gráfico 1 – Média ± Desvio Padrão das Áreas das Fibras do Músculo Tibial Anterior 14 dias após a indução da lesão.
Fonte: Elaborado pela autora
Lengenda: Comparativo entre as diferenças das médias das áreas das fibras musculares, obtidas na análise morfométrica nos grupos Hígido, Diabetes Mellitus (Diab), Laserterapia (Laser), Laser + Diclofenaco (Laser + Diclo.), Diclofenaco (Diclo.) e Lesão não tratado (NT). Os dados representam a média ± DP, n = 7, (ANOVA, seguido do teste Stundent-Newman- Keuls, ***p<0,001 vs NT; **p<0,01 vsNT,+p<0,05 vs. Laser+Diclo; ##p<0,01 vs. lesão).
A análise morfométrica das fibras do músculo tibial anterior com 28 dias, da variável área da fibra muscular apresenta resultado muito semelhante ao dos grupos 14 dias. Observou-se que os grupos Laser (105.89±3,4) e Laser+Diclo (93.44±3.8)
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apresentaram diferenças estatísticas na variável área da fibra muscular, demonstrando maior área da fibra muscular, quando comparados com o grupo Lesão não tratado (NT) (34.03±1,6) e ao grupo tratado apenas com diclofenaco (77.19±0.8). O grupo irradiado com Laser obteve resultados significativamente estatísticos, também com maior área da fibra muscular, quando comparado ao grupo Laser+Diclo. Os valores apresentados do grupo Laser demonstram áreas das fibras musculares semelhantes ao grupo hígido (93.82±2.2) (Gráfico 2).
Gráfico 2 – Média ± Desvio Padrão das Áreas das Fibras do Músculo Tibial Anterior 28 dias após a indução da lesão.
Fonte: Elaborado pela autora
Legenda:Comparativo entre as diferenças das médias das áreas das fibras musculares, obtidas na análise morfométricanos grupos Hígido, Diabetes Mellitus (Diab), Laserterapia (Laser), Laser + Diclofenaco (Laser + Diclo), Diclofenaco (Diclo) e Lesão não tratado (NT). Os dados representam a média ± DP, n = 7, (ANOVA, seguido do teste Stundent-Newman- Keuls, ***p<0,001 vs NT; **p<0,01 vsNT,+p<0,05 vs. Laser+Diclo; ##p<0,01 vs. lesão).
4.2 ANÁLISE FUNCIONAL
O Gráfico 3 representa a análise da marcha dos ratos (walking track analysis) após 14 dias da indução da lesão muscular. Observamos que os grupos Laser (- 6.8±0.3) e Laser+Diclo (-8.67±0.3) apresentaram diferenças estatísticas no teste funcional de marcha, demonstrando melhor padrão da marcha, quando comparados com o grupo Lesão não tratado (NT) (-12.97±0.4) e ao grupo tratado apenas com diclofenaco (-11.19±0.4). O grupo irradiado com Laser obteve resultados significativamente estatísticos, também com melhor padrão da marcha, quando
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comparado ao grupo Laser+Diclo. Os valores apresentados do grupo Laser demonstram padrão da marcha semelhantes ao grupo hígido (-6.67±0.2).
Gráfico 3 – Índice funcional do Músculo Tibial Anterior dos animais 14 dias após a indução da lesão.
Fonte: Elaborado pela autora
Legenda: Comparativo entre as diferenças das médias dawalking track analysis nos grupos Hígido, Diabetes Mellitus (Diab), Laserterapia (Laser), Laser + Diclofenaco (Laser + Diclo), Diclofenaco (Diclo) e Lesão não tratado (NT). Os dados representam a média ± DP, n = 7, (ANOVA, seguido do teste Stundent-Newman-Keuls, ***p<0,001 vs NT; **p<0,01 vs NT;
+p<0,05 vs. Laser+Diclo).
O Gráfico 4 representa os resultados obtidos semelhantes aos do Gráfico 3, na análise da marcha dos ratos (walking track analysis) após 28 dias da indução da lesão muscular. Observamos que os grupos Laser (-6.34±0.3) e Laser+Diclo (- 7.55±0.2) apresentaram diferenças estatísticas no teste funcional de marcha, demonstrando melhor padrão da marcha, quando comparados com o grupo Lesão não tratado (NT) (-11.64±0.2) e ao grupo tratado apenas com diclofenaco (- 10.48±0.1). O grupo irradiado com Laser obteve resultados significativamente estatísticos, também com melhor padrão da marcha, quando comparado ao grupo Laser+Diclo. Os valores apresentados do grupo Laser demonstram padrão da marcha semelhantes ao grupo hígido (-6.56±0.1).
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Gráfico 4 – Índice funcional do Músculo Tibial Anterior dos animais 28 dias após a indução da lesão.
Fonte: Elaborado pela autora
Legenda: Comparativo entre as diferenças das médias da walking track analysis nos grupos Hígido, Diabetes Mellitus (Diab), Laserterapia (Laser), Laser + Diclofenaco (Laser + Diclo), Diclofenaco (Diclo) e Lesão não tratado (NT). Os dados representam a média ± DP, n = 7, (ANOVA, seguido do teste Stundent-Newman-Keuls, ***p<0,001 vs NT; **p<0,01 vs NT;
+p<0,05 vs. Laser+Diclo).
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4.3 ANÁLISE HISTOLÓGICA
Pode-se observar a organização das fibras musculares normais e ilesas, com os núcleos (N) agrupados na periferia da célula.(40x) (Figura 5)
Figura 5 – Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Hígido.
Fonte: Elaborado pela autora
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Pode-se observar a organização das fibras musculares normais e ilesas, com os núcleos (N) agrupados na periferia da célula. (40x) (Figura 6).
Figura 6 –
Fonte: Elaborado pela autora
Figura 6- Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular;
Diabetes.
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Pode-se observar áreas de descontinuidade da acidofilia (DA), vasos sanguíneos (V) observam-se rompimento e extravasamento vascular e hemácias em locais de hemorragia, aglomeração dos núcleos das células musculares (N). (40x) (Figura 7).
Figura 7–Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular;
Lesão 14 dias.
Fonte: Elaborada pela autora
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São observadas, na figura 8, as áreas de descontinuidade da acidofilia (DA), vasos sanguíneos (V) e rompimento e extravasamento vascular e hemácias em locais de intensa hemorragia, aglomeração de núcleo das células musculares (N) (40x)(Figura 8).
Figura 8–Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular;
Lesão 28 dias.
Fonte: Elaborado pela autora
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Pode-se observar na figura 9 as áreas de descontinuidade da acidofilia (DA), vasos sanguíneos (V) observa-se rompimento e extravasamento vascular e hemácias em locais de intensa hemorragia, aglomeração de núcleo das células musculares (N) (40x ) (Figura 9).
Figura 9 - Foto Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular;
Diclofenaco 14 dias.
Fonte: Elaborado pela autora
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Observa-se o (N) indicado pelo acumulo de núcleos e áreas de descontinuidade da acidofilia (DA), e grandes áreas com, desorganização celular (DC). (40x) (Figura 10).
Figura 10–Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular;
Diclofenaco 28 dias.
Fonte: Elaborado pela autora
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Vasos sanguíneos (V) observa-se rompimento nos vasos, extravasamento vascular (N) indicado pelo acumulo de núcleos além de rompimento da fibra muscular e áreas de descontinuidade da acidofilia (DA) (10x). (Figura 11)
Figura 11 – Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular;
Laser 14 dias.
Fonte: Elaborado pela autora
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Pode-se observar a organização das fibras musculares normais e com aspecto ileso (OC), com os núcleos (N) agrupados na periferia da célula, com organização normal no tecido, ainda áreas de descontinuidade de acidofilia (DA).
(40x). (Figura 12)
Figura 12–Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Laser 28 dias.
Fonte: Elaborado pela autora
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Observa-se o (N) indicado pelo acumulo de núcleos e áreas de descontinuidade da acidofilia (DA) (10x) (Figura 13).
Figura 13 – Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular;
Laser+Diclo 14 dias.
Fonte: Elaborado pela autora
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Pode-se observar a organização das fibras musculares normais e com aspecto ileso (OC), com os núcleos (N) agrupados na periferia da célula, com organização normal no tecido, ainda áreas de descontinuidade de acidofilia (DA).(40x) (Figura 14).
Figura 14 – Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular;Laser+Diclo 28 dias.
Fonte: Elaborado pela autora
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5 DISCUSSÃO
O presente estudo buscou analisar os efeitos do tratamento de lesões musculares utilizando a Laserterapia de Baixa Potencia e o Diclofenaco de forma isolada ou em conjunto, utilizando ratos da linhagem Wistar macho, por serem os mais utilizado em pesquisas, por seu baixo custo e regeneração muscular semelhantes à dos seres humanos. Foi realizado o modelo de lesão muscular por um único trauma no musculo tibial anterior em ratos diabeticos, onde posteriormente foram feitas análises: Histológica, Morfológica e Funcional.
Para a indução do DM foi utilizado streptozotocina (50mg/kg) via intraperitonial, provocando aumento da glicemia (acima de 220mg/dL), verificada através do glicosímetro, 5 e 15 dias após a aplicação. Este achado é característica marcante da doença, que leva a hiperglicemia crônica, paralisação da captação de glicose pelos tecidos insulina dependentes, reduzindo e degradando a síntese de proteínas e levando, ainda à outra característica, que foi a perda de peso corporal (44).
Em pacientes diagnosticados com DM, é receitado como forma de tratamento e até mesmo como prevenção, a prática de exercício físico, tendo como objetivo redução da glicemia, além de diminuição dos fatores de risco como obesidade, sedentarismo e diminuição dos níveis de colesterol. Pacientes diabéticos fisicamente ativos apresentam melhor condição aeróbica e melhor prognóstico da doença, quando comparados a diabéticos inativos (1). Contudo, durante os exercícios podem ocorrer lesões por ruptura, contusões e lacerações levando a incapacidade, podendo interromper o tratamento através do exercício (11).
A DM pode causar atraso na cicatrização de lesões quando comparados a pacientes não diagnosticados com a doença. Pacientes com DM podem apresentar acúmulo de gordura visceral, sendo um dos responsáveis pela produção de substâncias inflamatórias, o que poderia levar ao atraso do reparo tecidual (45). Isso enfatiza a importância de tentar acelerar o processo de cicatrização, já que é sabido que, nesses pacientes, feridas não cicatrizadas podem aumentar o risco de amputações de membros.
Em estudo anterior (44) seguindo a mesma linha de pesquisa do presente estudo, porém com tempos de análises diferentes (6, 12 e 24 horas), os resultados encontrados mostram que o tratamento com laser combinado com o diclofenaco
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apresentou diferença significativa quando comparado aos demais grupos. Já neste trabalho o tratamento com laser de forma isolada demonstrou resultados melhores na análise morfométrica, observando maior área das fibras musculares, apresentando diferença estatisticamente significante quando comparado aos demais grupos tratados e o grupo não tratado.
As lesões musculares apresentam o mecanismo de recuperação que pode ser dividido em três estágios, onde os 2 últimos se sobrepõem: fase 1 destruição 1 a 3 dias (ruptura e necrose das miofibrilas, formação de hematoma e proliferação de células inflamatórias); fase 2 reparo e remodelação 3 a 4 semanas (fagocitose do tecido necrótico, regeneração das miofibrilas e formação de tecido cicatricial conectivo e neoformação vascular); fase 3 remodelação (maturação das miofibrilas, contração e reorganização do tecido cicatricial) (41). A sequência de eventos balanceada proporcionara uma ótima recuperação da função muscular.
Em alguns casos, após uma lesão, pode ocorrer a formação de tecido cicatricial fibroso incapacitante, onde há excessiva proliferação de fibroblastos, levando à formação de tecido cicatricial denso no local da lesão, ou este reparo pode ser lento e incompleto (41). A regeneração muscular é um processo complexo, onde a vascularização é um processo vital, este evento é fundamental para recuperação morfológica e funcional do músculo, onde vários fatores irão influenciar para o desempenho pós-lesão, o que deve ser considerado para que sejam traçados os objetivos e condutas para uma melhor evolução do quadro (46).
Umas das formas de tratamento bastante utilizadas são anti-inflamatórios não esteróides (AINES), que inibem a ação das ciclooxigenases (COX-1 e COX-2), que são enzimas que a partir de sucessivas reações do ácido araquidônico irão sintetizar prostaglandinas, responsáveis por controlar a inflamação, fluxo sanguíneo e formação de coágulos (47). A curto prazo, os AINES podem ter efeitos benéficos, porém a longo prazo, podem levar a respostas negativas de regeneração muscular(48).
Quando falamos de lesões musculares e o uso de AINES, temos que levar em consideração que esse medicamento aumenta o número de fibras de colágeno da mesma forma que provoca a diminuição da quantidade de fibras musculares e com isso pode gerar alterações nas propriedades biomecânicas, funcionais e morfológicas do musculoesquelético, levando-o à consequentemente a formação de tecido cicatricial com aspecto fibroso e pouco elástico. Em termos de vias de
44
aplicação, no diclofenaco tópico os efeitos adversos diminuem e sua eficácia é tão boa quanto a aplicação por via oral ou intramuscular (IM)(34,33).
O Laser de Baixa Potencia, diferente dos AINES, não apresenta efeitos adversos, proporcionando aumento da microcirculação local levando a vasodilatação, o que leva a um aumentodos nutrientes e enzimas que farão o reparo da lesão, além de diminuir os efeitos adversos causados pelos AINEs, modulando o processo inflamatório(49).
Dois estudos recentes (50,51) demonstraram que a dose de 3 J foi mais eficaz na modulação do processo inflamatório, análises bioquímicas e em análises funcionais, após contusão muscular, em animais não diabéticos, quando comparados aos grupos que receberam AINES tópicos. O resultado corrobora com o que foi encontrado no presente estudo onde, utilizando a mesma dose (3 J), o laser foi mais efetivo demonstrando diferença significativa na morfometria quando comparado aos demais grupos tratados e o grupo não tratado, ficando, inclusive, semelhante aos resultados do grupo hígido.
Estudos mostraram que, quando os tecidos musculares são expostos ao AINES, há inibição de COX-1 e COX-2, o que leva a redução da proliferação e fusão de células satélites, redução dos mionúcleos e redução da capacidade de regeneração, onde podemos questionar a real eficácia de seu uso para alívio de dor após lesão muscular (44).
A Laserterapia apresenta efeitos benéficos na resolução de lesões musculares, das propriedades que podemos citar a seu respeito estão a proliferação de microvasos, possível aumento de oxigenação no tecido, vasodilatação, proliferação epitelial, endotelial e fibroblástica, aumento da fagocitose, liberação de citocinas que reduzirão o processo inflamatório, aumento da síntese de colágeno, levando a resolução mais rápida do processo de reparação (52).
Alguns estudos mostram que o Laser pode potencializar a absorção de algumas substâncias como o Diclofenaco, (49) onde o grupo que recebeu a irradiação do laser e 5 minutos após foi aplicado o antiinflamatório, mostrou resultados mais positivos após a lesão por trauma, demostrando diferença significativa quando comparado aos demais grupos, concluindo que a combinação de duas terapias é mais eficaz do que quando utilizamos apenas uma delas. Como demonstrado anteriormente, combinação dos tratamentos com diclofenaco e Laser apresentam melhores resultados, em tempos mais curtos (até 48 horas), quando
45
comparados com o tratamento de forma isolada (49,43). Porém neste nosso estudo, na análise morfométrica, pode-se observar que os resultados após 14 dias, nos grupos Laser+Diclo e Laser mostraram diferenças estatisticamente significativas em relação a área da fibra muscular que apresentou maior área, quando comparado aos grupos Diclofenaco e Lesão não tratada (NT). O grupo que recebeu somente o tratamento com laser, tambem mostrou maior área da fibra muscular, quando comparado ao grupo Laser+Diclo. Os resultados do grupo irradiado com Laser mostraram que as áreas das fibras musculares estavam semelhantes às áreas do grupo hígido, o que se manteve nos resultados do final do processo de reparo tecidual (28 dias). Importante lembrar que o grupo tratado apenas com laser eram animais diabéticos, demonstrando a capacidade do tratamento em devolver a morfologia original das fibras musculares.
Diferente dos resultados encontrados em outro estudo (43) que também utilizou ratos diabéticos realizando lesão muscular, o grupo Laser+Diclofenaco apresentou diferença significativa quando comparado aos demais grupos, mostrando ser o melhor tratamento, porém em curto prazo (12 e 24 horas após a lesão).
Portanto, pode-se considerar que no tratamento de lesões na fase aguda (curto prazo), o laser combinado com o diclofenaco vem apresentando resultados mais eficazes, contudo em tratamentos a médio e longo prazo o Laser, sendo utilizado como tratamento isolado, demostra melhores resultados.
Após lesões musculares é comum os pacientes apresentarem incapacidades motoras nas fases da marcha, sendo assim essencial realizar análise funcional nos estudos onde são avaliadas as condições das lesões e do reparo do tecido muscular, pois um dos principais objetivos dos tratamentos e reestabelecer a função tecidual. No presente estudo, na avaliação funcional, foi encontrado que os grupos NT e Diclofenaco, nos tempos 14 e 28 dias, apresentaram os piores resultados, quando comparados aos demais grupos. Os grupos diabetes e hígido não mostraram diferença significativa quando comparados entre si. Os grupos que demosntraram melhor padrão da marcha foram o Laser e Laser+Diclo, apresentando diferença estatisticamente significativa quando comparados ao grupo tratado apenas com Diclofenaco e grupo NT. O grupo que recebeu a irradiação com Laser apresentou diferença estatisticamente significativa quando comparado ao grupo Laser+Diclo, mostrando um melhor padrão de marcha. O grupo Laser mostrou padrão de marcha semelhante ao grupo hígido.
46
Na análise funcional realizada em outro estudo (49), em fase aguda após lesão muscular, o tratamento apenas com diclofenaco tópico e intramuscular não foi capaz de mostrar melhora, sendo semelhantes aos grupos não tratados, porém os grupos que utilizaram Laser+Diclofenaco tanto tópico como intramuscular, obtiveram resultados estatisticamente significativos, apresentando melhor padrão de marcha. A pesquisa que também utilizou o tratamento com Laser+Diclofenaco após lesão muscular em ratos diabeticos, obteve melhores resultados com este tratamento, mostrando diferença estatisticamente significativos quando comparado aos demais grupos, inclusive ao que recebeu apenas o tratamento com laserterapia(43).
Na avaliação sobre os aspectos histológicos do tecido muscular, onde pode ser observada a morfologia do tecido e consequentemente o processo de reparo.
Nas lâminas do grupo Lesão 14 dias, onde o grupo não recebeu tratamento, há extravasamento de hemácias, com intensa hemorragia, aglomeração de núcleos na região central das células, desorganização celular mostrando que a lesão ainda está presente, assim como o grupo Lesão 28 dias, onde ainda há desorganização do tecido, porém já nota-se menor área de hemorragia e os núcleos já estão indo para periferia das células.
Nos grupos que receberam tratamento com laser e laser+diclo 28 dias observa-se os núcleos das células já na periferia. A presença de núcleos na periferia das células é indicativo de fibra muscular madura, portanto, quando as células estão na região central, como é o caso do grupo não tratado e do grupo diclofenaco 14 dias, a lesão ainda está presente (53). Para que a fibra muscular tenha aparência de madura, há um preenchimento da área lesionada com proteínas contráteis, onde os núcleos são empurrados para a periferia, o que observamos nos grupos laser e laser+diclo, tanto em 14 quanto 28 dias.
Os tecidos comprometidos respondem melhor quando comparados a tecidos ilesos quando expostos ao Laser, devido a transferência de energia que ocorre entre os fótons emitidos pelo laser e os fotoreceptores encontrados nas células (54). Os tecidos que passam pelo processo inflamatório onde estão isquêmicos e com pouca perfusão, mostram resultados melhores em relação ao laser do que tecidos normais, podendo ocorrer uma evolução mais rápida do tecido muscular.
Neste estudo a irradiação com o laser de baixa potencia, não evitou o aparecimento dos sinais típicos de lesão muscular tais como: rompimento de fibras musculares, vasos sanguíneos com extravasamento de hemácias, núcleos na região
47
central, desorganização celular e descontinuidade da acidofilia, porém nota-se aparente redução dos sinais de alterações teciduais, tais como: melhor organização tecidual, não identificação de hemácias extravasadas, células melhor delineadas, mais evidente no grupo que recebeu o tratamento com Laser de forma isolada, tanto após 14 como em 28 dias.
Pôde-se observar que, em lesões musculares em fases iniciais (agudas), a associação do Laser mais Diclofenaco mostra resultados positivos quando comparada aos demais tratamentos(49,43), porém, este estudo demostrou que o Laser de Baixa Potencia é o principal responsável pelos resultados positivos, sendo mais eficiente quando comparado ao uso de AINES associada ao Laser ou de forma isolada no tratamento de lesões em médio e longo prazo (14 e 28 dias).
Sugere-se novos estudos, comparando diferentes irradiações de Laser para obter melhor conhecimento da ação da Laserterapia no processo de tratamento de lesões musculares em pacientes diabéticos.
48
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Sobre os aspectos morfométricos, pode-se concluir que o tratamento utilizando o Laser de Baixa Potencia isolado, apresentou diferença estatisticamente significativa melhor, quando comparado aos demais tratamentos no período de 14 e 28 dias.
Em relação aos resultados encontrados no Índice Funcional do Ciático, o tratamento com LBP, também apresentou os resultados significantes em relação aos outros tratamentos realizados.
Com base nos resultados encontrados nos aspectos histológicos, o grupo que recebeu apenas o Laser mostrou uma melhora qualitativa, com melhor organização das células do tecido muscular, ausência de hemácias, quando comparado aos demais grupos, mesmo não evitando o surgimento dos sinais típicos de lesão.
Sugere-se novos estudos, comparando diferentes irradiações de Laser de Baixa Potência para obter melhor conhecimento da ação da Laserterapia no processo de tratamento de lesões musculares em pacientes diabéticos.
Como limitações que o estudo apresenta, podemos citar a falta de análises mais aprofundadas, como biologia molecular e bioquímicas, como também a utilização de maiores frequências de tratamento utilizando por exemplo 2 ou 3 vezes por semana, além de tempos mais longos de tratamento, como 10 dias ou 2 semanas.
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REFERENCIAS
1. MILECH A. Diretrizes da Sociedade Brasileira de Diabetes (2015-2016).
Sociedade brasileira de Diabetes São Paulo. 2016.
2. ASSOCIATION AD. Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care. 2013 jan; 36.
3. PESSOA A, FLORIM J, RODRIGUES H, ANDRADE-OLIVEIRA V, TEIXEIRA S.
Oral administration of antioxidants improves skin wound healing in diabetic mice.
Clinical Experimental Immunolog. 2016; 1.
4. ORGANIZAÇÃO PAN-AMERICANA DE SAÚDE. [Online].; 2016 [cited 2016 maio 15. Available from:
http://www.paho.org/bra/index.php?option=com_content&view=article&id=5053:n umero-de-pessoas-com-diabetes-nas-americas-triplicou-desde-
1980&Itemid=839.
5. GREENHALGH D. Wound healing and diabetes mellitus. Clin. Plast. Surg. 2003;
30.
6. MINOSSI J, LIMA F, CARAMORI C, HASIMOTO C, ORTOLAN E, RODRIGUES P. Alloxan diabetes alters the tensile strength, morphological and morphometric parameters of abdominal wall healing in rats. Acta Cirurg Bras. 2014; 29.
7. WOLFSON T, HAMULA M, JAZRAWI L. Impact of diabetes Mellitus on Surgical Outcomes in Sports Medicine. Phys Sports Med. 2013; 41.
8. ANDREWS K, HOUDEK M, KIEMELE L. Wound management of chronicdiabetic foot ulcers: from the basics to regenerative medicine. Prosthetics and Orthotics International. 2015: p. 29-39.
9. ALBRIGHT A, FRANZ M, HORNSBY G, KRISKA A, MARRERO D, ULLRICH I.
Exercise and type 2 diabetes. American College of Sports Medicine position stand. 2000; 32: p. 1-13.
10 .
PAULA F, LEITE N, VANZELA E, KURAUTI M, FREITAS-DIAS R, CARNEIRO E.
Exercise increases pancreatic b-cell viability in a model of type 1 diabetes through IL-6 signaling. FASEB Journal. 2015: p. 2015.
11 .
KIRKENDALL D, GARRETT JR W. Clinical perspectives regarding eccentric muscle injury. Clin.Orthop. Relat. Res.. 2002; 403.
12 JÄRVINEN T, JÄRVINEN M, KALIMO H. Regeneration of injured skeletal muscle
50
. after the injury. Muscles Ligaments Tendons J. 2014 feb; 3.
13 .
SUN J, WANG Y, ZHANG L, GAO C, ZHANG L, GUO Z. Time-dependent
expression of skeletal muscle troponin I mRNA in the contused skeletal muscle of rats skeletal muscle of ratsInternational. Journal of Legal Medicine. 2009: p. 27- 33.
14 .
IWATA A, FUCHIOKA S, HIRAOKA K, MASUHARA M, KAMI K. Characteristics of locomotion, muscle strength, and muscle tissue in regenerating rat skeletal muscles. Muscle Nerve. 2010; 4.
15 .
MARQUES A, VASCONCELOS A, CABRAL C, SACCO I. Effect of frequency of static stretching on flexibility, hamstring tightness and electromyographic activity.
Brazilian Jour. of Med. And Biol. Research. 2009.
16 .
JÄRVINEN T, JÓZSA L, KANNUS P, JÄRVINEN T, JÄRVINEN M. Organization and distribution of intramuscular connective tissue in normal and immobilized skeletal muscles. J Muscle Res Cell Motil. 2002: p. 245-54.
17 .
SHI X, GARRY D. Muscle stem cells in development, regeneration, and disease.
Genes Dev. 2006; 20.
18 .
KARALAKI M, FILI S, PHILIPPOU A, KOUTSILIERIS M. Muscle regeneration:
cellular and molecular events. In Vivo. 2009; 23.
19 .
HONG R, KO H, CHO Y, KIM H, MA Z, YU T. Interleukin-10 prevents diet- induced insulin resistance by attenuating macrophage and cytokine response in skeleta muscle. Diabetes. 2009; 58.
20 .
NIEMAN D, DAVIS J, HENSON D, GROSS S, DUMKE C, UTTER A. Muscle cytokine mRNA changes after 2.5h of cycling: influence of carbohydrate. Med.
Sci. Sports Exerc. 2005; 37.
21 .
TAKEUCHIA K, HATADEA T, WAKAMIYAA S, ARAKAWAB N, MIKI A. Heat stress promotes skeletal muscle regeneration after crush injuryin rats.
ActaHistochemica. 2014; 16.
22 .
TAKAGI R, FUJITA N, ARAKAWA T, KAWADA S, ISHII N, MIKI A. Influence of icing on muscle regeneration after crush injury to skeletal muscles in rats.
JApplPhysiol. 2011: p. 382–388.
23 .
JÄRVINEN T, JÄRVINEN T, KÄÄRIÄINEN M, KALIMO H, JÄRVINEN M. Muscle injuries: biology and treatment. Am. J. Sports Med. 2005: p. 745-764.
24 GODOI V. Avaliação da lesão e recuperação muscular após estiramento em ratos diabéticos. 2011. [dissertação]. São Paulo: Instituto de Ciências
51
. Biomédicas, Universidade de São Paulo.
25 .
JOSE F. O papel dos anti-inflamatórios não hormonais no tratamento da dor musculoesquelética. JBM. 2014 set/out; 102.
26 .
MULLER S. Análise clínica e biomecânica do efeito do diclofenaco sódico na consolidação da fratura da tíbia no rato. ActaOrtop.Bras. 2004; 12.
27 .
RIBEIRO B, ALVES N, DOS SANTOS L, CANTERO T, FERNANDES K, DIAS D.
Red and infrared low-level laser therapy prior to injury with or without
administration after injury modulate oxidative stress during the muscle repair process. PLoS ONE. 2016; 11.
28 .
TULBERG M, ALSTERGREN P, ERNBERG M. Effects of low-power laser exposure on masseter muscle pain and microcirculation. Elsevier. 203 Set; 105.
29 .
SILVEIRA P, SILVA L, FRAGA D, FREITAS T, STRECK E, PINHO R. Evaluation of mitochondrial respiratory chain activity in muscle healingory chain activity in muscle healing by low-level laser therapy. J PhotochemPhotobiol. 2009; 95.
30 .
XU X, ZHAO X, LIU T, PAN H. Low-intensity laser irradiation improves the mitocondrial dysfunction of C2C12 induced by electrical stimulation. Photomed Laser Surg. 2008: p. 197-202.
31 .
AVNI D, LEVKOVITZ S, MALTZ L, ORON U. Protection of skeletal muscles from ischemic injury: low-level laser therapy increases antioxidant activity. Photomed Laser Surg. 2005: p. 197-202.
32 .
RIZZI C, MAURIZ J, FREITAS CORREA D. Effects of low-level laser therapy (LLLT) on the nuclear factor (NF) kappaB signaling pathway in traumatized muscle. Lasers Surg Med. 2006: p. 704-713.
33 .
CARVALHO R, LEAL JR E, PETRELLIS M, MARCOS R, DE CARVALHO M, DE NUCCI DN. Effects of low-level laser therapy (LLLT) and diclofenac (topical and intramuscular) as single and combined therapy in experimental model of
controlled muscle strain in rats. PhotochemPhotobiol. 2013: p. 508-512.
34 .
RAMOS L, LEAL JR E, PALLOTTA R, FRIGO L, MARCOS R. Infrared (810 nm) low-level laser therapy in experimental model of strain-induced skeletal muscle injury in rats: effects on functional outcomes. PhotochemPhotobiol. 2012: p. 154- 60.
35 .
SOUZA N, FERRARRI R, SILVA D, NUNES F, BUSSADORI S, FERNANDES K.
Effect of low-level laser therapy on the modulation of the mitochondrial activity of macrophages. Braz J PhysTher. 2014: p. 308-14.
52
36 .
RODRIGUES N, BRUNELLI R, ABREU D, FERNANDES K, PARIZOTTO N, RENNO A. Morphological aspects and Cox-2 expression afte exposure to 780-nm laser therapy in injured skeletal muscle: an in vivo study. Braz J PhysTher.. 2014 ago.
37 .
HASLERUD S. The efficacy of low-level laser therapy for shoulde tendinopathy.
Physiother. Res. Int.. 2015: p. 08–125.
38 .
BRASSOLATTI P, BOSSINI P, OLIVEIRA M, KIDO H, TIM C, ALMEIDA-LOPES L. Comparative effects of two different doses of low-level laser therapy on wound healing third-degree burns in rats.. Microsc Res Tech. 2016 Apr: p. 313-20.
39 .
HEBDEN R, GARDINER S, BENNETT T, MACDONALD I. The influence of streptozotocin induced diabetes mellitus on fluid and electrolyte handling in rats.
Clin.Sci. 1986: p. 111-117.
40 .
OZDEMIR S. Treatment with AT (1) receptor blocker restores diabetes-induced alterations in intracellular Ca(2+) transients and contractile function of rat myocardium. ArchBiochemBiophys. 2005: p. 166-74.
41 .
BABU P, SRINIVASAN K. Renal lesions in streptozotocin-induced diabetic rats maintained on onion and capsaicin containing diets. J. Nutr. Biochem. 1999: p.
477-83.
42 .
ALMEIDA P, LOPES-MARTINS R, TOMAZONI S, ALBUQUERQUE-PONTES G, SANTOS L, VANIN A. Low-level laser therapy and sodium diclofenac in acute inflammatory response induced by skeletal muscle trauma: effects in muscle morphology and mrna gene expression of inflammatory markers.
PhotochemPhotobiol. 2013: p. 501–507.
43 .
SALTORATO J. Efeito do tratamento em conjunto da laserterapia de baixa potência e do diclofenaco sobre os aspectos histológicos, morfométricos e funcionais, em modelo experimental de lesão muscular por trauma em ratos diabéticos. 2016. Dissertação (Mestrado em Fisioterapia) - Universidade do Sagrado Coração.
44 .
TUOMILEHTO J, LINDSTRÖM J, ERIKSSON J, VALLE T, HÄMÄLÄINEN H, ILANNE-PARIKKA P. Prevention of type 2 diabetes mellitus by changes in lifestyle among subjects with impaired glucose tolerance. New England Journal Medicine. 2001: p. 1343–1350.
45 .
FERNANDES T, PEDRINELLI A, HERNANDEZ A. Lesão uscular:fisiopatologia, diagnóstico, tratamento e apresentação clínica. Revista Brasileira de Ortopedia.
2011; 46.
