CONVÊNIOS CNPq/UFU & FAPEMIG/UFU Universidade Federal de Uberlândia Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação
DIRETORIA DE PESQUISA COMISSÃO INSTITUCIONAL DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA
2008 – UFU 30 anos
1
1 – Acadêmicos do curso de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Uberlândia. 2 – Orientador, professor titular do curso de Medicina Veterinária.
SEQÜÊNCIA DE FORMAÇÃO ÓSSEA DOS MEMBROS
PELVINOS DE Gallus gallus domesticus LINNAEUS, 1758
(GALICIFORMES, GALINACAE) MARCADOS COM ALIZARINA
RED S
¹Juliana Macedo Magnino Silva¹
Laboratório de Pesquisa em Animais Silvestres (LAPAS), Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Uberlândia (UFU). Av. Amazonas, n˚ 2245, Jardim Umuarama, Uberlândia-MG, CEP: 38405-302.
ju.magnino@hotmail.com
André Luiz Quagliatto Santos²
quagliatto@famev.ufu.br
RESUMO: Com objetivo de investigar a seqüência de formação dos membros pelvinos, nos diferentes estágios de desenvolvimento pré natal em Gallus gallus domesticus, coletou-se 84 embriões. Efetuou-se biometria e os embriões foram submetidos à técnica de diafanização com coloração dos ossos. No estágio 37 o fêmur, tibiotarso e fíbula apresentam centros de ossificação na diáfise progredindo para as epífises. O Fêmur, o tibiotarso e o tarsometatarso começam a ossificar simultaneamente antes dos ossos da cintura pelvina. No estágio 39, os ossos da cintura pelvina mostram centros de ossificação. A seqüência de ossificação das falanges é: F.I dedo III > F. I dedo I = F. I dedo II = F. II dedo II = F. I dedo III = F. II dedo III = F. III dedo III = F.I dedo IV >F. II dedo IV = F. III dedo IV = F. IV dedo IV. As diferenças e semelhanças na sincronização de ossificação são evidentes entre Gallus gallus domesticus e as espécies comparadas. Assim, não existe um padrão de osteogênese para as aves, devido à variação do local inicial de formação óssea e da seqüência de ossificação.
Palavras-chave: Esqueleto, Ossificação, Alizarina, Gallus gallus domesticus, Aves.
INTRODUÇÃO
Segundo Tagariello et al. (2005), cada uma destas etapas, desde transição de condensação à diferenciação, é caracterizada por padrões temporais específicos e várias mudanças ocorrem em períodos previsíveis. As perturbações desta série, altamente harmônica de acontecimentos em desenvolvimento de cartilagem e osso, crescimento e homeostase, inevitavelmente resultam em defeitos do esqueleto (BELL et al., 2006).
Para Fritsch (2003) e Gray et al. (1996), o conhecimento do critério biológico para a seqüência de formação óssea, em local e tempo previsível, é de grande interesse clínico. O osso está sujeito a numerosas alterações patológicas, que impedem a função normal de sustentação e movimento. Esses distúrbios são alvos da medicina preventiva e cirúrgica e, para serem mais bem solucionados necessitam de subsídios da ciência básica (GUPTA, 2005).
Algumas pesquisas têm sido realizadas com Gallus gallus domesticus (AMARAL et al., 2004; DIAS e MÜLLER, 1998; HASEGAWA et al., 2002.). Mas, nos estudos voltados para o sistema locomotor ainda requer considerável atenção, especificamente sobre a seqüência de formação óssea quando marcados por tratamentos específicos durante a ontogenia.
Existem numerosos trabalhos realizados com vários outros animais utilizando a técnica de diafanização e coloração de ossos. Isto tem sido demonstrado nas contribuições de Patton e Kaufman (1995), Rieppel (1993), Pugener & Maglia (1997) nos estudos da ossificação em
camundongo, em, Alligator mississippiensis e Discoglossus sardus. Esses poderão fornecer dados comparativos úteis.
O Gallus gallus domesticus é o animal doméstico mais difundido e abundante do planeta e uma das fontes de proteína mais baratas. A avicultura na economia brasileira é o setor da agropecuária que experimenta um maior avanço científico e tecnológico resultando num surpreendente aumento de produtividade com o passar dos dias (SILVA et al., 1997).
Apesar de haver estudos sobre os mais variados aspectos do aparelho locomotor em Gallus
gallus domesticus, relatos da sequência de formação óssea dos membros pelvinos ainda não foram
encontrados na literatura.
O corante alizarina red s tornou-se universal para a coloração do osso, devido as suas propriedades seletivas. Moriguchi et al. (2003) elucidaram o mecanismo de adsorção da coloração do osso com esse corante, por microespectroscopia, e comprovaram sua eficácia pela detecção de depósitos de cálcio na reação de coloração.
Propõe-se elucidar o padrão do desenvolvimento ósseo em Gallus gallus domesticus, mais especificamente nos membros pelvinos, nos diferentes estágios de desenvolvimento pré-natal.
2. METODOLOGIA
Para a realização desta pesquisa foram utilizados 84 embriões de Gallus gallus domesticus, provenientes da Granja Planalto Ltda., no município de Uberlândia – MG e encaminhados ao Laboratório de Pesquisa em Animais Silvestres (LAPAS) da Faculdade de Medicina Veterinária (FAMEV) da Universidade Federal de Uberlândia.
Os embriões foram retirados dos ovos cortando-se a casca com tesoura cirúrgica, isolando-os do vitelo e de seus envoltóriisolando-os. Após a coleta, foi feita a biometria de todisolando-os isolando-os embriões, com auxílio de paquímetro metálico (125 MEB-6/150, Starret) com precisão de 0,05 milímetros e uma balança eletrônica com precisão de 0,1 grama.
Os embriões, fixados em solução de formol a 10%, foram submetidos à técnica de diafanização com hidróxido de potássio e coloração dos ossos com alizarina red S, seguindo-se o método de Davis e Gore (DAVIS e GORE, 1936). Após a coloração, os membros pelvinos foram cuidadosamente desarticulados para melhor visualização dos centros de ossificação.
As informações foram registradas com auxílio de um microscópio estereoscópico (SZX 12, Olympus). Foi observada a presença de centros de ossificação, bem como os diferentes estágios de desenvolvimento dos ossos que compõe os esqueleto dos membros pelvinos de Gallus gallus
domesticus.
Os estágios embrionários foram determinados de acordo com Joshua (1992). Por fim, os resultados foram confrontados com os da literatura consultada.
Tabela 1: Relação dos dias de incubação do embrião e seu respectivo estágio de desenvolvimento.
Dias de incubação Estágios de desenvolvimento 10° 36 11° 37 12° 38 13° 39 14° 40 15° 41 16° 42 17° 43 18° 44 19° 45
3
3. RESULTADOS
No estágio 37, o fêmur, o tibiotarso e o tarsometatarso já mostram centros de ossificação na porção central de cada osso. Essa seqüência é definida pela observação da retenção de corante. No estágio 39, foi possível visualizar o início dos centros de ossificação no ílio, ísquio e pube.
Figura 1: Fotografia comparativa de pernas e pés de Gallus gallus domesticus. A–Estágio 39,
B-Estágio 40, C-B-Estágio 43, F-Fêmur, T-Tibiotarso, TT-Tarsometatarso.
Figura 2 : Fotografia comparativa de cintura pélvica de Gallus gallus domesticus. A–Estágio 39,
B-Estágio 40, C-B-Estágio 41, D-B-Estágio 42, IL-Ìlio, IS-Ísquio, PU-Pube.
A ossificação do tibiotarso e do tarsometatarso torna-se mais aparente na diáfise. Neste estágio começa a se observar uma maior retenção de alizarina. No estágio 40, torna-se evidente que, os centros de ossificação do tibiotarso e tarsometatarso progridem em direção às epífises. O osso metatarso I mostra centro de ossificação no estágio 40. Neste estágio, todas as falanges com exceção da Falange II do dedo I e da falange III do dedo IV exibiram centros de ossificação. Nos dedos II e III o processo encontra-se mais avançado. No estágio 40, os centros de ossificação das falanges aparecem no dedo III e segue nos dedos IV e II, no estágio seguinte. Simultaneamente, foi observada a presença de centro de ossificação na falange I do dedo I. A falange II do dedo I possui centro de ossificação no estágio 41. Com exceção do dedo IV, no estágio 40 todas as falanges
apresentam centro de ossificação. A ossificação de todas as falanges foi verificada no estágio 41.
No estágio 43 o fêmur,tibiotarso, tarsometatarso e as falanges encontram-se em processo de ossificação embrionária avançado.
Figura 2: A: Fotografia do pé de Gallus gallus domesticus. D- Dedo, FI- Falange I; B; Fotografia
do pé de Gallus gallus domesticus; C: Fotografia do pé de Gallus gallus domesticus, F-Falange.
Tabela 2: Seqüência de ossificação dos ossos da cintura pelvina e membros pelvinos de Gallus gallus domesticus, dos estágios 37 ao 46.
4. DISCUSSÃO
A técnica de diafanização e coloração de ossos têm sido utilizada e mostra-se eficiente para evidenciar os centros de ossificação. Isso pode ser observado nos trabalhos de FRANZ-ODENDAAL (2005), NAKANE & TSUDZUKI (1999), VIEIRA & SANTOS (2007) nos estudos da ossificação em camundongo, em codorna japonesa e em tartaruga-da-amazônia.
De acordo com Jorge (2002) existe um mecanismo básico que controla o desenvolvimento dos membros com morfologia e função diferenciados, dentro de todos os vertebrados. A formação
5
dos membros inicia-se com a expressão de fatores que determinam posicionamento específico do primórdio ao longo do embrião.
Roach (2007) analizando cortes de ossos de embriões de galinha, relatou que os condrócitos se tornam células formadoras de osso que produzem matriz osteóide mineralizada intacta após o período de 9 a 12 dias de desenvolvimento embrionário. Os achados dos primeiros centros de ossificação nos embriões de Gallus gallus domésticos ocorreram no estágio 37.
Em Coturnix coturnix japonica, o início do aparecimento do centro de ossificação primária na diáfise do osso estudado foi achado entre o 6° e o 7° dia de incubação. Diferentes crescimentos entre os ossos da perna e da asa foram observados. Úmero e tíbiotarso mostraram os melhores índices de crescimento enquanto que o rádio e ulna mostraram os menores (POURLIS et al., 1998). O tempo de ossificação de embriões de perus ocorre em uma ordem cronológica característica, diferente das demais aves descritas, mesmo que pertençam a espécies afins (SCALA, et al., 1976).
Durante a incubação, foram observados, centros únicos de ossificação para cada um dos ossos: ílo, ísquio, pube, fêmur, tibiotarso, fíbula. Centros indiviuais foram encontrados nas falanges dos dedos I e IV. Após o nascimento, outro centro de ossificação foi encontrado, na porção proximal do tibiotarso (HOGG, 1980).
Baeriswyl (1980) avaliou o comprimento dos ossos da cintura próximo-distalmente e, através desse método foi possível determinar a idade dos esqueletos dos embriões de frangos do 7° ao 17° dias de incubação. Em embriões de gallus gallus domesticus, os ossos da cintura coram pela alizarina a partir do 13° dia de encubação, correspondente ao estágio 39. Estudos de ossificação dos embriões são importantes para detectar fatores que modificam o desenvolvimento do esqueleto, avaliação de sua importância e alterações no tempo de latência.
A epífise da fíbula funde com a tíbia e forma o tibiotarso durante os estágios 18 a 23. Qualquer intervenção nesses estágios pode provocar a separação da epífise distal da fíbula. A diferença de crescimento nos diâmetros da tíbia e da fíbula é resultado da diferença na osteogênese, ao invés da condrogênese, como se pensavam. (ARCHER, 1983).
Segundo Navagiri, et al. (1976), centros de cartilagem no tibiotarso e tarsometatarso começam a parecer entre o 6° e 9° dia de incubação. Em Gallus gallus domesticus, o centro de ossificação propriamente dito se inicia no 11° dia de incubação. Os centros de cartilagem se mantiveram durante o processo de ossificação e se fundiram à porção inferior da tíbia nos pintos. Os centros de ossificação do tibiotarso e fíbula são similares aos centros hipofisários de mamíferos em detalhes histológicos.
Nakane (1999) constatou em embriões de codorna japonesa que ao processo de ossificação ocorre da porção proximal para a distal do osso, com exceção da 2° falange do dedo I, 3° falange do dedo II, 4° falange do dedo III e 5° falange do dedo IV. Nos embriões de Gallus gallus domesticus, a 2° falange do dedo I e a 5° falange do dedo IV foram as últimas a serem visualizadas após a retenção do corante.
O ílio, ísquio, falange I do dedo II, falanges I e II do dedo III e falanges I e II do dedo IV coraram de vermelho na porção central do osso em Coturnix coturnix japonica no estágio 26 e a 2° falange do dedo I a 3° falange do dedo II a 4° falange do dedo III e 5° falange e dedo IV no estágio 28. Em Gallus gallus domesticus estas falanges são visualizadas nos estágio 40 e 41 (LANSDOWN, 1970).
A Formação da cartilagem e ossificação nos principais elementos que compõe o esqueleto em galos e codornas é muito similar. Tanto em Coturnix coturnix japonica como em Gallus gallus
domesticus, os centros de ossificação começam a aparecer no fêmur, tibiotarso e fíbula
aproximadamente ao mesmo tempo. O'Rahilly & Gardener (1956) relatam que no fêmur dos pintinhos, a escavação da cavidade medula óssea começa no 8° dia de incubação, ligeiramente mais cedo do que nas codornas.
O fêmur em gallus gallus tem sido descrito como o osso primordial da perna durante o período de condrogênese, embora a sua taxa de crescimento seja inferior ao do tibiotarso
(STEPANOVA, 1926). Em codornas, o tibiotarso possui a maior taxa de crescimento além de ser o componente primordial da perna.
A taxa de crescimento da fíbula de galinha possui maiores índices (FELL & CANTI, 1934), já em embriões de codornas com 6 dias incubação a taxa da fíbula é inferior, avançando um pouco no 7° dia de incubação.
Neumeister relatou um centro de ossificação distinto entre a tíbia e do tarsometatarso no 19° dia de incubação. Este centro presumivelmente corresponde a um dos três centros de ossificação visto na região do tarso em codornas.
Comparando o desenvolvimento da perna de Coturnix coturnix japonica e Gallus gallus
domesticus, fica claro que os elementos do esqueleto em ambas as aves desenvolvem em uma
seqüência muito semelhante, embora o desenvolvimento nos pintos ocorra mais cedo que o das codornas. A morfologia final da cintura nas duas aves é muito semelhante. Portanto, com base nestas observações, ambas podem ser classificadas na ordem Galliformes (WETMORE, 1951). A forma do esqueleto dos membros pelvinos é tipicamente verificada na maioria das espécies de aves. Em estudos de desenvolvimento normal do esqueleto, acredita-se que a origem das aves pertença à família primitiva de aves pseudosuchians. Em aves, ao longo da evolução exigiu-se um mecanismo diferente na formação do tibiotarso, tornando-se característica exclusiva do esqueleto da classe aviária (LANSDOWN, 1970).
5. CONCLUSÕES
O Fêmur, o tibiotarso e o tarsometatarso começam a ossificar simultaneamente antes dos ossos da cintura pelvina.
No estágio 39, os ossos da cintura pelvina mostram centros de ossificação
A seqüência de ossificação das falanges é: F.I dedo III > F. I dedo I = F. I dedo II = F. II dedo II = F. I dedo III = F. II dedo III = F. III dedo III = F.I dedo IV >F. II dedo IV = F. III dedo IV = F. IV dedo IV. Não existe um padrão de osteogênese para todas as aves.
6. REFERÊNCIAS
Amaral, V. C.; Santana, M. I.; Bombonato, P. P.; Carneiro E Silva, F. O.; Benedicto, H. G., 2004. Vascularization of chickens adrenal glands in NPK lineage (Gallus gallus domesticus) Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, São Paulo, v. 41, p. 361-367.
Archer, C. W.; Hornbruch, A.; Wolpert, L., 1983. Growth And Morphogenesis Of The Fibula In The Chick Embryo. J Embryol Exp Morphol. v. 75, p. 101-16.
Baeriswyl, F., 1980. Morphometric development of ossification in the chick leg from the 7th to the 17th day of incubation France Bull Assoc Anat (Nancy), v. 64, p. 183-98.
Bell, B.; Spotila, J. R., 2006. Congdon, J. High incidence of deformity in aquatic turtles in the John Heinz National Wildlife Refuge. Environmental Pollution, Barking, v. 142, p. 457-465.
Davis, D. D.; Gore, U. R., 1936. Clearing and staining skeleton of small vertebrates. Field museum
of natural history, Chicago, v. 4, p. 3-15.
Dias, P. F. E Muller, Y. M. R., 1998. Características do desenvolvimento embrionário
de Gallus gallus domesticus, em temperaturas e períodos diferentes de incubação, Braz. J. vet. res. anim. Sci., São Paulo, v. 35, n. 5, p. 233-235.
Fell, H. B. & Canti, R. G., 1934. Experiments on the development in vitro of the avian knee joint. Proc. R. Soc. B v. 116, p. 316-349.
Franz-Odendaal, T. A., 2005. Intramembranous ossification of scleral ossicles in Chelydra
serpentina. Zool. v. 109, p. 75-81.
Fritsch, H., 2003. Development of the human hand: a short, up-to-date overview. European Surgery, v.35, p. 125–128.
Gray, C.; Boyde, A.; Jones, S. J., 1996. Topographically induced bone formation in vitro: implications for bone implants and bone grafts. Bone, New York, v. 18, p. 115-123.
7
Gupta, R. K., 2005. Long bone fractures in osteopetrosis: awareness of primary pathology and appropriate pre-operative planning necessary to avoid pitfalls in fixation. Injury Extra, v. 36, p. 37-41.
Hasegawa, M.Y., 2002. Fonteque, J. H,.; Kohayagawa, A.; Boretti, L. P. Avaliação do Perfil Eletroforético das Proteínas Séricas em Matrizes Pesadas (Gallus Gallus Domesticus) da Linhagem Avian Farm. Revista Brasileira de Ciência Avícola,
São Paulo, v. 4, n. 3, p. 203 – 207.
Hogg, D. A., 1980. A re-investigation of the centres of ossification in the avian skeleton at and after hatching J. Anat. Glasgow, Scotland, v. 4, p. 725-743.
Jorge, E. C., 2002. Identificação de seqüências expressas (EST) em embriões de Gallus gallus Dissertação mestrado Piracicaba - São Paulo.
Joshua, R. S., 1992. On the republication of the Hamburger – Hamilton stages series. Developmental Dynamics v. 195, n. 4, p. 229-230.
Lansdown, A. B. G., 1970. A study of the normal development of the leg skeleton in the quail (Coturnix coturnix japonica) J. Anat., v. 106 , p. 147-160.
Moriguchi, T.; Yano, K.; Nakagawa, S., 2003. Kaji, F. Elucidation of adsorption mechanism of bone-staining agent alizarin red S on hydroxyapatite by FT-IR microspectroscopy. Journal of Colloid and Interface Science, New York, v. 260, p. 19–25.
Nakane, Y.; Tsudzuki, M., 1999. Development of the skeleton in Japanese quail embryos. Development Growth and Differentation, Nagoya, v. 41, p. 523–534.
Navagiri, S. S.; Dubey, P. N.,1976. The Ossification Centers In The Lower End Of Tibiotarsus In Domestic Fowl. Z Mikrosk Anat Forsch. v. 90, p. 360-7.
Neumeister, H., 1966. Observations on ossification of the embryonal skeleton of the domestic fowl. Proceedings of XlII World Poultry Congress, Kiev, U.S.S.R., p. 553-562.
O'rahilly, R. & Gardener, E., 1956. The development of the knee joint of the chick and its correlation with embryonic staging. J. Morph. v. 98, p. 49-88.
Patton, J. T.; Kaufman, M. H., 1995. The timing of ossification of the limb bones, and growth rates of various long bones of the fore and hind limbs of the prenatal and early postnatal laboratory mouse. Journal of Anatomy, London, v. 186, p. 175-185.
Pogue, R.; Sebald, E.; King, L.; Kronstadt, E.; Krakow, D.; Cohn, D. H., 2004. A transcriptional profile of human fetal cartilage. Matrix Biology, Stuttgart, v. 23, p. 299–307.
Pourlis, A. F.; Magras, I. N.: Petridis, D., 1998. Ossification and growth rates of the limb long bones during the prehatching period in the quail (Coturnix coturnix japonica) Anat Histol Embryol. Thessaloniki, Greece, 27 p. 61-3.
Pugener, L. A.; Maglia, A. M., 1997. Osteology and skeletal development of Discoglossus sardus (Anura, Discoglossidae). Journal of Morphology, New york, v. 233, n. 3, p. 267-286.
Rieppel, O., 1993. Studies on skeleton formation in reptiles. V. patterns of ossification in the skeleton of Alligator mississippiensis Daudin (Reptilia, Crocodylia). Journal of Zoology, London, v. 109, p. 301-3251.
Roach, H. I., 1997. New Aspects of Endochondral Ossification in the Chick: Chondrocyte Apoptosis, Bone Formation by Former Chondrocytes, and Acid Phosphatase Activity in the Endochondral Bone Matrix Journal of Bone and Mineral Research, Southampton - UK, v. 12 p. 795-805.
Scala G, Colella G, Gentile R., 1993. Chronology of the appearance of embryonic ossification nuclei in the turkey Italian Boll Soc Ital Biol Sper. v. 30, p. 638-44.
Silva, F. O C.; Severino, R. S.; Santos, A. L.Q.; Drummond. S. S.; Bombonato, P. P.; Santana, M. I. S.; Lopes, D.; Marçal, A. V., 1997. Origem e Distribuição da Artéria Celíaca Em Aves (Gallus
gallus domesticus - Linhagem Ross) Rev. Fac. Zootec. Vet. Agro. Uruguaiana, v. 4, n. 1, p. 35-41,
Jan.-Dez.
Stepanova, V., 1926. Mem. Acad. Sci. (Ukraine) Clas. Sci. Phys. Math. v. 2, n. 5, p. 419-435. Tagariello, A.; Schlaubitz, S.; Hankeln, T.; Mohrmann, G.; Stelzer, C.; Schweizer, A.; Hermanns, P.; Lee, B. Schmidt, E. R.; Winterpacht, A.; Zabel, B., 2005. Expression profiling of human fetal growth plate cartilage by EST sequencing. Matrix Biology, Stuttgart, v. 24, p. 530 – 538.
Vieira, L. G.; Santos, A. L. G., 2007. Sequence of metacarpal and phalangeal bone formation in embryos of Podocnemis expansa Schweigger, 1812 (testudines, podocnemididae) stained with alizarin red s Braz.J.Morphol.Sci v. 24 ,p. 44-51.
Wetmore, A., 1951. A revised classification of birds of the world. Smithson. misc. Collns. v.117, p. 22.
SEQUENCE OF PELVINE MEMBERS BONE FORMATION IN Gallus gallus domesticus LINNAEUS, 1758 (GALICIFORMES, GALINACAE) STAINED WITH ALIZARIN RED S Juliana Macedo Magnino Silva¹
Laboratório de Pesquisa em Animais Silvestres (LAPAS), Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Uberlândia (UFU). Av. Amazonas, n˚ 2245, Jardim Umuarama, Uberlândia-MG, CEP: 38405-302. Email: ju.magnino@hotmail.com
André Luiz Quagliatto Santos²
quagliatto@famev.ufu.br
ABSTRACT: To investigate the sequence of pelvine members formation in the various stages of prenatal development of Gallus gallus domesticus, 84 embryos were collected. Biometric measurements were taken and the embryos were subjected to the diaphanization technique with bone staining, followed by the Davis and Gore method. The ossification during the 37 stage of femur, tibiotarsus and tarsusmetatarsus becomes apparent in the diaphysis and displays more extensive ossification than pelvic limb. During stage 37, ilium, ischium, pubis exhibit ossification centers. The sequence of phalangeal formation is: F.I digit III > F. I digit I = F. I digit II = F. II digit II = F. I digit III = F. II digit III = F. III digit III = F.I digit IV >F. II digit IV = F. III digit IV = F. IV digit IV. The differences and similarities in the synchronization of ossification of Gallus gallus domesticus and comparable species are evident. Thus, there is no osteogenetic pattern common to all avian, due to variations in the initial site of bone formation and the sequence of ossification.
