FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
Amauri da Silva Justo Junior
QUANTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS POPULAÇÕES DE MONÓCITOS NA ATEROSCLEROSE HUMANA
CAMPINAS 2016
Amauri da Silva Justo Junior
QUANTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS POPULAÇÕES DE MONÓCITOS NA ATEROSCLEROSE HUMANA
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de mestre em Ciências Médicas, área de concentração em Ciências Biomédicas.
ORIENTADOR: PROF. DRA. MARIA HELOÍSA DE SOUZA LIMA BLOTTA
COORIENTADOR: DR. RÔMULO TADEU DIAS DE OLIVEIRA
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO
ALUNO AMAURI DA SILVA JUSTO JUNIOR, E ORIENTADO PELA PROFA. DRA. MARIA HELOÍSA SOUZA LIMA BLOTTA.
CAMPINAS
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
AMAURI DA SILVA JUSTO JUNIOR
ORIENTADOR: PROFA DRA. MARIA HELOÍSA DE SOUZA LIMA BLOTTA COORIENTADOR: PROF DR. RÔMULO TADEU DIAS DE OLIVEIRA
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. MARIA HELOISA DE SOUZA LIMA BLLOTA
2. PROFA. DRA. MARIA CRISTINA DE OLIVEIRA IZAR
3. PROF. DR. JOSÉ ROBERTO MATOS SOUZA
Programa de Pós-Graduação em Ciência Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
À minha família, por todo carinho, amor, confiança e apoio que me dão para que eu possa atingir minhas metas e realizar os meus sonhos. Nada disso seria possível se não fosse por vocês.
AGRADECIMENTOS Agradeço imensamente à minha família, por todo apoio, incentivo, exemplo,
força, inspiração e por estarem ao meu lado sempre. Aos meus pais Amauri e Adriana
que sempre fizeram de tudo para que eu conseguisse alcançar meus objetivos. Às
minhas irmãs Ana Celine e Ana Julia que sempre me apoiaram e compreenderam.
Aos meus tios/tias e primos/primas que sempre me apoiaram e entenderam minha
ausência nas reuniões de família sempre que necessário.
Agradeço a minha namorada, Letícia, por todo incentivo, carinho, compreensão
e ajuda.
À minha orientadora Dra Heloísa Blotta, agradeço pelo acolhimento em seu
laboratório, pelo comprometimento e ajuda na realização desta dissertação e também
na minha formação. Sou muito grato pela confiança em meu trabalho e também pelas
oportunidades que me deu.
Ao meu co-orientador Rômulo, agradeço por toda ajuda, ensinamentos,
dedicação e experiência compartilhada, por sanar todas as dúvidas e auxiliar na
realização de experimentos e análises.
Aos amigos que fiz no Laboratório de Imunologia Celular e Molecular, o meu
muito obrigado por todos os momentos de descontração proporcionados.
Aos meus amigos que não são do laboratório, por me darem apoio e
entenderem minha ausência nos últimos tempos.
A todos os pacientes pela colaboração em participar deste trabalho, sem os
quais nada disso seria possível.
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP -
processo número 2014/00327-2) e Conselho Nacional de desenvolvimento Científico
E por fim, a todas as pessoas que estiveram presentes em minha vida durante
“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”.
RESUMO
A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica caracterizada pela retenção
de lipídios e células da resposta imunológica na íntima arterial. Dentre as células que
ganham acesso à parede arterial, os monócitos são os primeiros a serem recrutados
diferenciando-se em macrófagos e contribuindo para a formação das lesões de
ateroma. Sabe-se que os monócitos circulantes constituem uma população
heterogênea composta por três tipos celulares, as células CD14++CD16- (Clássica),
CD14++CD16+ (Intermediária) e CD14+CD16++ (Não clássica), que apresentam
funções e capacidade migratória distintas. As diferentes populações de monócitos
podem ser associadas com a presença de fatores de risco para desenvolvimento de
doença arterial coronariana (DAC) ou mesmo predizer eventos cardiovasculares em
indivíduos com DAC. Entretanto, ainda não existe consenso acerca da função de cada
subtipo de monócito. Tendo em vista o papel importante dos monócitos em todos os
estágios de desenvolvimento do ateroma é objetivo deste trabalho avaliar a presença
de diferentes populações de monócitos em amostras de sangue periférico de
pacientes com DAC e também a produção de citocinas por estas populações frente
ao antígeno aterogênico HSP60. Para isso, a quantificação e a caracterização
fenotípica dos monócitos do sangue periférico dos grupos de estudo (síndrome
coronariana crônica (SCC), síndrome coronariana aguda (SCA) e controles [com (FR)
e sem (C) fatores de risco para aterosclerose]), bem como a avaliação da produção
de citocinas foi feita por citometria de fluxo. Foi observada uma menor frequência de
monócitos da população clássica e maior frequência da população não clássica no
grupo SCC comparado ao grupo controle. A análise do número absoluto mostrou que
o grupo SCC apresenta menor número de monócitos totais e das populações clássica
análise da expressão de receptores de superfície celular verificamos uma maior
frequência das três populações de monócitos CCR5+ e não clássicos CX3CR1+ no
grupo SCA. Encontramos também no grupo SCA a maior frequência de células TLR2+,
TLR4+ e CD36+ nas três subpopulações de monócitos, o que poderia sugerir que os
monócitos destes pacientes são capazes de reconhecer e promover inflamação em
resposta a moléculas associadas a dano geradas no quadro agudo. A estimulação de
monócitos com HSP60 induziu produção de citocinas de caráter inflamatório,
quimiocinas e citocinas moduladoras da resposta Th1 em células das populações
clássica e intermediária. Em conclusão os resultados indicam a participação das 3
populações de monócitos em todo processo aterosclerótico e sua associação com a
gravidade da doença.
ABSTRACT
Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease characterized by retention of
lipids and immune cells in the arterial intima. Among the cells that enter the arterial
wall, monocytes are the first to be recruited differentiating into macrophages and
contributing to the formation of atheroma lesion. It is known that circulating monocytes
constitute a heterogeneous population composed by at least three cells types:
CD14++CD16- (Classical), CD14++CD16+ (Intermediate) and CD14+CD16++ (Non
classical) cells that present distinct functions and migratory pattern. The different
monocytes population are associated with the presence of risk factors for development
of coronary arterial disease (CAD) or even predict cardiovascular events in patients
with CAD. However, there is no consensus about the function of each monocyte
subset. Due to the important role of monocytes in all development stages of the
atheroma formation, the aim of this study was to evaluate the presence of different
monocytes subpopulations in samples of peripheral blood of patients with CAD and to
evaluate the cytokine production by these subsets to the atherogenic antigen HSP60.
For this, quantification and phenotypic characterization of peripheral blood monocytes
of the study groups (chronic coronary syndrome (CCS), acute coronary syndrome
(ACS), and controls [with (RF) and without (C) risk factors for atherosclerosis]), as well
the cytokine production evaluation were assessed by flow cytometry. We found a lower
frequency of classical and a higher frequency of non classical monocytes in the SCC
group compared to control group. The analysis of the absolute number showed that
the CCS group presents a lower number of total monocytes, classical, and
intermediate subpopulation when compared to control and ACS groups. In relation to
the expression of cell surface receptors, we found a higher frequency of the three
also found a high frequency of TLR2+, TLR4+ and CD36+ cells of the three monocytes
subpopulations in the ACS group. These findings could suggest an increased capacity
of these monocytes to promote inflammation in response to damage associated
molecules generated during the acute response. Moreover, we found that the
stimulation of monocytes with HSP60 bring about the production of inflammatory
cytokines, chemokines and Th1 promoting cytokines in classical and intermediate
subpopulations. In conclusion, our data indicate the participation of the three
monocytes subpopulations in all atherogenic process and its association with disease
severity.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Análise por citometria de fluxo das subpopulações de monócitos aderidos às células endoteliais (HUVECs) ... 32 Figura 2 - Análise por citometria de fluxo das subpopulações de monócitos do sangue periférico... 39 Figura 3 - Frequência das subpopulações de monócitos do sangue periférico ... 40 Figura 4 - Número absoluto de monócitos totais e subpopulações de monócitos do sangue periférico ... 41 Figura 5 - Frequência de células CCR2+ nas subpopulações de monócitos do sangue
periférico... 42 Figura 6 – Análise da Intensidade Média de Fluorescência (IMF) do receptor CCR2 nos monócitos dos diferentes grupos de estudo ... 43 Figura 7 - Frequência de células CCR5+ nas subpopulações de monócitos do sangue
periférico... 44 Figura 8 - Frequência de células CX3CR1+ nas populações de monócitos do sangue
periférico... 45 Figura 9 - Frequência de células TLR2+ nas populações de monócitos do sangue
periférico... 46 Figura 10 - Frequência de células TLR4+ nas populações de monócitos do sangue
periférico... 47 Figura 11 - Frequência de células CD36+ nas populações de monócitos do sangue
periférico... 48 Figura 12 - Análise da Intensidade Média de Fluorescência (IMF) do receptor CD36 nos monócitos dos diferentes grupos de estudo ... 49 Figura 13 - Frequência de células SLAM+ (CD150) nas populações de monócitos do
sangue periférico ... 50 Figura 14 - Frequência de células CD202b+ nas populações de monócitos do sangue
periférico... 51 Figura 15 - Número de monócitos da subpopulação clássica aderidos às células endoteliais ... 53 Figura 16 - Frequência de monócitos positivos para citocinas inflamatórias ... 55 Figura 17 - Frequência de monócitos positivos para quimiocinas ... 57 Figura 18 - Frequência de monócitos positivos para citocinas moduladoras da resposta adaptativa ... 59
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Parâmetros clínicos e laboratoriais dos pacientes dos grupos experimentais. ... 36 Tabela 2 - Valores referenciais do perfil lipídico segundo a V Diretriz Brasileira de Dislipidemias e Prevenção de Aterosclerose ... 37
LISTA DE ABREVIATURAS
BSA: Soroalbumina bovina
CCL: Quimiocina ligante da família CC CCR: Receptor de quimiocina da família CC CD: Cluster de diferenciação
DAC: Doença arterial coronariana
DAMP: Padrões moleculares associados ao dano EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético
FSC: “Forward scatter“
HDL-C: Lipoproteína de alta densidade HLA-DR: “Human leucocyte antigen”
HSP: Proteína de choque térmico
HUVEC: Células endoteliais de veia umbilical humana IFN: Interferon
IL: Interleucina
LDL-C: Lipoproteína de baixa densidade
LOX-1: Receptor 1 do tipo lectina para LDL oxidada LPS: Lipopolissacarideo
MCP-1: “Monocyte Chemoattractant Protein-1”
M-CSF: Fator estimulante de colônia de macrófago MHC: Complexo principal de histocompatibilidade NLR: Receptor do tipo NOD
PBS: Tampão fosfato salina PCR: Proteína C reativa RPM: rotações por minuto SR: Receptor scavenger
SSC: Side scatter
TGF-B: Fator de transformação do crescimento β Th: Linfócito T helper
TLR: Receptor do tipo Toll
TNF-α: Fator de necrose tumoral α
Sumário 1. INTRODUÇÃO ... 18 2. OBJETIVOS ... 25 2.1. Objetivos Gerais ... 25 2.2. Objetivos Específicos ... 25 3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 26
3.1. Casuística e caracterização dos grupos experimentais ... 26
3.2. Obtenção dos leucócitos totais de sangue periférico ... 27
3.3. Citometria de fluxo para análise das populações de monócitos ... 28
3.4. Obtenção de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) ... 29
3.5. Isolamento de monócitos ... 29
3.6. Avaliação da capacidade de adesão de monócitos ao endotélio ativado... 31
3.6.1. Cultivo e manutenção de linhagem de células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) ... 31
3.6.2. Teste de adesão de monócitos ... 31
3.7. Avaliação da produção de citocinas após estímulo com HSP60 pela técnica de citometria de fluxo ... 33
4. RESULTADOS ... 35
4.1. Caracterização dos grupos de estudo ... 35
4.2. Análise das subpopulações de monócitos ... 39
4.3. Receptores de quimiocinas ... 41
4.4. Receptores de reconhecimento padrão: TLRs e CD36 ... 45
4.5. SLAM (6-sulfo LacNAc) ... 49
4.6. Tie-2 ... 50
4.7. Teste de Adesão ... 52
4.8. Estimulação com Heat Shock Protein 60 ... 53
5. DISCUSSÃO ... 60
6. CONCLUSÃO ... 69
1. INTRODUÇÃO
Doenças cardiovasculares são apontadas com uma das principais causas de
morte atualmente. Em 2012, estas doenças foram responsáveis por cerca de 17,5
milhões de óbitos a nível mundial, sendo que aproximadamente 7,4 milhões foram
devido a doença coronariana. No Brasil, em 2011, as doenças cardiovasculares
apareceram como a principal causa de morte na população, correspondendo a 31%
dos óbitos ocorridos no país no mesmo ano (aproximadamente 409 mil) (1).
Infarto do miocárdio, falência cardíaca e acidente vascular encefálico (AVE) são
as doenças cardiovasculares mais comuns, e o principal processo envolvido no
surgimento destes eventos é a aterosclerose (2).
A aterosclerose é um processo inflamatório crônico e sistêmico que afeta vasos
sanguíneos de médio e grosso calibre principalmente em locais de ramificação, onde alterações do fluxo sanguíneo geram “estresse” nas células endoteliais alterando a
integridade da barreira endotelial, facilitando assim a infiltração de moléculas (3-5).
A infiltração da partícula de LDL colesterol na íntima arterial e sua posterior
modificação é apontada como principal agente responsável pela resposta inflamatória
presente nas lesões de ateroma (6). Dentre os diferentes produtos gerados durante a
modificação da partícula de LDL colesterol, o mais estudado é a modificação oxidativa,
que pode ocorrer in vivo por meio de mecanismos dependentes de lipoxigenase,
mieloperoxidase, peróxido de hidrogênio ou óxido nítrico. A oxidação da partícula de
LDL colesterol promove a geração de grande variedade de lipídios oxidados e
componentes lipídico-proteicos modificados, tornando-a imunogênica (7,8) e passível
de ser reconhecida por células endoteliais, via receptor do tipo Toll 4 (TLR4) e
receptor-1 do tipo lectina para LDL oxidada (LOX-1), promovendo sua ativação, com
vascular-1 (VCAM-1), produção de quimiocinas, como a MCP-1/CCL2,
Fractalquina/CX3CL1 e RANTES/CCL5 culminando com a migração de células da
resposta imunológica para a íntima arterial (9-14).
O primeiro grupo celular a migrar para o local de ativação endotelial são os
monócitos. A presença de fatores de crescimento, como M-CSF, promove a
transformação dos monócitos em macrófagos, a principal célula envolvida nos
processos de formação e desestabilização das lesões de ateroma (15). Os
macrófagos passam a expressar grande quantidade de receptores da imunidade inata
envolvidos nos processos de endocitose de lipoproteínas e fragmentos apoptóticos,
como os receptores scavenger (SR), representados principalmente pelo CD36 ou
SRB, que apresentam papel essencial na formação da célula espumosa,
característica do ateroma (16,17). Além disso, os macrófagos aumentam a expressão
de receptores que induzem ativação de vias pró-inflamatórias como os TLRs e os
receptores do tipo NOD (NLRs) (17). Trabalhos recentes mostram expressão elevada
de diversos tipos de TLRs em macrófagos, células endoteliais e células musculares
lisas presentes em lesões ateroscleróticas humanas e de camundongos (18,19).
Similarmente, em trabalho recente de nosso grupo e de outros autores, foi
demonstrada a presença do RNAm e da proteína de diversos NLRs em lesões de
ateroma humano (20,21).
Na aterosclerose, os TLRs e NLRs estão envolvidos nos processos de
reconhecimento de produtos de estresse tecidual e degradação de matriz extracelular
ou células mortas, como a proteína de choque térmico 60 (HSP60) liberada por células
necróticas e que promove ativação de TLR2 e TLR4 e os cristais de colesterol que
promovem ativação do NLRP3 (21,22). Entretanto, no contexto da aterogênese, o
trabalho anterior, nosso grupo mostrou que a LDLox promove ativação de células
mononucleares do sangue periférico (CMSP), causando a liberação de mediadores inflamatórios como IFN-γ, CCL2 e CCL8 (23). Além disso, outros autores descreveram
que o reconhecimento da partícula de LDLox se dá principalmente via TLR4 (8).
O reconhecimento da partícula de LDL modificada e produtos de degradação
de matriz extracelular pelos NLRs e TLRs presentes nos macrófagos teciduais
promove cascatas inflamatórias diretamente por ativação do fator de transcrição
nuclear kB (NF-kB), vias de sinalização das proteínas quinases ativadas por
mitógenos (MAPKs) e caspases inflamatórias (24,25). Como consequência ocorre a produção de diversos componentes da resposta inflamatória como citocinas (IL-1β,
IL-6, IL-12, IL-18), quimiocinas (CCL2, CXCL8, CCL5, CXCL10) e proteases
(metaloproteinases e catepsinas) que participam ativamente do processo inflamatório
presente no ambiente aterosclerótico, promovendo o desenvolvimento e posterior
ruptura das placas de ateroma (3,17,22).
Outras células muito importantes na patogênese da aterosclerose são os
linfócitos TCD4+ (26). Linfócitos Th1, Th2, Th17 e T regulatórios (Treg) e seus
produtos foram detectados em lesões de ateroma humano e de camundongos
(26-28). A presença de IL-12 e IL-18 nas placas de ateroma (29,30) promove a indução
preferencial de linfócitos Th1 que apresentam como característica o fator de transcrição T-bet e a produção de grande quantidade de IFN-γ (26). O IFN-γ ativa as
vias pró-inflamatórias com ativação de macrófagos, produção de MMP9 e apoptose
de células musculares lisas induzindo mecanismos de desestabilização de lesões
ateroscleróticas (31). Por outro lado, a presença de citocinas anti-inflamatórias como
IL-10 induz a geração de células T regulatórias que apresentam o fator de transcrição FOXP3 e produzem citocinas anti-inflamatórias como IL-10 e TGF-β essenciais para
os mecanismos de estabilização das lesões de ateroma (28). Os linfócitos Th2 e Th17, gerados na presença de IL-4 ou TGF-β e IL-6 respectivamente, ainda apresentam
papel contraditório no contexto da aterogênese (26,32).
Como explicado anteriormente, a migração de monócitos é um processo
essencial para a patogênese da aterosclerose. Estudos em camundongos
identificaram a presença de duas populações distintas, uma denominada inflamatória,
caracterizada pela alta expressão dos receptores Ly6C(Ly6Chi) CCR2, CCR5 e CCR1
(33) e um grupo celular responsável pelo patrulhamento do endotélio, identificadas
pela baixa expressão de Ly6C (Ly6Clow) e alta expressão de CX
3CR1 (34). Dados
experimentais recentes apontam que a população de monócitos Ly6Chi é a primeira a
ganhar acesso ao local de desenvolvimento da lesão de ateroma, produzindo
mediadores inflamatórios como TNF-α, IL-12 e IL-6, além de apresentar
características de célula apresentadora de antígenos com alta expressão de MHC de
classe II (MHC II), CD80 e CD86 (35,36). Por outro lado, o papel da população Ly6Clow
na aterogênese ainda é contraditório, com trabalhos mostrando tanto função pró como
anti-aterogênica (37,38).
As diferentes populações de monócitos encontradas em camundongos
apresentam homologia com células humanas, sendo classificados de acordo com a
expressão dos receptores de superfície CD14 (coreceptor para LPS) e CD16 (receptor FcγIII) em 3 subtipos: clássicos, intermediários e não clássicos (39). O subtipo clássico
é caracterizado pela alta expressão de CD14 e ausência de CD16 (CD14++CD16-)
compreendendo a maior população de monócitos circulantes (70 - 80%). O subtipo
intermediário apresenta alta expressão de CD14 e baixa expressão de CD16
(CD14++CD16+), enquanto o subtipo não clássico possui baixa expressão de CD14 e
diferenças na expressão de receptores de quimiocinas, com alta expressão de CCR2
na população clássica e CX3CR1 nas populações intermediária e não clássica
(40,41).
Sabe-se que as subpopulações de monócitos derivam de um precursor comum
e acredita-se que estas células representam diferentes estágios de maturação dos
monócitos. Em estudo realizado com transplantados de medula óssea foi observado
que a reconstituição das subpopulações de monócitos começa com um aumento
gradual da população clássica, seguida pelo surgimento da intermediária e
subsequentemente, pelos monócitos não clássicos (42). Além disso, estudos in vitro
mostraram que células hematopoiéticas se diferenciam primeiramente em monócitos
CD14++CD16-, que posteriormente adquirem a expressão de CD16 (43). Uma
confirmação para este achado é o fato dos genes de transcrição associados com
maturação aumentarem progressivamente a partir dos monócitos clássicos para
intermediários e posteriormente para a subpopulação não clássica (44,45).
Além das diferenças apontadas, as subpopulações de monócitos circulantes
respondem de forma distinta aos estímulos inflamatórios. Cros et al (2010)
demostraram que monócitos CD14++CD16- estimulados com LPS produzem CCL2,
IL-10, IL-8, reativos intermediários de oxigênio, mieloperoxidase e altas concentrações
de IL-6, enquanto a população CD14+CD16++ responde somente a ligantes de
TLR7/TLR8 com produção de TNF-α, IL-1β e IL-6 (40). No entanto, alguns autores
descreveram resultados diferentes mostrando produção maior de TNF-α por
monócitos CD14+CD16++ após estímulo com LPS (41,46). A resposta das diferentes
populações de monócitos a antígenos presentes na lesão aterosclerótica ainda não
Tendo em vista a heterogeneidade da população de monócitos, trabalhos foram
desenvolvidos na tentativa de associar a presença de determinado subtipo com
características clínicas presentes em pacientes com aterosclerose. De maneira geral,
a presença de fatores de risco, como hipercolesterolemia, obesidade e resistência à
insulina/diabetes estão associados com maior quantidade de células CD14++CD16+
(47-49). Pacientes com DAC estável ou instável apresentam aumento da população
de monócitos CD16+ (50,51). Estudo prospectivo recente mostrou que o aumento na
população de células CD14++CD16- foi capaz de predizer eventos cardiovasculares
em indivíduos com DAC de maneira independente de outros fatores de risco (52).
Além disso, foi possível observar alteração das populações de monócitos após infarto
agudo do miocárdio, com aumento das células CD14++CD16- em 3 a 4 dias, enquanto
que a população CD16+ aumenta posteriormente (53).
A análise fenotípica das subpopulações de monócitos também pode ser
realizada com base na expressão do receptor de angiopoetina do tipo 2 (Tie2) e SLAM
(54). Os monócitos Tie2+ representam cerca de 20% do total dessas células no sangue
circulante (55,56), com alta expressão de genes para MMP9, VEGF e TNF-α e são
associados com a angiogênese e crescimento tumoral (57,58). A angiogênese é um
processo frequente na placa aterosclerótica, uma vez que a crescimento da lesão gera
hipóxia local, o que resulta na infiltração de células inflamatórias promovendo assim a
formação de novos vasos através da ativação do receptor Tie2+ presentes nos
monócitos (59,60).
O marcador de superfície 6-sulfo LacNAc ou SLAM é uma modificação da
molécula do ligante da glicoproteína P-selectina-1 (PSGL-1) descrita recentemente,
expressa em cerca 30 a 50% dos monócitos circulantes de indivíduos saudáveis.
P-selectina, além de sua função na adesão dos monócitos, desempenha também um
importante papel na regulação da produção de citocinas por estas células (61).
Poucos estudos investigaram a expressão dos receptores Tie2 (62) e SLAM
em monócitos de pacientes com DAC.
A migração de monócitos do sangue periférico e sua posterior transformação
em macrófagos tem um papel crucial no desenvolvimento e complicações das lesões
de ateroma. Entretanto, a recente caracterização das diversas subpopulações de
monócitos e os dados conflitantes acerca da função e dinâmica de produção desses
grupos celulares justificam a realização de estudos que possam melhor
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivos Gerais
Quantificar e caracterizar as diferentes populações de monócitos circulantes
em pacientes com doença arterial coronariana.
2.2. Objetivos Específicos
1) Determinar a porcentagem e o número absoluto das diferentes populações
de monócitos circulantes (CD14++CD16-, CD14++CD16+ e CD14+CD16++) em amostras
de sangue periférico de pacientes com doença arterial coronariana (SCC e SCA) e
comparar com indivíduos controles com e sem fatores de risco.
2) Caracterizar as subpopulações de monócitos quanto a expressão de
receptores de quimiocinas (CCR2, CCR5, CX3CR1), receptores de reconhecimento
padrão (TLR2, TLR4, CD36), Tie-2 e SLAM.
3) Determinar a capacidade da subpopulação clássica de monócitos de
pacientes com doença arterial coronariana (SCC) e de indivíduos controles com e sem
fatores de risco em aderir a células endoteliais ativadas.
4) Avaliar a produção de mediadores após estimulação com antígeno presente
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Casuística e caracterização dos grupos experimentais
Cada indivíduo foi informado sobre sua participação na pesquisa, assinando
um termo de consentimento pós-informação, de acordo com as normas estabelecidas
pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Instituição (Plataforma Brasil, N°. do parecer
538.397, aprovado em 03/03/2014).
Dentre os pacientes dos Ambulatórios da Disciplina de Cardiologia e da
Unidade Coronariana do Hospital das Clínicas da UNICAMP, foram selecionados
homens e mulheres com idade variando entre 30 e 80 anos para a formação de quatro
grupos distintos a serem analisados. Para a formação do grupo IV também foram
selecionados pacientes do setor de Hemodinâmica do Hospital Samaritano de
Campinas.
Grupo I (Controle) - Indivíduos sem doença coronária e sem fatores de risco para aterosclerose compõem o grupo controle, de mesma média de idade que os demais
analisados (grupos II, III e IV).
Grupo II (Fator de Risco) - Pacientes sem doença coronária com fatores de risco para aterosclerose: pacientes sem história de doença coronariana, sem antecedentes
familiares de primeiro grau ou com teste de isquemia negativo ou com
cinecoronariografia sem lesões obstrutivas acima de 50% da luz. Os pacientes
apresentaram pelo menos um fator de risco dentre os quais: hipertensão arterial
sistêmica, diabetes mellitus, dislipidemia ou tabagismo.
Grupo III (Síndrome Coronariana Crônica) - pacientes com doença coronária crônica estabelecida: doença coronariana documentada através de cateterismo cardíaco com
pelo menos uma artéria coronária envolvida com obstrução acima de 50% da luz, teste
(laboratorial ou eletrocardiograficamente) ou revascularização cirúrgica, sem
episódios de eventos agudos ou mudança na classe funcional nos últimos seis meses.
Grupo IV (Síndrome Coronariana Aguda) – pacientes com síndromes coronárias
agudas com ou sem supradesnível de segmento ST: história de síndrome coronária
instável definida como pelo menos um episódio de angina de repouso durando mais
que 20 minutos nas 24 horas anteriores com alterações dinâmicas de segmento ST
>= 1mm, angina com hipotensão ou edema pulmonar sem elevação de marcadores
cardíacos.
Para os quatro grupos, os seguintes critérios de exclusão foram considerados:
a. Gravidez
b. Doença valvar significante
c. História de cirurgia ou trauma nas últimas 4 semanas
d. História de doença inflamatória aguda e crônica ou uso de imunossupressores nas últimas duas semanas
e. História de neoplasia
f. Insuficiência cardíaca congestiva ou miocardiopatia dilatada avançada g. Insuficiência renal crônica
3.2. Obtenção dos leucócitos totais de sangue periférico
Após a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), o
sangue periférico dos diferentes grupos de pacientes e grupo controle foi coletado
(30mL) em tubos contendo heparina sódica. Para remoção das hemácias, 2mL de
sangue total foi incubado com 10mL de tampão de lise de hemácias (NaCl 10mM;
durante 10 minutos a 4ºC. Os leucócitos periféricos foram ressuspendidos em 100µL
de tampão PBS-BSA-A (PBS-BSA 0,1%; azida sódica 0,2mM) e submetidos à
caracterização fenotípica por citometria de fluxo.
3.3. Citometria de fluxo para análise das populações de monócitos
Os leucócitos periféricos obtidos conforme descrito no item anterior foram
distribuídos em placa de 96 cavidades com fundo em U (20µL por cavidade). Para a
caracterização das diferentes populações de monócitos bem como expressão de seus
receptores foi adicionado um conjunto de anticorpos para marcação de superfície:
anti-CD14 PercP.Cy5, anti-CD16 APC, anti-CCR2 PE, anti-CX3CR1 FITC, anti-SLAM
FITC, anti-Tie2 PE, anti-CD36 FITC, anti-CCR5 PE, anti-TLR2 FITC, anti-TLR4 PE.
Os anticorpos foram diluídos em 20µL de PBS-BSA-A seguido de incubação por 30
minutos a 4ºC no escuro. Após este período foram adicionados 150 µL de PBS-B-A
com posterior centrifugação por 10 minutos a 1250 rpm a 4ºC. O sobrenadante foi
desprezado, as células ressuspendidas (vórtex), com adição de 200µL de tampão
PBS-B-A, seguido de nova centrifugação (10 minutos a 1200 rpm, 4ºC). Em seguida
as células foram ressuspendidas novamente e adicionado 200µL de formaldeído 2%
seguido de incubação à temperatura ambiente por 20 minutos. Após o tempo de
incubação as células foram transferidas para tubos apropriados e o volume
completado para 300µL. Para a quantificação absoluta de cada população celular,
utilizamos o kit comercial AccuCheck Counting Beads (LifeTechnology) de acordo com
as instruções do fabricante com posterior leitura em citômetro de fluxo (FACS Calibur – BD Bioscience). A análise dos resultados realizou-se em programa específico
(FCSExpress – De Novo Software), onde analisamos a porcentagem e a quantidade
3.4. Obtenção de células mononucleares do sangue periférico (CMSP)
As CMSP obtidas de indivíduos saudáveis (80 – 100mL) e pacientes (30-40mL)
foram obtidas do sangue periférico em tubos contendo heparina sódica. As amostras
foram centrifugadas sobre uma solução de ficoll-hypaque (densidade 1,077 - 400 g
por 30 minutos a temperatura ambiente), sendo as células mononucleares (anel sobre
a solução de ficoll-hypaque) transferidas para outros tubos tipo falcon de 15 mL. As
CMSP foram submetidas a duas lavagens com meio RPMI (300 g por 10 minutos a
4ºC) e ressuspendidas em meio RPMI 1640 suplementado (soro bovino fetal 10% +
L-glutamina [2mM] + gentamicina [5µg/mL]). As células foram quantificadas e
submetidas ao isolamento de monócitos.
3.5. Isolamento de monócitos
Utilizamos dois tipos de separação para realização dos experimentos in vitro:
seleção negativa e seleção positiva.
Para os experimentos de adesão, onde não pode ocorrer ativação prévia das
células, utilizamos seleção negativa a qual fornecia monócitos enriquecidos da
população clássica. Os monócitos foram isolados utilizando-se o kit Monocyte
Isolation Kit II (Miltenyi Biotec) de acordo com as instruções do fabricante.
Resumidamente, as CMSP foram ressuspendidas a uma concentração de 1x107
células em 80µL de tampão de separação PBS-B-E (PBS-BSA [0,5%] + EDTA [2mM])
e incubadas por 10 minutos a 4ºC, com uma mistura de anticorpos biotinilados
anti-CD3 (linfócitos T), CD7 (linfócitos T), CD16 (neutrófilos e células NK), CD19 (linfócitos
B), CD56 (células NK), CD123 (células dendríticas e basófilos) e CD235a (Glicoforina
A, eritrócitos). Após a incubação foi adicionado o anticorpo anti-biotina acoplado a
com PBS-B-E (300g, 10 minutos, 4ºC), as células foram ressuspendidas em 500µL de
tampão e passadas em coluna LD (Miltenyi Biotec) de separação magnética. A fração
não retida pela coluna (monócitos) foi coletada, centrifugada (300g, 10 minutos, 4ºC)
e ressuspendida em meio RPMI 1640 suplementado na concentração de 1x106
cél/mL. Os monócitos obtidos foram utilizados para os testes descritos no item 3.6.
Para os experimentos de estimulação com HSP60 o qual precisa ser realizado
na presença das três populações de monócitos, utilizamos seleção positiva. As CMSP
foram submetidas à separação positiva por meio da incubação com anticorpos
acoplados a esferas magnéticas (anti-CD14 - MACS, Miltenyi Biotec) seguindo as
instruções do fabricante. Resumidamente, as CMSP foram ressuspendidas a uma
concentração de 1x107 células em 160µL de tampão de separação PBS-B-E
(PBS-BSA [0,5%] + EDTA [2mM]) e incubadas por 15 minutos a 4ºC, com anticorpos
anti-CD14 acoplados a esferas magnéticas. Após lavagem com PBS-B-E (300g, 10
minutos, 4ºC), as células foram ressuspendidas em 500µL de tampão e passadas em
coluna LD (Miltenyi Biotec) de separação magnética. A fração retida pela coluna
(monócitos) foi coletada com o auxilio do tampão PBS-B-E, centrifugada (300g, 10
minutos, 4ºC) e ressuspendida em meio RPMI 1640 suplementado na concentração
de 1x106 cél/mL. Os monócitos obtidos foram utilizados para os testes descritos no
3.6. Avaliação da capacidade de adesão de monócitos ao endotélio ativado
3.6.1. Cultivo e manutenção de linhagem de células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs)
Para os experimentos de adesão de monócitos, foram utilizadas células
endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC - Invitrogen, Life Technologies)
cultivadas de acordo com as instruções do fabricante. As células foram expandidas
em garrafas de cultura de 75mm² com utilização de meio 200 (Invitrogen, Life
Technologies) em estufa de CO2 (5%) a 37ºC. Ao atingirem 80-90% de confluência,
as células foram coletadas com uso de tripsina-EDTA/inibidor de tripsina (Invitrogen),
centrifugadas (180g, 4°C, 7 minutos) e tiveram seu número e viabilidade
determinados, sendo novamente ressuspendidas em meio de cultura apropriado. As
células foram transferidas para placa com 6 cavidades e então incubadas em estufa
de CO2 (5%) a 37ºC, por 2 dias (tempo necessário para atingir novamente 90% de
confluência). Após esse período, as células foram submetidas a uma lavagem para
remoção das células não aderidas, foi adicionado meio 200 fresco e as células foram incubadas por 24 horas na presença ou ausência de 1ng/mL de TNF-α e/ou 1ng/mL
de IL-1β para promover ativação endotelial. Após esse período o meio foi removido,
as cavidades foram gentilmente lavadas com meio fresco para remoção das células
não aderidas e utilizadas para os testes de adesão.
3.6.2. Teste de adesão de monócitos
Para avaliar a capacidade de adesão de monócitos às células endoteliais
ativadas, os monócitos purificados, como descrito anteriormente, foram incubados nas
placas de 6 cavidades onde as células HUVECs foram cultivadas. As células foram
monócitos por poço). Após 1 hora de incubação a 37ºC em estufa de CO2 (5%), as
cavidades da placa foram lavadas gentilmente por 5 vezes (com meio de cultura a
37ºC) para desprender os monócitos não aderidos. Em seguida foi adicionado
tripsina-EDTA/inibidor de tripsina (Invitrogen) para coleta dos monócitos aderidos às HUVECs.
Com o auxílio do cell scraper, o conteúdo de cada cavidade foi removido e
centrifugado (300g, 10 minutos, 4ºC). Os monócitos aderidos às HUVECs foram
ressuspendidos em 100µL de tampão PBS-BSA-A (PBS-BSA 0,1%; azida sódica
0,2mM) e submetidos à quantificação por citometria de fluxo.
Para tal análise por citometria de fluxo, delimitamos um gate para os monócitos
baseado no tamanho (FSC) e granulosidade (SSC) (Figura 1A). Especial atenção foi
dada para a exclusão das HUVECs não aderidas. Feito isto, prosseguimos para a
identificação das populações de monócitos/HUVECs com base na expressão dos
receptores CD14 e CD 16 (Figura 1B).
Figura 1 - Análise por citometria de fluxo das subpopulações de monócitos aderidos às células endoteliais (HUVECs). A) Inicialmente foi realizado um dot plot de tamanho (FSC) por granulosidade
(SSC) para determinação do gate dos monócitos. Após isso outro dot plot foi criado (B) onde foi possível realizar a identificação das três subpopulações de monócitos com base na positividade para CD14 e CD16.
3.7. Avaliação da produção de citocinas após estímulo com HSP60 pela técnica de citometria de fluxo
Após o isolamento dos monócitos conforme descrito no item 3.5, estas células
foram mantidas em placa de 6 cavidades na concentração de 1X106 cél/mL em meio
de cultura RPMI 1640 suplementado. Estas células foram estimuladas com 5 µg/mL de HSP60 (heat shock protein 60 – Sigma Aldrich), e com 100ng/mL de LPS. Após a
estimulação as células foram incubadas por 18 horas em estufa a 37ºC com 5% de
CO2. Após este período, foi adicionado brefeldina A (10µg/mL - Sigma Aldrich) e então
as células foram incubadas nas mesmas condições descritas acima por mais 6 horas.
Terminada a incubação, as células foram retiradas da placa, e transferidas para
placa de 96 cavidades com fundo em U, lavadas com tampão PBS-BSA-A e
centrifugadas (300g, 10 minutos, 4ºC). Os monócitos foram então ressuspendidos no
mesmo tampão e foi adicionado uma mistura de anticorpos para marcação de
superfície (anti-CD14 PercP.Cy5 e anti-CD16 APC) diluídos em 20µL de PBS-BSA-A.
Após isso, foi feita uma incubação de 30 minutos a 4ºC no escuro, seguido de adição
de 150 µL de PBS-B-A com posterior centrifugação por 10 minutos a 1250 rpm a 4ºC.
O sobrenadante foi desprezado e as células ressuspendidas (vórtex) com adição de
200µL de formaldeído 2% seguido de incubação à 4ºC por 20 minutos. Em seguida
as células foram centrifugadas novamente (10 minutos a 1200 rpm, 4ºC) e lavadas
com tampão PBS-B-A com posterior centrifugação por 10 minutos a 1250 rpm a 4ºC.
Após a centrifugação, foi adicionado 150µL de tampão de permeabilização
(PBS-BSA(0,1%)-Azida sódica (0,2mM)) em cada cavidade, e as células foram
incubas por 10 minutos a 4ºC no escuro, seguido de centrifugação por 10 minutos a
1250 rpm a 4ºC. Após a centrifugação, foram adicionados anticorpos para marcação
CCL2 PE, TNF-α PE e IL-12p70 PE) diluídos em tampão de permeabilização e as
células foram incubadas por 30 minutos a 4ºC no escuro.
Após este período, foi adicionado 120 µL de tampão de permeabilização em
cada cavidade e a placa foi centrifugada por 10 minutos a 1250 rpm a 4ºC. O
sobrenadante foi descartado, as células foram ressuspendidas em PBS-BSA-A
seguida de nova centrifugação (10 minutos a 1200 rpm, 4ºC). Em seguida as células
foram ressuspendidas novamente e adicionado 200µL de formaldeído 2% seguido de
incubação à temperatura ambiente por 20 minutos. Após o tempo de incubação as
células foram transferidas para tubos apropriados e o volume completado para 300µL.
A leitura foi realizada em citômetro de fluxo (FACS Calibur – BD Bioscience) e a análise dos resultados realizou-se em programa específico (FCSExpress – De Novo
Software).
3.8. Análise estatística
A análise estatística foi realizada pelo programa GraphPad Prism, versão 6.00
para Windows (San Diego Califórnia, EUA).
A distribuição de variáveis contínuas foi avaliada para normalidade pelo teste
de Kolmogorov-Smirnov. As diferenças entre os grupos foram estimadas por meio do
teste One-way ANOVA com pós teste de Bonferroni ou Kruskal-Wallis com pós teste
de Dunn para dados com distribuição normal e não-normal, respectivamente.
Para comparação entre as variáveis dependentes com distribuição normal,
utilizamos o teste de Friedman com pós-teste de Dunn para múltiplas comparações.
A comparação entre variáveis categóricas foi realizada pelo teste Qui-quadrado. As
4. RESULTADOS
4.1. Caracterização dos grupos de estudo
Seguindo os critérios descritos no item 3.1, após a assinatura do termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE) o sangue periférico de 93 pacientes foi
coletado, sendo 16 do grupo controle (grupo I), 34 do grupo fator de risco (grupo II),
32 do grupo Síndrome Coronariana Crônica (grupo III) e 11 do grupo Síndrome
Coronariana Aguda (grupo IV).
As características clínicas e laboratoriais dos grupos estudados, descritas na
tabela 1, foram informadas pelos pacientes no momento da coleta de sangue e
Tabela 1 - Parâmetros clínicos e laboratoriais dos pacientes dos grupos experimentais. Grupo I Controle Grupo II Fator de Risco Grupo III Síndrome Coronariana Crônica Grupo IV Síndrome Coronariana Aguda Valor de p Número de Pacientes 16 34 32 11 Idade (média ± DP) 54,56 ± 8,24 59,32 ± 8,25 61,06 ± 8,93 55,0 ± 11,64 0,059 Sexo (H/M) 7/9 20/14 23/9 7/4 IMC 25,74 29,65 28,76 27,80 0,1179
Fatores de risco para doenças vasculares (%) Hipertensão 0 61,76 87,10 80,00 Diabetes 0 17,65 45,16 27,27 Tabagismo 0 11,76 16,13 63,64 Dislipidemia 0 94,12 90,63 81,82 Medicamentos (%) Anti-hipertensivo 0 60,00 96,88 80,00 Hipolipemiantes 0 56,67 81,25 70,00 Exames Laboratoriais Triglicérides (mg/dL) 100,69 ± 40,02 156,09 ± 66,9 153,27 ± 80,93 225,91 ± 186,47 0,0083 Colesterol Total (mg/dL) 181,81 ± 24,15 191,88 ± 42,3 158,17 ± 46,55 182,18 ± 41,07 0,0156 HDL-C (mg/dL) 57,0 ± 10,05 52,42 ± 16,8 51,30 ± 26,82 37,73 ± 8,15 0,0004 LDL-C (mg/dL) 104,38 ± 21,32 108,30 ± 36,5 92,40 ± 33,97 108,91 ± 31,59 0,2353 TRIG/HDL 1,91 ± 1,09 3,24 ± 1,60 3,62 ± 2,81 6,48 ± 5,93 0,001 Glicemia (mg/dL) 86,19 ± 8,09 115,03 ± 42,2 126,12 ± 50,08 130,64 ± 95,19 0,0001 PCR (mg/L) 1,75± 2,25 4,71 ± 6,97 1,91 ± 2,61 11,31 ± 8,59 0,0001
HDL-C – Lipoproteína de alta densidade; LDL-C – Lipoproteína de baixa densidade; PCR – proteína C reativa; H – Homem; M – Mulher; IMC – Índice de massa corpórea. Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn para múltiplas comparações.
Não encontramos diferença significativa entre os quatro grupos estudados
quanto a idade, índice de massa corpórea e concentrações séricas de LDL colesterol.
A proporção de integrantes do sexo masculino e feminino nos grupos I e IV foi similar,
O fator de risco para desenvolvimento de doença aterosclerótica mais frequente
nos grupos II, III e IV foi dislipidemia (94,12%, 90,63% e 81,82%, respectivamente).
Para a classificação de dislipidemia foram utilizados os valores referenciais do perfil
lipídico constantes na V Diretriz Brasileira de Dislipidemias e Prevenção da
Aterosclerose (Tabela 2) (63) e os pacientes que apresentaram um ou mais valores
superiores aos limites estabelecidos, bem como aqueles que fazem o uso de estatina
foram classificados como portadores de dislipidemia.
Tabela 2 - Valores referenciais do perfil lipídico segundo a V Diretriz Brasileira de Dislipidemias e Prevenção de Aterosclerose Lipídeos Valores (mg/dL) Colesterol Total ≥ 240 LDL-C ≥ 160 HDL-C < 40 Triglicérides ≥ 200
A hipertensão foi o segundo fator de risco mais frequente nos grupos II
(61,76%), III (87,10%) e IV (80%). No grupo IV também encontramos uma frequência
alta de indivíduos tabagistas (63,64%). Os indivíduos que compõem o grupo controle,
não apresentaram nenhum dos fatores de risco citados acima, com exceção da PCR
que apresentou uma média um pouco elevada (1,75 mg/L).
Diabetes foi o terceiro fator de risco mais frequente nos grupos II e III. A análise
dos níveis glicêmicos dos participantes mostrou diferenças significativas entre o grupo
controle e os grupos II e III (p=<0,0001 em ambas comparações).
Os medicamentos em uso foram agrupados em anti-hipertensivos e
angiotensina, inibidores da enzima conversora de angiotensina, β-bloqueadores e
bloqueadores de canal de cálcio foram agrupados como anti-hipertensivos, enquanto
que os hipolipemiantes incluíram os diferentes tipos de estatina. O uso de
anti-hipertensivos e hipolipemiantes foi maior nos indivíduos do grupo III (96,88% e 81,25%
respectivamente) e grupo IV (80% e 70% respectivamente). Os indivíduos do grupo
controle não faziam uso de nenhum destes medicamentos.
Com relação aos exames laboratoriais, quando analisado o perfil lipídico
encontramos diferença significativa entre grupos nas concentrações séricas de
triglicérides, colesterol total e HDL colesterol. Os grupos II e IV apresentam
concentrações plasmáticas significativamente maiores de triglicérides quando
comparado ao grupo I. O grupo III foi o que apresentou menor concentração
plasmática de colesterol total quando comparado aos outros, apresentando diferença
significativa na comparação com o grupo II. Os maiores níveis de HDL-C foram
encontrados no grupo controle comparado aos outros três grupos, apresentando
diferença significativa comparado ao grupo fator de risco e ao grupo síndrome
coronariana crônica.
A proteína C reativa, marcador inflamatório utilizado para avaliar risco
cardiovascular (64), foi significantemente maior (p<0.05) no grupo SCA em relação
aos grupos SCC, FR e controle.
Além da PCR, concentrações plasmáticas aumentadas de triglicérides e
diminuídas de HDL-C são relacionadas a aumento de risco cardiovascular (65).
Encontramos em nosso estudo um aumento gradativo na proporção TRIG/HDL entre
maiores valores no grupo SCA, com diferença significativa na comparação entre estes
dois.
4.2. Análise das subpopulações de monócitos
Para a análise das populações de monócitos, depois de realizados os
procedimentos descritos no item 3.3, foi delimitado um gate para os monócitos
baseado no tamanho (FSC) e granulosidade (SSC) (Figura 2A). As células presentes
na área delimitada foram então analisadas quanto a expressão dos receptores CD14
e CD 16 (Figura 2B).
Foi observada diferença significativa quanto a frequência das subpopulações
de monócitos circulantes nos indivíduos estudados (Figura 3). A frequência de
monócitos clássicos, ao redor de 80%, foi significativamente menor no grupo SCC
quando comparado ao controle (Figura 3A). A porcentagem de células com fenótipo
intermediário, ao redor de 5%, não diferiu entre os grupos (Figura 3B). Em relação a
população não clássica, foi observado um leve aumento da frequência de células nos
grupos FR e SCC quando comparado ao grupo controle, apresentando diferença
significativa entre os grupos C e SCC (Figura 3C).
A B
Figura 2 - Análise por citometria de fluxo das subpopulações de monócitos do sangue periférico. A) Inicialmente foi feito um dot plot de tamanho (FSC) por granulosidade (SSC) para
determinação do gate dos monócitos. A partir deste, foi feito um segundo (B) gate que permitiu a identificação de três subpopulações de monócitos com base na expressão de CD14 e CD16.
C o n t r o l e F R S C C S C A 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 A % c é lu la s C D 1 4 + +C D 1 6 -C lá s s ic a * C o n t r o l e F R S C C S C A 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 B % c é lu la s C D 1 4 + +C D 1 6 + In t e r m e d iá r ia C o n t r o l e F R S C C S C A 0 1 0 2 0 3 0 4 0 C % c é lu la s C D 1 4 +C D 1 6 + + N ã o C lá s s i c a *
Figura 3 - Frequência das subpopulações de monócitos do sangue periférico - A) Frequência de
monócitos clássicos (CD14++CD16-). B) Frequência de monócitos intermediários (CD14++CD16+). C)
Frequência de monócitos não clássicos (CD14+CD16++). FR= Fator de Risco. SCC= Síndrome
Coronariana Crônica. SCA= Síndrome Coronariana Aguda. As barras horizontais representam a mediana. Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn. *p<0.05
Um menor número absoluto de monócitos das populações clássica e
intermediária (Figura 4 B e C) foi observado no grupo SCC, seguindo o mesmo padrão
encontrado na análise dos monócitos totais (Figura 4A). Comparando-se os
pacientes, notamos um número maior das subpopulações clássica e intermediária de
monócitos no grupo SCA, comparado ao SCC. O mesmo foi observado em relação
aos monócitos totais. Já na população não clássica, não observamos diferença
C o n t r o l e F R S C C S C A 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 * * * * A M o n ó c it o s T o ta is /m L M o n ó c it o s T o t a is C o n t r o l e F R S C C S C A 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 * * * B C D 1 4 + + C D 1 6 -/ L C lá s s ic a C o n t r o l e F R S C C S C A 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 * * * * C C D 1 4 + +C D 1 6 +/ L In t e r m e d iá r ia C o n t r o l e F R S C C S C A 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 D C D 1 4 +C D 1 6 + +/ L N ã o C lá s s i c a
Figura 4 - Número absoluto de monócitos totais e subpopulações de monócitos do sangue periférico - A) Monócitos totais circulantes. B) Monócitos clássicos (CD14++CD16-). C) Monócitos
intermediários (CD14++CD16+). D) Monócitos não clássicos (CD14+CD16++). FR = Fator de Risco. SCC=
Síndrome Coronariana Crônica. SCA= Síndrome Coronariana Aguda. As barras horizontais representam a mediana. Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
4.3. Receptores de quimiocinas
Diversos trabalhos apontam para o importante papel das quimiocinas CCL2
(MCP-1), CCL5 (RANTES) e CX3CL1 (fractalquina) e seus respectivos receptores
CCR2, CCR5 e CX3CR1 no recrutamento de monócitos, promovendo o
desenvolvimento e progressão da aterosclerose (66).
Em nosso estudo, encontramos uma frequência elevada (ao redor de 100%) de
células positivas para CCR2 na subpopulação clássica de monócitos dos 4 grupos de
foi bastante elevada, principalmente no grupo SCA em relação aos grupos FR e SCC
apresentando diferença significativa em ambas as comparações. Da mesma forma, a
subpopulação de monócitos não clássicos positivos para CCR2 também foi mais
elevada nos pacientes SCA (Figura 5C).
C o n t r o le F R S C C S C A 9 0 9 5 1 0 0 1 0 5 A F r e q u ê n c ia d e c é lu la s C C R 2 + C lá s s ic a C o n t r o le F R S C C S C A 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 * * * B F r e q u ê n c ia d e c é lu la s C C R 2 + In t e r m e d iá r ia C o n t r o le F R S C C S C A 0 5 0 1 0 0 1 5 0 * * * * * C F r e q u ê n c ia d e c é lu la s C C R 2 + N ã o C lá s s i c a
Figura 5 - Frequência de células CCR2+ nas subpopulações de monócitos do sangue periférico
- A) Monócitos clássicos (CD14++CD16-). B) Monócitos intermediários (CD14++CD16+). C) Monócitos
não clássicos (CD14+CD16++). FR= Fator de Risco. SCC= Síndrome Coronariana Crônica. SCA=
Síndrome Coronariana Aguda. As barras horizontais representam a mediana. Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
Como a subpopulação clássica apresenta uma alta frequência de células
CCR2+, sem diferenças entre os grupos, avaliamos a Intensidade Média de
Entretanto, conforme pode ser visualizado na Figura 6, as medianas das IMF também
não foram diferentes entre os grupos.
C o n t r o le F R S C C S C A 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 IM F C C R 2 + C lá s s ic a
Figura 6 – Análise da Intensidade Média de Fluorescência (IMF) do receptor CCR2 nos monócitos dos diferentes grupos de estudo – População clássica de monócitos FR = Fator de Risco. SCC=
Síndrome Coronariana Crônica. SCA= Síndrome Coronariana Aguda. As barras horizontais representam a mediana. Teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn.
A distribuição de monócitos clássicos, intermediários e não clássicos CCR5+ foi
significativamente maior no grupo SCA comparado aos outros grupos (Figura 7A, B e
C). Embora a mediana do grupo controle tenha sido bem menor do que a dos demais,
a distribuição heterogênea não resultou em significância estatística em relação aos
C o n t r o le F R S C C S C A 0 5 0 1 0 0 1 5 0 A F r e q u ê n c ia d e c é lu la s C C R 5 + C lá s s ic a * * * * * * * C o n t r o le F R S C C S C A 0 5 0 1 0 0 1 5 0 B F r e q u ê n c ia d e c é lu la s C C R 5 + In t e r m e d iá r ia * * * * * C o n t r o le F R S C C S C A 0 5 0 1 0 0 1 5 0 C F r e q u ê n c ia d e c é lu la s C C R 5 + N ã o C lá s s i c a * * * * * * * * * *
Figura 7 - Frequência de células CCR5+ nas subpopulações de monócitos do sangue periférico
- A) Monócitos clássicos (CD14++CD16-). B) Monócitos intermediários (CD14++CD16+). C) Monócitos
não clássicos (CD14+CD16++). FR= Fator de Risco. SCC= Síndrome Coronariana Crônica. SCA=
Síndrome Coronariana Aguda. As barras horizontais representam a mediana. Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
De maneira geral a análise do receptor de fractalquina CX3CR1 mostrou uma
frequência maior de células positivas nos grupos FR, SCC e SCA no que se refere as
3 subpopulações de monócitos (Figura 8). Entretanto, as diferenças mais significativas
foram observadas na subpopulação não clássica, onde o grupo SCA apresentou
C o n t r o l e F R S C C S C A 0 5 0 1 0 0 1 5 0 A F r e q u ê n c ia d e c é lu la s C X3 C R 1 + C lá s s ic a * C o n t r o l e F R S C C S C A 0 5 0 1 0 0 1 5 0 B F r e q u ê n c ia d e c é lu la s C X3 C R 1 + In t e r m e d iá r ia C o n t r o l e F R S C C S C A 0 5 0 1 0 0 1 5 0 C F r e q u ê n c ia d e c é lu la s C X3 C R 1 + N ã o C lá s s i c a * * * * *
Figura 8 - Frequência de células CX3CR1+ nas populações de monócitos do sangue periférico - A) Monócitos clássicos (CD14++CD16-). B) Monócitos intermediários (CD14++CD16+). C) Monócitos não
clássicos (CD14+CD16++). FR= Fator de Risco. SCC= Síndrome Coronariana Crônica. SCA= Síndrome
Coronariana Aguda. As barras horizontais representam a mediana. Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn. *p<0.05, **p<0.01.
4.4. Receptores de reconhecimento padrão: TLRs e CD36
Várias linhas de evidência indicam o envolvimento dos receptores de
reconhecimento de padrão na identificação de produtos endógenos alterados
presentes nas lesões, promovendo a indução de inflamação e a formação das células
espumosas (8). Receptores do tipo Toll e receptores scavenger como CD36 são
capazes de iniciar as cascatas de sinalização que ativam múltiplos genes da resposta
Encontramos uma frequência mais elevada de monócitos TLR2+ nas três
subpopulações no grupo SCA comparado aos outros três grupos (Figuras 9A, B e C),
sendo as diferenças mais marcantes observadas na comparação entre o grupo
controle vs. SCA (Figura 9).
C o n t r o le F R S C C S C A 0 5 0 1 0 0 1 5 0 * * * * * * * A F r e q u ê n c ia d e c é lu la s T L R 2 + C lá s s ic a C o n t r o l e F R S C C S C A 0 5 0 1 0 0 1 5 0 B F r e q u ê n c ia d e c é lu la s T L R 2 + In t e r m e d iá r ia * * * * * * C o n t r o l e F R S C C S C A 0 5 0 1 0 0 1 5 0 * * * * * * * C F r e q u ê n c ia d e c é lu la s T L R 2 + N ã o C lá s s i c a
Figura 9 - Frequência de células TLR2+ nas populações de monócitos do sangue periférico - A) Monócitos clássicos (CD14++CD16-). B) Monócitos intermediários (CD14++CD16+). C) Monócitos não
clássicos (CD14+CD16++). FR= Fator de Risco. SCC= Síndrome Coronariana Crônica. SCA= Síndrome
Coronariana Aguda. As barras horizontais representam a mediana. Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
A frequência de monócitos clássicos TLR4+ também foi maior no grupo de
pacientes com SCA comparado aos grupos FR e SCC (Figura 10A). O mesmo
comportamento foi observado nas populações intermediária (Figura 10B) e não
C o n t r o le F R S C C S C A 0 5 0 1 0 0 1 5 0 * * * * F r e q u ê n c ia d e c é lu la s T L R 4 + A C lá s s ic a C o n t r o le F R S C C S C A 0 5 0 1 0 0 1 5 0 * * * * * F r e q u ê n c ia d e c é lu la s T L R 4 + B In t e r m e d iá r ia C o n t r o le F R S C C S C A 0 5 0 1 0 0 1 5 0 F r e q u ê n c ia d e c é lu la s T L R 4 + C N ã o C lá s s i c a * * * * * * * * *
Figura 10 - Frequência de células TLR4+ nas populações de monócitos do sangue periférico - A) Monócitos clássicos (CD14++CD16-). B) Monócitos intermediários (CD14++CD16+). C) Monócitos não
clássicos (CD14+CD16++). FR= Fator de Risco. SCC= Síndrome Coronariana Crônica. SCA= Síndrome
Coronariana Aguda. As barras horizontais representam a mediana. Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
A frequência de células CD36+ foi elevada (ao redor de 100%) nas populações
clássica e intermediária em todos os grupos estudados (Figuras 11A e B). Mesmo
assim foi possível notar diferenças significativas, com maior porcentagem de células
positivas no grupo SCA em relação ao controle na subpopulação clássica (Figura 11A)
e intermediária (Figura 11B). Na população não clássica foi possível distinguir 3
padrões de frequência da molécula: baixa porcentagem de células CD36+ nos
controles, frequência intermediária nos grupos FR e SCC, e maiores frequências em
