Caracterização de fatores de risco genéticos para o desenvolvimento de inibidores em pacientes com hemofilia A

ALINI CAMARGO TUCUNDUVA

CARACTERIZAÇÃO DE FATORES DE RISCO GENÉTICOS PARA O DESENVOLVIMENTO DE INIBIDORES EM PACIENTES COM HEMOFILIA A

CAMPINAS 2017

CARACTERIZAÇÃO DE FATORES DE RISCO GENÉTICOS PARA O DESENVOLVIMENTO DE INIBIDORES EM PACIENTES COM HEMOFILIA A

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências, área de concentração em Clínica Médica.

ORIENTADORA: PROFA. DRA. MARGARETH CASTRO OZELO

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA ALINI CAMARGO TUCUNDUVA,

E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. MARGARETH CASTRO OZELO.

CAMPINAS 2017

ALINI CAMARGO TUCUNDUVA

ORIENTADOR: PROFA. DRA. MARGARETH CASTRO OZELO

MEMBROS:

1. PROFA. DRA. MARGARETH CASTRO OZELO

2. PROFA. DRA. PAULA RIBEIRO VILLAÇA

3. PROFA. DRA. MARIA DE LOURDES RIOS BARJAS DE CASTRO

Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de

Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca

examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Dedico este trabalho à minha Família: meus pais, Francisco e Aparecida meus irmãos e cunhados, Patrícia, Marcelo, Edmar e Lilian. e meu namorado, Alex.

Agradeço a Deus pela sabedoria, inspiração e por me fortalecer nos momentos que mais precisei.

Ao meu namorado, Alex, pelo amor, enorme paciência e apoio em todos os momentos.

Aos meus pais, Francisco e Aparecida, pelo amor incondicional, carinho e incentivo.

Aos meus irmãos e cunhados, Patrícia, Marcelo, Edmar e Lilian pela amizade e por sempre estarem do meu lado diante de todas as situações.

Aos funcionários e alunos dos laboratórios do Hemocentro da Unicamp: Investigação Molecular e Celular, Hemostasia, Genoma e ImunoHemato, meus agradecimentos.

Em especial, à biomédica Ucha, que participou de forma ativa durante toda a execução deste projeto, obrigada pela ajuda, dedicação e ensinamentos.

E principalmente à minha orientadora, Profª. Drª. Margareth Castro Ozelo, muito obrigada pela confiança e pela oportunidade oferecida. Obrigada pela paciência, pelos sábios ensinamentos durante esses anos e pelo grande exemplo de empenho e dedicação à profissão.

Introdução: Hemofilia A (HA) é uma doença causada pela deficiência do fator VIII (FVIII) da coagulação, resultante de herança genética ligada ao cromossomo X. Uma das principais complicações associadas ao tratamento da HA consiste no desenvolvimento de inibidores, que são anticorpos direcionados contra o FVIII infundido. Fatores de risco genéticos e ambientais estão relacionados à susceptibilidade dos pacientes a desenvolver inibidores, porém, a razão pela qual apenas alguns pacientes o desenvolvem ainda não está clara e sugere que a formação de inibidores esteja relacionada a um complexo processo multifatorial. Objetivo: Avaliar a influência de fatores genéticos no desenvolvimento de inibidores ao FVIII em pacientes com HA grave de diferentes regiões do Brasil. Métodos: Os anticorpos inibitórios de FVIII foram detectados pelo método de Bethesda modificado; as inversões do íntron 22 (INV22) e 1 (INV1) no gene F8 pela técnica de PCR inversa (IS-PCR); mutações de ponto no gene F8 por sequenciamento automático e a genotipagem de polimorfismos em genes imunorregulatórios foi realizada pelo método de discriminação alélica por PCR em tempo real (RT-PCR) com a utilização de ensaios do tipo TaqMan®. Resultados: O diagnóstico de HA grave (FVIII:C <1%) foi confirmado para todos os 422 pacientes incluídos no estudo. A presença de inibidores (>0,6UB em no mínimo duas ocasiões) foi detectada em 97 dos 422 pacientes (22,9%), sendo que 82 (19,4%) foram classificados como inibidores de alta resposta (≥5UB). Ao considerarmos o risco de desenvolvimento de inibidor de acordo com o grupo étnico, pacientes negros com HA grave apresentaram 2,18 vezes maior risco para o desenvolvimento de inibidores ao FVIII quando comparados com caucasoides (OR=2,18; 95% IC 1,36-3,50). Enquanto que, descendentes de índios brasileiros se mostraram menos propensos em desenvolver inibidor (OR=0,12; 95% IC 0,01-0,90). Adicionalmente, a análise dos diferentes tipos de mutações no gene F8 mostrou, que o risco de inibidor foi maior entre pacientes com mutações do tipo nonsense e frameshift (OR=2,54; 95% IC 1,17-5,52 e OR=3,08; 95% IC 1,03-9,22, respectivamente) quando comparados com indivíduos com INV22, a causa mais frequente de HA grave. Em relação aos SNPs nos genes imunorregulatórios, a presença do genótipo -857CT no gene TNFA indicou aumento da susceptibilidade ao desenvolvimento de inibidores (OR=1,89; 95% IC 1,11-3,21). Enquanto que portadores dos genótipos -819TT e -592AA no gene IL10 e do

respectivamente). Conclusão: O estudo em diferentes populações é uma importante etapa para o entendimento dos fatores de risco para o desenvolvimento de inibidores. Esse foi um dos primeiros trabalhos realizados no Brasil incluindo pacientes de diversas regiões e analisando simultaneamente diferentes fatores e seu envolvimento com o desenvolvimento de inibidores. A caracterização desses fatores de risco poderá ajudar no futuro a determinar um tratamento diferenciado para o controle e, sobretudo para a prevenção do desenvolvimento de inibidores.

Introduction: Hemophilia A is a disease caused by deficiency of coagulation factor VIII (FVIII) resulting from genetic inheritance linked to chromosome X. Inhibitor to factor VIII development is the most important complication of hemophilia A (HA) treatment, and consist in antibodies directed against factor VIII infused. The risk factors for the development of inhibitor can be genetic and non-genetic (environmental), however, why only some patients develop inhibitors is not yet known and suggests that the formation of inhibitors is related to a complex multifactorial process. Objective: To assess the influence of genetic factors in the development of FVIII inhibitors in patients with severe hemophilia A from different regions of Brazil. Methods: FVIIIinhibitors were detected using modifiedBethesdaassay; Intron 22 and 1 inversions in gene F8 were genotyped by inverse shifting polymerase chain reaction (IS-PCR); F8 point mutations were detected by automated sequencing, and the SNPs in immune regulatory genes were genotyped using TaqMan® SNP Genotyping Assay Kit. Results: The severe hemophilia A (FVIII:C <1%) was confirmed for all 422 patients included in the study. The inhibitors (>0.6 UB/mL on at least two occasions) were detected in 97 of the 422 HA, and in 82 of these cases, the inhibitor was of the high-responding type (≥ 5 UB/mL). Considering the risk of development according to the ethnic group, black patients with severe hemophilia A are twice as likely as white patients to produce inhibitors against factor VIII protein (OR= 2.18; 95%CI, 1.36-3.50). While, descendants of brazilian indians were less likely to develop an inhibitor (OR=0.12; 95%CI 0.01-0.90). In addition, analysis of the different types of mutations in the F8 gene showed that the risk of developing anti-FVIII antibodies was higher among patients with nonsense and frameshift mutations (OR=2.54, 95%CI, 1.17-5.52 and OR=3.08, 95%CI, 1.03-9.22, respectively) compared with individuals with intron 22 inversion, the most frequent cause of severe HA. Regarding the studied SNPs (single nucleotide polymorphism) in immune regulatory genes, the results indicated increased susceptibility to inhibitors development in patients with the -857CT genotype in gene TNFA (OR=1.89; 95%CI 1.11-3.21). However, patients with the -819TT genotype and -592AA in the gene IL10 and "CG/CG" haplotype in gene TNFA are lower risk to develop inhibitors (OR=0.34; 95%CI 0.13-0.88 e OR=0.52; 95%CI 0.33-0.83, respectively). Conclusion: The study in different populations is important to understand the risk factors for the

development of inhibitors. The determination of these risk factors will help in the future to determine differential treatment for the control and in particular, for preventing the development of inhibitors.

Figura 1: Modelo celular da coagulação sanguínea. ... 22

Figura 2: Estrutura e ativação do Fator VIII ... 25

Figura 3: Estrutura do FVIII e suas interações ... 25

Figura 4: Representação do gene do FVIII humano (F8). ... 26

Figura 5: Representação da formação da inversão do íntron 22 do gene F8 (INV22)...27

Figura 6: Representação da formação da inversão do íntron 1 do gene F8 (INV1) ... ..27

Figura 7: Representação da resposta imune ao FVIII exógeno ... 32

Figura 8: Exemplo de cálculo para obtenção de título final de anticorpos inibidores de FVIII ... 43

Figura 9: Estratégia para detecção de mutações na hemofilia A ... 44

Figura 10: Resultados dos genótipos da INV22 pelo teste IS-PCR ... 49

Figura 11: Resultados dos genótipos da INV1 pelo teste IS-PCR ... 50

Figura 12: Gráfico de distribuição alélica exibido pelo programa 7500 System Software para o SNP rs1982037 ... 55

Figura 13: Distribuição dos pacientes com hemofilia A grave incluídos no estudo, de acordo com cada centro e região territorial de origem ... 57

Tabela 1: Relação de coleta de amostras dos pacientes para realização do estudo... 40 Tabela 2: Relação de primers para investigação das inversões do íntron 1 e 22 do gene F8 ... 48 Tabela 3: Genotipagem dos rearranjos envolvendo o íntron 22 de acordo com os produtos de amplificação por IS-PCR para os testes diagnóstico e complementar... 49 Tabela 4: Genotipagem da inversão do íntron 1 (INV1) de acordo com os produtos de amplificação por IS-PCR para o teste diagnóstico ... 50 Tabela 5: Sequência dos primers utilizados para o sequenciamento do gene F8... ... 51 Tabela 6: Detalhamento dos 12 ensaios TaqMan® selecionados para o estudo... ... 54 Tabela 7: Características clínicas dos pacientes com HA grave incluídos no estudo ... 58 Tabela 8: Total de mutações identificadas para os pacientes com HA grave desse estudo ... 60 Tabela 9: Risco de ocorrência de inibidor em relação ao tipo de mutação no gene F8...62 Tabela 10: Mutações específicas encontradas em pacientes com inibidor positivo...62 Tabela 11: Análise comparativa das frequências alélicas e genotípicas para o polimorfismo -308 G>A do gene TNFA entre o grupo de pacientes com e sem inibidores ... 63 Tabela 12: Análise comparativa das frequências alélicas e genotípicas para o polimorfismo -857 C>T do gene TNFA entre o grupo de pacientes com e sem inibidores ... 64 Tabela 13: Frequências dos haplótipos do gene TNFA para os dois grupos avaliados (inibidor positivo e negativo) ... 65

Tabela 15: Análise comparativa das frequências alélicas e genotípicas para o polimorfismo -819 C>T do gene IL10 entre o grupo de pacientes com e sem inibidores ... 66 Tabela 16: Análise comparativa das frequências alélicas e genotípicas para o polimorfismo -592 C>A do gene IL10 entre o grupo de pacientes com e sem inibidores ... 67 Tabela 17: Frequências dos haplótipos do gene IL10 para os dois grupos avaliados (inibidor positivo e negativo) ... 67 Tabela 18: Frequências dos haplótipos formados pelos SNPs -819 C>T e -592 C>A do gene IL10 para os dois grupos avaliados (inibidor positivo e negativo) ... 68 Tabela 19: Análise comparativa das frequências alélicas e genotípicas para o polimorfismo -745 C>T do gene IL5 entre o grupo de pacientes com e sem inibidores...69 Tabela 20: Análise comparativa das frequências alélicas e genotípicas para o polimorfismo +49 A>G do gene CTLA4 entre o grupo de pacientes com e sem inibidores ... 69 Tabela 21: Análise comparativa das frequências alélicas e genotípicas para o polimorfismo -318 C>T do gene CTLA4 entre o grupo de pacientes com e sem inibidores ... 70 Tabela 22: Análise comparativa das frequências alélicas e genotípicas para o polimorfismo -1616 T>C no gene INFG entre o grupo de pacientes com e sem inibidores ... 70 Tabela 23: Análise comparativa das frequências alélicas e genotípicas para o polimorfismo +869 C>T no gene TGFB1 entre o grupo de pacientes com e sem inibidores ... 71 Tabela 24: Análise comparativa das frequências alélicas e genotípicas para o polimorfismo -1135 G>A no gene HMOX1 entre o grupo de pacientes com e sem inibidores ... 71 Tabela 25: Análise comparativa das frequências alélicas e genotípicas para o polimorfismo -413 A>T no gene HMOX1 entre o grupo de pacientes com e sem inibidores ... 72

negros” ... 73 Tabela 27: Distribuições genotípicas dos polimorfismos 857 C>T no gene TNFA, -819 C>T e -592 C>A no gene IL10 de acordo com o grupo dos índios versus “não-índios” ... 73

APCs: Células apresentadoras de antígeno

BDD-rFVIII: Concentrado de fator VIII recombinante com domínio B deletado

(B-domain deleted recombinant FVIII)

CCPa: Concentrado de complexo protrombínico ativado

CD: Antígeno de superfície clones celulares (cluster differenciator)

CpG: Região rica em citosina e guanina

CTLA4: Antígeno associado ao linfócito T citotóxico

DNA: Ácido desoxirribonucléico

dNTPs: Deoxinucleotídeos trifosfatados

EDTA: Ácido etilenodiaminotetracético

FL: Fosfolipídios

F8: Gene do fator VIII

F8A: Gene A associado ao fator VIII F8B: Gene B associado ao fator VIII FVIII: Fator VIII da coagulação

FVIIIa: Fator VIII ativado

FVIII:C: Atividade coagulante do FVIII

FIX: Fator IX da coagulação

FX: Fator X da coagulação

FXa: Fator X ativado

HA: Hemofilia A

HO-1: Enzima Heme Oxigenase 1

HMOX1: Gene da enzima heme oxigenase 1 IgG: Imunoglobulina G

IL: Interleucinas

IFNG: Interferon-gama

ITI: Indução da imunotolerância

Int1h: Íntron 1 do gene do fator VIII

Int22h: Íntron 22 do gene do fator VIII

INV1: Inversão do íntron 1 do gene do fator VIII

INV22: Inversão do íntron 22 do gene do fator VIII

Kb: Quilobase

MHC: Complexo Principal de Histocompatibilidade (major histocompatibility complex)

M: Molar

mL: Mililitro

mM: Milimolar μL: Microlitro

pb: Pares de base

PBS: Tampão fosfato salina

pdFVIII: Concentrado de FVIII derivado de plasma humano

rcf: Força centrífuga relativa

rFVIII: Concentrado de fator VIII recombinante

rFVIIa: Fator VII recombinante ativado

RNAm: Ácido ribonucleico mensageiro

SNP: Polimorfismo de nucleotídeo único (single nucleotide polymorphism) TGFB1: Fator de crescimento transformante-beta 1

Th1: Célula T auxiliar 1 (T helper cell type 1)

Th2: Célula T auxiliar 2 (T helper cell type 2)

TNFA: Fator de necrose tumoral alfa

TTPa: Tempo de Tromboplastina Parcial ativada

UB/mL: Unidade Bethesda por mililitro

UV: Radiação ultravioleta

Xq: Braço longo cromossomo X

V: Volts

1. INTRODUÇÃO...20

1.1 Hemostasia...20

1.1.1 Coagulação sanguínea...20

1.2 Hemofilia A...22

1.2.1 Fator VIII (FVIII)...23

1.2.1.1 Gene do FVIII (F8)...26

1.2.1.2 Mutações no gene F8...28

1.3 Tratamento da Hemofilia A...29

1.4 Anticorpos inibidores de FVIII...29

1.4.1 Imunologia dos anticorpos anti-FVIII...30

1.4.2 Sítio de ação dos inibidores...31

1.4.3 Alternativas terapêuticas na presença de inibidores anti-FVIII...33

1.4.4 Fatores de risco para o desenvolvimento de inibidores de FVIII...34

1.5 Polimorfismos em genes imunorregulatórios...36

1.5.1 Citocinas...36

1.5.2 Heme Oxigenase (HO-1)...37

2. OBJETIVOS...38

2.1 Objetivo Geral ...38

2.2 Objetivos específicos ...38

3. CASUÍSTICA...38

4. METODOLOGIA...39

4.1 Determinação da atividade de FVIII plasmático para confirmação e classificação da hemofilia A...40

4.2 Determinação dos anticorpos inibitórios (inibidores) através do método de Bethesda modificado (Bethesda-Nijmegen)...41

4.2.1 Tratamento pré-quantificação...42

4.2.2 Quantificação dos anticorpos inibitórios de FVIII...42

4.2.3 Cálculo da atividade residual de FVIII e conversão para Unidade Bethesda (UB)...43

4.3 Estratégia para detecção de mutações associadas à hemofilia A grave...44

4.3.3 Determinação das mutações associadas à hemofilia A por sequenciamento

automático do gene F8...50

4.4 Identificação polimorfismos em genes imunorregulatórios...53

4.4.1 Genotipagem por PCR em tempo real (Ensaio TaqMan®)...53

4.5 Análise estatística...56

5. RESULTADOS...57

5.1 Dados demográficos dos casos incluídos ...57

5.2 Características clínicas dos pacientes incluídos no estudo...57

5.3 Identificação das alterações moleculares no gene F8...59

5.4 Mutações no gene F8 e o risco de ocorrência de inibidor anti-FVIII...61

5.5 Polimorfismos em genes imunorregulatórios...63

5.5.1 Análise dos polimorfismos no gene TNFA...63

5.5.2 Análise dos polimorfismos no gene IL10...65

5.5.3 Análise de polimorfismos nos outros genes imunorregulatórios (IL5, CTLA4, INFG, TGFB1, HMOX1)...68

5.6 Distribuição genotípica entre grupos étnicos...73

6. DISCUSSÃO...74

7. CONCLUSÃO...86

8. REFERÊNCIAS...87

1. INTRODUÇÃO

1.1. Hemostasia

A hemostasia é definida como uma sequência de fenômenos biológicos, que garantem a integridade tissular e vascular através da manutenção da fluidez do sangue, sem que ocorra extravasamento pelos vasos ou bloqueio do fluxo pela presença de trombos. Três etapas, definidas por sua capacidade de avaliação in vitro de cada mecanismo envolvido, são responsáveis por sua manutenção: hemostasia primária, hemostasia secundária (coagulação) e hemostasia terciária (fibrinólise) [1].

Quando ocorre uma lesão vascular, o próprio endotélio vascular, as plaquetas e as proteínas plasmáticas do processo de coagulação, são ativadas com a finalidade da formação e estabilização de um trombo composto por fibrina, plaquetas e hemácias no local da injúria vascular. Os anticoagulantes naturais atuam no controle da atividade dos fatores de coagulação, impedindo que a geração de trombina e de fibrina ocorra de forma excessiva. A fibrinólise desfaz gradualmente a rede de fibrina, permitindo que o fluxo sanguíneo se restabeleça normalmente ao longo do leito vascular, assim que completa a cicatrização do local da lesão endotelial [2].

A ativação e propagação inapropriada do sistema hemostático normal pode comprometer a integridade vascular e tissular. Os mecanismos envolvidos nesse processo devem ser regulados, para concomitantemente evitar a perda excessiva de sangue (hemorragia) e a formação de trombos intravasculares (trombose) [3].

1.1.1. Coagulação sanguínea

O mecanismo bioquímico da formação do coágulo de fibrina envolve complexas interações entre o endotélio vascular, as plaquetas e as proteases plasmáticas. Em 1964, Macfarlane e Davie & Ratnoff propuseram a hipótese de reações em “cascata” para explicar a fisiologia da coagulação do sangue [4,5]. Esse clássico modelo descreve uma sequência de reações envolvendo a ativação de fatores de coagulação ao longo de duas vias, extrínseca e intrínseca, as quais se encontram

em uma via comum, a partir da ativação do fator X (FX) [3,6]. Embora o modelo em "cascata" tenha representado um avanço significativo no estudo da coagulação sanguínea, observações experimentais e clínicas, nas últimas décadas, demonstraram que a hipótese da cascata não reflete completamente os eventos da hemostasia in vivo [7].

Atualmente, o conceito de “modelo celular” proposto por Hoffman em 2003 tem sido mais amplamente aceito para explicar a fisiologia do processo de coagulação. As alterações propostas pelo modelo atual são embasadas na principal falha do modelo anterior: não explicar por que os indivíduos com coagulopatias que apresentam apenas uma das vias afetadas, extrínseca ou intrínseca, não conseguem ter uma coagulação normal compensada pela via não afetada [8, 9].

No “modelo celular”, as vias extrínseca e intrínseca não atuam separadamente como no modelo de 1960, mas sim como complementos de uma única reação. O processo de coagulação do sangue é dividido em três etapas principais: iniciação, amplificação e propagação (Figura 1), e o modelo também propõe que os fatores pró-coagulantes ativados, devem ser mantidos no local da lesão para promover um controle eficaz sobre o processo [7].

Figura 1. Modelo celular da coagulação sanguínea. Representação esquemática das fases de iniciação, amplificação e propagação. As flechas indicam as reações de ativação dos fatores de coagulação, representada pela letra “a”. Adaptado de Vine, 2009 [8].

1.2. Hemofilia A

A hemofilia A (HA) é uma doença hemorrágica hereditária ligada ao cromossomo X caracterizada pela deficiência ou disfunção da glicoproteína plasmática denominada fator (F) VIII. A ausência ou diminuição da atividade do FVIII endógeno ocorre devido alterações no gene do FVIII (F8), e resulta em produção insuficiente de trombina para consolidação do coágulo de fibrina durante o reparo da lesão endotelial. A doença afeta quase que exclusivamente indivíduos do sexo masculino, enquanto que mulheres portadoras de um único alelo mutado são habitualmente assintomáticas[10].

A prevalência estimada da hemofilia A é de aproximadamente um caso a cada 5.000-10.000 nascimentos masculinos para todas as populações étnicas e

populações, devido um equilíbrio entre a perda de mutações, no caso de indivíduos com hemofilia que geram somente filhos do sexo masculino, e o aparecimento de

mutações espontâneas no gene do FVIII, casos “de novo” [12]. O Brasil é

considerado o quarto país no mundo com maior número de pacientes com hemofilia A, a prevalência nacional é em torno de 9.912 pacientes enquanto que a global chega a 151.159 pacientes [11,13].

De acordo com a Sociedade Internacional de Trombose e Hemostasia (International Society on Thrombosis and Haemostasis, ISTH), a hemofilia pode ser dividida em três diferentes categorias: grave, moderada e leve [14]. As características clínicas apresentadas por cada classe estão diretamente associadas à concentração de FVIII plasmático endógeno. Indivíduos com hemofilia A “grave” (aproximadamente 50% do total dos casos) possuem atividade coagulante do FVIII inferior a 1% do normal e podem apresentar hemorragias espontâneas ou após traumas leves; pacientes com hemofilia A moderada (cerca de 10% dos indivíduos; atividade do FVIII 1% a 5%) apresentam um fenótipo intermediário e podem manifestar sangramentos espontâneos, porém com menor frequência que os graves. Pacientes portadores da forma leve da doença, observada em 30% a 40% dos casos (atividade do FVIII entre 5% a 40%), apresentam sangramento após traumatismos fortes e/ou procedimentos invasivo-cirúrgicos [10,14].

1.2.1. Fator VIII (FVIII)

O fator VIII é uma glicoproteína plasmática principalmente sintetizada no fígado e circula no plasma na forma de um complexo não-covalente com o fator de von Willebrand (FvW). O FVIII é essencial para a coagulação sanguínea servindo como cofator para o fator IX ativado (FIXa), juntamente com fosfolipídios de membrana e íons cálcio para formação do complexo tenase, que por sua vez, atua enzimaticamente sobre o FX convertendo-o em sua forma ativada (FXa) [15].

Na sua forma inativa, a proteína do FVIII é constituída por seis domínios “A1-A2-B-A3-C1-C2”, totalizando 2.332 aminoácidos [16]. Os domínios A são flanqueados por pequenas regiões (a1, a2 e a3), os quais contêm clusters de resíduos de ácido

aspártico e glutamina, chamados de regiões acídicas [17]. A estrutura esquemática dos domínios do FVIII está representada na Figura 2A.

Sua maturação e secreção envolvem diversas modificações pós-tradução. O FVIII é formado intracelularmente como um heterodímero inativo de cadeia pesada (domínios A1a1A2a2-B) de 200kDa e cadeia leve (domínios a3A3C1C2) de 80kDa, associados por um íon metálico divalente [18,19]. Após a liberação na circulação, o heterodímero do FVIII interage com o FvW para formar um complexo fortemente ligado e não covalente, que protege o FVIII da degradação prematura e da endocitose, e favorece a clivagem do FVIII pela trombina [20].

Durante o processo de coagulação, os traços de trombina gerados na etapa de iniciação clivam o FVIII, formando um heterotrímero composto de duas cadeias pesadas (domínio A1 de 50-kDa e A2 de 43-kDa) e uma leve (fragmento A3-C1-C2 de 73-kDa) (Figura 2B). O FVIII é ativado pela trombina nos resíduos de Arg372 (a1) e Arg740 (a2) na cadeia pesada, e no resíduo Arg1689 (a3) na cadeia leve. Após ativação do FVIII, o domínio B é removido e a alteração conformacional da molécula do FVIII, o libera do complexo com FvW. As subunidades A1 e A3-C1-C2 são mantidas unidas por ligações metálicas e a associação da subunidade A2 com o dímero A1/A3-C1-C2 é mediada por interações eletrostáticas [20,21].

Os diferentes domínios do FVIII apresentam sítios de ligação para vários componentes do processo de coagulação (Figura 3) [17,21]. A região acídica a1 contém um sítio de ligação com o FX [22], o domínio A2 e A3 com o FIX [23, 24], o domínio C2 com fosfolipídios e a região acídica a3 e o domínio C2 com o FvW [25]. Uma vez que o domínio B não contém nenhum local essencial de interação com os elementos da coagulação, esse domínio ficou por muito tempo sem função conhecida [16]. No entanto, algumas evidências sugerem que o domínio B esteja envolvido no controle da qualidade da síntese do FVIII e na modulação de interações intermoleculares do FVIII com várias moléculas e substratos durante as várias fases de sua vida útil no plasma [26].

Figura 2. Estrutura e ativação do Fator VIII. A. Estrutura primária do FVIII e seus domínios. Os sítios de clivagem pela trombina são Arg 372 no sítio a1, Arg 740 no sítio a2 e Arg 1689 no sítio a3 (indicados pelas flechas vermelhas). B. O FVIII é lançado na circulação como um heterodímero com cadeia pesada (domínios A1a1A2a2-B) e cadeia leve (domínios a3A3C1C2), associados por um íon metálico divalente. Após a clivagem proteolítica pela trombina, o FVIII é ativado e forma um heterotrímero de duas cadeias pesadas (domínio A1 e A2) e uma cadeia leve (fragmento A3C1C2), e dissocia-se do fator de von Willebrand (FvW). Adaptado de Lavigne-Lissalde et al., 2009 [21].

Figura 3. Estrutura do FVIII e suas interações. Os domínios A2 e A3 são locais de ligação do fator IX (FIX); Fosfolipídios (FL) ligam-se ao FVIII através do domínio C2; Fator de von Willebrand (FvW) interage com o FVIII através da região acídica “a3” e do domínio C2, enquanto que a região “a1” contém um sítio de ligação para o fator X (FX). Figura original.

1.2.1.1. Gene do FVIII (F8)

O gene F8 está localizado no braço longo do cromossomo X (banda Xq28) e compreende uma região de 186 Kb, constituído por 26 éxons, separados por 25 íntrons (Figura 4). O RNA mensageiro (RNAm) possui 9 Kb [27].

O maior íntron é o 22 (int22h) com 32 Kb. Esta região contém uma ilha de nucleotídeos CpG (considerada ponto favorável para ocorrência de mutações; “hot spots”), situados a 10 Kb do éxon 22, que podem funcionar como regiões promotoras bidirecionais, caracterizando a existência de dois genes: F8A e F8B.

Figura 4. Representação do gene do FVIII humano (F8). O gene F8 formado por 26 éxons (representados por retângulos brancos) incluindo as regiões dos genes F8A (retângulo em cor vermelho) e F8B (retângulo em cor amarela), região não codificada representada por retângulos em cor cinza claro. Figura original.

O F8A possui 1,8 kb, não apresenta íntrons e é transcrito em direção oposta ao F8, já F8B é transcrito na mesma direção de F8 e possui 2,5 kb. As sequências de F8A e da ilha de CpG formam uma região de aproximadamente 9,5 kb denominada int22h-1. Esta sequência possui similaridade com duas cópias extragênicas, a cópia proximal em relação ao gene do F8 é denominada int22h-2, e a cópia distal int22h-3, localizadas em torno de 400-500kb anteriores a porção telomérica de F8 [28]. Aproximadamente 50% dos pacientes com hemofilia A grave possuem uma inversão parcial do F8 devido a uma recombinação homóloga intracromossômica entre a região int22h-1 e uma das duas outras regiões homólogas teloméricas (int22h-2 e int22h-3), representada na Figura 5 [29, 30].

Figura 5. Representação da formação da inversão do íntron 22 do gene F8 (INV22). A linha representa o DNA que está fora do gene F8. As setas indicam a orientação das sequencias int22h-1, int22h-2 e int22h-3. Por recombinação homóloga intracromossomal, uma destas regiões forma um cruzamento estrutural sobre o elemento correspondente no íntron 22, resultando na inversão de éxons 1-22 em relação aos éxons 23-26 do gene F8.

Outra mutação recorrente baseada em um mecanismo similar é identificada no íntron 1 (int1h), onde uma cópia de 1kb (int1h1) pode recombinar com uma região homóloga extragênica, localizada a aproximadamente 140 kb anteriores a porção telomérica de F8, denominada int1h2 (Figura 6) [31]. A frequência da inversão de sequências do íntron 1 do F8 (INV1), varia de 0 a 15% em pacientes com hemofilia A grave em diferentes populações [32].

Figura 6. Representação da formação da inversão do íntron 1 do gene F8 (INV1). A linha representa o DNA que está fora do gene F8. As setas indicam a orientação das sequencias int1h1 e int1h2. Os passos subsequentes representam a recombinação homologa entre as duas sequências int1h, explicando a inversão do íntron 1.

Ambos os rearranjos, inversão do íntron 22 (INV22) e do íntron 1 (INV1), impedem a formação completa do RNAm do gene F8 e consequentemente o produto resultante é uma proteína truncada. Assim, as inversões no gene F8 estão associadas com níveis indetectáveis de FVIII plasmático (<1%) e, portanto, com o fenótipo de hemofilia A grave. Acredita-se que a configuração específica do gene do FVIII bem como a sua localização no braço longo do cromossomo X, fazem desta região particularmente propensa a rearranjos, o que resulta na alta frequência desses eventos mutacionais recorrentes [33].

As outras mutações responsáveis pela hemofilia A são, na sua maioria, mutações de ponto no gene F8, o que dificulta o rápido diagnóstico molecular de portadores de hemofilia, devido ao grande número de análises a serem realizadas (varredura de todo o gene F8) para um único indivíduo para se chegar ao diagnóstico.

1.2.1.2. Mutações no gene F8

Os efeitos das mutações no F8 podem ser (1) espaciais, causando torções em segmentos de cadeias da proteína ou introduzindo impedimento estérico entre resíduos adjacentes; ou (2) criando novas ou destruindo pontes de hidrogênio, pontes dissulfeto ou ligações iônicas [34]. Esses efeitos podem afetar os sítios de interações do FVIII com outros fatores, como FvW, FIX, FX ou com os fosfolipídios, impedir à ativação pela trombina, ou ainda modificar o processamento proteolítico da proteína, o dobramento correto, as modificações pós-traducionais ou a secreção.

Segundo o banco de dados online de mutações para hemofillia A, Factor VIII (F8) Variant Database, existem 2.015 diferentes mutações que resultam em hemofilia A grave, moderada ou leve [35]. Sabe-se que pacientes que apresentam a forma leve e moderada da doença, normalmente apresentam mutações mais brandas no gene F8 quando comparados com indivíduos que apresentam a forma grave. O banco de dados inclui a descrição de 1.341 mutações pontuais, as quais resultam em mudança de aminoácido na sequência original (mutação de sentido trocado; “missense”), criam códons de parada (mutação sem sentindo; “nonsense”) ou ainda dão origem a um processamento do RNAm alterado ou ausente. Além dessas, são

descritas 468 grandes deleções (acima de 50bp) que frequentemente estão associadas à forma grave da doença, assim como as inversões dos íntrons 22 e 1 [35, 36].

Em uma revisão e estudo de meta-análise realizada em 2012, Gouw et al. [37] analisaram mutações no gene do FVIII em 5.383 pacientes com hemofilia A grave. Os resultados mostraram que 3% dos pacientes com HA grave apresentam grandes deleções, 10% mutações tipo nonsense, 45% inversão do íntron 22, 2% inversão do íntron 1, 16% pequenas deleções ou inserções, 15% mutações missense e 3% mutações em sítio de splicing. Em 4,6% de pacientes estudados, a mutação não foi encontrada.

1.3. Tratamento da Hemofilia A

Atualmente, o tratamento clássico dos pacientes com HA envolve a terapia de reposição do FVIII através de concentrados de FVIII purificados do plasma de doadores (pdFVIII) ou de maneira mais segura, sem o risco de contaminação por infecções transmitidas por transfusões sanguíneas, o uso de produtos recombinantes (rFVIII) [38]. No entanto, uma limitação relacionada à reposição deste fator deficiente é a meia-vida baixa (10 a 12 horas) do FVIII. A infusão frequente a cada 2 a 3 dias é necessária para manter níveis adequados de FVIII no plasma evitando assim, episódios hemorrágicos [39]. Além disso, outra dificuldade do tratamento é o desenvolvimento de anticorpos capazes de neutralizar a função coagulante do FVIII exógeno administrado, os chamados inibidores [38, 40]. A presença dos inibidores prejudica a indução da hemostasia terapêutica a partir da reposição do concentrado de FVIII, dificultando o controle dos episódios hemorrágicos [41].

1.4. Anticorpos inibidores de FVIII

Os inibidores são aloanticorpos neutralizadores da atividade coagulante do FVIII desenvolvidos por pacientes com HA. Ocorrem em cerca de 20 a 30% dos portadores de HA grave e de 10 a 15% dos portadores da forma leve ou moderada da doença [42,43].

A presença do inibidor é classicamente titulada através do método conhecido como ensaio de inibidor Bethesda, descrito por Kasper e colaboradores em 1975, posteriormente modificado pelo protocolo de Nijmegen [45]. Por definição, uma unidade Bethesda (UB) corresponde à quantidade de anticorpos inibidores circulantes capazes de neutralizar 50% da atividade de FVIII plasmático existente em 1mL de plasma normal. Os inibidores podem ser classificados segundo o título de anticorpos circulantes e a resposta anamnéstica. Indivíduos com > 5UB são considerados portadores de alto título de inibidores e aqueles com valores ≤ 5UB, portadores de baixo título [45]. Os altos títulos de inibidores podem permanecer por vários meses, mesmo se o paciente interromper a exposição ao FVIII ou se elevarem a níveis superiores a 5 UB quando expostos à novas infusões de FVIII, caracterizando um quadro de inibidor de alta resposta. Alternativamente, o quadro de inibidor de baixa resposta é marcado pela persistência de título dos inibidores ≤ 5 UB, apesar de constante estímulo com o fator deficiente [46].

1.4.1. Imunologia dos anticorpos anti-FVIII

O sistema imune desenvolve tolerância a antígenos “próprios” durante a fase neonatal e a primeira infância. A ausência da proteína do FVIII em pacientes com HA impede o reconhecimento do FVIII como próprio e o desenvolvimento de tolerância. Como consequência, o FVIII exógeno usado na terapia de reposição é reconhecido pelo sistema imune como proteína estranha ao organismo e, portanto, durante o tratamento alguns pacientes acabam por desenvolver anticorpos anti-FVIII [47, 48].

A resposta do sistema imune à terapia de reposição de FVIII está associada ao desenvolvimento de uma resposta imune clássica, onde o FVIII exógeno é transportado para os órgãos linfoides secundários (baço e linfonodos) [49] e nesses locais, as células apresentadoras de antígenos (APCs), tais como as células dendríticas, são ativadas e reconhecem o antígeno (proteína do FVIII), que sofre endocitose e então é processado em peptídeos de 9 a 14 aminoácidos [50]. Estes peptídeos de FVIII são apresentados pelas células dendríticas aos linfócitos T CD4+ via moléculas do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) de classe II. Cada molécula MHC permite a ligação de um único peptídeo. O reconhecimento do

peptídeo pelas células T requer a interação dos receptores específicos das células T (TCR), e de sinais coestimulatórios (CD40 e CD40 ligante), (CD80/86 e CD28), representados na Figura 7 [50, 51]. Na presença de ambos os sinais, ocorre ativação do linfócito T, que pode se diferenciar em célula T auxiliar 1 (Th1), responsável pela secreção de citocinas pró-inflamatórias, como interferon-gama (IFNG), fator de necrose tumoral-alfa (TNFA) e interleucina-2 (IL-2), que facilitam o estabelecimento de uma resposta imune que favorece a ativação das APCs e estimulam as células B a se diferenciarem em células produtoras de anticorpos, como IgG1 e IgG2 e ainda em células B de memória; e em células T auxiliares 2 (Th2), que por sua vez, produzem citocinas anti-inflamatórias/reguladoras, como interleucina-4 (IL-4), interleucina-10 (IL-10), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6) e fator de crescimento transformante-beta (TGFB), que reduzem a intensidade da resposta imune através da regulação da ativação das APCs e das células Th1, além de estimularem células B a se diferenciarem em células produtoras de anticorpos, como IgG4 e ainda em células B de memória [52, 53].

1.4.2. Sítios de ação dos inibidores

Os mecanismos de ação dos anticorpos anti-FVIII ainda não são completamente conhecidos. Porém, sabe-se que os inibidores atuam de modo a bloquear os sítios de interações da proteína do FVIII ou neutralizar a atividade pró-coagulante do FVIII infundido.

 Anticorpos que se ligam ao domínio A2 do FVIII causam impedimento estérico do sítio de clivagem pela trombina, localizado entre os domínios A1 e A2, o que promove redução no nível de FVIII ativado no plasma [54,55].

 Anticorpos dirigidos contra o domínio A3 impedem a ligação do FVIII ao FIX [56].

 Anti-FVIII que se ligam ao domínio C2 impedem a ligação do FVIII aos fosfolipídios de membrana, bem como ao FvW, visto que esse domínio apresenta sítios para ambas as ligações [57].

 Inibidores do FVIII podem se ligar aos epítopos formados pela associação do FVIII e FvW, e impedir sua liberação quando clivado pela trombina [58,59].

Em 2009, em um estudo realizado por Whootla et al. [60], também foi verificado a presença anticorpos anti-FVIII da classe IgG com atividade proteolítica em pacientes com hemofilia A. Demonstrando que a resposte imune ao FVIII abrange diferentes mecanismos de ações que resultam em baixa sobrevida do fator infundido no plasma.

Figura 7. Representação da resposta imune ao FVIII exógeno. A proteína do FVIII é endocitada pelas células apresentadoras de antígenos (APCs), que a processa em peptídios e os apresenta as células T CD4+ via MHC de classe II. O reconhecimento do peptídeo pelas células T requer a interação dos receptores específicos das células T (TCR), e de sinais coestimulatórios (CD40 e CD40 ligante), (CD80/86 e CD28). Na presença de ambos os sinais, ocorre ativação do linfócito T, que pode se diferenciar em célula T auxiliar 1 (Th1), responsável pela secreção de interferon-gama (IFNG), fator de necrose tumoral-alfa (TNFA) e interleucina-2 (IL-2); e em células T auxiliares 2 (Th2), que produzem citocinas como interleucina-4 (IL-4), interleucina-10 (IL-10), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6) e fator de crescimento transformante-beta (TGFB). As citocinas secretadas pelas células Th1 e Th2, estimulam o crescimento e a diferenciação das células B em plasmócitos produtores de anticorpos anti-FVIII e em células B de memória. Figura original.

1.4.3. Alternativas terapêuticas na presença de inibidores anti-FVIII

O tratamento de hemorragias em pacientes graves com inibidores de baixa resposta (título de inibidor persistentemente ≤ 5 UB, apesar de constantes/repetidos estímulos com o fator deficiente), envolve o uso de altas doses de FVIII, dose suficiente para neutralizar os inibidores circulantes e para controlar o episódio hemorrágico. Para os pacientes com inibidores de alto título (> 5 UB), devido à uma resposta hemostática ineficaz à terapia de reposição com o concentrado do fator deficiente, faz-se necessário o uso de produtos que possuem a capacidade de gerar trombina independente de FVIII, os chamados agentes de bypass, como o concentrado de complexo protrombínico ativado (CCPa) e o fator VII ativado recombinante (rFVIIa) [61].

O uso de derivados de CCPa estimula a formação de coágulos cessando os eventos hemorrágicos; porém, em alguns casos pode causar estímulo excessivo pró-coagulante, e por ser derivado de plasma humano, pode ainda conter traços em sua composição de FVIII, resultando em 20% dos casos, resposta anamnéstica com a produção de anticorpos contra o FVIII [62]. No caso da administração de rFVIIa, devido sua meia-vida baixa, há a necessidade de várias doses a cada 2 a 4 horas. Esses produtos são de alto custo e de limitada disponibilidade [63].

O tratamento de indução de imunotolerância (ITI) é a única terapia atualmente disponível capaz de erradicar a presença do inibidor. Esse tratamento é baseado na administração frequente de altas doses de concentrado do FVIII associado ou não a medicamentos imunossupressores, na tentativa de estabelecer uma tolerância do paciente à proteína do FVIII [62]. Os mecanismos exatos de indução da tolerância ainda não foram completamente elucidados, contudo, o conceito geral é baseado na teoria de que frequentes doses de FVIII contribuirão para diminuição da resposta imune ao FVIII infundido, através da eliminação de células efetoras por processos de ativação e exaustão celular [64]. As limitações sobre o tratamento de ITI são relacionadas ao alto custo e à necessidade de infusões endovenosas frequentes, o que pode representar um problema, sobretudo para as crianças. Além disso, é menos provável que pacientes com altos títulos de inibidores apresentem sucesso [65].

1.4.4. Fatores de risco para o desenvolvimento dos anticorpos inibitórios de FVIII

Os determinantes da formação de inibidores em pacientes com hemofilia A grave são individualmente variáveis e muito mais complexos do que se pode ser descrito por uma meta-análise. É surpreendente que nem todos os pacientes, com ausência de FVIII endógeno circulante, formam anticorpos quando expostos ao fator deficiente e apenas alguns reagem deste modo. Apesar da etiologia dos inibidores de FVIII ainda não estar totalmente compreendida, acredita-se que existam interações entre a predisposição genética e condições ambientais ou exógenas que estejam associadas ao risco de desenvolvimento de inibidores em paciente com hemofilia A. Entre os fatores genéticos, o tipo de mutação no gene F8, a etnia, a história familiar quanto a inibidores, o genótipo MHC classe II e polimorfismos em genes imunorregulatórios parecem estar envolvidos [50,66-69]. Características do tratamento (tipo e pureza do concentrado de FVIII utilizado), idade de início do tratamento, intensidade do tratamento e infecções associadas estão entre os fatores não-genéticos [70-73].

O tipo de mutação no F8 é o fator genético que possivelmente mais influencia no desenvolvimento de inibidores. O grupo de pacientes com maior risco de produzir inibidores é aquele em que os indivíduos apresentam maiores alterações no gene F8, tais como mutações nonsense, grandes deleções ou inversões, provavelmente devido à ausência de FVIII circulante e à falta de aquisição da tolerância imunológica. Nesses casos, o sistema imune do paciente pode ser exposto a epítopos adicionais de FVIII mediante terapia de reposição. Portanto, podem vir a desenvolver anticorpos específicos contra a molécula do FVIII exógena. A incidência deve ser menor em pacientes cuja mutação no F8 ainda permita que certa quantidade de FVIII esteja presente na circulação, como nas mutações missense, pequenas deleções e mutações em sítio de splicing, consideradas de baixo risco para o desenvolvimento de inibidores [50].

Entre os fatores de risco não genéticos, o mais controverso é o risco de desenvolver inibidor frente ao tipo de FVIII administrado, derivado do plasma (pdFVIII) ou recombinante (rFVIII) [71, 74 e 75].

Em uma revisão e estudo de meta-análise realizada em 2010, Iorio et al. [75] destacaram que não era possível ainda provar ou afastar a hipótese de que havia um maior risco de desenvolvimento de inibidor associado ao uso do rFVIII quando comparado com o uso dos concentrados de fator VIII derivados de plasma em pacientes não previamente tratados.

Recentemente, o estudo SIPPET (Survey of Inhibitors in Plasma-Products Exposed Toddlers), incluindo 303 pacientes com hemofilia A evidenciou um aumento do risco do desenvolvimento de inibidores nos pacientes previamente não tratados (PUP) que utilizaram concentrado de rFVIII, quando comparados aos que utilizaram concentrado de fator VIII derivado de plasma (incidência cumulativa de 44,5% vs. 26,7%, respectivamente) [76]. No entanto, um estudo realizado com 377 pacientes com HA mostrou que o grau de pureza dos concentrados derivados de plasma influencia o desenvolvimento de inibidor, independentemente de outros fatores de risco, sendo que o uso de pdFVIII de alta pureza foi associado a uma maior incidência cumulativa de inibidor quando comparado com o uso de pdFVIII de baixa e intermediária pureza [77].

Aledort et al. [78] evidenciaram em uma meta-análise envolvendo mais de 3000 pacientes previamente tratados que a exposição ao concentrado de fator VIII recombinante com o domínio B deletado (BDD-rFVIII) foi associada a uma elevação estatisticamente significativa na ocorrência de inibidores. Recentemente, em um estudo de coorte holândes realizado por van den Berg al. [79], foi verificado aumento do diagnóstico de inibidores em 20 anos de tratamento de pacientes com HA (19,5% na década de 1990, quando comparados com 30,9% na década de 2000), porém os resultados indicaram que esse aumento foi devido ao diagnóstico de inibidores de baixo título e não mostraram correlação com o tipo de concentrado de FVIII utilizado.

A maioria, mas não todos os pacientes que desenvolvem inibidores o fazem no início da vida, após um número médio de 9 a 12 tratamentos com o fator exógeno. Entretanto, não há nenhuma idade provável ou número de tratamentos realizados que tornam um indivíduo completamente seguro ao risco de desenvolver inibidor [80]. Alguns estudos revelaram que em cirurgia ou exposição prolongada (5 dias ou mais) ao FVIII no primeiro tratamento, e altas doses durante os primeiros 50 dias de

exposição ao FVIII exógeno, há aumento de 2 a 3 vezes no risco de desenvolver inibidor [74, 81].

1.5. Polimorfismos em genes imunorregulatórios

1.5.1. Citocinas

As citocinas são proteínas ou glicoproteínas responsáveis pela modulação da resposta imune diante de uma variedade de estímulos. Atuam como fatores de crescimento de linfócitos primários, como moléculas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias, e desempenham papel fundamental no deslocamento de linfócitos. Os níveis de citocinas e consequentemente a modulação da resposta imune, variam de acordo com a predisposição genética de cada indivíduo [82]. Sabe-se que polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) encontrados em regiões gênicas não-codificantes (íntrons) ou em regiões reguladoras/promotoras de citocinas podem alterar a capacidade de transcrição gênica e, consequentemente sua produção local ou sistêmica. Alterações na expressão das citocinas podem ter consequências patológicas, como por exemplo, conduzir o indivíduo a doenças crônicas, promover um aumento no risco de infecções ou alterar o curso de uma doença aguda [82,83].

Na última década, vários estudos investigaram a associação de SNPs em genes da

IL-10, IL-5, TNFA, CTLA4, INFG, TGFB1, entre outros, com o desenvolvimento de

inibidores em paciente com HA grave [84-88]. Os genes que codificam IL-10 e TNFA

foram os primeiros genes, além do gene do FVIII, a serem associados à produção de inibidores do FVIII na HA, sugerindo que a secreção dessas citocinas pode ter um impacto considerável no contexto da resposta imune ao FVIII [84,86].

Hu et al. [53] e Chaves et al. [89] sugerem inclusive que um perfil de citocinas pró-inflamatórias estaria relacionado a uma resposta imune inicial ao FVIII e que a conversão para um perfil de citocinas anti-inflamatórias/reguladoras representaria um ponto decisivo para o desenvolvimento de anticorpos da subclasse IgG4 com atividade inibitória de FVIII.

1.5.2. Heme Oxigenase (HO-1)

A Heme Oxigenase 1 (HO-1) é uma potente enzima antioxidante e anti-inflamatória que age na quebra do anel porfirínico do heme para produzir biliverdina, numa reação que são liberados ferro livre e monóxido de carbono em quantidades equimolares [90]. A indução da HO-1 pode resultar na modulação negativa do processo inflamatório, com a diminuição da expressão de citocinas como TNFA, IL-6, IL-1B, concomitante a níveis aumentados da citocina imunomoduladora IL-10 [91].

Mais recentemente, em estudo realizado com camundongos com deficiência de FVIII, a administração intravenosa de hemina (forma oxidada do heme), indutor de HO-1, antes da reposição terapêutica de FVIII resultou em uma diminuição drástica nos níveis de inibidores anti-FVIII comparados com camundongos tratados com PBS (tampão fosfato-salino, “phosphate buffered saline”). Portanto, deficiências na expressão da HO-1 podem ter relação com efeitos negativos no tratamento de reposição do FVIII ou até mesmo prejudicar na terapêutica da indução de HO-1 em pacientes que apresentam inibidores [92].

2. OBJETIVOS

2.1. Geral

Avaliar o risco de fatores genéticos para o desenvolvimento de inibidores em pacientes com diagnóstico de hemofilia A grave, pertencentes às cinco regiões geográficas do Brasil.

2.2. Específicos

a) Verificar se há associação entre as etnias e o risco de desenvolvimento de inibidores anti-FVIII nessa população.

b) Avaliar o risco de pacientes com história familiar apresentarem inibidor positivo.

c) Identificar mutações no gene F8 e 12 polimorfismos nos genes imunorregulatórios: IL10, IL5, INFG, TGFB1, TNFA, CTLA4 e HMOX1.

d) Avaliar a associação das mutações no gene F8 e dos polimorfismos em genes reguladores da resposta imune com a produção de inibidores de FVIII.

3. CASUÍSTICA

Foram convidados a participar desse estudo, pacientes portadores de hemofilia A grave, provenientes de seis centros distintos, representantes de cada uma das cinco regiões territoriais do Brasil, incluindo o Hemocentro do Acre (Hemoacre), Rio Branco-AC, região Norte; Hemocentro da Bahia (Hemoba), Salvador-BA, região Nordeste; Hemocentro do Mato Grosso (Hemomat), Campo Grande-MT, região Centro Oeste; Hemocentro do Paraná (Hemepar), Curitiba-PR, região Sul; Hemocentro do Espírito Santo (Hemoes), Vitória-ES e Hemocentro da UNICAMP, Campinas-SP, região Sudeste.

O presente trabalho faz parte de um estudo multicêntrico (EMBIH-Estudo Multicêntrico Brasileiro de Inibidores em Hemofilia) que envolve a participação desses seis centros de tratamento de hemofilia do Brasil, coordenado pela Unidade de Hemofilia do Hemocentro da Unicamp em Campinas-SP.

Para cada caso incluído foi preenchido um questionário de identificação (Anexo 1: Questionário de identificação). Entre os dados demográficos, um dos principais critérios analisados nesse estudo foi a definição do grupo étnico. A classificação étnica foi considera a partir de características genéticas e fenotípicas, não sendo incorporados aspectos sócio-culturais. Portanto, foi adotado nesse estudo dois critérios de inclusão entre as informações preenchidas no questionário de inclusão: traços físicos e principalmente a ancestralidade, tendo sido considerado pertencente à etnia negra o paciente que possuía pelo menos um ascendente negro ao longo das três últimas gerações; no caso do grupo indígena, foi considerado antecedente do índio brasileiro o paciente que possuía pelo menos um antepassado indígena ao longo das três últimas gerações e nenhum negro; e a classificação para caucasoide, foi considerada quando o paciente não possuía ascendentes negros ou indígenas ao longo das três últimas gerações.

4. METODOLOGIA

Após a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 2), aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp, parecer N°829.390 (Anexo 3), amostras dos pacientes selecionados para este estudo foram coletadas. Em média foram coletados dois tubos de 4,5 mL de sangue em citrato de sódio e em EDTA, em um volume total de aproximadamente 18 mL de sangue total, de acordo com idade, peso do paciente e momento da avaliação. A finalidade para coleta de amostras do estudo está resumida na Tabela 1.

Tabela 1: Relação de coleta de amostras dos pacientes para realização do estudo.

Volume (mL) Tubo Finalidade Testes

9 Citrato de

sódio 3,2% Plasma

1. Avaliação atividade de FVIII plasmático 2. Quantificação de inibidor

9 EDTA 10% DNA 3. Investigação mutação gene F8

4. Polimorfismos em gene imunorregulatórios

As amostras em tubo de citrato de sódio 3,2% foram centrifugadas a 1.726 rcf por 15 minutos em temperatura ambiente, para a separação de alíquotas de plasma, que foram armazenadas a -80°C até a realização dos testes coagulométricos. As amostras de plasma, provenientes de outras instituições, foram enviadas ainda congeladas por acondicionamento em gelo seco, dentro de caixas de isopor lacradas. Enquanto que as amostras em tubo de EDTA foram enviadas sob-refrigeração em caixa térmica contendo gelo reciclável (gelox) e mantidas em geladeira (4 a 8°C), até a realização do isolamento de DNA a partir de leucócitos. Após extração, as amostras de DNA foram armazenadas em freezer -20°C.

4.1. Determinação da atividade de FVIII plasmático para confirmação e classificação da hemofilia A

A atividade coagulante do FVIII no plasma (FVIII:C) foi determinada pelo teste de Tempo de Tromboplastina Parcial ativada (TTPa) modificado, realizado no coagulômetro ACL TOP 500 (Intrumentation Laboratory, EUA) com a utilização de plasma comercial deficitário em FVIII (Factor VIII deficient plasma, Intrumentation Laboratory, EUA).

Para realização das análises laboratoriais de hemostasia, os conceitos de via intrínseca e extrínseca do modelo clássico da cascata de coagulação, ainda são empregados para interpretação dos testes. A avaliação da atividade plasmática de FVIII consiste inicialmente na mistura do plasma do paciente com o plasma comercial deficiente apenas em FVIII. Essa mistura é submetida ao teste de TTPa, que avalia o tempo para a formação da fibrina baseado na presença dos fatores da via intrínseca da coagulação, da qual faz parte o FVIII. O tempo necessário para a formação da fibrina é correlacionado a uma curva padrão de calibração sendo possível, desta maneira, se determinar a atividade coagulante do FVIII plasmático do paciente avaliado [93].

Nos casos onde inicialmente houve detecção de FVIII:C pelo método coagulométrico e em todos os casos recém diagnosticados, foi realizada a avaliação de FVIII:C pelo método cromogênico no coagulômetro ACL TOP 500 (Intrumentation Laboratory, EUA) com a utilização de substrato cromogênico (electrachrome factor VIII, Intrumentation Laboratory, EUA).

O método cromogênico é o mais recomendado para o diagnóstico de hemofilia A grave devido a sua melhor reprodutibilidade quanto a valores baixos de FVIII:C. Este método não depende de substrato deficiente de fator, eliminado, assim, possíveis interferências de FVIII residual [93]. Esse teste baseia-se na mistura do plasma do paciente com um meio com quantidades ótimas de trombina, Ca+2, fosfolipídios, FIXa e excesso de FX, permitindo que a velocidade de ativação do FX seja linearmente relacionada com a quantidade de FVIII. O FXa ao hidrolisar o substrato cromogênico libera o grupo cromóforo para-nitroanilina, que é lido fotometricamente. O FXa gerado e, portanto, a intensidade de cor será proporcional a atividade de FVIII na amostra do paciente.

Para garantir que a dosagem de FVIII:C se referia ao fator endógeno, foi respeitado um período mínimo de 15 dias entre a coleta das amostras destinadas a esta análise de FVIII:C e a última infusão de concentrado de FVIII. Desta forma a gravidade da hemofilia foi confirmada de acordo com a atividade coagulante do FVIII plasmático <1% para todos os casos incluídos no estudo.

4.2. Determinação dos anticorpos inibitórios (inibidores) através do método de Bethesda modificado (Bethesda-Nijmegen)

A quantificação (titulação) do inibidor pelo método de Bethesda modificado (Bethesda-Nijmegen) é considerada a técnica padrão ouro para este tipo de avaliação. Apresenta maior especificidade quando comparado à técnica original, e além disso, é a técnica recomendada pelo subcomitê técnico da Sociedade Internacional de Trombose e Hemostasia (ISTH) para este tipo de análise [44].

O princípio desta técnica é avaliar indiretamente a ação do anticorpo em pesquisa junto a uma concentração da proteína de FVIII conhecida.

4.2.1. Tratamento pré-quantificação

Para a determinação dos anticorpos inibitórios, as amostras de plasma foram descongeladas em banho-maria a 37°C por 5 minutos e passaram por tratamento de calor através da incubação a 56°C por 30 minutos. Após a incubação as amostras foram centrifugadas por 5 minutos a 2.200 rcf.

O objetivo desta aplicação técnica é evitar a interferência da possível presença de FVIII endógeno residual ou exógeno proveniente da reposição de concentrado de produtos contendo FVIII [94]. A presença de FVIII pode interferir na realização da quantificação desses inibidores, provocando resultados falsos negativos ou menor titulação de anticorpos. Esta interferência pode ocorrer devido à ocupação do sítio de ligação do anticorpo à proteína do FVIII. O aquecimento à 56°C por 30 minutos promove a denaturação do FVIII e das demais proteínas presentes na amostra. Como os anticorpos são mais estáveis às alterações da temperatura, a quantificação desses torna-se mais fidedigna após a etapa de aquecimento [94].

4.2.2. Quantificação dos anticorpos inibitórios de FVIII

Após o tratamento com calor, as amostras de plasmas dos pacientes foram centrifugadas e os sobrenadantes foram separados cuidadosamente e diluídos em tampão diluente (Factor diluent Intrumentation Laboratory, EUA), nas concentrações: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 e assim por diante, a depender do título de inibidor encontrado nas primeiras diluições realizadas. Para cada diluição foi acrescentado plasma padrão normal com concentração de FVIII conhecida (Calibration Plasma, Intrumentation Laboratory, EUA) na proporção 1:1. Para o controle negativo foi realizado uma diluição 1:1 do plasma padrão normal de FVIII com plasma comercial deficiente do FVIII (Factor VIII deficient plasma, Intrumentation Laboratory, EUA), para simular uma amostra de paciente com hemofilia sem a presença de inibidor. Após acréscimo do plasma padrão, as amostras foram incubadas por 2 horas a 37°C e foi avaliada a atividade do FVIII plasmático pelo método coagulométrico. Após a determinação de FVIII:C, calculou-se a atividade residual de FVIII para verificar junto a comparação do controle negativo à ação do inibidor. Este cálculo é aplicado para todas as diluições realizadas da amostra do paciente.

4.2.3. Cálculo da atividade residual de FVIII e conversão para Unidade Bethesda (UB)

Para o cálculo da atividade do fator residual, o valor encontrado de atividade de fator VIII de cada diluição foi dividido pelo valor de atividade de FVIII encontrado no plasma controle e multiplicado por 100. A atividade residual de fator VIII vs. a unidade Bethesda é plotada em papel mono-log em uma escala aritmética (Figura 8).

Por definição, uma unidade Bethesda (1 UB) corresponde à quantidade de inibidor capaz de neutralizar 50% da atividade de fator VIII plasmático. Os títulos em UB referentes a cada diluição foram então multiplicados pelo fator de diluição do plasma utilizado para o teste. Valores menores que 0,6 UB foram considerados negativos.

Figura 8. Exemplo de cálculo para obtenção de título final de anticorpos inibidores de FVIII. O plasma A foi testado nas diluições 1:10, 1:20 e 1:40. Os pontos são plotados em um gráfico log‑linear com valores próximos de 100%, 50% e 25% de atividade residual, correspondendo a 0, 1 e 2 UB, respectivamente. O título final foi obtido multiplicando-se o valor obtido pelo fator de diluição correspondente. Para o cálculo final de unidades Bethesda, considera-se a diluição cujo fator residual estiver mais próximo de 50%. Fonte: Brasil, Manual de diagnostico laboratorial das Coagulopatias Hereditárias e Plaquetopatias [93].

A positividade para o teste foi confirmada em pelo menos duas amostras positivas (>0,6 UB) por pelo menos duas vezes, com intervalo mínimo de 6 meses entre as amostras.

4.3. Estratégia para detecção de mutações associadas à hemofilia A grave

Para determinação das alterações moleculares associadas aos casos com diagnóstico de HA grave, foi adotada a estratégia de acordo com a Figura 9.

Figura 9. Estratégia para detecção de mutações na hemofilia A. O diagnóstico molecular das alterações relacionadas com a Hemofilia A grave foi iniciado com a pesquisa da inversão do íntron 22 do gene F8 (INV22). Se a pesquisa para INV22 apresentou-se negativa, realizou-se a investigação para a presença da inversão do íntron 1 do gene F8 (INV1). Quando ambas as inversões foram negativas, realizou-se o sequenciamento do gene F8 para investigação de alterações moleculares responsáveis pela hemofilia A grave.

4.3.1. Extração de DNA de sangue periférico

O DNA foi extraído de 9 mL de sangue coletado com EDTA. Após centrifugação por 10 minutos a 563 rcf, o sobrenadante foi desprezado. Ao precipitado foram adicionados 5 volumes de NH4Cl 144mM (cloreto de amônio) e ½ volume de

NH4HCO3 10mM (bicarbonato de amônio), os reagentes foram homogeneizados por

inversão dos tubos, para a lise das hemácias. As amostras foram centrifugadas a durante 15 minutos a 682 rcf e o sobrenadante foi desprezado, esse mesmo procedimento foi repetido novamente.

Ao precipitado obtido após centrifugação, foram adicionados 5 mL de tampão TKM1

(Tris-HCl 10mM, KCl 10mM, MgCl2 10mM, EDTA 0,2mM, pH 7,6) e 200μL de Triton

10X (Sigma Chemical, CO, Steinheim, Alemanha). Os reagentes foram misturados por inversão até completa dissolução do Triton. Realizou-se nova centrifugação, 15 minutos a 682 rcf, e após descarte do sobrenadante, o pellet foi lavado com 5 mL TKM1 e centrifugado novamente nessas mesmas condições. O pellet obtido foi

ressuspenso com 400μL de TKM2 (NaCl 400mM, KCl 10mM, MgCl2 10Mm, pH 7,6) e

25μL de SDS 10% (dodecil sulfato de sódio), para a lise dos leucócitos. As amostras foram incubadas em banho-maria a 55°C durante 30 minutos, para dissolução do pellet formado. Após este período, foram acrescentados 180μL de NaCl 5M e homogeneizados com a própria ponteira. Esperou-se o tempo de 20 a 30 minutos em temperatura ambiente para que ocorresse a precipitação de proteínas. Após este tempo, as amostras foram centrifugadas a 12400 rcf por 5 minutos.

O sobrenadante contendo o DNA foi submetido à extração através da adição de 450μL de clorofórmio-álcool isoamílico e 450μL de fenol bidestilado saturado com Tris-HCl pH 8,0, seguida de centrifugação a 12400 rcf por 5 minutos. Este processo foi repetido após a adição de 1 mL de clorofórmio-álcool isoamílico. Após centrifugação, o sobrenadante foi transferido para um novo tubo de fundo cônico de 1,5 mL.

Acrescentou-se 10% do volume do sobrenadante com acetato de sódio 3 M pH 5,2 e 1 mL de etanol absoluto gelado, os tubos foram agitados por inversão para precipitação do DNA. As amostras foram novamente centrifugadas por 5 minutos a