UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E
ENGENHARIA DE MATERIAIS (P
2CEM)
MARIA ERISFAGNA RIBEIRO DE MACEDO
ARCABOUÇOS 3D (SCAFFOLDS) À BASE DE POLI
(HIDROXIBUTIRATO), QUITOSANA E FIBROÍNA DA SEDA PARA
ENGENHARIA TECIDUAL.
Orientador: Professor Dr. Luís Eduardo Almeida
MARÇO DE 2017
SÃO CRISTÓVÃO, SE.
ii Scanned by CamScanne
iii FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
M141a
Macedo, Maria Erisfagna Ribeiro de
Arcabouços 3D (Scaffolds) à base de poli (hidroxibutirato), quitosana e fibroína da seda para engenharia tecidual / Maria Erisfagna Ribeiro de Macedo ; orientador Luis Eduardo Almeida. – São Cristóvão, 2017.
65 f. ; il.
Dissertação (mestrado em Ciência e Engenharia de Materiais) – Universidade Federal de Sergipe, 2017.
1. Engenharia de materiais. 2. Quitosana. 3. Ossos. 4. Seda. 5. Polímeros. I. Almeida, Luis Eduardo, orient. II. Título.
iv
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, pelo dom da vida, pela sabedoria, paciência e coragem para superar os momentos difíceis dessa caminhada.
A minha família, pelo apoio e em especial a minha mãe Evanete, por ter me proporcionado tudo que estava ao seu alcance durante minha estadia longe de casa.
Ao meu noivo Damon, pelo apoio, paciência, companheirismo e incentivo.
Aos colegas e amigos do grupo de pesquisa, em especial a Jamilly, Thiago e Geane pela troca de conhecimento, pelo apoio e por estar comigo em todos os momentos que precisei.
Aos meus amigos de curso, em especial a Camila, Alberto Júnior e Givanilson pelo companheirismo, amizade, motivação e apoio em momentos de aflições.
Ao meu orientador, Dr. Luís Eduardo Almeida, pelo apoio, incentivo e conhecimento transmitido.
Ao professor Dr. Marcelo Massayoshi Ueki, pela disponibilidade de sempre em ajudar e pelo suporte na realização de análises térmicas.
À professora Débora dos santos, pelo suporte durante a realização dos testes “in vitro”.
Por fim à Universidade Federal de Sergipe (UFS), à CAPES ao CNPq, pelo apoio laboratorial e financeiro para a realização dessa pesquisa.
v
Resumo da Dissertação apresentada ao P
2CEM/UFS como parte dos
requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre em Ciências e
Engenharia de Materiais (M.Sc.)
ARCABOUÇOS
3D
(SCAFFOLDS)
À
BASE
DE
POLI
(HIDROXIBUTIRATO), QUITOSANA E FIBROÍNA DA SEDA PARA
ENGENHARIA TECIDUAL.
Maria Erisfagna Ribeiro de Macedo
Março/2017
Orientador: Dr. Luís Eduardo Almeida
Programa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Materiais
Materiais à base de polihidroxibutirato (PHB), quitosana (QUI) e fibroína (SF) são biocompatíveis e atrativos para aplicações na engenharia tecidual óssea. Neste trabalho foi preparado, caracterizado e avaliado o comportamento in vitro de arcabouços 3D de PHB/QUI/SF em diferentes proporções: grupo I: PHB/QUI (50:50 % em massa), grupo II-PHB/QUI/SF (50:45:5 % em massa) e grupo III- PHB/QUI/SF (50: 35:15 % em massa). Os arcabouços foram produzidos pelo método da liofilização das misturas dos componentes dos três grupos. A caracterização físico-química dos arcabouços foi realizada por difração de raios X, espectroscopia no infravermelho, microscopia eletrônica de varredura e análise termogravimétrica. A análise de MEV mostrou que os arcabouços 3D apresentam uma boa porosidade. Por FTIR observou-se que os componentes utilizados na preparação dos arcabouços interagiram quimicamente entre si. As análises térmicas indicam que a fibroína aumenta a estabilidade térmica dos arcabouços. A viabilidade e a proliferação celular foram avaliadas pelo método do MTT e os resultados de citotoxicidade mostraram que ambos os arcabouços não são citotóxicos. Além disso, os arcabouços estimularam a proliferação celular, sendo promissores para aplicações em engenharia tecidual.
Palavras Chaves: Arcabouços 3D; Poli(hidroxibutirato); Quitosana; Fibroína da
seda; Testes in vitro.
vi
Abstract of dissertation presented to as a partial fulfillment of the requirements
for the degree of Master in Materials Science and Engineering (M.Sc.)
3D SCAFFOLDS BASED ON POLY (HYDROXIBUTIRATE), CHITOSAN
AND SILK FIBROIN FOR TISSUE ENGINEERING.
Maria Erisfagna Ribeiro de Macedo
Março/2017
Advisor: Dr. Luís Eduardo Almeida
Postgraduate Program in Materials Science and Engineering
Materials based on polyhydroxybutyrate (PHB), chitosan (CHI) and fibroin (SF) are biocompatible and attractive for applications in bone tissue engineering. In this work, 3D scaffolds of PHB/CHI and PHB/CHI/SF in different proportions was prepared, characterized and evaluated the in vitro behavior: group I: PHB/CHI (50:50 wt.%), group II: PHB/CHI/SF (50:45:5 wt.%) and group III: PHB/CHI/SF (50:35:15 wt.%). The scaffolds were produced by the lyophilization method of the components mixtures. The physical-chemical characterization of the scaffolds was performed by X-ray diffraction, infrared spectroscopy, scanning electron microscopy and thermogravimetric analysis. A highly porous nature was revealed by SEM analysis of the scaffolds. The FTIR analysis revealed that the constituents used in the preparation of the scaffolds interacted chemically with each other. Thermal analysis showed that fibroin increases the thermal stability of the scaffolds. The viability and cell proliferation were assessed by the MTT method and the cytotoxicity results showed that all scaffolds are non-cytotoxic. In addition, the scaffolds stimulated cell proliferation and are promising for tissue engineering applications.
Keywords: 3D Scaffolds; Poly (hydroxybutyrate); Chitosan; Silk Fibroin; In
vitro tests.
vii
Sumário
1. INTRODUÇÃO ... 1 2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 3 2.1. Osso ... 3 2.2. Biomateriais ... 5 2.3. Arcabouços ... 72.4. Materiais poliméricos na engenharia tecidual ... 11
2.4.1. Polihidroxibutirato... 12 2.4.2. Quitosana... 14 2.4.3. Fibroína da seda ... 17 3. REVISÃO DA LITERATURA ... 20 4. OBJETIVOS: ... 23 4.1. Geral ... 23 4.2. Específicos ... 23 5. MATERIAIS E MÉTODOS ... 24
5.1. Produção dos arcabouços... 24
5.2. Caracterização físico-química ... 25
5.2.1. Grau de desacetilação da quitosana ... 25
5.2.2. Viscosidade e massa molar da quitosana ... 26
5.2.3. Difratometria de raios X (DRX) ... 27
5.2.4. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ... 27
5.2.5. Espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) ... 28
5.2.6. Análise termogravimétrica (TGA) ... 28
5.3. Testes biológicos ... 28
5.3.1. Procedimento de esterilização ... 28
5.3.2. Teste de citotoxidade ... 28
viii
5.3.4 Análise Estatística ... 30
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 31
6.1. Grau de desacetilação da quitosana ... 31
6.2. Viscosidade e massa molar da quitosana ... 32
6.3. Difratometria de raios X (DRX) ... 33
6.4. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ... 35
6.5. espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) .... 36
6.6 Análise termogravimétrica (TGA) ... 38
6.7. Teste de citotoxidade ... 41
6.8. Proliferação celular ... 42
7. CONCLUSÕES ... 45
8. PERSPECTIVAS FUTURAS... 46
1
1. INTRODUÇÃO
Danos devido às doenças e lesões no tecido esquelético como consequência do envelhecimento e de acidentes é um problema crescente na população mundial (O’BRIEN, 2011). O osso é atualmente um dos tecidos mais transplantados, com cerca de 15 milhões de casos de fraturas por ano (GÓMEZ et al., 2016). Para isso, são realizados vários procedimentos cirúrgicos que substitui ou repõe os tecidos que foram danificados.
Os tratamentos mais convencionais usados atualmente é o transplante de tecido a partir de um local para outro no mesmo paciente (um autoenxerto) ou a partir de um indivíduo para outro (um transplante ou aloenxerto) (O’BRIEN, 2011). Embora esses procedimentos cirúrgicos promovam uma melhor qualidade de vida para o paciente, existem limitações em ambas às técnicas, como o risco de transmissão de doenças, infecções na região doadora, rejeições do implante e a escassez de doadores (BASHA et al., 2015, SWETHA et al., 2010, O’BRIEN, 2011). Com isso, a necessidade de se encontrar estratégias inovadoras na produção de biomateriais em terapias para reparar, melhorar ou manter a função do tecido ósseo se torna premente.
A engenharia tecidual desenvolve metodologias que aumenta o potencial de regeneração de tecidos/órgãos perdidos ou danificados de forma irreversível, criando um ambiente apropriado para sobrevivência, adesão e proliferação das células. A proliferação e diferenciação adequada das células, bem como fatores de crescimento para reparação de tecidos/órgãos podem ser alcançados de forma adequada em um arcabouço artificial com estrutura tridimensional (3D) (SINGH et al., 2016).
O arcabouço 3D serve como suporte temporário que irá proporcionar um ambiente adequado para que as células consigam aderir, proliferar e se diferenciar (COSTA-PINTO et al., 2011). Para realizar essas metas, o arcabouço deve apresentar alguns requisitos, tais como: biocompatibilidade, biodegradabilidade, porosidade, propriedades mecânicas adequadas em relação à área a ser implantado. (O’BRIEN, 2011, COSTA-PINTO et al., 2011).
Os compósitos poliméricos têm recebido atenção considerável de muitos pesquisadores, porque é uma maneira custo-efetiva para a preparação de novos materiais com propriedades físico-químicas, propriedades mecânicas, térmicas e respostas biológicas desejadas (BHARDWAJ, KUNDU, 2011). Os polímeros naturais
2 utilizados como biomateriais incluem alginato, celulose, dextrano, proteínas, levana, colágeno, gelatina, elastina, ácido hialurônico, seda, albumina, pectina, amido, galactano, quitosana, curdlana, glúten, fibroína, polihidroxialcanoatos, polietilenoglicol, heparina, dentre outros. Os polímeros naturais têm muitas vantagens tais como a sua semelhança com a matriz extracelular (ECM) natural dos tecidos, biocompatibilidade, facilidade de processamento e disponibilidade comercial (SINGH et al., 2016).
O polihidroxibutirato (PHB) tem atraído muita atenção para a engenharia tecidual óssea, porque é um polímero biocompatível e biodegradável. Apesar dessas características, o PHB apresenta algumas desvantagens, que limitam sua aplicação para dispositivos médicos como alto grau de cristalinidade o que o torna extremamente quebradiço (DÍAZ, et al., 2015, MENDONÇA, et al.,2012, QUENTEL et al., 2010), e propriedades hidrofóbicas, que interfere na adesão celular (ASRAN et al., 2010, MEDVECK, 2011).
Arcabouços preparados a partir de um único polímero não podem transmitir todas as propriedades necessárias (SHARMA et al., 2015), como é o caso de arcabouço preparado apenas com o PHB, pois não se consegue obter uma estrutura porosa devido a sua hidrofobicidade. Enquanto a combinação de dois ou mais polímeros para fabricar arcabouços, pode gerar um efeito sinérgico, proporcionando uma boa resistência mecânica ao arcabouço, bem como facilitar a adesão e proliferação celular (SHARMA et al., 2015).
Uma das estratégias empregadas para melhorar as propriedades do PHB é combiná-lo com outros biopolímeros(MENDONÇA et al., 2012). Neste sentido, foram produzidos arcabouços 3D (scaffolds) de base polimérica utilizando polihidroxibutirato (PHB), quitosana (QUI) e fibroína da seda (SF) para a regeneração tecidual óssea. A quitosana para alterar o caráter quebradiço e hidrofóbico do PHB e a fibroína que é sinalizadora de adesão celular.
3
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1. Osso
O osso é um tecido conjuntivo altamente funcionalizado que forma a estrutura esquelética do corpo humano com várias funções fisiológicas (SARAVANAN, et al.,2016). Aproximadamente 35% do tecido ósseo é feito de uma parte orgânica, enquanto o restante correspondente a 65% é composto de matriz inorgânica. A matriz extracelular orgânica do osso consiste de macromoléculas complexas, tais como colágeno que compõem 90-95% da matriz orgânica, osteocalcina, osteopontina, osteonectina, sialoproteína óssea, hialuronano e proteoglicanos. A fase mineral do osso inorgânico consiste de hidroxiapatita (HA), bem como, carbonatos e sais inorgânicos (MELKE et al., 2015).
O osso exibe quatro tipos de células: osteoblastos, células de revestimento do osso, osteócitos e osteoclastos. O osso exerce funções importantes no corpo, tais como a locomoção, apoio e proteção dos tecidos moles, armazenamento de cálcio e fosfato e alojamento de medula óssea. Apesar de sua aparência inerte, o osso é um órgão altamente dinâmico que é continuamente reabsorvido pelos osteoclastos e neoformado por osteoblastos. Há evidências de que os osteócitos atuam como orquestradores deste processo de remodelação óssea (SILVA et al., 2015).
Em geral, o osso pode ser classificado em duas categorias de acordo com a sua estrutura, cortical (compacto) e trabecular (esponjoso) (LEE et al., 2013; MOTTAGHITALAB et al., 2015). O osso cortical é duro, com 5-10% de porosidade e corresponde aproximadamente 80% dos ossos do esqueleto, incluindo os ossos cuboides, chatos, e as extremidades dos ossos longos. A rigidez do osso cortical é muito maior que o trabecular. Em contraste, a porosidade do osso trabecular é de aproximadamente 50-95%, sendo mais elevada do que os ossos corticais. A área de superfície do osso trabecular é igualmente maior do que a do osso cortical. As estruturas exterior e interior do osso são partes corticais e trabeculares, respectivamente (MOTTAGHITALAB et al., 2015).
Como resultado das mudanças nas funções dos osteoclastos e osteoblastos relacionadas à idade, a estrutura óssea tende a deteriorar-se ao longo do tempo e
4 levar a um aumento do risco de fraturas em mulheres e homens. Estima-se que 40% das mulheres caucasianas com 50 anos ou mais irá desenvolver uma fratura vertebral, no quadril ou fratura de punho em algum momento durante o resto de suas vidas, e que este risco aumenta para cerca de 50% se fraturas vertebrais detectadas apenas por imagens radiológicas são incluídas na estimativa. Estima-se que cerca de 13% de homens caucasianos pode sofrer fraturas semelhantes. O risco destas fraturas é um pouco menor em mulheres e homens não caucasianos (NICOLE, CLARKE, 2015).
É estimado que o custo hospitalar com fraturas osteoporóticas custa nos EUA entre US $ 12,2 e US $ 17,9 bilhões por ano (NICOLE, CLARKE, 2015). O SUS (Sistema Único de Saúde) registra a cada ano mais de R$ 51 milhões com o tratamento de fraturas decorrentes de queda e R$ 24,77 milhões com medicamentos para tratamento da osteoporose, doença que atinge principalmente mulheres na pós– menopausa, caracterizada pela fragilidade dos ossos.
Os ossos são tecidos dinâmicos que formam o esqueleto do corpo e são propensos a alterações ao longo de todo o ciclo de vida. Diversas malformações ósseas como a deformidade craniofacial devido a anomalias congênitas, ressecções tumorais ou lesões dolorosas, podem ser tratadas através da reconstrução óssea (SINGH et al., 2016).
O tecido ósseo é capaz de curar e remodelar sem deixar qualquer cicatriz em casos de danos ou fratura (CAETANO et al., 2016). A remodelação óssea é o processo pelo qual o osso é continuamente reparado durante a vida adulta através de ciclos de reabsorção óssea e formação óssea (GALLAGHER, 2008). No entanto, em fraturas patológicas, perda óssea traumática ou ressecção de tumor primário, quando o defeito excede um tamanho crítico, o osso não é mais capaz de remodelar-se. Nestes casos, a enfoque clínico é o uso de enxertos ósseos (CAETANO et al., 2016).
Enxertos ósseos são divididos em autoenxertos, aloenxertos e xenoenxertos. Autoenxerto é o transplante de um tecido de uma área para outra do mesmo individuo e não apresenta risco de transmissão de doença ou rejeição do sistema imunológico. Porém apresenta outras limitações como morbidade, dor local, internação prolongada, riscos de infeção profunda e hematoma. O aloenxerto é o transplante de um tecido de indivíduo para outro, suas limitações estão associadas à rejeição, transmissão de doenças e infeção. Além disso, a taxa de cicatrização é geralmente menor que os autoenxertos. Xenoenxertos é o transplante de um tecido de um indivíduo para outro de uma espécie diferente, produzem resultados clínicos deficientes e apresentam risco de transmissão da doença, no entanto, o uso de biomateriais pode ser um método
5 alternativo para reparação de defeitos, especialmente para pacientes com idade avançada (CAETANO et al., 2016).
A regeneração de um defeito do osso pode ser feita por meio da engenharia tecidual, através da osteogênese com a ajuda de suportes apropriados, que contêm transportadores biocompatíveis e fatores de crescimento específicos (SINGH et al., 2016). Ao longo das últimas duas décadas, a pesquisa tem-se centrado nas relações estrutura-função de muitas proteínas que são polímeros naturais. Polímeros naturais do tipo proteínas, por exemplo, colágeno, elastina, albumina, e fibrina são candidatos promissores para engenharia tecidual (MOTTAGHITALAB et al., 2015).
2.2. Biomateriais
Existem relatados que fraturas osteoporóticas estão entre os causadores de defeitos ósseos, especialmente em mulheres com mais de 60 anos idade. De acordo com relatos na Europa e nos Estados Unidos, existe mais de 400.000 e 600.000 candidatos para procedimento de enxertos ósseos, respectivamente, cada ano. A Organização Mundial de Saúde (OMS) informou que nos Estados Unidos, em 1995, o custo relacionado ao tratamento de pacientes com defeitos musculoesqueléticos foi $ 215.000.000.000 (MOTTAGHITALAB et al., 2015). No Brasil no período de 1995 a 2000 houve uma ascensão constante (107%) nos gastos do Sistema Único de Saúde (SUS), tendo sido gastos com órteses, próteses e materiais R$ 242,7 milhões em 2000 frente a R$ 116,9 milhões em 1995 (BELLOTI, 2009).
Reparação óssea é um processo complexo. Após a lesão, diferentes tipos de células, moléculas sinalizadoras e proteínas da matriz trabalham juntas para reparar o defeito ósseo. No entanto, o mecanismo natural de reparo do osso é insuficiente no caso de grandes defeitos ósseos, e eles não podem ser tratados com procedimentos clínicos de rotina. Para resolver este problema, os biomateriais foram introduzidos (MOTTAGHITALAB et al., 2015).
Biomateriais desempenham um papel indispensável, no campo da engenharia tecidual. Os Biomateriais têm sido usados durante anos para aplicações tais como a substituição da lente intraocular e obturações dentárias, mas os avanços em biologia celular e molecular, química, ciência dos materiais e engenharia têm proporcionado oportunidades muito mais amplas para uso clínico (KEANE, BADYLAK, 2014). Assim,
6 os biomateriais ajudam na melhoria da qualidade de vida e longevidade dos seres humanos (GEETHA et al., 2009).
Biomateriais são utilizados em diferentes partes do corpo humano, como as válvulas artificiais no coração, stents em vasos sanguíneos, implantes de substituição nos ombros, joelhos, cotovelos, orelhas e dentes. É também usado como simulador cardíaco e para a reconstrução do trato urinário. Entre todos estes, o número de implantes utilizados para substituições da coluna vertebral, quadril e joelho são extremamente elevados (GEETHA et al., 2009).
Na primeira Conferência de Consenso da Sociedade Europeia de Biomateriais (ESB) em 1976, um biomaterial foi definido como "um material inviável utilizado num dispositivo médico, destinado a interagir com sistemas biológicos". No entanto, a definição atual da ESB é um “'material destinado a interagir com sistemas biológicos para avaliar, tratar, aumentar ou substituir qualquer tecido, órgão ou função do corpo”. Esta mudança sutil na definição é indicativa de como o campo de biomateriais evoluiu (O'BRIEN et al., 2011).
As classes gerais de biomateriais são: metais, polímeros, cerâmicos e compósitos. Os metais são materiais inorgânicos que apresentam arranjo atômico e características de ligação que acarretam maiores propriedades mecânicas, térmicas e elétricas. Dentre elas, a condutividade e a resistência mecânica, em especial o suporte de carga, tornam ideais para uma variedade de aplicações médicas, incluindo próteses para substituição de tecido duro, dispositivos de fixação, implantes dentários e dispositivos ativos tais como stents (BINYAMIN et al., 2006). Apesar do grande número de metais e ligas metálicas que são produzidos na indústria, apenas alguns são biocompatíveis para serem usadas com sucesso em longo prazo, como material de implante (CHEN,THOUAS, 2015).
As cerâmicas têm sido utilizadas para a fabricação de implantes, tais como os dentários devido às propriedades de biocompatibilidade e comportamento inerte. Uma vez que o osso é composto por uma cerâmica de fosfato de cálcio, hidroxiapatita, a substituição óssea usando uma substância de composição semelhante, tal como a hidroxiapatita sintética, pode-se presumir ser adequada. No entanto, este material tem limitações com a baixa ductilidade e fragilidade. Com isto, estas limitações conduziram ao desenvolvimento de implantes metálicos, que podem ser arquitetados com revestimentos de fosfato de cálcio (ZANDPARSA et al., 2014).
7 Os polímeros são a mais ampla classificação de biomateriais. São moléculas orgânicas versáteis na sua composição e propriedades, sendo usados em instrumentos cirúrgicos, dispositivos implantáveis, revestimentos do dispositivo, cateteres, enxertos vasculares, biomateriais injetáveis, e agentes terapêuticos. Existem várias vantagens de se utilizar polímeros para aplicações biomédicas, incluindo custo relativamente baixo, facilidade de fabricação, história de uso e versatilidade. A seleção do polímero apropriado para uma aplicação clínica exige a consideração de vários parâmetros diferentes para alcançar o conjunto ideal de propriedades do material (BINYAMIN et al., 2006).
Cada material individual tem suas vantagens e desvantagens como materiais de enxerto ósseo para regeneração e reparação óssea, o que pode ser superado através da combinação de diferentes materiais (GARETA et al., 2015). Por exemplo, KASUGA et al. (2003) fabricaram um compósito que consiste no polímero PLA e carbonato de cálcio sintético. O compósito resultante não mostrou nenhuma fragilidade e melhor módulo de elasticidade em comparação com a do PLA individual. Além disso, o compósito foi capaz de formar uma camada de apatita semelhante ao osso na sua superfície, quando imerso em fluido corporal simulado (SBF), mostrando, assim, bioatividade e osteocondutividade.
A seleção do biomaterial para determinada aplicação deve levar em consideração às similaridades físicas, químicas e biológicas destes, com o tecido a ser substituído (BINYAMIN et al., 2006). Geralmente a biocompatibilidade é o requisito básico dos biomateriais para reparação de tecidos (WANG, 2016). A biocompatibilidade refere-se à capacidade de um material em estimular uma resposta apropriada no tecido hospedeiro em uma situação específica (WILLIAMS, 2008).
2.3. Arcabouços
A engenharia tecidual vem pesquisando soluções que tenha o potencial de reduzir as complicações relacionadas a métodos de tratamento usados atualmente (ZHOU, LEE, 2011). Para isso, desenvolve metodologias aplicando os princípios da engenharia e das ciências da vida para produzir substitutos biológicos que tem como finalidade reparar ou repor tecidos que foram danificados (OLSON et al., 2011, (ZAVAGLIA, SILVA, 2016). Uma das estratégias da engenharia tecidual é o
8 desenvolvimento de arcabouço 3D, sendo projetado para fornecer um suporte inicial para adesão celular (ZHOU, LEE, 2011) (Figura 1).
Figura 1: Ilustração esquemática do modelo dos arcabouços 3D(SHAPIRO, OYEN, 2013).
O desenvolvimento desta técnica permite a regeneração de tecidos através da cultura de células saudáveis dos pacientes em estruturas bioreabsorvíveis que atuam como uma matriz e serve como suporte físico e um substrato adesivo para o crescimento celular isolado (Figura 2). O arcabouço é preparado para mimetizar as condições do tecido original e é produzido como um material bioabsorvível que se degrada à medida que o tecido se regenera. Isto evita a necessidade de uma segunda cirurgia para a remoção do material sintético, o que reduz a possibilidade de resposta inflamatória (ZAVAGLIA, SILVA, 2016).
Figura 2: Representação esquemática da engenharia estadual (ZAVAGLIA, SILVA, 2016).
O arcabouço 3D serve como suporte temporário que irá proporcionar um ambiente adequado para que as células consigam aderir, proliferar e se diferenciar
9 (COSTA-PINTO et al., 2011). Para realizar essas metas, o arcabouço deve apresentar alguns requisitos, tais como: biocompatibilidade, biodegradabilidade, propriedades mecânicas apropriadas, porosidade e morfologia adequadas todas em relação à área a ser implantado. (O’BRIEN, 2011, COSTA-PINTO et al., 2011).
Para ser biocompatível o arcabouço deve promover um espaço apropriado para que as células possam aderir e migrar para a superfície do material e através dele. Depois do implante o arcabouço deve apresentar respostas inflamatórias insignificantes, para diminuir o efeito de rejeição pelo paciente (O’BRIEN, 2011). Materiais incompatíveis provocam uma resposta inflamatória, eventualmente, leva à rejeição ou necrose (OLSON et al., 2011).
O arcabouço precisa ser biodegradável para permitir que as células produzam a sua própria matriz extracelular e os subprodutos da degradação não devem ser tóxico (O’BRIEN, 2011). Como também o tempo de degradação do arcabouço deve coincidir com o tempo de regeneração do novo tecido (COSTA-PINTO et al., 2011). Em relação às propriedades mecânicas os arcabouços devem exibir características similares ao local em que será implantado, como também apresentar resistência suficiente para permitir sua manipulação durante o procedimento cirúrgico (O’BRIEN, 2011).
Bons arcabouços devem apresentar uma estrutura com alta porosidade e poros interligados para garantir a penetração celular e difusão de nutrientes para as células (O’BRIEN, 2011, PUPPI et al., 2010). Os poros necessitam ser grande o suficiente para permitir que as células migrem para a estrutura, e pequenos bastantes para promover a fixação celular (O’BRIEN, 2011). Por exemplo, na regeneração de tecido ósseo in vitro, alguns estudos indicaram a necessidade de tamanho de poro variando de 200 a 400 μm (PUPPI et al., 2010).
Com o objetivo de obter um material poroso, diversas técnicas têm sido estudadas. As principais técnicas empregadas na fabricação de arcabouços porosos tridimensionais são: liofilização, gas foaming, separação de fases, prototipagem rápida, eletrofiação, lixiviação de partículas dentre outras (PUPPI et al., 2010; SUBIA et al., 2010). As técnicas de obtenção dos arcabouços não devem alterar a química e as propriedades de biocompatibilidade dos materiais. Elas necessitam produzir arcabouços que apresentem porosidade, poros interligados, morfologia regulares, tamanho e distribuição adequada como também deve proporcionar boa reprodutibilidade (PUPPI et al., 2010).
10 A liofilização é o método mais comumente usado na produção dos arcabouços (ZENG et al., 2015). Essa técnica é baseada no princípio da sublimação. Inicialmente o polímero é dissolvido num solvente para formar uma solução de concentração desejada. Em seguida a solução é congelada resultando na formação de cristais de gelo e por fim são removidos por sublimação aplicando uma pressão baixa, tendo como resultado uma estrutura com alta porosidade e interconectividade. A vantagem é que não é necessário o uso de agente porogênico, nem elevadas temperaturas (SUBIA et al., 2010) e esse método protege de forma máxima, as propriedades das matérias-primas enquanto se forma um material poroso (ZENG et al., 2015).
Os arcabouços podem ser produzidos a partir de uma variedade de materiais, incluindo metais, cerâmicas e polímeros. As ligas metálicas são populares para ambos os implantes dentários e ósseos enquanto cerâmicas com boa osteocondutividade têm sido utilizados para engenharia de tecido ósseo. No entanto, ambos os metais e cerâmicas têm desvantagens significativas. Alguns metais não são biodegradáveis e não fornecem uma matriz biomimética para o crescimento celular e a formação de tecido. Cerâmicas apresentam biodegradabilidade limitada e são difíceis de processar em estrutura altamente porosa devido a sua fragilidade. Em contraste, polímeros têm uma grande flexibilidade de processamento e biodegradabilidade. Portanto, os arcabouços poliméricos são materiais dominantes em engenharia tecidual (LIU et al., 2012).
Biomateriais poliméricos de origem natural têm se destacado em relação aos polímeros sintéticos em aplicações na engenharia tecidual, por causa do seu comportamento biocompatível e biodegradável. Os materiais de base natural são biopolímeros que incluem polissacáridos, tais como amido, alginato, quitosana, derivados do ácido hialurônico, as proteínas como o colágeno, fibroína da seda e lignoceluloses (SWETHA et al., 2010) e os polihidroxialcanoatos que são poliésteres naturais alifáticos (PUPPI et al., 2010). Os Polímeros naturais frequentemente possuem estruturas altamente organizadas e pode conter uma substância extracelular, denominada ligante, à qual é necessária para se ligarem com receptores celulares (SWETHA et al., 2010).
11
2.4. Materiais poliméricos na engenharia tecidual
A engenharia tecidual envolve o diagnóstico, tratamento e prevenção de doenças com o objetivo de melhorar a qualidade de vida das pessoas através do desenvolvimento de materiais avançados e abordagens terapêuticas com base em arcabouços e liberação de fármacos (SALERNO, PASCUAL et al., 2015). Os polímeros são matérias-primas estudadas para a fabricação de arcabouços para aplicações em engenharia tecidual e diversos tipos de materiais poliméricos biodegradáveis já foram utilizados neste campo (ARMENTANO et al., 2010). Entre eles, os polímeros (biopolímeros) provenientes de recursos renováveis são enfatizados (SALERNO, PASCUAL et al., 2015).
Os polímeros podem ser classificados como materiais de base natural, incluindo polissacarídeos (amido, alginato, quitina / quitosana, ácido hialurônico) ou proteínas (soja, colágeno, fibrina, seda) (ARMENTANO et al., 2010) e polímeros sintéticos obtidos pela polimerização de monômeros de base biológica, como o ácido polilático, succinato de polibutileno, polietileno e microbianamente fermentado, tais como poli-hidroxialcanoatos (SALERNO, PASCUAL et al., 2015).
Polímeros naturais tais como o colágeno, fibrina, gelatina, amido, ácido hialurônico, quitosana e fibroína apresentam a vantagem de boa biocompatibilidade e biodegradabilidade, também são bioativos, pois eles têm potencial para interagir com o tecido hospedeiro (GARETA et al., 2015), por apresentar uma estrutura química e composição semelhantes às macromoléculas da matriz extracelular (ECM). Como consequência direta, a utilização destes materiais em sistemas vivos reduzira a estimulação de inflamação crônica ou reações imunológicas e toxicidade, muitas vezes ocorre quando um dispositivo polimérico sintético é implantado num hospedeiro (SALERNO, PASCUAL et al., 2015).
Alguns polímeros naturais, tais como amido ou quitosana são oriundos de uma fonte quase ilimitada. Porém, algumas desvantagens de polímeros naturais é a resistência mecânica insuficiente e a as altas taxas de degradação. Assim, eles são muitas vezes utilizados na forma de compósitos ou são quimicamente modificados para melhorar as propriedades mecânicas e taxas de degradação (GARETA et al.,
12
2.4.1. Polihidroxibutirato
O polihidroxibutirato (PHB) (Figura 3) é um bipolímero biodegradável e hidrofóbico (MEDVECKY et al.,2014), descoberto na bactéria Bacillus megaterium pela microbiologista Lemoigne, pertencente à família dos polihidroxialcanoatos (PHAs) (DÍAZ et al., 2015). Os PHAs são uma família de poliésteres alifáticos que consistem geralmente de ácidos hidroxicarboxílicos. Durante o seu processo de síntese, fontes de carbono são convertidas diretamente em PHA por fermentação microbiana. Nesta família de poliéster, mais de 150 monômeros diferentes (tais como hidroxibutirato e hidroxivalerato) estão presentes, o que pode dar origem aos materiais com várias propriedades (MOKHTARZADEH et al., 2016).
Figura 3: Representação da estrutura química do PHB.
O PHB pode ser produzido por outros tipos de bactérias, tais como Zoogloea ramigera, Ralstonia eutropha, Methylobacterium, Escherichia coli, Pseudomonas acidofilia, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida e Azotobacter vinelandii (DÍAZ et al.,2015). O PHB degrada-se tanto por hidrólise como por reação enzimática. O produto hidrolisado é o ácido 3-hidroxibutírico, sendo um metabólito natural que está contido no sangue humano (KIM et al., 2000).
A obtenção do PHB ocorre basicamente em duas etapas (Figura 4). Inicialmente, as bactérias são induzidas a crescer, em meio de cultura sem limitação de nutrientes necessários ao crescimento, até que seja atingida a concentração celular desejada de bactérias. Em seguida, a síntese do PHB ocorre quando há limitação de nutrientes necessários para a bactéria em um meio com excesso de carbono, os
13 microrganismos se alimentam desses açúcares, e em seu interior são formados grânulos de poliéster (TELLES et al., 2011).
Após esse processo, o PHB é extraído e purificado, com o auxílio de um solvente orgânico, que rompe a parede celular do microrganismo, possibilitando a liberação dos grânulos de poliéster. O que resta do processo retorna à lavoura como adubo orgânico. O bioplástico obtido junto à máquina extratora possui a aparência de um pó branco (TELLES et al.,2011).
Figura 4: Esquema de produção do PHB (ORTEGA, 2006).
Os polímeros estão localizados no citoplasma da célula bacterina com formato granular que podem medir em média de 0,2 - 0,5 μm e podem ser visualizados com bastante clareza com um microscópio óptico de contraste de fase, devido à sua alta refratividade. Quando as colônias de bactérias contendo PHA são observadas por microscopia eletrônica de transmissão, os PHAs aparecem como corpos densos, como pode ser visto na Figura 5 (SUDESH et al.,2000).
Figura 5: Imagem de microscopia eletrônica de transmissão de colônia de rastonia eutropha contendo 90% de seu organismo preenchido por PHB (SUDESH et al., 2000).
14 A massa molar média do PHB produzido a partir dos diversos tipos de bactérias varia normalmente de 104 até 106 g/mol, com um índice de polidispersividade em torno
de 2. A temperatura de transição vítrea é de 4°C, enquanto que a temperatura de fusão está próxima de 180°C. As densidades do PHB cristalino e do PHB amorfo são 1,26 e 1,18 g/cm3, respectivamente. Propriedades mecânicas do PHB, tais como o
módulo de Young e resistência à tração na ruptura são 3,5 GP e 43 MPa, respectivamente (SUDESH et al., 2000).
Devido à sua biocompatibilidade, biodegradabilidade os polihidroxibutiratos vêm sendo usados para aplicações em engenharia tecidual. O PHB parece adequado para ser usados em endoprótese temporária, placa do osso, remendo, pregos e parafusos. Testes in vitro mostraram que o PHB é biocompatível com várias linhas celulares, incluindo osteoblastos, células epiteliais e condrócitos ovinos (PUPPI et al., 2010).
O PHB tem algumas propriedades mecânicas semelhantes às dos termoplásticos convencionais como polipropileno ou polietileno, embora apresente um elevado grau de cristalinidade, acarretando um comportamento frágil (DÍAZ et al., 2015), comprometendo a utilização de polihidroxibutiratos como arcabouço 3D para aplicações em engenharia tecidual (MENDONÇA et al., 2012). Apresentam também outras desvantagens como a hidrofobicidade (ASRAN et al., 2010).
Além disso, sua temperatura de cristalização está muito próxima da temperatura ambiente, fazendo com que o seu grau de cristalinidade aumente com o tempo, restringindo a mobilidade da fase amorfa tornando-o quebradiço (QUENTAL et al., 2010). Uma das estratégias empregadas para melhorar as suas propriedades é misturar o PHB com outros polímeros, tais como quitosana (MENDONÇA et al., 2012).
2.4.2. Quitosana
A quitosana (QUI) é um polissacarídeo semicristalino linear composto por unidades monoméricas de β(1-4)-2-amino-2-deoxi-D-glicose e β(1-4)-2-acetamida-2-desoxi-D-glicose (Figura 6), obtido a partir da desacetilação da quitina. A quitina é o segundo biopolímero mais abundante e é encontrada em invertebrados, como cascas de crustáceos ou cutículas de insetos, em alguns envelopes de cogumelos, paredes celulares de algas verdes, e leveduras (CROISIER,JÉRÔME, 2013, HU et al., 2016). No mundo milhões de toneladas de quitina são colhidas anualmente, portanto, este biopolímero representa uma fonte barata e facilmente disponível (DASH et al., 2011).
15 Quitina Quitosana
Figura 6: Representações das estruturas química da quitina e quitosana. (LOGITHKUMAR et al., 2016)
A quitina é insolúvel na maioria dos solventes orgânicos, mas a quitosana é solúvel em soluções ácidas diluídas com pH inferior a 6,0, devido à protonação dos grupos amino que possuem um valor de pKa de 6,3 tornando a quitosana um polieletrólito catiônico solúvel em água. A presença dos grupos amino indica que o pH altera substancialmente o estado de carga e as propriedades da quitosana. Em pH inferior, estas aminas são protonadas e tornam-se carregada positivamente fazendo da quitosana um polieletrólito catiônico solúvel em água. Por outro lado, em pH acima de 6,0, os grupos aminos da quitosana são desprotonados e o polímero perde a sua carga e torna-se insolúvel (DASH et al., 2011).
A diferença entre a quitosana e a quitina é a presença de grupos funcionais de acetilatos na quitina e a quitosana apresenta grupos aminos (figura 6). O principal parâmetro que influencia as características da quitosana é o grau de desacetilação, que representa a quantidade de grupos de amino ao longo da cadeia (CROISIER, JÉRÔME, 2013; DASH et al., 2011). A massa molar e grau de desacetilação afeta diretamente as propriedades químicas e biológicas do polímero (Tabela 1).
16 ↑ - Diretamente proporcional à propriedade; ↓ - inversamente proporcional à propriedade (DASH et al., 2011).
A QUI apresenta várias propriedades que a torna adequada para aplicação na engenharia tecidual, especialmente, a biodegradabilidade, biocompatibilidade, bioatividade, antibacteriana, auxilia a cicatrização e possui superfície hidrofílica, que está ausente em muitos polímeros sintéticos (COSTA-PINTO et al., 2011; SARAVANAN et al., 2016). Outra característica importante da quitosana, para aplicações em engenharia tecidual, é a sua capacidade de ser moldado em várias estruturas, como: microesferas, pastas, membranas, fibras e matrizes porosas (COSTA-PINTO et al., 2011).
A quitosana não é apenas um polímero contendo grupos amino, mas também um polissacarídeo, que contém, por conseguinte, ligações glicosídicas quebráveis. Portanto, a degradação da quitosana in vivo ocorre por várias proteases, e principalmente pela lisozima. A biodegradação da quitosana leva à formação de oligossacarídeos não tóxicos de comprimento variável. Estes oligossacarídeos podem ser incorporados em vias metabólicas ou podem ser excretados (CROISIER, JÉRÔME, 2013).
A compatibilidade da quitosana com o sistema fisiológico aumenta com o aumento grau de desacetilação. Ao mesmo tempo em que o número de cargas positivas aumenta, a interação entre as células e a quitosana aumenta o que tende a melhorar a biocompatibilidade (CROISIER, JÉRÔME, 2013). A exposição de qualquer material ao ambiente biológico resulta em rápida adsorção de proteínas em sua superfície. E essas proteínas regulam as funções celulares através das integrinas mediadas por vias de sinalização que resultam na adesão, espraiamento, proliferação
Propriedade Características estruturais
Solubilidade ↑ Grau de desacetilação
Cristalinidade ↓ Grau de desacetilação
Biodegradabilidade ↓ Grau de desacetilação ↓ Massa molar
Viscosidade ↑ Grau de desacetilação
Biocompatibilidade ↑ Grau de desacetilação
Mucoadesão biológica ↑ Grau de desacetilação ↑ Massa molar Antimicrobiana ↑ Grau de desacetilação ↑ Massa molar Antioxidante ↑ Grau de desacetilação ↓ Massa molar
17 e diferenciação celular. Os grupos amino e carboxila da QUI são os principais mediantes na adsorção das proteínas (SARAVANAN et al., 2016).
Um dos desafios da utilização dos arcabouços porosos em engenharia tecidual tem sido o de como melhorar a interação entre biomateriais e células visando controlar a adesão celular (LIU et al., 2012). Neste contexto, atenção tem sido dada às proteínas como a fibroína da seda (REN et al., 2007).
2.4.3. Fibroína da seda
A fibroína da Seda (SF) é um polímero natural produzido pelo bicho-da-seda Bombyx mori (CAI et al., 2017; ZHU et al., 2010), e tem sido amplamente utilizada como um biomaterial para uma variedade de aplicações em engenharia tecidual, devido à sua facilidade de processamento, biodegradabilidade, boa biocompatibilidade, baixa imunogenicidade, baixa resposta inflamatória e propriedades mecânicas (BHARDWAJ, KUNDU, 2011).
A principal vantagem da fibroína da seda em comparação com outros biopolímeros naturais é a sua excelente propriedade mecânica (KUNDU et al., 2013), a Tabela 2 mostra uma comparação entre as propriedades mecânicas da fibroína com outros polímeros naturais e sintéticos.
Tabela 2: comparação entre as propriedades mecânicas da SF com outros polímeros. Material Resistência a tração (MPa) Módulo de elasticidade (GPa) % Alongamento Fibroína (com sericina) 500 5-12 19 Fibroína (sem sericina) 610-690 15-17 4-16 Colágeno 0,9-7,4 0,0018-0,016 2-68 Osso 160 20 3 Kevlar (49 fibras) 3600 130 2,7 Borracha sintética 50 0,001 850 (VEPARI, KAPLAN, 2007)
A fibroína é formada por três componentes proteicos: uma grande proteína, conhecida como a cadeia pesada (cadeia-H) que está ligada por pontes de dissulfeto a
18 uma pequena proteína, chamada cadeia leve (cadeia-L), e uma pequena glicoproteína, conhecida como a proteína P25. A cadeia-H é hidrofóbica e contém blocos de (Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser)n que são conhecidas pela forma cristalina anisotrópica folha-β e
por atribuírem a fibroína boa propriedade mecânica, enquanto a cadeia-L é mais hidrofílica e relativamente elástica, e a proteína P25 desempenha um papel na manutenção da integridade do complexo (HARDY, SCHEIBEL, 2010; KUNDU et al., 2013).
Além disso, a fibroína é um bipolímero que contém a sequência tripeptídica: Arg-Gly-Asp (RGD), arginina (Arg), glicina (Gly), ácido aspártico (Asp), que é conhecida por promover adesão celular, especialmente de células osteoplásticas, fibroblásticas e células-tronco (REN et al., 2007, MELKE et al., 2015). As células interagem principalmente com arcabouços através de grupos químicos (ligantes) sobre a superfície do material. Arcabouços sintetizados a partir de materiais naturais extracelulares (por exemplo, colágeno) possuem naturalmente estes ligantes, sob a forma de Arg-Gly-Asp (RGD), enquanto para arcabouços feitos a partir de polímeros sintéticos pode ser necessário incorporar materiais que contém estes ligantes através, por exemplo, da adsorção de proteínas (O’BRIEN, 2011).
Devido à sua composição química e estrutura, a SF é altamente biocompatível. O seu papel como biomaterial foi avaliada pela primeira vez em 1995, o que evidenciou à adesão e o crescimento de células de fibroblastos em matrizes de SF (MELKE et al., 2016). Diversos materiais de fibroína em diferentes formas interagem favoravelmente com sistemas biológicos sem indução de respostas imunológicas adversas, demonstrando sua biocompatibilidade com vários tipos de células promovendo a sua adesão, proliferação, crescimento e funcionalidade (KOH et al., 2015).
A SF apresenta biodegradabilidade, pois é susceptível a degradação proteolítica por várias enzimas, tais como proteases XIV, quimotripsina e colagenase IA. Os produtos de degradação da SF não mostrou citotoxicidade significativa para células neuronais em ensaios in vitro. Os aminoácidos resultantes da degradação podem ser absorvidos in vitro ou in vivo, o que favorece em aplicações biomédicas (MELKE et al., 2015).
19
2.4.4. Ensaios in vitro
Os testes in vitro são destaques nas pesquisas de biomateriais e na engenharia tecidual, sendo amplamente utilizados no desenvolvimento de implantes, arcabouços e sistemas de liberação de fármacos. Os ensaios in vitro são testes realizados em condições que simulam o meio com o qual o material vai entrar em contato quando implantado, e permitem avaliar possíveis mecanismos de reações interfaciais entre o implante e os tecidos (KIRKPATRICK, MITTERMAYER,1990). Esses ensaios podem ser realizados com bactérias, fungos, algas e crustáceos, além de frações subcelulares presentes no sistema biológico como suspensões celulares, cultivo de tecidos, cultivos celulares, enzimas e proteínas (MOURA et al., 2012).
Os testes in vitro são menos dispendiosos que testes in vivo, como também reduz o uso de animais em pesquisas biomédicas, evitando questões éticas e morais desses ensaios. Os estudos com esses métodos comprovam que os testes de cultura celular podem ser utilizados com sucesso, pois são reprodutíveis, rápidos, sensíveis e financeiramente acessíveis para a execução do estudo de biocompatibilidade in vitro (ROGERO et al., 2003).
A cultura celular refere-se a células isoladas do tecido original ou de linhagem celular. Uma grande variedade de células animais pode ser cultivada e manipulada in vitro. Os fibroblastos são um dos tipos de células mais utilizadas devido à facilidade de isolamento e cultivo (RAAB et al., 2014).
Uma das funções mais importantes dos testes in vitro é detectar efeitos tóxicos dos biomateriais numa fase preliminar (KIRKPATRICK, MITTERMAYER,1990). De acordo com o Órgão Internacional de Padronização (International Standard Organization), ISO 10993, o ensaio de citotoxicidade in vitro é o primeiro teste para avaliar a biocompatibilidade de qualquer material para uso em dispositivos biomédicos (ROGERO et al., 2003).
20
3. REVISÃO DA LITERATURA
Arcabouços de PHB foram produzidos por KHORASANI et al. (2011), pelo método de separação de fases, com o objetivo de produzir arcabouços adequados para cultura de células p19 (células capazes de se diferenciar em células nervosas). Os resultados obtidos apontam a produção de arcabouços com 90% de porosidade e que foram capazes de oferecer ambiente adequado para a proliferação e diferenciação das células p19. No entanto, para outras aplicações arcabouços produzidos apenas com o PHB não tem as propriedades necessárias para sua aplicação, como é o caso de arcabouços para engenharia tecidual óssea. SHARMA et al. (2015), produziram arcabouços combinando quatro polímeros e perceberam um efeito sinérgico da combinação destes quatro polímeros, sobretudo no que diz respeito às propriedades mecânicas.
Alguns relatos na literatura estabelecem que a mistura de QUI com PHB para a produção de blendas ou até mesmo compósitos com mais um componente como a hidroxiapatita (HA) consegue resolver o problema da alta cristalinidade do PHB e se pode produzir arcabouços com boas propriedades para uso na engenharia tecidual ou em sistemas de liberação de fármacos (MENDONÇA et al., 2012; MEDVECKY, 2011; RAJAN et al., 2011).
TAI et al. (2017), prepararam membranas de PHB-fosfato de cálcio/QUI. A fim de melhorar as suas propriedades mecânicas, a membrana de PHB foi inicialmente enxertada com poli (ácido acrílico) e seguida por reação de amidação com quitosana. As membranas preparadas de PHB-QUI e PHB- fosfato de cálcio/QUI tiveram assim uma ligação interfacial forte e propriedades mecânicas melhoradas.
CÃO et al. (2005), compararam a citocompatobilidade de filmes de QUI e filmes de PHB/QUI e observaram que os filmes de PHB/QUI apresentaram melhores propriedades mecânicas além de melhor citocompatibilidade.
GIRETOVA et al. (2016), estudaram a influência da microestrutura, propriedades físico-químicas e degradação enzimática de compósitos de polihidroxibutirato/quitosana/fosfato de cálcio na resposta osteoblástica in vitro. Verificaram que a porosidade dos compósitos desempenha um papel positivo na adesão e proliferação dos osteoblastos durante um curto período de tempo após o cultivo das células. O crescimento populacional mais rápido dos osteoblastos foi encontrado em filmes tratados com fosfato de cálcio, indicando o efeito sinérgico
21 quando se utiliza mais de um componente na preparação de compósitos, blendas ou arcabouços.
KARPOVA et al. (2016), estudaram o efeito da quitosana em matrizes fibrosas de PHB. Mostraram que a adição de uma pequena quantidade de quitosana provoca alteração nas morfologias das matrizes, formando estruturas elipsoidais que aumenta com o aumento da concentração de quitosana. Além disso, a adição de quitosana levou a um aumento das entalpias de fusão.
Com a finalidade de obter arcabouços fibrosos e hidrofílicos SADEGHI et al. (2016), produziram arcabouços de PHB/QUI pelo método de eletrofiação e utilizando ácido trifluoroacético como solvente. Os resultados mostraram que com a mistura de PHB/QUI pode se produzir arcabouços fibrosos mais hidrofílicos e com maior taxa de perda de massa em comparação com os arcabouços de PHB, o que é mais favorável para aplicações em engenharia tecidual cartilaginoso. Porém, o solvente utilizado é caro, além disso, a realização do teste in vitro foi apenas durantes 4 horas para observar a ligação das células com a superfície do arcabouço.
MENDONÇA et al. (2012), produziram arcabouços de PHB e QUI pelo método de liofilização e observaram que um aumento na quantidade de QUI indica uma diminuição na cristalinidade do PHB, assim, todos os arcabouços de PHB/QUI são menos cristalinos do que com PHB puro, o que ocasiona melhores propriedades mecânicas dos arcabouços para aplicação na engenharia tecidual. Observaram também interações intermoleculares entre os grupos amino e hidroxila da quitosana com grupos carbonila do PHB. Apesar de ter sido feito um estudo da morfologia e das propriedades químicas e físicas dos arcabouços não foi apresentado um estudo detalhado sobre a interação dos arcabouços com células.
MEDVECKY (2011), produziu arcabouços PHB/QUI/HA por liofilização e também observou que a presença da quitosana reduz a cristalinidade do PHB, além disso, notou as interações intermoleculares entre os polímeros. No estudo das propriedades químicas e físicas dos compósitos de PHB/QUI, realizados por RAJAN et al. (2011), também observaram que a presença da QUI melhora as propriedades do PHB, possibilitando o desenvolvimento de arcabouços. Porém, a interação entre o biomaterial e as células não foram explorados nesses estudos.
MA et al. (2010), prepararam membranas ultrafinas de polihidroxibutirato (PHB) e quitosana, e investigaram a citotoxidade e adesão com células de fibroblastos de rato. Foi observado que os materiais não eram tóxicos e não liberam substâncias
22 prejudiciais para as células. Mostraram também que as membranas são adequadas para as células aderirem, sendo um material de grande potencialidade em engenharia tecidual para a regeneração de tecidos.
MEDVECKY et al. (2014), produziram arcabouços de PHB/QUI e avaliaram o seu efeito citotóxico, através do ensaio de MTT, em meio com fibroblastos. Os arcabouços não apresentaram qualquer efeito citotóxico, além disso, eles promoveram a adesão e proliferação celular. Apesar desses trabalhos terem realizados testes in vitro com células, estudos envolvendo cultivo de células das linhagens pré-osteoblásticas e pré-osteoblásticas sobre os arcabouços de PHB/QUI ainda é inexplorado para implementar esses biomateriais em determinadas aplicações em engenharia tecidual, como na regeneração óssea.
Um dos desafios da utilização dos arcabouços porosos em engenharia tecidual tem sido o de como melhorar a interação entre biomateriais e células visando controlar a adesão celular (LIU et al., 2012). Neste contexto, atenção tem sido dada às proteínas como a fibroína da seda (REN et al., 2007). Alguns relatos na literatura mostram que a fibroína utilizada na produção de biomateriais proporciona benefícios no que se refere à adesão, proliferação e diferenciação de células. Como por exemplo, nos estudos realizados por LIMA et al. (2013), ZENG et al. (2015). Sendo assim, a fibroína foi adicionada nos compósitos de PHB/QUI no intuito de melhorar a adesão e a proliferação de células.
LIMA et al. (2013), produziram arcabouços a base de QUI, SF e HA. A introdução da SF e HA em arcabouços baseados em quitosana permitiu otimizar suas propriedades biológicas, melhorando o crescimento celular e diferenciação osteogênica. Demonstram também o grande potencial dos compósitos ternários desenvolvidos para engenharia de tecidos.
ZENG et al. (2015), examinaram a estrutura microscópica e as propriedades relacionadas aos arcabouços de SF/QUI com diferentes proporções. Observaram que os arcabouços com maior quantidade de fibroína apresentaram uma melhor resposta a proliferação e diferencia celular.
23
4. OBJETIVOS:
4.1. Geral
Avaliar adesão e proliferação de células cultivadas em compósitos de polihidroxibutirato, quitosana e fibroína.
4.2. Específicos
A. Produzir arcabouços contendo QUI, PHB e SF;
B. Avaliar a morfologia, a cristalinidade e a interação PHB/QUI/SF nos arcabouços;
C. Avaliar a citotoxicidade dos arcabouços;
D. Testar o comportamento celular frente aos arcabouços em ambiente estático.
24
5. MATERIAIS E MÉTODOS
A metodologia empregada nesse trabalho pode ser vista através do diagrama apresentado na Figura 7.
Figura 7: Resumo das etapas realizadas.
5.1. Produção dos arcabouços
O polihidroxibutirato (PHB), na forma de pó branco amarelado usado nesse trabalho foi fornecido pela PHB Industrial S/A (São Paulo, Brasil) (lote L: FE 150), com alto grau de pureza de mais 99,5%, umidade abaixo de 0,3%, massa molecular: 600.000 g.mol-1, densidade: 1,20 g.cm-3 e temperatura de fusão: 170-175°C, a
quitosana (QUI) foi proveniente da casca de caranguejo, da Sigma - Aldrich (EUA) (lote - BCBD8191V), a viscosidade e grau de desacetilação não foram especificados. A fibroína de Seda, na forma de pó branco foi extraída do casulo do Bombyx mori e obtida da Huzhou Xintiansi Bio-tech Co Ltd. (China) com peso molecular em cerca de 250000 g.mol-1. É insípida, inodora, ligeiramente solúvel em água.
A metodologia empregada para a produção dos arcabouços é esquematizada na Figura 8. Os arcabouços foram produzidos a partir de uma solução de PHB 10% (m/v) dissolvido em clorofórmio a 80ºC durante 24 horas, sob refluxo com agitação magnética constante, misturada a uma solução de quitosana e fibroína dissolvidos em 4% (v/v) de ácido acético. Os arcabouços foram preparados em diferentes proporções:
i) Grupo I (controle) - PHB/QUI (50:50% em massa) ii) Grupo II - PHB/QUI/SF (50:45:5% em massa) iii) Grupo III - PHB/QUI/SF (50:35:15% em massa).
25 Para garantir boa homogeneização, a suspensão ficou sob agitação durante 30 minutos e depois em banho ultrassônico (Ultrasonic Cleaner 1400, original, Brasil) por 20 minutos. Posteriormente, essa suspensão foi colocada em moldes, congeladas durante 24 horas a -80°C e liofilizadas (LS3000, terroni) durante 24 horas. As amostras secas foram retiradas dos moldes, neutralizadas em uma solução 0,1% de NaOH aquoetanólica (8:2, v/v) durante 3 horas e lavadas por 30 minutos com água destilada. Por fim, os arcabouços foram congelados novamente por 24 horas e reliofilizados durante 24 horas.
Figura 8: Representação esquemática da produção dos arcabouços 3D por liofilização.
5
.2. Caracterização físico-química
5.2.1. Grau de desacetilação da quitosana
O grau de desacetilação da quitosana (GD%) foi determinado por titulação potenciométrica segundo RESENDE (2010). Foram dissolvidos 0,2 g de quitosana em uma solução padronizada 0,1 M de ácido clorídrico. Em seguida, esse material foi titulado com uma solução padrão de NaOH 0,1 M, e o pH foi monitorado usando um pHmetro (Kasvi). Em seguida, foi construído um gráfico de pH versus volume de NaOH utilizado. Com os resultados extraídos do gráfico é possível determinar o GD% da quitosana por meio da relação apresentada a seguir:
26 𝐺𝐷( %) =161[ 𝑏𝑎𝑠𝑒](𝑉2− 𝑉1)
𝑚 (1)
Sendo: 161 - massa molar da unidade monomérica da quitosana (g/mol),
m - massa da amostra (g),
[base]- concentração molar do NaOH,
V1- Primeiro ponto de inflexão da curva relacionado ao volume de NaOH usado
para neutralizar o excesso de HCl (mL),
V2 - Segundo ponto de inflexão da curva relacionado ao volume da base usada
para neutralizar os grupos da quitosana protonados (mL).
5.2.2. Viscosidade e massa molar da quitosana
A viscosidade e a massa molar da quitosana foram determinadas pelo método viscosimétrico (ABREU et al., 2013), medindo-se o tempo de escoamento de soluções poliméricas em cinco concentrações diferentes (0,001 a 0,012 g/ml), em um viscosímetro capilar de Otswald em banho termostático a 30°C, na qual as amostras de quitosana foram dissolvidas em ácido acético 4% v/v. Os experimentos foram realizados em triplicata.
A viscosidade específica e a viscosidade específica reduzida do polímero foram determinadas de acordo com as seguintes equações, respectivamente:
ηesp= (
t − t0
t0 ) (2) ηred = (ηesp
c ) (3)
Sendo: ηesp - viscosidade específica,
t = tempo de escoamento da solução no viscosímetro
t0 = tempo de escoamento do solvente puro no viscosímetro,
27 ηred = viscosidade específica reduzida.
A viscosidade intrínseca é obtida pela extrapolação gráfica da relação de viscosidade reduzida em função da concentração do polímero. A determinação da massa molar viscosimétrica da quitosana (M) foi estimada através da equação de Mark-Kuhn-Houwink-Sakurada, indicada na equação a seguir:
[η] = κ(𝑀)𝛼 (4)
Sendo: [η] - viscosidade intrínseca do polímero (mL/g) M - massa molar viscosimétrica
α e κ são constantes que são dependentes das interações entre o polímero e solvente. Para quitosana na forma neutra, α=0,76 e κ=0,074 (ABREU et al., 2013).
5.2.3. Difratometria de raios X (DRX)
A técnica difração de raios X foi utilizada para avaliar a cristalinidade e a estrutura dos materiais. Para isso foi utilizado um difratômetro da marca Shimadzu LabX XRD-6000 com radiação CuKα (𝜆 = 1,5406Å). Os difratogramas dos polímeros na
forma de pó e dos arcabouços produzidos foram obtidos no intervalo de 10°≤ 2θ ≤ 40° com uma velocidade de varredura de 2°/min.
5.2.4. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
O MEV foi utilizado para analisar a morfologia e a microestrutura das amostras. Como os polímeros não são condutores, as amostras preparadas foram previamente revestidas com uma fina camada de ouro. As análises de MEV foram realizadas em um microscópio JEOL, modelo JSM-5700, operando a 5 kV
28
5.2.5. Espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)
A técnica de FTIR foi usada para obter informações químicas das amostras. Para realização dessas análises foi utilizado um espectrômetro com transformada de Fourier usando o modo de refletância total atenuada (FTIR-ATR) de modelo Varian 640-IR FTIR-ATR), operando em um intervalo de 4000-800 cm-1 com resolução de 4
cm-1.
5.2.6. Análise termogravimétrica (TGA)
A técnica de TGA foi usada para avaliar as propriedades térmicas dos arcabouços produzidos. As medidas de TG foram realizadas utilizado um analisador termogravimétrico do modelo NETZSCH STA 449 F1 Jupiter, em atmosfera de nitrogênio e oxigênio com variação de temperatura entre 0°C e 600°C e taxa de aquecimento de 10°C/min.
5.3. Testes biológicos
5.3.1. Procedimento de esterilização
Os arcabouços foram esterilizados no Laboratório de Instrumentação Nuclear da Universidade Federal do Rio de Janeiro por método de irradiação gama com fonte de cobalto - 60, dose de 25 KGy/min e tempo de irradiação de 718 min, de acordo com as normas da ISO 10993-12:2012.
5.3.2. Teste de citotoxidade
A viabilidade celular foi obtida através do método colorimétrico utilizando o MTT – 3-(4-5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio. Esse método consiste na capacidade da enzima desidrogenase, presente na mitocôndria de células, em converter o sal
29 tetrazólico (MTT), solúvel em água, no cristal de formazan (E,Z- 1-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-1,3-difenilformazan), produto insolúvel em água. Para quantificar a viabilidade celular, o formazan produzido é solubilizado em solventes específicos (dimetilsulfóxido (DMSO), isopropanol). Dessa maneira, a conversão do MTT em formazan é realizada somente por células viáveis, indicando a viabilidade celular (LUPU, POPESCU, 2013, YANG et al., 2015).
Células do tipo fibroblasto L929, cedidas pela Universidade Federal Fluminense do Rio de Janeiro, foram utilizadas para avaliar a citotoxicidade in vitro dos arcabouços. As células foram cultivadas em meio de cultivo (DMEM) (Sigma) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab), 1% de L-glutamina e 1% penicilina/estreptomicina. As células foram expandidas em atmosfera umidificada (37°C, e 5% de CO2) em incubadora (LS Logen).
As amostras foram colocas em meio de cultura suplementado durante 24 horas para adesão das proteínas. Subsequentemente elas foram centrifugadas (Centrifuga LSDTL40B - LS Logen) durante 10 minutos a 1500 rpm para eliminar eventuais partículas solta no material. Em seguida, foram dispostas em placas de 24 poços e 5,0x105 células em 30 μL de meio foram inoculadas no centro do material, e em poços
vazios para controle, posteriormente foram adicionados 1000 μL de meio e incubadas a 37°C em atmosfera contendo 5% de CO2 por 24 horas. Decorrido esse tempo, o
meio de cultura foi removido, e adicionado 1000 μL de MTT (Sigma-Aldrich).
As amostras foram recolocadas na incubadora durante 3 horas. Após a retirada do MTT, foi colocado isopropanol acidificado por 10 minutos. A absorbância foi lida a 570 nm pelo leitor de placa ELISA (Synergy H1 Multi-Mode Reade). Para a realização do teste foi utilizado como controle positivo (citotóxico) células e meio de cultura com 10% de DMSO e como o controle negativo (não citotóxico) foram usadas células e meio de cultura cultivadas diretamente na placa. O teste foi realizado em triplicata.
5.3.3. Proliferação celular
Osteoblastos da linhagem MG-63 cedidos pela Universidade Federal Fluminense do Rio de Janeiro, foram utilizadas para avaliar a adesão e proliferação in vitro dos arcabouços. As células MG-63 obtidas de osteossarcoma humano pertencem a uma linhagem bem estabelecida, apresentando características de osteoblastos imaturos.
30 Essas células foram cultivadas em meio de cultivo do tipo DMEM (Sigma) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab), 1% de L-glutamina e 1% penicilina/estreptomicina. As células foram expandidas em atmosfera umidificada (37 °C, e 5% de CO2) em incubadora (LS Logen) até atingirem aproximadamente 90% de
confluência.
As amostras foram colocas em meio de cultura com soro durante 24 horas para adesão das proteínas. Em seguida, foram dispostas em placas de 24 poços e 1,0x105
células em 30 μL de meio foram inoculadas no centro de cada arcabouço, posteriormente foram adicionados 1000 μL de meio e incubadas a 37°C em atmosfera contendo 5% de CO2 durante 7, 14 e 21 dias. O meio de cultura era trocado de dois
em dois dias.
Decorrido esse tempo, o meio de cultura foi removido, e adicionado 1000 μL de MTT (Sigma-Aldrich). As amostras foram recolocadas na incubadora durante 3 horas. Após a retirada do MTT, foi colocado isopropanol acidificado por 10 minutos. A absorbância foi lida a 570 nm pelo leitor de placa ELISA (Synergy H1 Multi-Mode Reade). O teste foi realizado em triplicata.
5.3.4. Análise Estatística
Todos os dados foram apresentados com a sua respectiva média ± desvio padrão. Análise de variância one way seguida do teste de Tukey. Para todas as análises, diferenças com p≤0,05 foram consideradas significativas.
