UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS CAMPUS DE ARAPIRACA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA E AMBIENTE JOÃO CARDOSO DE ALBUQUERQUE NETO

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CAMPUS DE ARAPIRACA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA E AMBIENTE

JOÃO CARDOSO DE ALBUQUERQUE NETO

PERÍODOS DE EMBEBIÇÃO E SECAGEM NA TOLERÂNCIA A DESSECAÇÃO EM SEMENTES DE CULTIVARES DE AMENDOIM

Arapiraca – AL 2019

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PERÍODOS DE EMBEBIÇÃO E SECAGEM NA TOLERÂNCIA A DESSECAÇÃO EM SEMENTES DE CULTIVARES DE AMENDOIM

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Agricultura e Ambiente da Universidade Federal de Alagoas, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Agricultura e Ambiente.

Orientadora: Prof.ª. Dra. Ademária Aparecida de Souza

Coorientador: Prof. Dr. Jessé Marques da Silva Júnior Pavão

Arapiraca – AL 2019

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À minha família que de forma direta ou indireta me deu condições para caminhar ao longo do meu mestrado.

À minha amada Esposa Neusa, pelo carinho, apoio, incentivo e paciência durante a realização e conclusão deste trabalho.

À Deus, ao meu querido pai Luiz Carlos Barros e vó Lourdes (in memoriam), que me amaram por toda as suas vidas e sempre despertaram o interesse para concretização deste sonho em minha vida.

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Primeiramente, agradeço a Deus, fonte de sabedoria e de inspiração, pela concretização de mais uma etapa da minha vida profissional e acadêmica.

A minha família e minha esposa por sempre estarem do meu lado em todos os momentos da minha vida.

Ao meu avô cujo carrego o nome herdei, por sempre me apoiar nas minhas decisões no caminho da vida.

A meu sogro Everaldo Eleutério e sogra Neusa Nunes pelo amor de pai e mãe dado a mim e sempre pela mão estendida nas horas difíceis.

A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Alagoas (FAPEAL) e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão de bolsas de estudos para mim e meus colegas do mestrado.

À Universidade Federal de Alagoas- UFAL e ao Programa de Pós-Graduação em Agricultura e Ambiente (PPGAA) Campus de Arapiraca.

À professora Dra. Ademária Aparecida de Souza pelos conhecimentos fornecidos. Ao professor Dr. Antônio Lucrécio dos Santos Neto por sempre acreditar em mim pelo seu incentivo, motivação, oportunidade, paciência, conhecimentos fornecidos.

Ao professor Dr. Jessé Marques da Silva Júnior por ter dado total apoio durante todo o trabalho conduzido em laboratório e pelos ensinamentos, motivação e palavras de apoio para que eu pudesse concluir o meu mestrado.

À professora Dra. Maria Claudjane, pelo apoio e disponibilidade de me auxiliar nos testes desenvolvidos em laboratório.

Ao professor Dr. José Vieira por ter permitido uso total do laboratório de Fisiologia Vegetal para esse trabalho ser concretizado.

À professora Dra. Jurema Rosa de Queiroz Silva por aceitar o convite de examinadora da minha dissertação.

Ao professor Dr. Emerson por permitir algumas vezes poder utilizar o laboratório de sua responsabilidade.

A todo o pessoal do laboratório Labmeg em especial aos técnicos Ítalo e Diego e professora Eliane por toda assistência.

Ao professor Dr. Godoy do Instituto de Agronomia de Campinas (IAC) pelo fornecimento das sementes IAC 505 para a utilização neste trabalho

Ao meu primo e companheiro de jornada da UFAL, Ricardo Barros, pela amizade, companheirismo e disponibilidade em sempre me ajudar na minha vida pessoal e acadêmica.

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conhecimentos transmitidos.

A todos os meus colegas de turma de mestrado pela companhia e auxílio nas disciplinas do mestrado.

A todos os funcionários da Universidade Federal de Alagoas, Campus de Arapiraca, por tornar um ambiente agradável.

Finalmente gostaria de agradecer a todos, que direta ou indiretamente contribuíram para a realização e conclusão deste trabalho. Minha sincera gratidão.

Essa conquista também pertence a vocês!

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Mecanismos de tolerância à dessecação são importantes ferramentas para conservação de sementes e manutenção da espécie. No amendoim (Arachis hypogaea L.) essa técnica ainda há poucos estudos entre os grupos morfológicos (porte ereto e rasteiro), para entender as suas respostas diante da situação estressante ambiental. O presente trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar a influência de diferentes períodos de embebição e secagem na capacidade de tolerância à dessecação em sementes de cultivares de amendoim (Arachis hypogaea L.). O trabalho foi realizado na Universidade Federal de Alagoas (UFAL) - Campus de Arapiraca, no laboratório de Fisiologia Vegetal, utilizando o delineamento experimental inteiramente casualizado (DIC), em esquema fatorial 3x5, com quatro repetições. Os tratamentos foram constituídos por três cultivares de amendoim (BR 1, BRS 151-L7 e IAC 505) e 5 períodos de embebição (0, 12, 24, 36 e 48 horas). Após se fazer a curva de embebição se fez a secagem usando 70 g de sílica em caixas gerbox e uma tela metálica, para obtenção do peso inicial das sementes que durou 51 horas. As variáveis fisiológicas e bioquímicas avaliadas foram: porcentagem de germinação (GER), porcentagem de plântulas normais (PN), porcentagem de plântulas anormais na 1ª contagem (PA), porcentagem final de plântulas anormais (GERA), envelhecimento acelerado (EA) e comprimento de plântulas (CP); condutividade elétrica (CE); índice de velocidade de germinação (IVG) e tempo médio de germinação (TMG), superóxido dismutase (SOD); açúcares totais (AT); açúcares redutores (AR); proteínas totais (PT); peróxido de hidrogênio (H2O2); proteínas totais do superóxido dismutase (PTSOD). Os dados coletados foram submetidos a análise de variância através do software estatístico Sisvar. De maneira geral, a qualidade bioquímica e fisiológica das sementes de amendoim é reduzida à medida que aumenta o período de absorção de água seguido de secagem. A cultivar IAC 505 apresenta maior tolerância à dessecação entre as variedades analisadas.

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Mechanisms of desiccation tolerance are important tools for seed conservation and species maintenance. In the peanut (Arachis hypogaea L.) this technique there are still few studies among the morphological groups (upright and creeping), to understand their responses to the stressful environmental situation. The objective of this work was to evaluate the influence of different periods of imbibition and drying on the desiccation tolerance of peanut (Arachis hypogaea L.) seeds. The work was carried out at the Federal University of Alagoas (UFAL) - Arapiraca Campus, in the Plant Physiology Laboratory, using a completely randomized experimental design (DIC), in a 3x5 factorial scheme, with four replications. The treatments consisted of three peanut cultivars (BR 1, BRS 151-L7 and IAC 505) and 5 soaking periods (0, 12, 24, 36 and 48 hours). After the embedding curve was made the drying was done using 70 g of silica in gerboxes and a metal screen, to obtain the initial weight of the seeds that lasted 51 hours. The physiological and biochemical variables were: percentage of germination (GER), percentage of normal seedlings (PN), percentage of abnormal seedlings in the first count (PA), final percentage of abnormal seedlings (GERA), accelerated aging of seedlings (CP); electrical conductivity (EC); germination velocity index (IVG) and mean germination time (TMG), superoxide dismutase (SOD); total sugars (AT); reducing sugars (AR); total proteins (PT); hydrogen peroxide (H2O2); total proteins of superoxide dismutase (PTSOD). The collected data were submitted to analysis of variance through statistical software Sisvar. In general, the biochemical and physiological quality of the peanut seeds is reduced as the water absorption period increases, followed by drying. The cultivar IAC 505 showed higher tolerance to desiccation among the varieties analyzed.

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Figura 1 - Grupos botânicos Virgínia (porte rasteiro (A) e Valência (porte ereto (B)). ... 16

Figura 2 - Vagens da cultivar de amendoim BR1. ... 18

Figura 3 - Vagens e grãos da cultivar de amendoim BRS 151 - L7. ... 19

Figura 4 - Vagens e grãos da cultivar de amendoim IAC 505. ... 19

Figure 5 - Rápida absorção de água (I), efeitos metabólicos (II) e crescimento do eixo embrionário (III). ... 21

Figura 6 - Esquematização do protocolo utilizado para a classificação fisiológica de sementes quanto à tolerância à dessecação ou armazenamento. ... 22

Figura 7 - Pesagem de 50 sementes (A), sementes para embeber em papel germitest (B) e rolos de papéis germitest na BOD (C). ... 26

Figura 8 - Protusão radicular das sementes de amendoim... 27

Figura 9 - Pesagem da sílica (A), sílica dentro da caixa gerbox (B), rede metálica de sustentação de sementes (C), coloração da sílica para troca (D), distância da rede para sílica (E), sementes após curva de embebição (F), caixas gerbox com sementes, cobertas com papel alumínio para secagem (G), pesagem das sementes (H) e sementes secas com radícula (I). ... 28

Figura 10 - Obtenção da condutividade elétrica (CE) das sementes de amendoim das cultivares BR1; BRS 151-L7 e IAC 505. ... 29

Figura 11 - Sementes sobre tela e água em caixa gerbox para envelhecimento acelerado (A), caixas das sementes cobertas por papel alumínio (B) e rolo com sementes em teste de germinação após o envelhecimento (C)... 30

Figura 12 - Espectrofotômetro Thermo biomate 3s fechado (A), aberto (B) e cubetas (C). .... 36

Figura 13 - Curvas de embebição (A) e secagem (B) de sementes das cultivares de amendoim. ... 38

Figura 14 - Variáveis porcentagem final de plântulas anormais (GERA) (A), índice de velocidade de germinação (IVG) (B), peróxido de hidrogênio (H2O2) (C) e proteína totais do superóxido dismutase (PTSOD) (D) em função de períodos de secagem de amendoim. ... 42

Figura 15 - Análise de regressão das variáveis plântulas normais (PN) (A), porcentagem de plântulas anormais (PA) (B), porcentagem de germinação (GER) (C), condutividade elétrica (CE) (D), em relação a interação dos fatores períodos de secagem e cultivares de amendoim. ... 43

Figura 16 - Análise de regressão das variáveis comprimento de plântulas (CP) (A), envelhecimento acelerado (EA) (B), açúcares redutores (AR) (C) e proteínas totais (PT) (D), em relação a interação dos fatores períodos de secagem e cultivares de amendoim... 45

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Tabela 1 - Reagentes para serem utilizados no tampão de extração (50mL) ... 30

Tabela 2 - Meio de Reação (250mL) ... 31

Tabela 3 - Curva padrão do método solúveis totais (AT) ... 32

Tabela 4 - Curva padrão para açúcar redutor (AR) ... 33

Tabela 5 - Curva Padrão para proteínas totais (PT) ... 34

Tabela 6 - Preparo do TCA 0,1% e H2O2 (1,1 mM) ... 34

Tabela 7 - Curva padrão do Peróxido de Hidrogênio ... 35

Tabela 8 - Curva padrão para proteínas solúveis totais ... 36

Tabela 9 - Resumo da análise de variância para as variáveis: porcentagem de plântulas normais (PC), GER, PCA, GERA, CE, IVG, TMG, CP, em função de cultivares e períodos de em sementes de amendoim. ... 39

Tabela 10 - Resumo da análise de variância para as variáveis: EA, SOD, ACUT, ACR, PTNT, PERO, PTNSOD, em função de cultivares e períodos de secagem em sementes de amendoim...39

Tabela 11 - Teste de média para o fator cultivar em relação as variáveis: GERANOR, IVG, TMG, PERO, PTNSOD, em função de cultivares e períodos de secagem em sementes de amendoim. ... 40

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1 INTRODUÇÃO ... 11

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 13

2.1 O Amendoim no Brasil ... 13

2.2 O amendoim (Arachis hipogaea L.) ... 16

2.3 Germinação e Dessecação de Sementes ... 19

3 MATERIAL E MÉTODOS ... 26

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 38

5 CONCLUSÕES ... 47

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1 INTRODUÇÃO

O amendoim (Arachis hypogaea L.) é uma planta pertencente à família Fabaceae. Caracteriza-se como uma cultura de alto valor econômico. Seus derivados são apreciados mundialmente devido ao alto valor nutricional e energético, além de apresentar subprodutos comumente utilizados na alimentação de bovinos e na fabricação de fertilizantes (FAO, 2011). O Brasil semeou em 2018, cerca de 138,5 mil hectares de amendoim, atingindo uma produção de 511,4 mil toneladas de grãos, apresentando um rendimento médio de 3.693 kg ha. A região Sudeste do Brasil caracteriza-se como a maior produtora, destacando-se o estado de São Paulo, responsabilizando-se por 90% da produção nacional. Estima-se que 82% das áreas de reforma de canaviais paulistas sejam ocupadas pela cultura do amendoim. Nesta mesma safra, a área plantada no Nordeste correspondeu a 2,2 mil hectares, com uma produtividade de 995 kg ha-1, concentrada principalmente nos estados da Bahia, Ceará e Pernambuco (CONAB, 2018).

Dentre os principais fatores que afetam a produção de amendoim, destaca-se o manejo de sementes antes do plantio e grãos após a colheita, principalmente a dessecação de sementes. O termo tolerância à dessecação pode ser definido como a capacidade de um organismo tolerar a secagem e reativar o seu metabolismo normalmente após a reidratação (ALPERT, 2000; PENCE, 2002; BARTELS, 2005). Em espécies vegetais, essa capacidade é mais comum em grãos de pólen, sementes e esporos, ocorrendo raramente em indivíduos adultos (ALPERT, 2000). Quanto à capacidade de tolerarem a secagem e o armazenamento, as sementes podem ser classificadas em três grupos: ortodoxas (tolerantes), recalcitrantes (sensíveis) e intermediárias (ROBERTS, 1973; ELLIS et al., 1990).

Em grande parte das espécies vegetais, o desenvolvimento da semente só é considerado completo após o período de secagem. Na ausência deste período, as sementes permanecem dormentes. Sementes que toleram esta secagem são denominadas de ortodoxas. O desenvolvimento destas sementes pode ser dividido em duas fases: fase inicial, quando a secagem é letal, e a fase subsequente, que vai até o final do desenvolvimento da semente, onde a mesma pode tolerar a dessecação, ou seja, mantém a capacidade de germinar quando desidratada e reidratada (BEWLEY; BLACK, 1994).

Salienta-se que a água é fator fundamental para a semente, participando de vários eventos metabólicos relacionados à estabilidade de membranas, bem como na conformação de proteínas. Quando removida abaixo do limite suportado pela célula, podem ocorrer danos aos microtúbulos (FARIA et al., 2004), aumento da concentração dos solutos; alteração do pH

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Intracelular, aceleração de reações degenerativas, desnaturação de proteínas e perda da integridade de membranas, causando danos irreversíveis (SUN e LEOPOLD, 1997).

A compreensão dos mecanismos de tolerância à dessecação é de suma importância para o estabelecimento de estratégias para a conservação de sementes (BOVI et al., 2004), uma vez que há um número considerável de espécies vegetais de interesse, como é o caso do amendoim (TWEEDLE et al., 2003).

A tolerância a dessecação é importante no conhecimento de sementes que toleram ou não a seca em diferentes estágios da germinação em função do aumento do tempo de embebição, porém, sementes que pertencem a habitat seco e de baixa precipitação, por uma questão de adaptação, tendem a tolerar a dessecação em maiores níveis. Baixos conteúdos de água podem prolongar, por períodos maiores, a viabilidade das sementes. Torna-se um desafio conseguir que as sementes, após certo tempo, ainda apresentem elevada qualidade fisiológica (VILLELA; PERES, 2004).

A capacidade das sementes ortodoxas de suportarem a redução do teor de água geralmente é dependente da taxa de secagem, a qual tem mostrado afetar a sobrevivência das sementes. Dessa forma, discute-se a importância da secagem na maturação em relação ao vigor das sementes. Teoricamente, a tolerância à dessecação tende a aumentar com o número de mecanismos de proteção em atividade de tal modo que, provavelmente, exista um gradiente de tolerância dependente da interação efetiva entre os mecanismos que estão presentes (BERJAK; PAMMENTER, 2000).

A identificação de genótipos com alta produtividade, estabilidade de produção e ampla adaptabilidade aos mais variados ambientes, torna o procedimento indispensável para se assegurar maior confiabilidade na recomendação de cultivares (CRUZ; CASTOLDI, 1991; SUDARIC et al., 2006).

Dado o exposto, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar a influência de diferentes períodos de embebição e secagem na capacidade de tolerância à dessecação em sementes de cultivares de amendoim (Arachis hypogaea L.).

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2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 O Amendoim no Brasil

O Brasil já ocupou a sétima posição mundial no ranking da produção de amendoim, com a produção de 956 mil toneladas obtida em 1972. Esse quantitativo é um marco na história do amendoim brasileiro, e até hoje se busca repeti-lo. A perda de posições relativas naquele ranking ocorreu em função da contaminação de grãos por aflatoxina, a maior disponibilidade de óleo de soja no mercado alimentar brasileiro e a queda do preço do produto nos mercados interno e externo, o que desestimulou o plantio. Assim, a partir de 1974 ocorreu forte redução da área plantada e da produção, caindo até a cifra de 137 mil toneladas de amendoim em casca na safra de 1997 (CONAB, 2012).

No Brasil, a cultura é explorada em larga escala no Estado de São Paulo, respondendo por cerca de 90% da produção. A região Nordeste detém cerca de 10%, a maioria conduzida por pequenos produtores que vivem da agricultura familiar (SANTOS et al, 2005). Para as condições climáticas dessa região, onde as adversidades de clima são expressivas, o amendoim se constitui numa excelente alternativa agrícola. As cultivares precoces desenvolvidas pela Embrapa têm apresentado grande adaptação e estabilidade em ambientes semi-áridos (SANTOS et al. 1999; NOGUEIRA et al. 1998; NOGUEIRA; SANTOS, 2000).

Os tipos de amendoim cultivados no Brasil, são de hábito de crescimento ereto, e são cultivados em razão do menor ciclo (em torno de 90 dias) e da facilidade na colheita. Outro tipo utilizado é o de hábito rasteiro, com maior produção no país, sendo mais concentrado nas regiões Sudeste e Centro-Oeste, em sistemas de cultivo tecnificados; cultivares deste tipo, embora mais produtivas, têm ciclo longo (entre 130 e 150 dias) e, frequentemente, menor adaptação às condições de clima do Nordeste (GODOY et al., 2005). Para a região nordeste, os tipos eretos são mais recomendados pela maior adaptação climática e menor ciclo. Em programas de melhoramento voltados para o Nordeste, Santos et al. (2005) reportaram que a associação dessas características, aliadas à produtividade e precocidade, é imprescindível na obtenção de uma cultivar.

O amendoim (Arachis hypogaea L.) é uma das principais oleaginosas cultivadas no Brasil e no mundo, e considerada uma das mais importantes culturas entre as leguminosas, ao lado do feijão e da soja (Henriques Neto et al., 1998). No Brasil, em especial no Nordeste, essa oleaginosa tem sido tradicionalmente cultivada em condições de agricultura de sequeiro, sujeita aos elevados riscos causados pelas variações do clima. A cultura mostra-se bem adaptada à seca

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e observa-se que dentro da espécie podem existir genótipos mais aclimatados a condições de baixa disponibilidade hídrica, em função das características morfológicas e fisiológicas (ARAÚJO; FERREIRA, 1997).

Segundo Hsiao (1973), as plantas cultivadas no campo estão sujeitas a déficit hídrico, normalmente traduzido por alterações metabólicas, cuja importância depende da sua intensidade e duração, incluindo a redução do desenvolvimento das células, expansão das folhas, transpiração e redução na translocação de fotoassimilados e apresenta-se, dentre todos os fatores ambientais, o que mais frequentemente limita o desenvolvimento das culturas.

Em relação ao Nordeste brasileiro, o cultivo muitas vezes é adotado sob condições de sequeiro, de forma solteira ou consorciada com outras culturas, como o milho, no período das águas (SANTOS et al., 1976). Na região destaca-se nos cultivos as variedades BR1, BRS 151 L-7 e BRS Havana, por adequarem-se a umidade relativa do ar em torno de 70%, temperaturas entre 20 e 30 °C, e precipitação pluvial acima de 500 mm/ano (AMARAL et al., 2005). O estado de Alagoas não apresenta tradição no cultivo do amendoim, porém, a cultura torna-se uma alternativa em áreas de renovações de canaviais por agregar características favoráveis à cultura da cana de açúcar, principalmente, em relação as condições edáficas (CONAB, 2011).

Melo (2013) afirma que conhecer as condições edáficas é fator relevante no planejamento da cultura, bem como, o sistema de cultivo mais indicado. No Brasil, o amendoim é cultivado em quase todos tipos de solo, entretanto, o melhor rendimento é obtido em solos bem drenados, com fertilidade razoável e textura arenosa, favorecendo a penetração dos ginóforos, o desenvolvimento de vagens e a redução de perdas na colheita. Além do solo, condições climáticas também atuam preponderantemente sobre a produção da cultura, principalmente no Nordeste brasileiro, onde à instabilidade das chuvas põe em risco os cultivos, que geralmente ocorrem em sequeiro, ocasionando baixa produção.

O valor econômico do amendoim está ligado ao fato dos grãos possuírem sabor agradável e serem ricos em óleo (cerca de 50%) e proteína (22 a 30%). Além disso, contêm carboidratos, sais minerais e vitaminas B e E, constituindo-se num alimento altamente energético (585 calorias/100g). O sabor agradável torna o amendoim um produto destinado ao consumo tanto “in natura” como processado (aperitivos salgados, torrados e doces). Os grãos também são utilizados para a extração de óleo, empregados diretamente na alimentação humana, na indústria de conservas, em produtos medicinais, na indústria de tintas e tem potencial na produção de biodiesel (BULGARELLI, 2008).

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A nível mundial, a China destaca-se como o maior produtor de amendoim, representando 36,4% da produção global, enquanto a produção brasileira corresponde a cerca de 1,1% (FAO, 2019). A produção brasileira de amendoim encontra-se distribuída em 10 estados e suas atividades de plantio e colheita se distribuem ao longo de todo o ano. Porém, os principais estados na produção nacional de amendoim são: São Paulo, Minas Gerais, Paraná e Rio Grande do Sul, representando cerca de 95% da produção nacional na safra (IBGE, 2016).

Na região Nordeste o cultivo do amendoim é uma atividade de grande interesse por parte de pequenos e médios agricultores que vivem da agricultura familiar, caracterizando-se assim como uma cultura de elevada importância socioeconômica (GRACIANO et al., 2011).

Bulgarelli (2008) afirma que o amendoim no Brasil possui alta relevância, pois, além de atender as necessidades internas, apresenta boas perspectivas de aumento de participação no mercado externo, devido à valorização do produto. Ainda, afirma ser importante a intensificação de pesquisas, com o intuito de aumentar os conhecimentos técnico-científicos que possibilitem elevação da produtividade, proporcionando preços competitivos de mercado e retorno econômico compensador.

De acordo com Martins (2006), durante a década de 1960, o Brasil destacava-se como importante produtor mundial de amendoim e um dos maiores produtores de óleo de amendoim. Entretanto, as políticas agrícolas implementadas em resposta ao cenário macroeconômico nacional e internacional, durante as décadas de 1970 e 1980, voltadas a favorecer o desenvolvimento de culturas de exportação, consistiram num dos principais fatores que contribuíram para o declínio da cultura no Brasil (FREITAS; MARGARIDO; NEGRI NETO, 2004; BACHA, 2003).

De acordo com Freitas e Amaral (2002), houve a partir da década de 1990 uma mudança no mercado de amendoim que passou a ser destinado à indústria de confeitos, exigindo padrões de segurança e qualidade de produto. Martins (2006) aponta essa fase como período de grande demanda por novas tecnologias que pudessem suprir o mercado, como novas cultivares, técnicas de manejo, colheita e pós-colheita.

Os produtores estão em busca de técnicas agrícolas que permitam maior produtividade e menor custo de produção. A introdução de novas cultivares tem contribuído para o aumento de produtividade e para o atendimento às especificidades do mercado externo (MARTINS, 2006). A cadeia produtiva do produto também tem assumido um arranjo diferente devido ao crescimento da demanda pelo produto in natura pela indústria de confeitos nacional e das exportações. Tais mercados, mais exigentes em qualidade, têm ditado a dinâmica da cadeia na

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busca de mecanismos de coordenação adequados à sua gestão, como a necessidade de rastreabilidade de produtos, selos e certificações.

2.2 O amendoim (Arachis hipogaea L.)

O gênero Arachis destaca-se na produção de amendoim. Este gênero caracteriza-se por apresentar folhas tetrafoliadas, caules eretos ou decumbente, ciclo anual ou perene, diploidia e tetraploidia. A análise do conhecimento taxonômico e fitogeográfico, resultante de pesquisas direcionadas ao melhoramento genético do amendoim, tem se voltado para questões intrigantes a nível multidisciplinar, algumas das quais requerem ser analisadas a partir de conhecimentos arqueológicos. No Brasil dois tipos botânicos, o Valência (porte ereto) e o Virgínia (rasteiro), são mais comercialmente cultivados (Figura 1). O grupo Spanish tem pouca expressão econômica no país (FERREIRA, 2014).

Figura 1 - Grupos botânicos Virgínia (porte rasteiro (A) e Valência (porte ereto (B)).

Fonte: http://infoamendoim.com.br. Acesso em: 19 nov. 2018.

O grupo Valência apresenta porte ereto, ciclo curto, sementes de tamanho médio, tegumento de coloração vermelha, 3 a 5 sementes por vagem, apresentam nós produtivos tanto na haste principal como nas ramificações (SILVEIRA, 2010). Plantas do grupo Virgínia podem apresentar porte ereto ou rasteiro, ciclo longo, vagens geralmente com duas sementes grandes, coloração bege, presença de dormência e ausência de flores na haste principal (GODOY et al., 2005). O grupo Spanish apresenta porte ereto, ciclo curto e sementes de tamanho pequeno, com coloração vermelha, e geralmente, duas sementes por vagem e nós produtivos tanto na haste principal como nas ramificações (SILVEIRA, 2010).

Virgínia Valência

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Graciano et al. (2009) afirmam que o amendoim é uma planta alotetraplóide, que se reproduz quase que exclusivamente por autogamia, ereta ou prostrada, anual, com ciclo entre 90 e 160 dias, atingindo altura da haste principal entre 50 a 60 cm. Desenvolve-se logo após a germinação, um ramo principal que se origina da gema apical do epicótilo e dois ramos laterais originados a partir das gemas axilares aos cotilédones. Cerca de 30 dias após a emergência observa-se o início da ramificação alternada ou sequencial. Ainda, apresenta folhas compostas, pinada, com dois pares de folíolos inseridos num pecíolo de 4 a 9 cm. A inserção dos folíolos é oposta, apresentando a forma elíptica e lanceolada, dependendo da cultivar. Os estômatos estão presentes nas duas superfícies foliares, adaxial e abaxial. A flor é completa, perfeita, hermafrodita, com corola papilionácea, de coloração amarela, agrupada em números variáveis ao longo do ramo principal ou secundário, conforme a cultivar.

No aspecto fenológico, as fases de crescimento e desenvolvimento nos genótipos do tipo Valência e Virgínia são particularmente definidas, mas podem variar, dependendo do local e das condições climáticas, principalmente da temperatura onde são cultivados. No estado de São Paulo, com semeadura no período das águas (setembro-outubro), os genótipos do grupo Valência iniciam o florescimento geralmente entre os 30 a 32 dias após a semeadura. Nos genótipos do grupo Virgínia, o florescimento e o final do ciclo ocorrem, respectivamente, entre 35 a 40 e entre 120 a 140 dias após a semeadura (EMBRAPA, 2011).

Os frutos são vagens ou legumes estruturalmente deiscentes, mas funcionalmente indeiscentes, uniloculadas, estranguladas, de coloração palha, com superfície reticulada. A casca representa de 25 a 30% do peso dos frutos secos, tem como principal constituinte a celulose e é relativamente pobre em nutrientes (CENTURION; CENTURION, 1998). O número e tamanho das sementes variam entre as cultivares, podendo apresentar diversas colorações e tamanho variados. A semente é constituída de tegumento de cor variável como branco, rosa, vermelho, negro ou manchado. Comercialmente, são mais comuns as de película vermelha, rosa ou castanha. As sementes são provenientes dos óvulos constituídas de dois cotilédones volumosos, ela é a parte de maior interesse econômico, devido ao seu elevado teor de óleo comestível, ultrapassando 40% em algumas variedades e cerca de 20% de proteínas (GODOY et al. 2005).

A cultivar BR1, lançada em 1994, ganhou destaque por substituir a cultivar tradicional Tatu no Nordeste. A cultivar Tatu apresenta alto teor de óleo, porém, baixa adaptabilidade às condições de estresse hídrico, ponto este em que a cultivar BR1 se sobressai. Para compor esta cultivar, utilizou-se um bulk formado pelos genótipos CNPA 95 AM, CNPA 96 AM e Sapé

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Roxo, todos com ciclo em torno de 89 dias após emergência e altamente adaptados às condições edafoclimáticas do Nordeste (LUCENA NETO, 2013). A cultivar BR1 pertence ao grupo Valência, de porte ereto, possuindo haste principal com 35 cm, arroxeada, com seis ramos laterais. As folhas são de tamanho médio e coloração verde-escuro característico. As flores possuem estandarte amarelo ouro com enervações de coloração vinho ao centro. As vagens são de tamanho médio, com pouca reticulação e bico quase ausente, possuindo de três a quatro sementes vermelhas, de tamanho médio e arredondado (SANTOS et al., 2009) (Figura 2).

Figura 2 - Vagens da cultivar de amendoim BR1.

Fonte: https://www.google.com/amendoimBR1. Acesso em: 05 mar. 2019.

A cultivar BRS 151 L7 foi lançada em 1998, apresenta porte ereto, com cerca de 45 cm. As hastes e os ginóforos são de coloração verde-arroxeado. As vagens são de tamanho médio, possuindo sementes vermelhas e grandes, normalmente possuindo dois grãos por vagens. Apresenta boa tolerância ao estresse hídrico, sendo cultivada tanto em sequeiro como irrigada. Em regime de sequeiro, apresenta produtividade média de 1.850 kg ha-1. Em regime irrigado pode atingir uma produção potencial em torno de 4.500 kg ha-1 (EMBRAPA, 2019) (Figura 3)

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Figura 3 - Vagens e grãos da cultivar de amendoim BRS 151 - L7.

Fonte: https://ruralpecuaria.com.br. Acesso em: 05 mar. 2019.

A cultivar IAC 505, caracteriza-se como uma planta de hábito de crescimento rasteiro, com ramificação espessa, ciclo longo (130 a 135 dias) e de crescimento indeterminado, em relação a qualidade dos grãos, possui a característica “Alto Oleico” (70 a 80 % de ácido oleico no óleo), propiciando prolongamento da “vida de prateleira” do produto, ponto importante na sua comercialização. Apresenta produtividade média de 4.500 kg ha-1, e potencial de 6.000 kg ha-1 (IAC, 2019).

Figura 4 - Vagens e grãos da cultivar de amendoim IAC 505.

Fonte: http://oagronomico.iac.sp.gov.br. Acesso em: 05 mar. 2019. 2.3 Germinação e Dessecação de Sementes

Na literatura encontra-se uma gama de definições para o termo germinação, porém, a definição deste termo depende da forma como é abordado. Em aspectos fisiológicos,

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finaliza-se no momento da protrusão da radícula, enquanto no ponto de vista tecnológico, a germinação só é encerrada, após a formação evidente da radícula, cotilédone, eixo principal e folha superior (MARCOS FILHO, 2005).

A qualidade fisiológica das sementes deve ser preservada até o momento da semeadura, permitindo o uso de espécies vegetais em épocas e locais diferentes aos de sua origem (KOHOMA et al., 2006; YUYUAMA et al., 2011). O alto teor de água apresentado pelas sementes após a coleta constitui uma das principais causas da perda do potencial germinativo, causando aumento na taxa respiratória e favorecendo ação de microrganismos (DESAI et al., 1997).

Analisando do ponto de vista fisiológico, a germinação é dividida em três fases: embebição, alongamento celular e divisão celular. Em nível fisiobioquímico, o processo de germinação é dividido em fases de reidratação, aumento da respiração, ativação das enzimas, digestão enzimática de reservas, mobilização e transporte de reservas, assimilação metabólica e crescimento e diferenciação dos tecidos (CASTRO et al., 2004).

O processo de embebição possui um padrão trifásico. A primeira fase é caracterizada pela rápida absorção de água pelas sementes, devido à diferença de potencial matricial encontrada nos tecidos da semente. Nessa fase ocorre o início da degradação dos nutrientes de reserva e consequentemente o crescimento do embrião. Durante a fase II, inicia-se o transporte ativo de substâncias desdobradas na fase anterior, do tecido de reserva para o tecido meristemático. Como não ocorre grande diferença entre os potenciais hídricos entre o substrato e a semente, a embebição da semente é quase nula. Já a fase III é caracterizada pelo início do crescimento do eixo embrionário e posterior protrusão da radícula. Para que isso ocorra às substâncias processadas durante a fase I e transportadas na fase II são reorganizadas em substâncias processadas em mais complexas que formam o citoplasma, o protoplasma e as paredes celulares (BEWLEY; BLACK, 1994) (Figura 5).

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Figure 5 - Rápida absorção de água (I), efeitos metabólicos (II) e crescimento do eixo embrionário (III).

Fonte: Adaptado de Nonogaki et al. (2010) e Bove et al. (2001). Acesso em: 11 nov. 2018.

O desenvolvimento da semente e a germinação são estádios fisiológicos distintos no ciclo de vida da planta e mostram diferenças marcantes. O metabolismo durante o desenvolvimento da semente é predominantemente anabólico, com massivo processo de síntese e deposição de reservas de polímeros nos tecidos. Enquanto na germinação, há mobilização destas reservas e são observadas mudanças qualitativas e quantitativas nas enzimas catabólicas. Os produtos deste processo degradativo são utilizados como substrato e fonte de energia para o desenvolvimento das plântulas. Esta distinção entre as duas fases implica na existência de uma chave (switch) para efetuar a transição (JIANG; KELMODE, 1994).

Em relação ao processo dessecação, a tolerância à dessecação pode ser definida como a tolerância de sementes a condições de baixa disponibilidade hídrica, bem como a habilidade de germinar após rápida secagem (MARCOS FILHO, 2005; PEREIRA, 2011). A tolerância à dessecação é um importante estudo para o conhecimento de sementes que toleram ou não a seca, em diferentes estágios da germinação (BLACK, 1999). De forma geral, ocorre aumento da sensibilidade à dessecação em função do aumento do tempo de embebição das sementes, porém, sementes que pertencem a habitat seco e de baixa precipitação, por uma questão de

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adaptação, tendem a tolerar a dessecação em maiores níveis da germinação dependendo da espécie ou família (DEMIR; ELLIS, 1992; SANHEWE; ELLIS, 1996).

Nos últimos anos, vários estudos começaram a ser realizados visando o comportamento de sementes ortodoxas, principalmente nos aspectos fisiológicos e bioquímicos, incluindo a tolerância à dessecação (BERJAK et al. 1990; LEPRINCE et al. 1993; ELLIS et al. 2003; NEVES 1994; KERMODE,1997).

Atualmente as sementes são classificadas em três categorias quanto ao seu comportamento durante a dessecação ou armazenamento: sementes ortodoxas, que toleram dessecação a baixos conteúdos de água (2% - 5%) e podem ser armazenadas em baixas temperaturas (-20 ºC), condições que maximizam o tempo de armazenamento; sementes intermediárias, que não toleram a dessecação a baixos conteúdos de água (10% - 12 %), mas que podem ser armazenadas a baixas temperaturas (geralmente acima de 0 ºC); e sementes recalcitrantes, comuns entre as espécies florestais da região tropical, as quais não toleram dessecação a baixos conteúdos de água (<12%), nem o armazenamento a baixas temperaturas (ROBERTS 1973; ELLIS ET AL., 1990; HONG ET AL., 1996; SACANDÉ ET AL.; 2004) (Figura 6).

Figura 6 - Esquematização do protocolo utilizado para a classificação fisiológica de sementes quanto à

tolerância à dessecação ou armazenamento.

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A capacidade de tolerar a secagem ocorre nos mais diversos tipos de organismos, sendo que nas espécies vegetais é mais comum em sementes ortodoxas, grãos de pólen e esporos, e em alguns casos pode vir a ocorrer em algumas plantas no estado vegetativo (KERMODE, 2002). Sementes capazes de tolerar a secagem e congelamento são classificadas como ortodoxas, sendo assim é possível realizar o armazenamento por períodos longos e em condições de baixa umidade mantendo a germinabilidade (ROBERTS, 1973).

O momento da perda da tolerância à dessecação em uma semente ortodoxa em processo germinativo varia muito em função da espécie, podendo ser antes, depois ou durante a protrusão radicular (BARBEDO et al., 2002; CORBINEAU et al., 2004). Em geral, sementes ortodoxas toleram a secagem durante o processo de germinação, sendo possível a perda de água pela semente durante as fases I e II da embebição (CASTRO et al., 2004). Ao longo do processo germinativo e a subsequente protrusão da radícula, em geral ocorre perda ou redução na capacidade da plântula em tolerar a dessecação. Segundo Vinayachandra e Chandrashekar (2011), relatam que a longevidade das sementes, sensibilidade à dessecação e ao congelamento são pré-requisitos para a conservação de espécies de plantas que, geralmente, produzem sementes não ortodoxas. A longevidade das sementes e o comportamento de muitas espécies selvagens e semi-domesticadas de regiões tropicais tem sido documentada por vários autores.

A tolerância a dessecação pode ser definida como a tolerância de sementes a condições de baixa disponibilidade hídrica (MARCOS FILHO, 2005). Onde a tolerância à dessecação é um importante estudo para conhecimento de sementes que toleram ou não à seca, em diferentes fases da germinação (BLACK, 1999).

A dessecação apresenta como vantagem à semente, a possibilidade de sobreviver e colonizar ambientes com menor disponibilidade hídrica, como ocorrência de secas sazonais. Assim, existe forte seleção por organismos tolerantes à dessecação para colonizar a terra (ALPERT, 2005). Dessa forma, plantas como o amendoim que produzem sementes ortodoxas foram selecionadas para sobreviver em condições adversas, sendo capazes de permanecer viáveis por períodos de seca, até que haja água e outros condições favoráveis para seu desenvolvimento (BILIA, 1998).

A redução do teor de água é um dos fatores essenciais que influenciam na variação das propriedades físicas dos materiais vegetais durante a secagem (RESENDE et al., 2005). Desta forma, informações como: tamanho, volume, porosidade e massa específica, entre outras, são ferramentas imprescindíveis no estudo envolvendo transferência de calor e massa e movimentação de ar em uma massa de grãos (GONELI et al., 2011).

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O conhecimento da secagem em grãos é bastante relevante para poder saber se estas por sua vez pode ocorrer danos ou não na sua estrutura celular, consequentemente se refletindo em uma produção que possa futuramente determinar a produção de uma cultura ou espécie. De acordo com Mayor & Sereno (2004), a redução do teor de água do produto pode causar danos em suas estruturas celulares tanto quanto variações na forma e redução em suas emissões.

A secagem é uma das etapas mais relevantes durante a fase pós-colheita de produtos agrícolas, torna-se imprescindível o conhecimento do comportamento das propriedades físicas dos grãos e frutos de amendoim. Neste sentido, inúmeros autores têm investigado as variações das propriedades físicas em função do teor de água e de outros fatores durante a secagem, para diversos produtos (CORRÊA et al., 2006; RAZAVI et al., 2007; MILANI et al., 2007; KIBAR; ÖZTÜRK, 2008; TAVAKOLI et al., 2009; LANARO et al., 2011; BANDE et al., 2012).

O dessecamento constitui um evento integrante do processo do desenvolvimento da maioria das sementes, especialmente as ortodoxas (KERMODE et al., 1986). Nesse grupo, o desenvolvimento só se completa quando a semente apresenta baixos teores de umidade. Possivelmente o dessecamento tem um papel fundamental na interrupção dos processos de desenvolvimento essenciais para a germinação, pois a reidratação de sementes quiescentes conduz à germinação (BEWLEY; BLACK, 1994).

Um considerável número de espécies vegetais conhecidas apresenta algum grau de sensibilidade à dessecação (ELLIS, 1996). Dessa forma, a compreensão dos mecanismos da tolerância à dessecação em sementes é de grande importância para o estabelecimento de técnicas para sua conservação (BOVI et al., 2004).

A cultura do amendoim possui rápida capacidade de recuperação, sendo que 24 horas após a irrigação as folhas restabelecem a turgescência foliar e a atividade estomática (PALLAS et al., 1979; TÁVORA; MELO, 1991), porém, esta característica é governada geneticamente, ocorrendo diferenças entre materiais genéticos. Um dos resultados obtidos por Nogueira e Dos Santos (2000), foi que plantas irrigadas após 60 dias de estresse hídrico recuperaram a turgescência foliar e a atividade estomática em 48 horas. Verificou-se ainda que a cultivar BR1 é a que mantém resistência estomática menor, apresenta os menores valores de potencial hídrico foliar, que leva a crer que seja a variedade mais adaptada à região Nordeste.

Graciano (2009) verificou que a cultivar BR1 apresentou maior acúmulo de solutos orgânicos osmoticamente ativos, maior redução do potencial hídrico foliar e sofreu menores alterações no crescimento quando comparada com a cultivar BRS Havana. A ocorrência de déficit hídrico nas fases de crescimento e desenvolvimento dos ginóforos e das vagens na

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cultura resulta em decréscimo na produção, primariamente pela redução do número de vagens, antes mesmo que pela massa das vagens e sementes (BOOTE et al., 1976; PALLAS et al., 1979). O déficit hídrico pode afetar negativamente o conjunto das funções fisiológicas da planta, como a fotossíntese, respiração e outras reações metabólicas, que podem repercutir diretamente nas variações anatômicas (estômatos), no crescimento, na reprodução e no desenvolvimento das plantas, de modo geral, particularmente nos frutos e sementes e, consequentemente, na produtividade (SILVA; BELTRÃO, 2000).

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3 MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi conduzido no Laboratório de Fisiologia Vegetal da Universidade Federal de Alagoas (UFAL) - Campus de Arapiraca (coordenadas geodésicas: 9°45'58” de latitude sul, 35°38'58” de longitude oeste, 324 m de altitude) no período de maio de 2018 a fevereiro de 2019. Adotou-se no experimento o delineamento inteiramente casualizados (DIC), em esquema fatorial 3 x 5, com quatro repetições. Foram estudadas três cultivares de amendoim (BR1, BRS 151-L7 e IAC 505) e cinco períodos de embebição das sementes (0, 12, 24, 36 e 48 horas). Utilizou-se um total de 15 kg de sementes de amendoim no experimento, dos quais 4,0 kg de sementes da cultivar BR1, 5,5 kg da cultivar IAC 505 e 5,5 kg da cultivar BRS 151-L7. Sendo escolhidas essas variedades devido as da EMBRAPA BR1 e BRS serem as mais cultivadas no Nordeste e a IAC 505 devido ser outra variedade que é bem valorizada no sudeste e sul do Brasil, para que assim se possa conhecer estas que são bem valorizadas nessas regiões e conhecer melhor suas diferenças.

Na obtenção dos períodos de embebição (curva de embebição) das sementes para posterior dessecação, foram pesadas 50 sementes de cada cultivar e colocadas para embeber em papel germitest (Figura 7A e B), está por sua vez foi feita de duas vezes, para que pudesse dar tempo de fazer todos os testes das variáveis (ter material para os testes). O papel germitest foi confeccionado em forma de rolo, composto por três folhas e adicionados 50 ml de água destilada para 50 sementes. Os rolos foram postos em recipientes, cobertos por plástico para manutenção da umidade dentro de câmaras BOD com temperatura regulada para 25ºC, na presença de luz (Figura 7C).

Figura 7 - Pesagem de 50 sementes (A), sementes para embeber em papel germitest (B) e rolos

de papéis germitest na BOD (C).

Fonte: Autor, (2018).

Realizou-se a pesagem a cada 2 horas até o período final de 48 horas, onde considerou-se a protrusão radicular, quando as considerou-sementes obtiveram 2 mm de radícula (Figura 8), foi feito esse procedimento para que houvesse o controle de quanto tempo seria para a semente emitir a

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radícula, se baseando em vários pré-testes. De posse dos dados, gerou-se um gráfico da curva de embebição das sementes durante 48 horas para as três cultivares estudadas.

Figura 8 - Protusão radicular das sementes de amendoim.

Na obtenção da curva de secagem utilizou-se as sementes da curva de embebição (cinco períodos). Colocou-se 50 sementes por caixa gerbox sobre uma tela metálica e 70 g de sílica, sendo trocada a cada 12 horas e em seguida a caixa foi tampada e recoberta com papel alumínio e colocado em câmara BOD a 25ºC, com a presença de luz, para secagem até alcançar o seu peso inicial (IAC 505 = 215,5 g; BR1 = 130,7 g e BRS 151 L7 = 127,7 g), com pesagens a cada 2 horas, este por sua vez, para controlar o peso para não ultrapassar assim os desejados (pesos iniciais) (Figura 9).

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Figura 9 - Pesagem da sílica (A), sílica dentro da caixa gerbox (B), rede metálica de sustentação de

sementes (C), coloração da sílica para troca (D), distância da rede para sílica (E), sementes após curva de embebição (F), caixas gerbox com sementes, cobertas com papel alumínio para secagem (G), pesagem das sementes (H) e sementes secas com radícula (I).

Posteriormente aos processos da curva de embebição e secagem, realizou-se a reidratação das sementes, colocando as sementes secas por 24 horas em caixa gerbox sobre tela metálica e 50 ml de água destilada, fechada e coberta por papel alumínio em câmara BOD a 25ºC. Em seguida, as sementes foram colocadas sobre papel germitest umedecido com água destilada (quantidade de água correspondeu a 2,5 vezes o peso do papel seco), posteriormente com 24 horas, observou-se a retomada do crescimento das sementes após os procedimentos aplicados. O processo de curva de Embebição e Secagem teve que ser feito de duas vezes,

A

B

C

D

E

F

(31)

devido a quantidade de sementes ser muito alto e ter que dividir os processos de avaliações fisiológicas e bioquímicas.

Durante a pesquisa avaliou-se as seguintes variáveis fisiológicas: porcentagem de germinação (GER), porcentagem de plântulas normais (PN), porcentagem de plântulas anormais na 1ª contagem (PA), porcentagem final de plântulas anormais (GERA), envelhecimento acelerado (EA) e comprimento de plântulas (CP) (BRASIL, 2009); condutividade elétrica (CE) (VANZOLINI; NAKAGAWA, 1999); índice de velocidade de germinação (IVG) (Maguire,1962); tempo médio de germinação (TMG) (Labouriau, 1983).

Determinou-se o grau de umidade das sementes através de estufa à 105 ± 3°C, durante 24 horas, utilizando-se quatro repetições por amostra de acordo com as Regras para Análises de Sementes (RAS) (BRASIL, 2009), sendo os resultados expressos em percentagem (base úmida). Ainda de acordo com as RAS, montou-se testes de germinação, com quatro repetições de 50 sementes, distribuídas em rolos de papel (germitest), previamente umedecidos com 2,5 vezes seu peso de água destilada, assim tornou-se possível obter as variáveis: porcentagem de germinação, comprimento de plântulas, plântulas normais e anormais.

A condutividade elétrica (CE) foi determinada de acordo com Vanzolini e Nakagawa (2005), em quatro repetições de 50 sementes cada, onde estas foram pesadas e, posteriormente, colocadas para embeber em recipientes plásticos contendo 75 ml de água destilada, sendo mantidos em incubadora BOD a 25°C por 24 horas. Após esse período, a condutividade elétrica da solução de embebição foi obtida com auxílio de um condutivímetro (Figura 10). Onde os resultados foram expressos em S cm-1 g -1 de semente.

Figura 10 - Obtenção da condutividade elétrica (CE) das sementes de amendoim das cultivares BR1;

BRS 151-L7 e IAC 505.

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O índice de velocidade de germinação (IVG) foi determinado conforme Maguire (1962), baseando-se no somatório do número de sementes germinadas a cada dia, dividido pelo número de dias decorridos entre a semeadura e a germinação. Enquanto isso, o tempo médio de germinação (TMG) foi obtido de acordo com Labouriau (1983), onde realizou-se a contagem diária das sementes germinadas até o décimo dia após a semeadura. A variável envelhecimento acelerado (EA), foi determinada de acordo com as RAS (BRASIL, 2009), por meio do acondicionamento de 50 sementes em caixa “gerbox”, sobre uma tela, contendo 75 ml de água na caixa por 48 horas à temperatura de 41 °C. Após este procedimento, as sementes foram colocadas em rolo de papel germitest, obtendo-se a porcentagem de germinação (Figura 11 A, B e C).

Figura 11 - Sementes sobre tela e água em caixa gerbox para envelhecimento acelerado (A), caixas

das sementes cobertas por papel alumínio (B) e rolo com sementes em teste de germinação após o envelhecimento (C).

As variáveis bioquímicas superóxido dismutase (SOD) (Giannopolitis, Reis, 1977); açúcares totais (AT) (YEMM & WILLIS, 1954); açúcares redutores (AR) (MILLER, 1959); proteínas totais (PT) (Bradford, 1976); peróxido de hidrogênio (H2O2) (Alexieva et al., 2001); proteínas totais do superóxido dismutase (PTSOD) (Dubois et al., 1956), foram realizadas de acordo com protocolo de “preparo de soluções e reagentes para análises bioquímicas do Laboratório de Fisiologia Vegetal, campus Arapiraca da Universidade Federal de Alagoas, seguindo os seguintes métodos:

- Atividade da Enzima Superóxido Dismutase (Giannopolitis, Reis, 1977):

Para este teste foi feito a extração, sendo retirado 100 mg do eixo embrionário da semente, após se fazer isto homogeneizou-se do tecido com 1000 µL de tampão de extração, sendo que almofariu-se e pistilo que estiveram devidamente congelados, sendo em seguida transferido para microtubos de 2mL, onde após se fazer este procedimento foi lavado o grau por 2 vezes com 500µL de tampão de extração, onde era mantido em gelo, sendo centrifugado

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a 4ºC, 15.000G, 15 minutos, sendo feito em seguida a retirada cuidadosamente do sobrenadante em um microtubo, onde foi mantido as amostras em gelo, sendo estas por sua vez analisadas no dia e dosada com proteína no extrato.

Tabela 1 - Reagentes para serem utilizados no tampão de extração.

Reagentes [Estoque] (mM) [Meio de extração] (mM) Usar do estoque

TFK (pH 7,8) 105 100 47,6 mL EDTA 100 0,1 50 µL DTT 300 1 833 µL β-Mercaptoetanol 14000 10 53,57 µL Triton X-100 10% 0,1% 500 µL PVPP* --- 30% (p/p) 1 pitada rasa Água --- --- completar p/ 50mL

*Colocar uma pitada do PVPP direto no grau para macerar as amostras. OBS.: Fazer na capela pois o β-Mercaptoetanol é muito tóxico.

Fonte: Protocolo de Preparo de Soluções e Reagentes para Análises Bioquímicas do Laboratório de Fisiologia Vegetal da Universidade Federal de Alagoas, (2018).

O TFK (tampão fosfato de potássio 105 mM, pH 7,8) sendo o tampão de extração, utilizando o monobásico (pesar e dissolver em água deionizada) e o dibásico (pesar e dissolver em água deionizada) se faz o cálculo na obtenção de 250 mL.

136,09g --- 1000mM --- 1000mL 174,18g --- 1000mM --- 1000mL

Xg --- 105mM --- 250mL Xg --- 105mM --- 250mL

X= 3,57235g X= 4,57223g

Tabela 2 - Meio de Reação (250mL):

Reagentes [estoque] (mM) [Meio de reação] (mM) Usar do estoque

TFK (pH 7,8) 55 52,5 238,63 mL

EDTA 1* 0,0001 25 µL

NBT --- 0,0755 0,0153g

Metionina --- 13 0,4849g

Riboflavina 0,1 0,002 5mL

Água --- --- Completar para 250mL

Extrato --- --- x µL

*Diluir EDTA 100mM = 10 µL de EDTA 100mM + 990 µL de água. OBS.: fazer a metionina e o meio de reação no escuro por ser foto lábil.

O TFK (tampão fosfato de potássio 55 mM pH 7,8) sendo a reação monobásico (pesar e dissolver em água deionizada) e o dibásico (pesar e dissolver em água deionizada) em 250 mL.

136,09g --- 1000mM --- 1000mL 174,18g --- 1000mM --- 1000mL

Xg --- 55mM --- 250mL Xg --- 55mM --- 250mL

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Após se fazer todas as reações foi levado para a máquina espectrofotômetro Thermo biomate 3s (Figura 12) no laboratório Labmeg no bloco conhecido com “casa velha”, onde no mesmo foi realizado o branco da máquina sendo 3000µL de meio de reação que fica sempre no escuro, em seguida foi colocado as amostras para tomar uma alíquota do extrato e completar para 3000µL com meio de reação, se fazendo branco da amostra onde foi tomar a mesma alíquota da amostra de meio de extração e completar para 3000µL com meio de reação onde neste teste foi tomado alíquotas de 100 e 200 µL, foram colocados os tubos em câmara com duas lâmpadas fluorescentes de 15watts e ligar por 10 minutos, sendo em seguida feitos as leituras na máquina com 560nm.

OBS.: foram armazenadas o resíduo em frasco âmbar por se tratar de material muito tóxico.

- Método da Antrona (Yemm & Willis, 1954):

Utilizado para quantificação de açúcares solúveis totais (AT)

Para início foi feito o reagente antrona, onde neste por sua vez foi adicionado 40 mg de antrona a 1mL de água destilada e após, 20 mL de H2SO4 concentrado (Este reagente deve ser preparado na hora do uso e sob resfriamento). Após se obter o reagente da antrona, foi utilizado também Glicose 60µg/mL.

Na obtenção da curva padrão conforme a tabela 3, deve-se adicionar primeiramente a solução de glicose e depois o reagente Antrona. Este sistema foi mantido em gelo. Foi agitado os tubos e levá-los ao banho-maria à 100ºC por 3 minutos. Sendo Resfriados a temperatura ambiente ou no gelo e foi feito a leitura em λ = 620nm em espectrofotômetro U.V.

Tabela 3 - Curva padrão do método solúveis totais (AT).

Tubos

Glicose (60 µg / mL) Água Antrona

µg AST (mL) (mL) (mL) 1 0,0 1,0 2,0 0 2 0,1 0,9 2,0 6 3 0,2 0,8 2,0 12 4 0,4 0,6 2,0 24 5 0,6 0,4 2,0 36 6 0,8 0,2 2,0 48 7 1,0 0,0 2,0 60

*Volume reacional = 3 mL. Obs.: Para quantificação de AST em tecidos vegetais pode-se usar alíquotas de até 1,0 mL.

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- Método do Ácido Dinitrosalicílico (Miller, 1959): Utilizado para a quantificação de açúcares redutores (AR)

Para obter os dados dos açúcares redutores (AR) foi primeiramente feito a preparação do reagente DNS, onde este por sua vez foi adicionado 50 mL de hidróxido de sódio (NaOH) 2N a 2,5 g de DNS e aproximadamente 125 mL de água destilada e agitado até à dissolução. Posterior, foi adicionado 75g do sal de Rochelle e completado o volume da solução para 250 mL. Este reagente é instável na presença de luz. Após se fazer a preparação do DNS foi também utilizado os reagentes Ácido dinitrosalicílico, NaOH 2N, Tartarato duplo de sódio e potássio (Sal de Rochelle) e Glicose (10mM).

Na obtenção da curva padrão na tabela 4, foi adicionado o reagente de DNS, agitado a mistura e levado os tubos ao banho-maria a 100ºC durante 5 minutos, após esse tempo foi esfriado a temperatura ambiente e completado o volume para 5 mL com água destilada, se fazendo em seguida a leitura em λ = 540 nm no espectrofotômetro U.V.

Tabela 4 - Curva padrão para açúcar redutor (AR).

Tubos Glicose (10 mM) Água DNS µmol de AR (mL) (mL) (mL) 1 0,0 0,75 0,5 0,0 2 0,1 0,65 0,5 1,0 3 0,2 0,55 0,5 2,0 4 0,3 0,45 0,5 3,0 5 0,4 0,35 0,5 4,0

*Volume reacional = 5 mL. Obs.: Para quantificar AR de tecidos convenientemente preparados, pode-se usar até 0,75 mL de alíquota e seguir as mesmas recomendações para a obtenção da curva padrão.

- Método de Bradford (1976):

Utilizado para quantificação de proteínas totais (PT).

Foi feito para este método primeiramente a preparação do reagente comassie-blue G-250, onde este foi dissolvido 100 mg de Comassie blue em 50 mL de etanol 95%. Foi adicionado 100 mL de H3PO4 85% e completado para 1 L. Foi deixado overnight com agitação constante e filtrado. Dessa forma, as concentrações finais que ficaram foram: 0,01% de Comassie, 8,5% de ácido fosfórico e 4,7% de etanol. (Ácido fosfórico deve ser adicionado ao Comassie dissolvido em etanol e nunca o contrário). Assim foi feito a utilização do Comassie Blue

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G-250, H3PO4 e etanol, além de outro reagente que é o Sono Albumina Bovina (BSA) (1mg/mL ou 10 g/0,1mL). Na obtenção da curva padrão de acordo a tabela 5, deve-se agitar os tubos em vótex e fazer a leitura no espectrofotômetro U.V. em e=595 nm. O procedimento para a obtenção da curva padrão de proteínas utilizando-se como padrão o BSA (1mg/mL).

Tabela 5 - Curva Padrão para proteínas totais (PT).

T BSA (1 mg / mL) Água Comassie Blue G-250 g p

(mL) (mL) (mL) 1 0,00 0,10 5,0 0 2 0,02 0,08 5,0 20 3 0,04 0,06 5,0 40 4 0,06 0,04 5,0 60 5 0,08 0,02 5,0 80 6 0,10 0,00 5,0 100 *Volume reacional = 5,1 mL.

- Método de Quantificação de Peróxido de Hidrogênio (Alexieva et al., 2001):

Para o Peróxido de Hidrogênio foi feito o meio de extração sendo coletado 50mg do eixo embrionário, das sementes, homogeneizando o tecido com 1000 µL de TCA 0,1% e o almofariz e pistilo foram congelados, após se fazer isso foi transferido para microtubos de 2 mL, onde foi lavado o grau com 2 x 500 µL de TCA 0,1%, sendo centrifugado a 4ºC, 10.000G em 15 minutos, após se fazer esse procedimento foi decantado cuidadosamente o sobrenadante em um microtubo, tendo por fim as amostras armazenadas em freezer.

Tabela 6 - Preparo do TCA 0,1% e H2O2 (1,1 mM).

Reagente Preparo

TCA 0,1%

Pesar 50mg de Ácido Tricloacético dissolver em 50mL de água.

(Reagente muito hidrofílico e deve ser pesado rapidamente, usar vidro-relógio pois é um ácido muito corrosivo)

H2O2

(1,1mM)

Diluição 110mM: 10µL de H2O2 P.A. + 990 µL de água deionizada.

Diluição 1,1mM: 10µL da diluição A + 990 µL de água deionizada. Obs: fazer na hora por ser instável, no máximo usar por turno.

Tubos

g proteína Tudos

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Tabela 7 - Curva padrão do Peróxido de Hidrogênio. [H2O2] (µM) H2O2 1,1mM (µL) Tampão Fosfato de Potássio 100mM (µL) KI 1M (µL) 0 0 500 1000 9,9 4,5 495,5 1000 19,8 9 491 1000 29,7 13,5 486,5 1000 39,6 18 482 1000 49,5 22,5 477,5 1000 66 30 470 1000 165 75 425 1000

O meio de reação foi feito com o branco da máquina sendo utilizado de tampão fosfato de potássio 100mM + 1000 µL de KI 1M. Sendo que para a amostra foi tomado uma alíquota do extrato (100 e 200 µL) e completado com tampão fosfato de potássio 100 mM para 500 µL e foi vortexado e adicionado 1000 µL de KI 1M. Também foi realizado o branco da amostra sendo tomado a mesma alíquota do extrato (100 e 200 µL) com TCA 0,1% e completar com Tampão fosfato de potássio 100 mM para 500 µL e vortexado, adicionado 1000 µL de KI 1M. Foi vortexado as amostras e deixado no escuro por 1 h. Sendo por fim, após se fazer todo esse processo foi feito a leitura em espectrofotômetro à 390 nm em cubetas de Quartzo.

- Método de quantificação de proteínas solúveis totais (Dubois et al., 1956):

Foi coletados 50mg do eixo embrionário das sementes das sementes, homogeneizando o tecido com 600 µL de etanol 80%, sendo levado em banho a 70ºC por 90 min (travar os tubos para não abrirem-se), se fazendo em seguida a centrifugação a 25ºC, 15.000G em 10 minutos, sendo decantado cuidadosamente o sobrenadante em um microtubo, onde neste em seguida foi adicionado ao pellet 600 µL de etanol 80%, vortexado e levado ao banho maria a 70ºC por 30 minutos. Após se fazer esse procedimento, foi centrifugado a 25ºC, 15.000G, em 10 minutos, sendo combinado e quantificado os dois sobrenadantes, tendo as amostras armazenadas em freezer.

Na obtenção dos reagentes solução de fenol (5%) e solução padrão de glicose anidra 180 g.mL-1 (1 mmol.L-1 ou 1 mol.mL-1), foi dissolvido em 50 g de fenol em 700 mL de água deionizada e completado o volume para 1000 mL. Onde foi armazenado a solução em frasco escuro, hermeticamente fechado, a qual é válida por mais de um ano, sendo este procedimento feito para solução de fenol (5%), já para a solução padrão de glicose anidra 180 g.mL-1₍₁ mmol.L-1_{ou 1 mol.mL}-1_{), foi dissolvido 0,018g de glicose em cerca de 70mL de água} deionizada e completado o volume para 100 mL.

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Tabela 8 - Curva padrão para proteínas solúveis totais. Concentração (µmol.mL-1₎ Volume do Padrão (µL) Volume de Água (µL) Volume de Fenol 5% (µL) Volume de Ácido Sulfúrico (ml) 0,0 0 500 500 2,5 0,01 50 450 500 2,5 0,02 100 400 500 2,5 0,04 150 350 500 2,5 0,05 200 300 500 2,5 0,07 250 250 500 2,5 0,08 300 200 500 2,5 0,10 350 150 500 2,5

Na utilização da máquina foi feito o branco da máquina onde foi utilizado 500 L de água + 500 L fenol 5%. Sendo feito para a amostra uma alíquota do extrato e completado com água para 500 L e vortexado e adicionado 500L de fenol 5%. O branco da amostra foi tomado alíquota do extrato com etanol 80% e completado com água para 500 L e vortexar, adicionado 500L de fenol 5%. Foi adicionado 2,5 mL de ácido sulfúrico P.A. (H2SO4), devendo-se ser direcionado diretamente contra a superfície da solução para que seja obtida uma boa mistura, deixando os tubos em repouso por 10 minutos, nestes foram vortexados e deixados em bandeja contendo água à temperatura ambiente por 20 minutos, sendo feito por fim a leitura em espectrofotômetro em 490nm com cubetas de vidro.

Após fazer todo o preparo das soluções bioquímicos, realizou-se leitura para obtenção dos resultados dos mesmos no espectrofotômetro Thermo Biomate 3s (Figura 12 A, B e C).

Figura 12 - Espectrofotômetro Thermo biomate 3s fechado (A), aberto (B) e cubetas (C).

Os dados coletados foram submetidos a análise de variância, quando significativos ao nível de 5% de probabilidade de acordo com o Teste F, as variáveis qualitativas foram

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comparadas pelo Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade, e as variáveis quantitativas foram submetidas a análise de regressão (p<0,05).

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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na figura 13A verifica-se a curva de embebição de sementes. Na curva de embebição das três cultivares, a cultivar IAC 505 apresentou um maior peso (g) em relação aos outros materiais no ponto zero, ou seja, 215,5 g, enquanto as cultivares BR1 e BRS 151 L7 apresentaram 130,7 g e 127,7 g, respectivamente. Após o período de embebição de 48 horas, verificou-se um peso final da cultivar IAC 505 de 318,1 g, e para as cultivares BR1 e BRS 151 L7, registrou-se 207,4 e 204,6 g, respectivamente. Outros valores (g), ao longo do processo de embebição, podem ser obtidos através da regressão cúbica.

Figura 13 - Curvas de embebição (A) e secagem (B) de sementes das cultivares de amendoim.

Bewley et al. (1994) afirmam que o processo de embebição de sementes pode ser dividido em três fases, sendo a primeira caracterizada pelo rápido aumento do conteúdo de água, não ocorrendo eventos metabólicos, logo, sementes nesta fase geralmente são capazes de tolerar a dessecação, esta fase é tida como uma estratégia de defesa de sementes para evitar sua morte em casos de restrição hídrica no ambiente. Na segunda fase ocorre estagnação do conteúdo de água da semente, havendo a ativação de processos metabólicos. Por fim, a terceira fase caracteriza-se por um novo aumento na absorção de água ocorrendo a germinação visível (protrusão radicular). Durante a obtenção da curva de embebição das cultivares estudadas, a protrusão radicular ocorreu nas três cultivares com 42 horas, fase três do processo de embebição. Onde a fase 1 correspondeu ao período de 0 a 14 horas, fase 2 ao período de 14 a 38 horas e a fase 3 de 38 a 48 horas (Figura 13A).

P ES O (g) P ES O (g) A) B)

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A curva de secagem (Figura 13B) das sementes possui como ponto zero o ponto final da curva de embebição, após 51 horas de secagem e pesagens obteve-se o peso inicial das sementes antes do processo de embebição, correspondendo para as cultivares IAC 505, BR1 e BRS 151 L7, um peso de 189,3, 129,7 e 127,5 g, respectivamente. Salienta-se que sementes ortodoxas normalmente são capazes de tolerar a baixa disponibilidade hídrica por longos períodos, sendo este um mecanismo de sobrevivência (ALPERT, 2005). Entretanto, com o início do processo germinativo, os mecanismos relacionados com a manutenção da tolerância à dessecação são gradativamente desativados, sendo que a protrusão radicular, em geral, marca a perda dessa tolerância. Estes mecanismos desativados são substituídos pela ativação de outros, relacionados com a ativação do metabolismo celular, além do início da replicação do DNA e consequentemente divisão da célula (POTOKINA et al, 2002).

Além da desidratação ocorrida durante o processo de maturação, a semente pode sofrer secagem imposta por condições ambientais, como período de seca prolongado (NIKOLOVA, 1997). Tais condições ambientais desfavoráveis devem ser toleradas pelas sementes, caso contrário, na ocorrência de seca no momento da germinação de uma semente sensível, a mesma perderá sua viabilidade. A secagem torna os solutos internos da célula concentrados, o que possibilita a ocorrência de reações destrutivas dentro da célula, tais como a desnaturação de proteínas, elevação do pH intracelular, perda da integridade das membranas e alterações na composição química e propriedades físicas da parede celular (NEDEVA; NIKOLOVA, 1997). A secagem pode ocorrer rapidamente em algumas espécies ou lentamente e mesmo de forma atenuada em algumas sementes (BOUBRIAK, 1994; FINCH-SAVAGE, 2002).

Nas Tabelas 1 e 2 encontram-se os resumos da análise de variância para as variáveis fisiológicas e bioquímicas das sementes estudadas. Observou-se diferença significativa para o fator cultivar em relação a todas as variáveis analisadas - porcentagem de plântulas normais (PN), porcentagem de germinação (GER), porcentagem de plântulas anormais na 1ª contagem (PA), porcentagem final de plântulas anormais (GERA), condutividade elétrica (CE), índice de velocidade de germinação (IVG), tempo médio de germinação (TMG), comprimento de plântulas (CP), envelhecimento acelerado (EA), superóxido dismutase (SOD), açúcares totais (AT), açúcares redutores (AR), proteínas totais (PT), peróxido de hidrogênio (H2O2) e proteína totais do superóxido dismutase (PTSOD).