UTILIZAÇÃO DE BACULOVÍRUS COMO SISTEMA DE EXPRESSÃO PARA A PROTEÍNA DO CAPSÍDEO DO CIRCOVÍRUS SUÍNO TIPO 2 (PCV2)
Autores: Keila Catarina PRIOR, Diogenes DEZEN
Identificação dos autores: Bolsista PIBITI/CNPq; Orientador IFC–Câmpus Concórdia
Introdução
A circovirose suína é uma doença infectocontagiosa de distribuição mundial, causada pelo circovírus suíno tipo 2. A forma mais frequente e importante de manifestação dessa enfermidade é a Síndrome Multissistêmica do Definhamento Suíno (SMDS), caracterizada pelo emagrecimento rápido e progressivo dos animais. Atualmente a circovirose é considerada uma doença endêmica no Brasil, pois tem apresentado um aumento gradual em número de casos clínicos com confirmação laboratorial (MORÉS et al., 2007).
O PCV2 é considerado um dos patógenos mais importantes em suínos, causando sérios prejuízos econômicos devido à elevada mortalidade, atraso na produção ou pela ocorrência de infecções secundárias associadas ao vírus. O principal problema da SMDS é a sua duração nos rebanhos, podendo persistir por vários meses se medidas de controle apropriadas não forem adotadas. As taxas de mortalidade podem triplicar nas fases de creche e terminação, podendo normalizar dentro de alguns meses (CIACCI-ZANELLA, 2007).
Uma alternativa importante para o controle da doença baseia-se na utilização de vacinas, as quais estão sendo aplicadas nos rebanhos brasileiros desde 2008, sendo que até esse momento, a prevenção era baseada única e exclusivamente na correção de fatores de risco para a infecção (CIACCI-ZANELLA & MORÉS, 2007).
Dentre os genótipos já identificados, o PCV2a foi incialmente o mais prevalente em suínos afetados pela SMDS até 2003, e as vacinas comerciais foram desenvolvidas baseadas neste genótipo. No entanto o PCV2b emergiu globalmente, sendo associado a surtos mais severos da SMDS, tornando-se o genótipo prevalente em suínos do mundo inteiro (CIACCI-ZANELLA et al. 2015).
Atualmente existem cinco vacinais comerciais registradas na maioria dos países, inclusive no Brasil. No entanto, elas ainda são de alto custo e todas são construídas a
partir de amostras do vírus ocorrentes em outros países e baseadas no genótipo PCV2a (CIACCI-ZANELLA et al. 2015).
Portanto, o desenvolvimento e uso de vacinas com cepas autóctones poderia con-tribuir na melhoria de imunidade de rebanhos locais, haja vista que podem existir dife-renças antigênicas importantes entre cepas. Neste sentido, em experimentos prévios, rea-lizados na Universidade Federal do Rio Grande do Sul, foram produzidas três construções de baculovírus capazes de produzir e secretar a proteína do capsídeo (ORF2) do PCV2, proteína esta originada de uma amostra autóctone, representativa das amostras de PCV2b circulantes no Brasil.
Os objetivos deste projeto foram inicialmente estabelecer o sistema de cultivo ce-lular no Laboratório de Microbiologia Veterinária do IFC-Concórdia, realizar a amplifi-cação dos estoques virais e iniciar as titulações virais.
MATERIAL E MÉTODOS
Para o cultivo celular, foram utilizadas garrafas de cultivo de 25cm² de superfície, contendo células da linhagem Sf21, as quais são derivadas de tecido ovariano da lagarta
Spodoptera frugiperda.
O repique foi realizado seguindo as recomendações previamente descritas (INVI-TROGEN, 2002) e em condições assépticas. Para garantir estas condições, o repique foi realizado em cabine de segurança biológica, onde se realizou a desinfecção desta com luz ultravioleta durante quinze minutos e todo material utilizado no cultivo foi submetido anteriormente a processo de esterilização.
O repique celular foi realizado em garrafas com cerca de 80-90% de confluência da monocamada de células. Para a análise da confluência, observou-se a monocamada no microscópio invertido, sob aumento de 100x. Em seguida, realizou-se a remoção do meio de cultivo presente nas garrafas e adicionou-se 2 mL do meio de cultivo TC-100 suple-mentado com 10% de soro fetal bovino. Posteriormente realizou-se ação mecânica sobre as garrafas para que as células se desprendessem da parede e fossem ressuspendidas no meio de cultivo. Com o auxílio de uma pipeta fez-se a homogeneização da suspensão e realizou-se a transferência de 1 mL dessa, para uma nova garrafa. Em seguida completou-se o volume final de 5 mL decompletou-sejado para cada garrafa com a adição de 4 mL do meio de
cultivo em cada. Posteriormente as garrafas foram incubadas a 27ºC em atmosfera ambi-ente, até atingirem 80-90% de confluência, o que foi obtido entre o 4º e 5º dia.
Para a amplificação dos estoques virais as células da linhagem Sf21 em multiplicação, foram infectadas com os estoques virais e após 48 horas o sobrenadante foi centrifugado a 2000 rpm durante dez minutos. Este foi aliquotado em criotubos e armazenado a -80ºC.
Seguiu-se com a titulação viral em diluição seriada com a determinação das unidades formadoras de placas, caracterizadas por zonas em que as células foram destruídas pela infecção. Realizaram-se diluições (10-3 a 10-8) a partir do estoque viral e estas foram inoculadas em monocamada de células da linhagem Sf21. Após uma hora de incubação das placas a 27ºC, fez-se a remoção do sobrenadante e as células infectadas foram imobilizadas com meio de Grace contendo 1% de agarose. O cultivo foi incubado a 27ºC por 7 dias. Após este período realizou-se a contagem das unidades formadoras de placas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Através do acompanhamento diário do desenvolvimento dos cultivos realizados, observou-se que a formação de 80-90% de confluência da monocamada ocorre em média no período de quatro a cinco dias (Figura 01). Portanto a periodicidade dos repiques deve ser cumprida estritamente, pois a divisão celular exacerbada causa o fenômeno de inibi-ção por contato, caracterizado por interrupinibi-ção da divisão celular por consequência do contato físico entre duas células, devido a um excesso de densidade celular em um meio de cultivo, gerando atrasos na multiplicação da linhagem de célula (Alves e Guimarães, 2010). Além disso, deve-se ressaltar que o cultivo celular é um procedimento muito sus-cetível a contaminações, uma vez que utiliza de meios ricos em nutrientes e a presença de contaminantes no cultivo leva a morte celular e consequente perda do procedimento (Alves e Guimarães, 2010).
Na titulação viral (Figura 02), após 6 passagens, obteve-se 1,1 x106 a 4,5 x106 unidades formadoras de placas (PFU) por mL de amostra. Estes valores indicam que os baculovírus possuem boa replicação em sistema de cultivo celular e que, portanto, este método de replicação é adequado para se utilizar no processo.
Figura 01: cultivo celular observado em microscópio invertido demonstrando aproximadamente 90% de confluência. Aumento de 100X.
Figura 02. Determinação do número de unidades formadoras de placa (PFU). Os poços foram corados com vermelho de metila para melhor visualização das PFU.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A multiplicação de células em laboratório é um processo que requer inúmeros cuidados e o estabelecimento dos procedimentos demanda tempo, uma vez que falhas resultam em morte celular e o processo deve ser retomado. Atualmente, a pesquisa encontra-se em andamento, sendo que o próximo passo será o de avaliar a multiplicidade de infecção e determinação de expressão da proteína recombinante através da técnica de
Western blot, visando determinar qual dos baculovírus recombinantes será capaz de produzir a proteína codificada pela ORF2 com maior eficiência e eficácia.
REFERÊNCIAS
ALVES, E. A.; GUIMARÃES, A. C. R. Capítulo 5: Cultivo Celular. In: MOLINARO, E.; CAPUTO, L.; AMENDOEIRA, R. Conceitos e métodos para formação de profissionais em laboratórios de saúde. Vol 2. Rio de Janeiro: EPSJV; IOC, 2010. p. 215-253.
CIACCI-ZANELLA, J. R. Circoviridae. In: FLORES, E.F. (Ed) Virologia Vete-rinária. Santa Maria: UFSM, 2007. p. 363-374.
CIACCI-ZANELLA, J. R.; SCHAEFER, R.; GAVA, D. et al. Novos conheci-mentos sobre a infecção por PCV2 e a emergência de novas estirpes virais. In: BARCEL-LOS, E. B. et al. Avanços em Sanidade Produção e Reprodução de Suínos. Porto Alegre: UFRGS, 2015. p. 207-220.
INVITROGEN. Guide to Baculovirus Expression Vector Systems (BEVS) and Insect Cell Culture Techniques. 2002. p. 30. Disponível em: <http://tools.thermofis-her.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf> Acesso em 20 de junho de 2016.
MORÉS, N.; BARCELLOS, D.; CIACCI-ZANELLA, J. Circovirose suína. In: SOBESTIANSKY, J., BARCELLOS, D. (Ed.) Doenças dos Suínos. Goiânia: Canône. Editorial, 2007. p. 213-225.
