Declaração de Conflitos de Interesse

(1)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

Declaração de Conflitos de Interesse

•

Nada a declarar.

(2)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

Sala 2

-

Mesa redonda

A biologia viral na indução

do câncer por HPV

Diagnóstico laboratorial e

monitorização

dos pacientes com HPV

(3)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

HISTÓRIA NATURAL DA INFECÇÃO POR HPV

ALTERAÇÕES TRANSIENTES

RESOLUÇÃO

HPV

PERSISTÊNCIA

LIE DE BAIXO GRAU

INÍCIO DA

ATIV. SEXUAL

LIE DE ALTO GRAU

C.A. “IN SITU”

C.A.. INVASIVO

(4)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

FATORES INFLUENCIANDO A PROGRESSÃO DE LIE

1. TIPO DE HPV

ONCOGÊNICOS X NÃO-ONCOGÊNICOS

2. PERSISTÊNCIA

3. CARGA VIRAL

4. FATORES AMBIENTAIS/COMPORTAMENTAIS DO HOSPEDEIRO

IMUNOSUPRESSÃO, CIGARRO, ANTICONCEPCIONAIS HORMONAIS

5. FATORES GENÉTICOS DO HOSPEDEIRO

6. CO-INFECÇÕES

(5)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

1. TIPO DE HPV

(6)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

(7)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

2. PERSISTÊNCIA

JAMA,2001;286:3106

(8)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

2. PERSISTÊNCIA

Type-Specific Persistence of Human Papillomavirus DNA

before the Development of Invasive Cervical Cancer.

NEJM

1999;341:1633

-

8.

8. Wallin, Keng-Ling; Wiklund, Fredrik; Angstrom, Tord;

Bergman, Frank; Stendahl, Ulf; Wadell, Goran; Hallmans, Goran; Dillner,

Joakim

.

(9)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

2. PERSISTÊNCIA

Estes trabalhos demonstraram que o aparecimento

das lesões é precedido de infecção persistente por um tipo de HP

V

A

negativação

do HPV

-

DNA indica

clareamento

da lesão

Os tipos

oncogênicos

tem uma tendência muito maior de persistir

que os não

(10)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

3. CARGA VIRAL

A carga de HPV

-

16 aumenta de acordo com o grau de neoplasia

mas a de HPV

(11)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

3. CARGA VIRAL

Quanto maior a carga de HPV-16 maior o OR

(12)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

VANTAGENS

DO USO DO PCR SOBRE

OUTRAS TÉCNICAS MOLECULARES

NO DIAGNÓSTICO DE HPV

1.

1. SENSIBILIDADE

SENSIBILIDADE

PCR É A TÉCNICA DE MAIOR SENSIBILIDADE NA

DETECÇÃO DE DNA DE HPV .MAIOR VALOR PREDITIVO NEG.

2.

2. TIPAGEM

TIPAGEM

A PCR permite o conhecimento do tipo específico de HPV, seja

através de PCR tipo

-

específico, genérico + RFLP, hibridização

reversa ou

sequenciamento

.

3.

3. VERSATILIDADE QUANTO AO TIPO DE

VERSATILIDADE QUANTO AO TIPO DE

AMOSTRA BIOLÓGICA

Pode

-

se trabalhar com células esfoliadas de mucosa, biópsias, materia

l

parafinado, esfregaços corados, sangue, etc.

(13)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

DESVANTAGENS

DO USO DO PCR

SOBRE OUTRAS TÉCNICAS MOLECULARES

NO DIAGNÓSTICO DE HPV

1.

1. SENSIBILIDADE

SENSIBILIDADE

POUCA CORRELAÇÃO CLÍNICA. A GRANDE MAIORIA DAS

MUHERES PCR+ SÃO ASSINTOMÁTICAS E IRÃO CLAREAR A

INFECÇÃO NOS PRÓXIMOS MESES. BAIXO VALOR PREDITIVO

POSITIVO.

CONTAMINAÇÃO!

2.

2. REPRODUTIBILIDADE E CONTROLE DE QUALIDADE

REPRODUTIBILIDADE E CONTROLE DE QUALIDADE

Sistemas de PCR “in

-

house

” tem menor padronização levando

a variação inter

-

laboratorial. O controle de qualidade dos reagentes é

mais complicado e menos rigoroso.

3. EXECUÇÃO

Mais complexa e com mais etapas que CH, demanda maior

capacitação laboratorial (equipamentos).

(14)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV)

(15)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV)

Aprox. 8000pb

E5

E2

E4

E1

E7

E6

L1

L2

URR

Aprox. 8000pb

E5

E2

E4

E1

E7

E6

L1

L2

URR

(16)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV)

(17)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV)

PRIMERS MY09/11. AMPLIFICAM APROX. 450 PARES DE

BASES DO GENE L1 DE CERCA DE 30 TIPOS DE HPVs.

TIPAGEM POR RFLP COM 7 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

268 pb

da ß-globina

humana

450 pb

do gene L1

dos HPVs

(18)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV)

PRIMERS MY09/11. AMPLIFICAM APROX. 450 PARES DE

BASES DO GENE L1 DE CERCA DE 30 TIPOS DE HPVs.

TIPAGEM POR RFLP COM 7 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

HPV 16

(19)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV)

(20)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV)

LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test

37 genótipos. ROCHE “RUO”

(21)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

(22)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV)

PCR TIPO

-

ESPECÍFICO

–

EMPREGA PRIMERS QUE AMPLIFICAM

APENAS UM TIPO DE HPV, UTILIZANDO COMO ALVO

UMA SEQUÊNCIA ESPECÍFICA, EM GERAL DOS

GENES E6 E/OU E7

ESTE SISTEMA DE PCR TEM MAIOR SENSIBILIDADE QUE O

GENÉRICO, E É O IDEAL QUANDO SE QUER INVESTIGAR

APENAS 1 TIPO DE HPV.

(23)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV)

PCR TEMPO

-

REAL : EMPREGADO QUANDO SE QUER

DETERMINAR A

CARGA VIRAL

(QUANTIFICAÇÃO).

SABE

-

SE QUE QUANTO MAIOR A CARGA VIRAL MAIOR É

O RISCO DE LESÃO FUTURA >NIC2 E DA PRESENÇA DE

LESÃO NO MOMENTO DO DIAGNÓSTICO.

(24)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA -

-0 10 20 30 40 50 1 2 3 4 5 6 Concentration log 10 Threshold Cycle 0.5 1.5 2.5 0 10 20 30 40 50 60 70 Ce F2/ F 1

Test Sample

Threshold Threshold Cycle

Threshold Cycle = 35

Load = 10

3.8

_copies/ml

(25)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

Teste em Microarray

PapilloCheck

®

Teste em Microarray

(26)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

Teste em Microarray

PapilloCheck®

3,8 mm

Canal Verde

(532 nm)

Canal vermelho (635 nm)

orientation control

hybridization control

printing -control

PCR -control

sample -control

(27)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV)

RT

-

PCR (REVERSE

-

TRANSCRIPTION PCR)

O ALVO É UMA MOLÉCULA DE

mRNA

, CUJA DETECÇÃO

IMPLICA NA EXPRESSÃO DE DETERMINADO GENE.

NECESSITA DE UMA ETAPA PRÉVIA AO PCR, DE

TRANSCRIÇÃO REVERSA, SÍNTESE DE

cDNA

PODE SER REALIZADA SIMULTANEAMENTE POR

ENZIMA BI

-

FUNCIONAL (

Tth

)

TERIA MAIOR CORRELAÇÃO COM LESÕES E DOENÇA

PreTect

(28)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

Comparision between PreTect HPV-Proofer and DNA-tests

NO

YES

Minimum of false negative

results (related to cervical

cancer) (1)

YES

NO

Distresses a high number of

women unnecessary (3,4)

YES

NO

Identifies all sexually active

women as positive once or

more during their lifetime (5)

YES

NO

Detects a very common

infection (1,5)

NO

YES

Identifies the primary cause of

cervical cancer (E6/E7

onco-proteins) (5,6)

DNA-tests

PreTect

HPV-Proofer

Statement (ref. no.)

(29)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

Comparision between PreTect HPV-Proofer and DNA-tests

YES

High Positive Predictive Value

(4,8)

NO

YES

Minimum of false positive

results (related to healthy

women) (1, 6)

DNA-tests

PreTect

HPV-Proofer

Statement (ref. no.)

(30)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

Comparision between PreTect HPV-Proofer and DNA-tests

1. Lie AK et. al. (2005) DNA VERSUS RNA BASED METHODS FOR HUMAN PAPILLOMAVIRUS DETECTION IN CERVICAL NEOPLASIA. Gynecologic Oncology, Volume 97, Issue 3 , June 2005, Pages 908-915

2. Walboomers et. a. (1999) HUMAN PAPILLOMAVIRUS IS A NECESSARY CAUSE OF INVASIVE CERVICAL CANCER WORLDWIDE. J. Pathol. 189: 12-19 (1999)

3. ALTS group (2000) Human papillomavirus testing for triage of women with cytologic evidence of low-grade squamous intraepithelial lesions: baseline data from a randomized trial. J Natl Cancer Inst. 2000 Mar 1;92(5):397-402

ALTS group (2003) A randomized trial on the management of low-grade squamous intraepithelial lesion cytology interpretations. Am J Obstet Gynecol. 2003 Jun;188(6):1393-400

Arbyn et. al. (2002) Triage of women with atypical or low-grade cytological abnormalities of the cervix by HPV testing.

Systematic review and meta-analysis. European Network for Cervical Cancer Screening Depotnum: D/2001/2505/34, IPH / EPI – REPORTS Nr. 2001- 019

Arbyn et. al (2004) Virologic versus cytologic triage of women with equivocal Pap smears: a meta-analysis of the accuracy to detect high-grade intraepithelial neoplasia. J Natl Cancer Inst. 2004 Feb 18;96(4):280-93

4. Molden T et. al. (2005) Predicting CIN2+ when detecting HPV mRNA and DNA by PreTect HPV-proofer and consensus PCR: A 2-year follow-up of women with ASCUS or LSIL pap smear. Int J Cancer. 2005 Jan 11;114(6):973-976

5. Quality Manual - The Norwegian Cancer Registry (in Norwegian)

6. zur Hausen H. Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical application. Nat Rev Cancer. 2002 May;2(5):342-50 7. Cuschieri K et. al. (2005) Assessment of human papillomavirus mRNA detection over time in cervical specimens collected in

liquid based cytology medium. J Virol Methods. 2005 Mar;124(1-2):211-5

8. Hovland S, Lie AK, Risberg B, Ryd W, Borge B, Berle E, Skomedal H, Kadima T, Batumbola L, Kyembwa ML, Bilayi E, Mukwege D, Chirimwami B, Kashongwe JP, Mvula M, Falang BM, and Karlsen F: Calculations from a High Risk Population study.

(31)

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

-

LIM 52

DR. JOSÉ EDUARDO LEVI

INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL DA

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

E-MAIL: dudilevi@usp.br