UNIJUÍ - UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL
JANINE DA ROSA ALBARELLO
PROCESSAMENTO DE IMAGENS DIGITAIS PARA MODELAGEM E CONTROLE DO TRATAMENTO DE FERIDAS CUTÂNEAS
Ijuí
JANINE DA ROSA ALBARELLO
PROCESSAMENTO DE IMAGENS DIGITAIS PARA MODELAGEM E CONTROLE DO TRATAMENTO DE FERIDAS CUTÂNEAS
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Modelagem Matemática da Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul – UNIJUÍ como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Modelagem Matemática.
Orientador: Prof. Dr. Daniel Curvello de Mendonça Müller
Ijuí 2013
Aos meus pais, Aldo e Aleida, ao meu
esposo, Ezequiel e meus filhos, Maria Clara e
Pedro Henrique, pelo amor, carinho,
dedicação e estímulo que sempre ofereceram,
pelas angústias e preocupações passadas por
minha causa, dedico-lhes essa conquista como
AGRADECIMENTOS
Á Deus, por ter-me concedido saúde, luz, força e perseverança necessárias para que eu superasse todas as adversidades.
Aos meus pais Aldo e Aleida, que sempre me apoiaram nas minhas escolhas.
Ao meu esposo Ezequiel, que sempre esteve ao meu lado, mostrando-se amigo e companheiro, com muito amor e carinho dando sugestões e apoio.
Aos meus pequenos Maria Clara e Pedro Henrique que mesmo com minha ausência sempre me esperavam com um abraço forte e um sorriso no rosto.
Aos meus irmãos Givanete e Jovane pelo incentivo.
Ao professor Dr. Daniel Curvello de Mendonça Müller pela orientação, pela dedicação, pelo constante incentivo, pela paciência e pela amizade, com os quais foi possível a concretização deste trabalho.
Ao professor Dr. Oleg Khatchatourian pela constante ajuda e apoio.
Ao Hospital Veterinário da Unijuí e bolsistas do curso de Medicina Veterinária que contribuíram para o sucesso deste trabalho.
Aos animais que sacrificaram a vida para que obtivesse êxito neste trabalho.
Professores do Mestrado e funcionários do Departamento de Ciências Exatas e Engenharias pelos ensinamentos e amizades.
Aos colegas do curso pelos bons momentos vividos durante estes dois anos de convivência, pelas ideias trocadas e amizade.
A Geni, que com muita disposição, demonstrou-se sempre atenciosa as dúvidas e solicitações realizadas.
A UNIJUÍ pelo apoio financeiro a esta pesquisa.
A todas as pessoas que direta e indiretamente incentivaram a realização deste sonho. Meus sinceros e eternos agradecimentos.
“Na origem de todas as grandes obras houve fermentação de sonhos, projetos e aspirações.
Houve uma dedicação apaixonada àquilo que não
existia para que chegasse a existir. Houve uma
intuição de possibilidades inéditas e um lançar-se
furiosamente para o futuro. Não basta ter grandes
desejos para realiza-los. Mas ninguém realiza
grandes obras sem ter tido grandes desejos”. José Comblin
RESUMO
Feridas são caracterizadas como uma solução na continuidade da pele, sendo geralmente causadas por traumatismos. O acompanhamento da cicatrização dessas lesões, em geral, ocorre de forma visual e de maneira subjetiva. Dessa forma, pesquisas comparando tratamentos distintos, acabam por perder sua precisão quando avaliadas através de métodos subjetivos. Nesse sentido, o processamento de imagens foi aqui utilizado, com o objetivo de avaliar sua aplicabilidade em precisar a evolução da cicatrização cutânea. Foram utilizadas 18 ratas Wistar, divididas em grupos de animais tratados com rifamicina, óleo essencial de alecrim e solução fisiológica, todos aplicados topicamente sobre uma lesão cirúrgica circular. A obtenção das imagens dessas feridas ocorreu no primeiro, sétimo, décimo quarto e vigésimo primeiro dias pós-operatórios. Ainda que não tenha havido diferença entre os grupos, foi possível validar o método para o fim testado, sugerindo sua introdução como modelo de avaliação de lesões cutâneas.
ABSTRACT
Wounds are characterized as a solution in the continuity of skin is usually caused by trauma. Monitoring the healing of these lesions generally occurs visually and subjectively. Thus, studies comparing different treatments, they lose their accuracy when evaluated by subjective methods. In this sense, the image processing is used here in order to evaluate its applicability in specifying the evolution of skin healing. 18 Wistar rats were divided into groups of animals treated with rifamycin, rosemary essential oil and saline solution, all applied topically over a circular surgical lesion were used. Obtaining images of these wounds occurred in the first, seventh, fourteenth and twenty- first postoperative day. Although there was no difference between the groups, it was possible to validate the method for order tested, suggesting its introduction as an evaluation model of cutaneous lesions.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Imagem Alecrim-do-campo, Baccharis Dracunculifolia ... 16
Figura 2- Modelo de paquímetro simplificado (à esquerda) e paquímetro digital (à direita) sendo usado para aferição de feridas cutâneas em ratos ... 17
Figura 3- Convecção dos eixos para representação de imagens ... 18
Figura 4- Ilustração de tipos de conectividade de pixels vizinhos (PADILHA 2007) ... 19
Figura 5- Etapas de um sistema de Processamento de Imagens Digitais ... 21
Figura 6- Imagem ilustrativa da metodologia utilizada. 18 ratas, foram divididas em três grupos, onde cada grupo foi tratado com fitoterápico (Óleo Essencial de Alecrim), rifamicina e solução fisiológica. Todos os animais foram auto-controle ... 25
Figura 7- Sequência cirúrgica. Indução anestésica através de máscara facial (A); Colocação de molde (moeda de 10 centavos de real esterilizada) sobre o dorso do animal (B); Demarcação com lápis dermatológico (C); Lesão confeccionada após incisão com bisturi (D) ... 26
Figura 8- Posicionamento do animal abaixo da câmera digital. O tripé foi regulado para obtenção de imagens sempre da mesma distância, e com ainda o mesmo zoom da câmera ... 32
Figura 9- Imagem original da ferida, já inserida no programa ... 33
Figura 10- Imagem na etapa de pré-processamento, transformada em tons de cinza ... 33
Figura 11- Imagem na etapa de segmentação, bordas detectadas pelo Método de Prewitt ... 34
Figura 12- Imagem na etapa de dilatação dos contornos com a função imdilate ... 34
Figura 13- Imagem na etapa de preenchimento da lesão com a função imfill ... 35
Figura 14- Imagem na etapa de limpeza da borda da lesão e remoção dos contornos descontínuos ... 35
Figura 15- Imagem na etapa de remoção de objetos menores que 700 pixels ... 36
Figura 16- Imagem na etapa original com a lesão identificada ... 36
Figura 17- Gráfico da dinâmica de área média em mm2 ... 39
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Valores das áreas reais das feridas em pixel e a comparação dos resultados com a área da elipse ... 37 Tabela 2- Resultados da análise de variância para área em mm2, em quatro diferentes dias de avaliação (1, 7, 14 e 21 dias pós-operatórios) ... 39 Tabela 3- Resultados da análise de variância para área em pixel, em quatro diferentes dias de avaliação (1, 7, 14 e 21 dias pós-operatórios) ... 40
LISTA DE SÍMBOLOS
B4 - Conectividade entre quatro neurônios vizinhos. B8 – Conectividade entre oito neurônios vizinhos. a, b e c - Constantes.
,f x y - Função bidimensional da intensidade luminosa.
JPEG - Joint photographic experts group. PID – Processamento de imagens digitais.
SUMÁRIO INTRODUÇÃO ... 11 1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 13 1.1 Pele ... 13 1.2 Feridas ... 13 1.3 Avaliação da Cicatrização ... 16 1.4 Imagens Digitais ... 17 1.4.1 Pixel ... 18
1.5 Processamento de Imagens Digitais ... 19
1.5.1 Aquisição de Imagens ... 21 1.5.2 Pré-Processamento ... 21 1.5.3 Segmentação ... 21 1.5.4 Representação e Descrição ... 22 1.5.5 Reconhecimento e Interpretação ... 22 1.6 Modelo Matemático ... 22 2 MATERIAIS E MÉTODOS ... 24 2.1 Modelo Experimental ... 24 2.2 Procedimentos Pré-Cirúrgicos ... 26 2.3 Procedimentos Pós-Cirúrgicos ... 27
2.4 Destino dos Animais ... 27
2.5 Modelo Matemático ... 27 3 RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 32 CONCLUSÃO ... 42 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 43 ANEXOS ... 48 APÊNDICES ... 51
INTRODUÇÃO
O uso crescente de técnicas tradicionais de processamento de imagens digitais (PID) vem ao encontro da obtenção de resultados quantitativos nas mais diversas áreas do conhecimento. No caso da avaliação da área de lesões, objeto deste estudo, o PID torna-se útil para avaliar e comparar tratamentos alternativos na cura de feridas cutâneas.
Atualmente, o PID é utilizado em várias áreas de aplicação do conhecimento humano para resolver uma gama variada de problemas e que, normalmente requerem métodos capazes de melhorar a informação visual para análise e interpretação humana ou a percepção automática das máquinas. Como exemplos temos as imagens radiográficas, melhoradas por tratamento digital para auxiliar radiologistas na identificação de doenças. A própria arqueologia utiliza esse recurso para a restauração de figuras e a geologia no estudo das imagens obtidas por satélites. Por sua vez, a percepção de máquinas utiliza-se desse recurso para o reconhecimento automático de caracteres, processamento de impressões digitais, reconhecimento da face humana, guia de robôs e até o processamento automático de imagens de satélites para o reconhecimento de queimadas (MARTINS, 2004).
O aparecimento de novas tecnologias na área da computação provocou um aumento significativo nas pesquisas de novos algoritmos computacionais que tentam simular o comportamento humano em tarefas cotidianas. Esta tecnologia vem sendo frequentemente usada para auxiliar em procedimentos nas mais diversas áreas, como a utilização do computador na realização do processamento de imagens de órgãos, tecidos ou células, adquiridas em exames médicos. Nesse contexto, realiza-se a automação de diagnósticos patológicos, facilitando o trabalho dos profissionais e permitindo que laboratórios mantenham a qualidade ao manipular elevado número de amostras diárias (FAILACE, 1995).
No trabalho aqui descrito, buscou-se avaliar a aplicabilidade do PID para modelagem matemática e controle da cicatrização de feridas cutâneas, sob diferentes tratamentos. Entendeu-se que a nova metodologia permitiria detectar minuciosamente as fases visuais da cicatrização cutânea, podendo avaliar a resposta frente aos distintos tratamentos utilizando-se o método de PID, ajuste de contorno e análise estatística. Para tanto, as imagens foram analisadas na ferramenta computacional MATLAB.
Buscando explicitar a problemática proposta, é de conhecimento da área que a resistência bacteriana aos antimicrobianos vem se tornando um problema de saúde pública, sendo observado em todo o mundo. O uso indiscriminado de antibióticos contribui para a sobrevivência de alguns microorganismos, o que lhes permite criar resistência àquele agente químico. Dessa forma, tem-se buscado aumentar a gama de agentes naturais para utilização no tratamento de lesões, seja com objetivos antimicrobianos, seja reduzindo a inflamação local. Nesse trabalho, utilizou-se a ferramenta proposta de avaliação de imagens digitais, para comparar a utilização de óleo essencial de uma planta nativa do Rio Grande do Sul, o Alecrim-do-campo (Baccharis dracunculifolia) com tratamentos já estabelecidos. O emprego desses agentes ocorreu em lesões cutâneas experimentais em ratos, promovidas em ambiente cirúrgico.
O uso de plantas no tratamento e cura de enfermidades é tão antigo quanto à espécie humana. As observações populares sobre a utilização e a eficácia de plantas medicinais (fitoterápicos) contribuem de forma relevante à divulgação das virtudes terapêuticas das plantas, prescritas com frequência pelos efeitos medicinais que produzem, apesar de nem sempre terem seus constituintes químicos conhecidos (SILVA, 2010). Em todo o mundo, e em particular nos países da América do Sul, o uso de fitoterápicos contribui significativamente com os primeiros cuidados relacionados à saúde. O Brasil é o país com a maior biodiversidade de plantas do mundo, contando com um número estimado de mais de 20% do total de espécies do planeta. Possui a mais diversa flora, superior a 55 mil espécies descritas, sendo essa rica biodiversidade, acompanhada por vasta aceitação das pessoas em utilizar plantas medicinais para tratamentos (SILVA, 2010).
Esta dissertação aborda no primeiro capítulo a revisão bibliográfica, situando o caráter interdisciplinar da proposta. No capítulo 2 encontram-se descritos os materiais usados e a metodologia empregada para a obtenção do modelo de lesões e o processamento das imagens adquiridas. E finalmente, no capítulo 3, apresentam-se os resultados encontrados através do PID, utilizando-se os métodos de ajuste de contornos e posteriomente análise estatística.
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 Pele
O tegumento que reveste a superfície do corpo dos animais é composto pela pele e seus anexos: glândulas sudoríparas, glândulas sebáceas, pelos e unhas, correspondendo a aproximadamente 16% do peso corporal e caracterizando-se como o maior órgão do corpo (GARTNER; HIATT, 2003; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004; REHEN; PAULSEN, 2007).
A pele é constituída por uma porção epitelial, a epiderme e uma porção conjuntiva, a derme. Abaixo e em continuidade com a derme está a hipoderme (subcutâneo), que não faz parte da pele, apenas lhe serve de união com os órgãos adjacentes (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004)
Apresenta diversas funções, como proteger o corpo contra atritos, lesões e a penetração de agentes injuriantes. Evita ainda a perda de água, auxilia na termorregulação, proporciona a excreção através das glândulas sudoríparas, recebe as sensações do ambiente e as transmite para o sistema nervoso central. Participar também na proteção contra os raios ultravioletas e na absorção e síntese de vitamina D (GARTNER; HIATT, 2003; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). No trabalho aqui apresentado, a pele foi o instrumento utilizado para demonstrar o emprego do PID na comparação de diferentes agentes com características cicatrizantes.
1.2 Feridas
Feridas são traumatismos que resultam em solução na continuidade da pele, deixando expostos os tecidos subjacentes (ROSA et al., 1983). Cada região do corpo dos animais está susceptível a determinados tipos de lesões, variando conforme o agente agressor. As causas mais comuns são as excisões de massas, lesões iatrogênicas, complicações de cirurgias extensas, queimaduras, brigas, agressão por objetos cortantes, atropelamentos ou contato com substâncias cáusticas (PODE, 2006).
A cura de tecidos lesados se dá por regeneração, reparo, ou a combinação destes. Quando um tecido é lesionado ou perdido, e substituído por outro, estrutural e funcionalmente
similar, temos a regeneração, enquanto que, quando esta substituição é realizada por um tecido cicatricial não funcional, torna-se classificado como reparo (TOWNSED et al. 2010). Cabe salientar que a pele, apesar de apresentar várias camadas germinativas, só possui capacidade regenerativa, na epiderme ou na fase embrionária do animal (POPE, 1996).
Segundo HEDLUND (2005), as fases da cicatrização de ferimentos são a inflamação, o debridamento, o reparo e a maturação, sendo que essas ocorrem de maneira dinâmica e muitas vezes simultaneamente. Na primeira fase ocorre uma breve vasoconstrição, seguida de vasodilatação, permitindo a passagem de fibrinogênio e elementos de coagulação para o interior dos ferimentos, além de liberar células polimorfonucleares, principalmente neutrófilos, que na segunda fase irão debridar microorganismos e resíduos, por fagocitose, evitando infecções. Na fase de reparo, a presença dos macrófagos, o teor de oxigênio tecidual baixo (20 mmHg) e uma ligeira acidez, estimulam a proliferação de fibroblastos e a síntese de colágeno. Por fim, na última fase, quando o colágeno já está devidamente depositado nos ferimentos, ocorre a maturação tecidual (TREICHEL, 2010).
Existe a possibilidade de ocorrerem complicações no reparo da pele, como em situações nas quais, a pouca elasticidade da pele em determinados locais e o movimento inviabilizam a cicatrização de feridas, por exemplo, aquelas localizadas nos membros (ROSA et al. 1983). FOWLER (2006) descreve a complicada reconstrução distal do membro, devido à escassez de tecidos circunjacentes e a associação frequente de lesões ortopédicas com perda cutânea. Este autor citou ainda que os tratamentos por segunda intenção ou técnicas de alongamento da pele são utilizados para feridas que envolvam menos de 30% do membro.
Outra situação bastante problemática diz respeito aos pacientes, humanos ou animais, que sofrem queimaduras. A maioria dos agentes infecciosos são incapazes de penetrar a pele, quando esta apresenta-se íntegra (WELSH; MALE, 1992). Por este motivo, segundo estes autores, quando um indivíduo é acometido por graves queimaduras, a prevenção de infecções através da pele deve ser uma das maiores preocupações. O tratamento de pacientes humanos queimados, por muito tempo, foi associado a um grande sofrimento e a resultados insatisfatórios (TOMITA, 2005). Acrescentou ainda que muitos pacientes não sobrevivem ao choque causado pela perda de fluídos, a sepse e à insuficiência respiratória (BORGES, 2012).
As cicatrizes hipertróficas e os quelóides são graves problemas para alguns pacientes, gerando desde preocupações cosméticas até a presença de prurido, dor e pressão no local. Estas anormalidades ocorrem em indivíduos predispostos e representam uma resposta do tecido conjunto ao traumatismo, inflamação, cirurgia ou queimaduras (WOLFRAM et al., 2009).
Segundo BORGES (2012), os registros mais antigos sobre manuscritos egípcios que datam de 3000-2500 ac., mencionam curativos à base de mel, graxa, fios de linho e 23 diversos tipos de excrementos, que faziam parte dos princípios da farmacopeia egípcia. Hipócrates, que lançou as bases da medicina científica, recomendava que as feridas fossem mantidas limpas e secas, e preconizava sua limpeza com água morna, vinho e vinagre. A partir do século XIX, durante a Guerra da Criméia, foram criados vários tipos de curativos, à base de fibras de linho, que, sendo reutilizadas várias vezes, se tornavam gradativamente mais macias, mas eram pouco absorventes (MANDELBAUM, 2003).
BAO et al. (2008) citaram que o ágar, um polímero altamente hidrofílico, é um gel que apresenta propriedades especiais e biocompatibilidade favorável como curativo, entretanto, a força de tensão moderada e a baixa taxa de degradação tornam seu uso dificultado, podendo ser melhorado com a adição de colágeno tipo I. LEE et al. (2009) testaram de maneira eficiente, o alginato, um polímero de ácido gulurônico e manurônico, utilizado como scaffold em aplicações biomédicas, em defeitos de pele em ratos.
KIM et al. (2008) demonstraram que a aplicação tópica de azeite de oliva com ozônio, em feridas cutâneas de porquinhos-da-índia, acelerou a cicatrização. MARTIN et al. (2009) utilizaram até mesmo a nicotina, uma das milhares de substâncias presentes no cigarro, devido os seus efeitos pró-angiogênicos estimulados pelas células endoteliais. Contudo, os efeitos benéficos ainda estão sob investigação e, portanto, deve-se limitar a aplicação local de nicotina.
MOGFORD et al. (2009) demonstraram que o progresso da reparação do defeito cutâneo em ratos, pode ser reforçado com o uso de um selante de fibrina com fibroblastos dérmicos. ALTOMARE et al. (2009) estudaram a influência do ultra-som (US) terapêutico no reparo de lesões cutâneas e lesões isquêmicas em ratos. Houve aceleração na contração da ferida, aumento da densidade de colágenos e nova formação na epiderme nos animais que receberam o tratamento com US, mas ocorreu atraso na cicatrização em feridas isquêmicas.
O uso de plantas para curar doenças, incluindo as infecciosas, tem sido extensivamente aplicada pelas pessoas. Os resultados publicados até o momento revelam o grande potencial das plantas como opção para tratamentos terapêuticos, apesar do fato que elas não tenham sido completamente estudadas (VERDI et al., 2005).
O Alecrim-do-campo, pode ser ingerido na forma de chá das folhas para clorose, inapetência, histeria, nervosismo, indigestão, tosses, bronquites e asma. Provoca suor, é depurativo do sangue, tônico para o coração e anti-reumático, é usado também para banhos de pele e do cabelo e para caspa (CARRICONDE, 1996).
As propriedades antimicrobianas do alecrim-do-campo estão presentes em um novo enxaguatório bucal desenvolvido na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP) da USP. O produto, em fase de registro de patente, já foi aprovado em testes clínicos que mostraram sua eficácia no controle do biofilme dental bacteriano, ajudando a evitar cáries.
Figura 1: Imagem Alecrim-do-campo, Baccharis Dracunculifolia.
OLIVEIRA et al. (2005) descreve que os óleos essenciais são oriundos do metabolismo secundário das plantas, e que já foi estabelecido cientificamente que 60% destes possuem propriedades antifúngicas e 35% propriedades antibacteriana. Sendo assim, vem sendo analisados vários tipos de fitoterápicos de uso popular a fim de identificar os princípios ativos, efeitos terapêuticos e colaterais (SOUZA et al, s/a).
1.3 Avaliação da Cicatrização
Conforme visto anteriormente, o processo de cicatrização ou reparo das feridas é composto de uma série de estágios complexos, interdependentes e simultâneos, que são descritos em fases e que resultarão ao final em uma cicatriz, um tecido não idêntico ao original (SANTOS, 2000; CESARETTI, 1998).
As tentativas humanas de intervir no processo de cicatrização das feridas, acidentais ou provocadas intencionalmente como parte da realização de procedimentos, remontam à antiguidade, demonstrando que desde então já se reconhecia a importância de protegê-las de forma a evitar que se complicassem e repercutissem em danos locais ou gerais para o paciente (MANDELBAUM, et al2003).
Atualmente, apesar da variada gama de produtos disponíveis no mercado, a avaliação da eficácia desses produtos é subjetiva e intuitiva, sendo ancorada na experiência e vivência
do avaliador. TREICHEL et al. (2011), em sua pesquisa com cicatrização de ferimentos cutâneos, utilizou da mensuração de feridas no momento de criação da lesão (dia 0) e aos 7, 14 e 21 dias de pós operatório. As medidas (altura e largura) foram obtidas com a utilização de paquímetro (Figura 1), e desenhadas em papel manteiga para posterior conferência. As feridas, ocasionadas pelas biópsias, não eram levadas em consideração nas mensurações seguintes.
Figura 2: Modelo de paquímetro simplificado (à esquerda) e paquímetro digital (à direita) sendo utilizado para aferição de feridas cutâneas em ratos.
Para a mensuração das áreas de feridas, utilizaram-se da fórmula da área do quadrado (TREICHEL et al., 2011). Entretanto, sabe-se que as lesões, ainda que realizadas experimentalmente, não seguem um padrão linear de cicatrização, podendo-se perder o aspecto quadrado durante o transcorrer da sua evolução. FERREIRA et al. (2008), também mediram áreas de feridas através de um programa de computador chamado “Matlab 6.0 release 13”, específica para processamento e análise de imagens. Esse programa, assim como o proposto nessa dissertação, realizava a contagem de pixels e as convertia em área. A escolha desse processo é justificada pelo baixo custo, fácil manuseio e aplicabilidade clínica dos mesmos. Além disso, permitem a mensuração de áreas de feridas irregulares, cujas formas geométricas dificultariam a realização das áreas através de fórmulas matemáticas convencionais (SERAFINI, 2012).
Atualmente, o tratamento de feridas representa um tema de relevante preocupação. Surge a necessidade de qualificação, ampliando a abordagem para o conhecimento de diferentes processos de análises das mesmas, ajudando o entendimento e a comparação minuciosa entre diferentes técnicas de tratamento.
1.4 Imagens Digitais
A imagem digital ou monocromática trata-se de uma função bidimensional f(x,y) da intensidade da luz do objeto, onde x e y denotam coordenadas espaciais. O valor de f no ponto (x, y) é proporcional ao brilho (ou níveis de cinza) da imagem no ponto, como ilustrado na figura 2. O valor da função correspondente é determinado de acordo com o brilho da imagem, representado por um conjunto finito de números inteiros que vai de 0 a 100. Onde o ponto da função tiver valor igual a 0, representa a cor preta, se a função tiver valor 100 representa a cor branca. Exemplo disso pode ser observado na figura 2, com uma região em destaque, em que se observam os níveis de cinza ou níveis de luz de cada um deles.
Figura 3: Convecção dos eixos para representação de imagens.
Uma imagem também pode ser representada por uma matriz N x M, conforme a equação a seguir:
1.4.1 Pixel
Conforme PINTRO (2009) pixel é o elemento básico de uma imagem digital. De forma mais geral, um pixel é o menor ponto que forma uma imagem digital, a qual é constituída através de sensores, na verdade pelo agrupamento de milhares de minúsculos sensores, que quando atingidos por raios de luzes grava a tonalidade de cor que atingiu. Depois, por meio de softwares, esses pequenos pedacinhos de imagens são integrados para formar a imagem final. A quantidade de pixels que formam essa imagem resulta por sua vez, pela quantidade de sensores que existem no equipamento de captura, de modo que, quanto mais pixels uma imagem tiver melhor é a sua resolução e qualidade.
O pixel na maioria das vezes assume a forma quadrada ou retangular. Contudo, a organização de uma imagem sob a forma de uma matriz de pixels é realizada em uma simetria quadrada. Isto se deve a facilidade de implementação eletrônica, seja dos sistemas de aquisição, seja dos sistemas de visualização das imagens. Esse tipo de organização provoca o aparecimento de dois importantes problemas nas técnicas de processamento (PADILHA, 2007).
Em primeiro lugar um pixel não apresenta as mesmas propriedades em todas as direções, isto é, ele é anisotrópico. Esta propriedade faz com que um pixel tenha quatro vizinhos de borda e quatro vizinhos de diagonal. Esta característica obriga que seja definido o tipo de conectividade que será utilizada, ou B4 (considerando apenas os vizinhos de borda) ou B8 (considerando os vizinhos de borda e os de diagonal), como ilustrado na Figura 3. O segundo problema é a consequência direta do primeiro, ou seja, as distâncias entre um ponto e seus vizinhos não é a mesma para qualquer tipo de vizinho. Será igual a 1 para vizinhos de borda e 2 para aqueles na diagonal.
1.5 Processamento de Imagens Digitais
Devido ao avanço tecnológico, cada vez mais pessoas têm acesso a imagens digitais, seja por meio de celulares, câmeras, scanners ou até mesmo equipamentos de ultrassom, que posteriormente podem ser modificadas através de tratamento. Essa tecnologia permite que profissionais de várias áreas possam utilizar deste recurso no seu dia a dia. A utilização do PID está crescendo nos últimos anos, com a utilização de imagens e gráficos em diversas variedades de aplicações. Aliado a isso, encontra-se a tecnologia de micro computadores, que também cresce consideravelmente, possibilitando o uso de sistemas mais eficientes e de baixo custo.
Conforme NEVES (2001), o processamento de imagens trata da aquisição de dados de uma imagem adquirida através de algum meio de digitalização e sua manipulação a fim de se obter informações específicas da mesma, realçando as informações importantes e removendo as desnecessárias. Este processo facilita a manipulação bem como a análise dos dados obtidos da imagem, os quais são usados para solução de diversos problemas, tais como: descoberta automática de fissuras em materiais, contagem de glóbulos brancos em amostras de sangue, cálculo do volume sanguíneo nas câmaras do coração.
De acordo com GONZALES et al. (2000), as técnicas de processamento digital de imagens começaram a ter aplicações no início do século XX, com o envio de imagens por meio de cabos submarinos entre Londres e Nova Iorque para a publicação em jornais. As imagens eram codificadas no transmissor e decodificadas no receptor, para o qual havia necessidade de melhoramento na qualidade da imagem.
Segundo MARTINS (2004), o grande salto nas técnicas de processamento de imagens ocorreu com o surgimento dos computadores de grande porte no período da corrida espacial, aliado à necessidade de análise e melhoramento das imagens de televisão, enviadas por sondas espaciais nas missões para a Lua, para Marte (missões Marine) e também nos vôos tripulados para a Lua.
Segundo GONZALES; WOODS (2000) o PID para o reconhecimento de padrões encontrados em imagens pode ser dividido em cinco etapas: aquisição de imagens, pré-processamento, segmentação, representação/descrição e reconhecimento/interpretação, conforme o esquema apresentado na Figura 4.
Figura 5: Etapas de um sistema em PID.
1.5.1 Aquisição de Imagens
A aquisição de imagens, a primeira etapa, segundo GONZALES; WOODS (2000) depende de dois componentes. O primeiro é um dispositivo físico que seja sensível a uma banda do espectro de energia eletromagnética e que produza um sinal elétrico de saída proporcional a um nível de energia percebida. Como exemplos, têm-se equipamentos de radiologia, microscópios eletrônicos, magnéticos, radares, equipamento de ultrassom, câmeras digitais. O segundo é um dispositivo digitalizador para a conversão da saída elétrica para a forma digital.
1.5.2 Pré-Processamento
A segunda etapa é o pré-processamento da imagem. A sua principal função é utilizar métodos e algoritmos, para melhorar a imagem e citar as principais características para a execução do processamento, uns dos exemplos é o isolamento de regiões conforme a textura, o aumento de contraste, a suavização para tons de cinza no caso de imagem colorida e a remoção de ruídos introduzidos no processamento de aquisição das imagens.
1.5.3 Segmentação
A segmentação é um dos processos mais difíceis em processamento de imagem digital, é ela que determina a falha ou sucesso de toda a análise. Ao analisar uma imagem é necessário destacar uma determinada região, proporcionando uma melhor visualização do
objeto que se pretende analisar na imagem. Para analisar uma imagem primeiramente precisamos segmentar a mesma, isso significa, subdividir a imagem em partes ou objetos, que serão analisadas por algoritmos especializados.
Segundo LUCCA (1998), as técnicas empregadas para segmentação automática de imagens podem ser agrupadas em três principais categorias: ajuste de regiões (region fitting), crescimento de regiões (region growing) e detecção de bordas (edge detection).
Segmentações produzidas por algoritmos que empregam técnicas de detecção de bordas baseiam-se em encontrar limites entre regiões homogêneas de diferentes propriedades, e necessitam de operadores específicos que realcem as bordas antes da segmentação. Uma borda é o limite entre duas regiões com propriedades de níveis de cinza relativamente distintas e sua detecção pode ser feita automaticamente por operadores de derivadas locais denominados de gradientes, os quais são implementados usando janelas (máscaras) de vários tamanhos. Técnicas de detecção de bordas têm sido largamente empregadas para segmentar imagens ópticas. Alguns exemplos de operadores de bordas usados em tais imagens são os gradientes de Canny, Prewitt, Sobel, Marr-Hildreth, Log, Roberts, e Zerocross, os quais utilizam máscaras de tamanhos 2 x 2 , 3 x 3 ou 5 x 5 (GONZALES, 1993).
Não existe um método único que possa segmentar todos os tipos de imagens, existem várias técnicas de segmentação de imagens. A escolha de um método adequado depende das características da imagem, das operações de pós-segmentação (reconhecimento de formas, interpretação, localização, etc.) e das características a serem analisadas (contornos, regiões, formas, etc.). Uma imagem em tom de cinza pode ser segmentada de duas maneiras se considerarmos as semelhanças entre os tons de cinza ou as suas diferenças, é a característica da imagem que me dirá qual a técnica mais adequada.
1.5.4 Representação e Descrição
Uma representação é a transformação dos dados em uma forma adequada para em seguida finalizar o processamento. Um método também deve ser especificado para descrever os dados de maneira que os traços interessantes sejam realçados (PADILHA, 2007).
A descrição (seleção de característica) trata da extração de características que resultam em alguma quantidade de informações interessantes ou características que são básicas para diferenciar uma classe de objetos de outra.
1.5.5 Reconhecimento e Interpretação
É o último estágio do PID. Reconhecimento é a parte do processamento que classifica os objetos a partir de informações encontradas na imagem, este processo atribuirá um rótulo para o objeto baseado nas informações recebidas dos descritores. A interpretação envolve a atribuição de significado a um conjunto de objetos.
1.6 Modelo Matemático
O modelo matemático de um sistema físico é considerado um conjunto de equações que, juntamente com as condições de contorno, descrevem adequadamente processo físico que se deseja analisar. Segundo GAYATHRI, JAYAS (2007), os modelos matemáticos podem ser uma ferramenta útil para estudar qualquer sistema complexo onde a manipulação do mesmo é difícil ou até mesmo impossível. As equações matemáticas podem variar de equações simples a equações diferenciais parciais mais complexas. A maior restrição de descrever os problemas do mundo real é a complexidade das equações diferenciais e encontrar soluções exatas para tais equações. Isto pode envolver cálculos tediosos e em a maioria dos casos soluções são impossíveis. Estas limitações podem ser superadas usando suposições simplificando realísticas e usando métodos numéricos apropriados (KNOB, 2010).
2. MATERIAIS E MÉTODOS
O estudo foi desenvolvido no Laboratório de técnica cirúrgica do Hospital Veterinário da UNIJUÍ. O bloco cirúrgico conta com dois vestiários, uma sala de preparação dos pacientes e uma sala de recepção e preparação anestésica. O bloco da técnica cirúrgica possui um local com múltiplos pontos para lavagens de mãos, cinco mesas reguláveis com calha e aste para soro, cinco aparelhos de anestesia inalatória, aspirador cirúrgico, foco cirúrgico e instrumental básico e especial. Apresenta sala de pós-operatório e em anexo, possui uma sala de emergência, onde permanecem pacientes que necessitem tratamento intensivo. As avaliações computacionais foram realizadas em laboratórios específicos da própria UNIJUI.
O ratário foi organizado de forma que permanecesse 24 horas climatizado a 22(±2)°C, com iluminação artificial controlada, em períodos de 12 horas de luz. Em anexo ao local, havia tanque para lavagem das gaiolas e estocagem de maravalha e ração. Não ouve estresse sonoro próximo à sala, bem como trânsito de animais de outras espécies. Os ratos utilizados nesse experimento foram adquiridos no biotério da UNIJUÍ e manipulados sempre pelas mesmas pessoas, sendo essas treinadas para manipulação e contenção da espécie.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Experimentação Animal da UNIJUÍ, seguindo os princípios éticos do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), sob o protocolo N° 001/2013 de 03/07/2013.
Soma-se ainda, à preocupação de bem estar dos animais, referente à utilização de o menor número possível de cobaias; cuidados pós-operatórios rigorosos; manutenção do conforto e analgesia de cada indivíduos, segundo Lei nº 5.517 de 23 de outubro de 1968, artigo 5º; Lei nº 6.638 de 08 de maio de 1979; à resolução nº 592 de 26 de junho de 1992 e Projeto de Lei nº 9.605/1998 e nº 1. 691/2003.
2.1 Modelo experimental
Foram utilizadas 18 ratas (Wistar) da espécie Rattus Norvegicus, com idade aproximada de sessenta dias e massa corporal média de 200 g. Todos os animais foram alojados em gaiolas divididas em 3 grupos, pelo período de 10 dias para sua adaptação às
condições ambientais e ao convívio humano. Durante todo o período do experimento, os animais receberam ração específica para a espécie e água ad libitum.
Os grupos foram diferenciados em: Grupo 1 (Grupo que utilizou Óleo Essencial de Alecrim do Campo), Grupo 2 (Grupo que utilizou Rifamicina comercial) e Grupo 3 (Grupo que utilizou Solução fisiológica). Todos os animais foram tratados por 21 dias consecutivos após a criação da lesão cirurgia, a qual será descrita posteriormente. Esse tratamento consistiu em todos os animais dos três grupos, receberem a limpeza da ferida com dois jatos de solução fisiológica. Após isso, os animais do G1, recebiam 0,1ml de óleo essencial de Alecrim do Campo e o G2, dois jatos de Rifamicina spray. As imagens foram obtidas nos dias 1, 7, 14 e 21 após a criação cirúrgica das lesões.
A opção pela escolha de ratas fêmeas foi baseada no fato de que os grupos foram comparados entre si, sendo todas da mesma idade, oriundas do mesmo local de aquisição e mantidas sobre mesma condição, ou seja, qualquer interferência seria inferida a todos os grupos. Além disso, considerou-se o fato das fêmeas serem menos agressivas, visto não haver possibilidade de realização de curativos oclusivos sobre as lesões, que permaneceram abertas. Amparou-se em trabalhos que utilizaram ratas Wistar (Oliveira et al. 2001; Olsson et al, 2006).
Um diagrama simplificado da metodologia empregada está apresentado na figura 5.
FIGURA 6 – Imagem ilustrativa da metodologia utilizada. Foram 18 ratas, divididos em três grupos, onde cada grupo foi tratado com fitoterápico (Óleo essencial de alecrim), rifamicina e solução fisiológica. Todos os animais foram auto-controle.
2.2 Procedimentos Pré-Cirúrgicos
Os animais foram preparados para a cirurgia com jejum sólido de 4 horas, líquido de 2 horas e higienizados. O protocolo anestésico constou de, medicação pré-anestésica composta por cetamina (50 mg/kg) e midazolam (1 mg/kg), ambos por via intramuscular (IM).Foi realizada tricotomia da região dorsal e após foram encaminhados ao bloco cirúrgico, onde foram posicionados em decúbito dorsal sobre colchão térmico e colocados em máscara facial para anestesia inalatória (Figura 6 A). O agente de manutenção anestésica utilizado foi o isoflurano vaporizado em oxigênio. Como anti-inflamatório terapia, utilizou-se cetoprofeno na dose de 1,5 mg/kg. Com o animal devidamente anestesiando, uma moeda de 10 centavos de real, esterilizada (Figura 6 B), foi utilizada como molde para confecção do defeito, sendo inicialmente demarcada com lápis dermatológico (Figura 6 C) e com o bisturi se promoveu a remoção da camada cutânea (Figura 6 D). Os 18 animais foram operados no mesmo dia e no mesmo turno, minimizando as diferenças entre os períodos de cicatrização de cada um. Após o procedimento cirúrgico, permaneceram no bloco, sob aquecimento até total recuperação anestésica, quando foram transferidos para as gaiolas com suas identificações específicas. As caudas foram marcadas com caneta marca-texto, identificando o animal e seu respectivo grupo.
Figura 7 – Sequência cirúrgica – Indução anestésica através de máscara facial (A); Colocação do molde (moeda de 10 centavos de real esterilizada) sobre o dorso do animal (B); Demarcação com lápis dermatológico (C); Lesão confeccionada após incisão com bisturi (D).
2.3 Procedimentos Pós-Cirúrgicos
Foi administrado cetoprofeno (1,5 mg/kg) como anti-inflamatório pós-operatório, via subcutânea, uma vez ao dia, durante dois dias. Todos foram submetidos à limpeza da ferida cirúrgica com solução fisiológica uma vez ao dia. A troca do curativo foi realizada nos animais de todos os grupos, diariamente, durante 21 dias, conforme já explicitados anteriormente.
2.4 Destino dos Animais
Os animais desse experimento foram eutanasiados após o término de avaliação. O procedimento ocorreu através da aplicação de Tiopental sódico por via intraperitoneal e subsequentemente colocação dos mesmos em câmara hiperbárica sob isoflurano, para aprofundamento do plano anestésico, até parada cardiorrespiratória.
Esse procedimento segue o Artigo 14. Da lei N° 11.794, de 8 de outubro de 2008, que regulamenta o inciso VII do § 1° do art. 225 da Constituição Federal, estabelecendo
procedimentos para o uso científico de animais; revoga a Lei N° 6.638, de 8 de maio de 1979;
e entre outras, dá as providências:
§ 4º O número de animais a serem utilizados para a execução de um projeto e o tempo de duração de cada experimento será o mínimo indispensável para produzir o resultado conclusivo, poupando-se, ao máximo, o animal de sofrimento.”
§ 8º É vedada a reutilização do mesmo animal depois de alcançado o objetivo principal do projeto de pesquisa.”
2.5 Modelo Matemático
Com o contorno da lesão encontrado, será realizado a rotação das células, de modo que, todos fiquem na posição horizontal, possibilitando com isso uma padronização. Este desenvolvimento foi baseado na rotação de elipses desenvolvido através do processo de diagonalização de matrizes. Utilizando a equação geral da elipse, equação (3.1).
ax2bxycy2dxey10 (3.1)
Substituindo todos os N pixels que constituem as bordas (núcleos e externas) das lesões, na equação (3.1), foi obtido um sistema para, dado pela equação (3.2):
Denotando: [ ]( ) [ ] ( ) [ ] ( )
Para determinar os valores das constantes que pertencem ao vetor X, é necessário, em um primeiro momento determinar a matriz pseudo-inversa A* da matriz A, a qual foi determinada pela função pinv do Matlab, que é equivalente a solução deste sistema pelo método dos mínimos quadrados. Após determinar A* foi obtido X através da equação (3.2), com isso será obtido em função das coordenadas utilizadas, variáveis que constituem elipses (xe ye), caracterizadas pelas coordenadas empregadas.
Com os valores do vetor X foi possível determinar o centro de massa dos mesmos, denotado na equação (3.3). { Onde: (3.2) (3.3)
| | | | e | | | |
Após determinar o centro de massa da elipse é realizado a mudança de variáveis, equação (3.4), fazendo com que o ponto de inércia das elipses translade para o centro do plano cartesiano.
{
Substituindo a equação (3.4) na equação (3.1), encontrou-se a equação (3.5).
( ) ( )( ) ( ) ( ) ( )
Reescrevendo a equação (canônica) para as novas coordenadas (X,Y), temos a equação (3.6). Onde: ( ) ( ) ( ) (3.4) (3.5) (3.6)
Onde teremos:
Encontrando autovalores e autovetores:
c b b a A /2 2 /
A X1 1 e
A X2 2 1X12 2Y12 FEncontramos equação da elipse na forma canônica:
1 2 2 1 1 2 1 F Y F X (3.8) 1 F a ; 2 F b E assim teremos: Aab 2 1 F A (3.9) (3.7)
Finalizando essa etapa, obteve-se a imagem de cada lesão, individualmente.
As análises de área da ferida foram realizadas em programa MATLAB Versão 7.9.0, 2004, após realizou-se a análise estatística.
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Neste trabalho foram utilizados Processamento de Imagens Digitais em conjunto com Análise Estatística para a identificação da evolução cicatricial de lesões cutâneas tratadas com fitoterápicos. Tal linha de pesquisa visa, utilizando-se da modelagem matemática, comparar o uso de fitoterápicos com tratamentos tradicionais buscando reduzir os problemas relacionados ao uso indiscriminado de alopatia.
O modelo proposto foi configurado por uma rede feedforwad multicamadas com aprendizado backpropagation, geralmente utilizado para este tipo de reconhecimento de padrões. O processamento de imagens é uma ferramenta que se adapta adequadamente a projetos ligados a diferenciação taxonômica de experimentos, podendo ser treinada para tomar decisões de acordo com as características definidas.
O processamento de imagem foi dividido em cinco etapas. Para a primeira, a aquisição das imagens, obteve-se imagens digitais da área das lesões, fotografadas através de câmera digital semiprofissional (Nikon D3100), acoplada a um tripé com regulagem de altura, com resolução fina de 1280 x 960 pixels, sob luz fluorescente. As imagens foram obtidas sempre da mesma distância e aproximação de zoom, sendo salvas na extensão JPEG (Figura 7 e 8). Dessa forma foi possível comparar os animais entre si, obtendo boa qualidade de imagem.
Figura 8 – Posicionamento do animal abaixo da câmera digital. O tripé foi regulado para obtenção de imagens sempre da mesma distância, respeitando-se ainda o mesmo zoom da câmera.
Figura 9: Imagem Original da ferida, já inserida no programa.
As demais etapas do processamento, após a aquisição da imagem, foram desenvolvidas através da ferramenta criada com base no software MATLAB.
A imagem a ser processada foi inserida ao programa figura 8, onde na etapa seguinte, de pré-processamento, foi feita a suavização em tons de cinza através da função rgb2gray, buscando realçar o contraste, como mostra a figura 9. A imagem foi transformada em uma matriz, onde cada posição da matriz representa um pixel e seu valor representa o tom cinza do referido pixel.
Figura 10: Imagem na etapa de pré-processamento, transformada em tons de cinza.
Na próxima etapa é realizada a segmentação, onde se utilizou alguns métodos para efetuar a detecção do contorno da lesão. De acordo com a qualidade das imagens obtidas, o
Imagem Original 100 200 300 400 500 600 700 100 200 300 400 500 600 700
Imagem em tons de cinza
100 200 300 400 500 600 700 100 200 300 400 500 600 700
Método de Prewitt apresentou o melhor resultado na detecção dos contornos. Contudo, como pode ser observado na figura 9, o resultado não foi satisfatório, apresentando contornos fracos e descontínuos. Assim, foi necessário realizar a dilatação dos contornos com a função
imdilate, obtendo um bom resultado conforme figura 10.
Figura 11: Imagem na etapa de segmentação, bordas detectadas pelo Método de Prewitt.
Contudo, o resultado não foi satisfatório, apresentando contornos fracos e descontínuos. Assim, foi necessário realizar a dilatação dos contornos com a função imdilate, obtendo um bom resultado
Figura 12: Imagem na etapa de dilatação dos contornos com a função imdilate.
A dilatação dos contornos ainda resultou em alguns contornos descontínuos, então aplicou-se a função imfill, que preenche toda a lesão que possui contorno contínuo, como mostra a figura 12.
Bordas detectadas pelo Metodo de Prewitt
100 200 300 400 500 600 700 100 200 300 400 500 600 700
Dilatação dos contornos no Método de Prewitt
100 200 300 400 500 600 700 100 200 300 400 500 600 700
Figura 13: Imagem na etapa de preenchimento da lesão com a função imfill.
Devido à dilatação dos contornos executada anteriormente, algumas lesões perderam suas características, dificultando a identificação dos padrões nas etapas posteriores. Por isso, utilizou-se a função imerode para limpar as bordas da ferida reduzindo a dilatação realizada anteriormente. Logo, os contornos descontínuos também foram removidos, como pode ser visto na figura 13.
Figura 14: Imagem na etapa de limpeza da borda da lesão e remoção dos contornos descontínuos.
Finalizando a etapa de segmentação foi realizada a remoção dos ruídos através da função bwareaopen. Assim, aglomerados de pixels que poderiam ser considerados como objetos a serem identificados, mas que por sua vez não representavam as lesões e sim algum tipo de interferência, foram retirados da imagem, como pode ser observado na figura 14.
Preenchimento da lesão 100 200 300 400 500 600 700 100 200 300 400 500 600 700
Limpeza das bordas da lesão e remoção dos contornos descontínuos
100 200 300 400 500 600 700 100 200 300 400 500 600 700
Figura 15: Imagem na etapa de remoção de objetos menores que 700 pixels.
Com o encerramento prévio da segmentação, deu-se início a etapa de representação, a qual foi inicialmente desenvolvida pela função bwboundaries. A função numerou a lesão identificada na etapa de segmentação, figura 15, e retornou em forma de vetores v as coordenadas matriciais (x,y) de todos os pixels que constituem as bordas dos eritrócitos, possibilitando com isso a extração da característica morfológica das mesmas.
Denotando:
[ ] ( )
, onde representa o número de pixels que constituem a borda da lesão.
Figura 16: Imagem na etapa original com a lesão identificada.
Remoção de objetos menores que 700 pixels
100 200 300 400 500 600 700 100 200 300 400 500 600 700
Imagem original com a lesão identificada
1 100 200 300 400 500 600 700 100 200 300 400 500 600 700
Através destas coordenadas resultantes da função, extraíram-se da imagem os pixels de cada lesão identificados por uma matriz. Devido aos diferentes formatos das lesões, obtiveram-se matrizes de dimensões variadas.
Demonstra-se na tabela 1 a descrição da análise de cada imagem, comparando o resultado pela forma da elipse com o valor real da área da ferida em pixel. Observa-se não haver diferença estatística entre ambas, sendo factível a utilização da área da elipse na obtenção desse tipo de modelo de ferida cutânea experimental.
Tabela 1 - Valores das áreas reais das feridas em pixel e a comparação dos resultados com a área da elipse.
DIA 1 DIA 2 DIA 3 DIA 4
Cálculo elipse Número de pixel Cálculo elipse Número de pixel Cálculo elipse Número de pixel Cálculo elipse Número de pixel G1 Oléo 1 190712.3288 193522.3138 124072.8579 124896.1669 35954.7623 36272.8962 8199.4999 8375.2837 2 297748.7261 302373.7402 119935.5761 121040.1031 42065.8901 42452.8239 9396.7717 9649.5444 3 225667.7421 229972.7406 155749.0186 158665.5774 33160.1887 34320.5995 3001.4564 3230.3164 4 160806.4401 164607.7401 115160.4136 117402.8812 23398.3194 23904.28 4945.7981 5451.8247 5 229809.0496 233025.1538 147872.3566 150182.9224 26691.2685 27364.1184 3440.9808 3588.909 6 210219.627 213350.0227 118127.5979 119536.677 23653.0057 24053.5811 4078.478 4326.0481 G2 Rifamicina 1 216513.319 219511.9592 118284.6431 120425.0179 19675.9291 20204.1158 3358.3982 3913.1971 2 206785.6752 209549.0838 116345.0369 118178.9089 30330.6637 31228.6404 3863.0411 4018.9251 3 178358.5959 181078.82 122510.0697 124712.7996 18804.6543 19238.5581 5811.174 6124.4846 4 210792.8936 213761.421 121938.2887 124696.7514 17247.9003 17812.2053 2093.3174 2175.9982 5 154684.3655 157106.2911 131783.0994 134061.5504 20676.9217 21339.8756 3506.3116 4469.7563 6 206896.5464 210320.258 125002.9122 126582.2577 32075.3322 32955.0836 4546.9844 4915.4126 G3 Sol. fisiológica 1 213034.0907 218234.9752 112589.0798 114212.6558 40873.5388 41479.7307 13161.004 13434.3179 2 209015.545 211073.0143 136801.767 138323.9753 14772.6739 15185.2109 2598.8421 2665.5612 3 219962.6625 223141.26 117601.7963 118653.4427 16710.7895 17173.1317 1000.0000 1000.0000 4 287145.9346 290844.0375 122343.5771 123681.7903 12579.6386 13077.4067 1000.0000 1000.0000 5 184394.8469 186466.4616 118155.4549 120739.2395 43420.6726 44392.7991 10482.1565 10840.3728 6 176692.4453 179337.8629 73469.2781 75388.8996 19296.627 19801.2321 1000.0000 1000.0000
Entendendo-se ter sido eficaz a avaliação da evolução da ferida, aprofunda-se na observação dos tratamentos em questão. Cabe salientar que o uso do óleo essencial de Alecrim-do-campo, se deu na concentração pura. Ainda que o uso de óleos essenciais seja recomendado após diluições, optou-se por iniciar a pesquisa partindo da maior concentração, o que permitirá a evolução desse estudo em trabalhos futuros. Descreve-se na literatura atual a intensificação dos estudos abordando produtos naturais para auxilio na cicatrização (COELHO et al., 2010), sendo seu uso, habitualmente empregado em lesões cutâneas com o
intuído de auxiliar o processo cicatricial (SHIMIZU, 2009). A escolha pelo óleo de alecrim baseou-se em trabalhos que apontam seu benefício. Ferronatto et al. (2007) utilizaram os óleos essenciais obtidos de B. uncinella e B. dracunculifolia, avaliados sobre as bactérias patogênicas Escherichia coli (ATCC 25922-beta-lactamase negativa), Pseudomonas
aeruginosa (ATCC 27853) e Staphylococcus aureus (ATCC 25923-suscetível a oxacilina e
penicilina) e demonstraram a eficiência em inibir o crescimento dos microrganismos testados. O processo de cicatrização da pele, como citado anteriormente, ocorre em três fases: inflamatória, proliferativa e de remodelagem (CLARK, 1996). Na fase proliferativa, ocorre a formação de novos vasos sanguíneos, a partir de vasos preexistentes, conhecido como angiogênese, representando uma importante etapa na cicatrização (FOLKMAN et al., 1992). Devido aos efeitos imputados ao Alecrim-do-campo, sobre sua ação pró-angiogênica estimulada pelas células endoteliais, optou-se pela sua utilização na forma de óleo essencial.
Conforme informado anteriormente, como ponto de partida nessa categoria de pesquisa, definiu-se utilizar o óleo essencial sem diluição. Contudo, na dosagem e concentração utilizada, não foi visualizada vantagem em relação ao grupo controle, observando-se, inclusive, pequena reação inflamatória aos sete dias de avaliação no grupo de animais que receberam aplicação tópica do óleo. Por sua vez, esses animais obtiveram resultados finais semelhantes àqueles que receberam tratamento convencional (aplicação de Rifamicina spray), sugerindo que o óleo essencial não acelerou o processo, mas também não prejudicou a cicatrização, o que instiga a continuidade da pesquisa com diferentes formulações e concentrações.
Nas observações subjetivas do trabalho, evidenciou-se que 66% dos animais do grupo que utilizou o óleo essencial de Alecrim apresentou exsudato seropurulento ao sétimo dia de tratamento, sendo cessado após limpeza. Essa formação pode ter sido desencadeada pela toxicidade do óleo essencial puro, sem diluição, o que levou a formação de crosta de fibrina espessa formada sobre as feridas desse grupo. Notou-se que a ferida com melhor aspecto visual, foi aquela tratada apenas com a limpeza diária de solução fisiológica. Salienta-se que essa observação foi meramente de aspecto visual, pois o processo cicatricial enquanto área de lesão, não diferiu estatisticamente entre os grupos.
Na tabela 2, é possível observar que os resultados na análise de variância para área em mm2 mostra que fatores usados nos experimentos não influenciaram sobre dinâmica de cura. Os ratos também não influenciaram sobre a cura. Somente o tempo foi significativo.
Tabela 2 – Resultados da análise de variância para área em mm2, em quatro diferentes dias de avaliação (1, 7, 14 e 21 dias pós-operatórios), Anova para 2 fatores com repetições.
Tabela da Anova para 2 Fatores com Repetições
G.L. Soma de Quadrados Quadrado Medio Estat. F P-valor
Dia 3 11.10885028 3.702950094 1522.000948 0 2.772537 ** Fator 2 0.012107105 0.006053553 2.488154771 0.0924 3.164993 N.S.
Rato 5 0.017954258 0.003590852 1.47592576 0.2126 2.382823 N.S. Dia:Fator 6 0.016575758 0.002762626 1.135505404 0.3543 2.268717 N.S.
Residuos 55 0.133812174 0.002432949
Gráfico da dinâmica de variação de área média em mm2.
Figura 17: Gráfico da dinâmica de área média em mm2. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 0 1 2 3 4 5 Á re a, mm 2 Dias
Influência de fatores sobre dinâmica de cicatrização
G2 Óleo G3 rifamicina G4 Sol. Fisiológica
Tabela 3 – Resultados da análise de variância para área em mm2, em quatro diferentes dias de avaliação (1, 7, 14 e 21 dias pós-operatórios).
Tabela da Anova
G.L. Soma de Quadrados Quadrado Medio Estat. F P-valor
Dia 3 1537922.275 512640.7583 383.8848754 0 ** Rato 5 5159.375599 1031.87512 0.772707291 0.5745 Ns Fator 2 4073.119737 2036.559869 1.5250534 0.2286 Ns Dia:Fator 6 5285.729453 880.9549088 0.659692504 0.6823 Ns Rato:Fator 10 20042.12116 2004.212116 1.500830174 0.1706 Ns Resíduos 45 60093.105 1335.402333
Gráfico da dinâmica da variação de área média relativa.
Figura 18: Gráfico da dinâmica da variação de área média relativa.
Observa-se que as variações de áreas foram mínimas, tanto entre os grupos, quanto dentro dos próprios grupos. Entendem-se os resultados analisando que nos primeiros dias, ocorre o processo de estabilização de bordas e reorganização dos tecidos ao redor da feria. Com o evoluir da cicatrização, após iniciada a fase de deposição de fibroblastos, as bordas da ferida tendem a cicatrizarem mais rápido, pois é ausente a necessidade de debridamento por parte de neutrófilos e macrófagos. Dessa forma, os valores das áreas da lesão caem significativamente, tendendo à normalidade a partir da terceira semana (14 dias).
Ressalta-se que observação final, que o programa desenvolvido permite analisar detalhadamente a cicatrização cutânea, tornando-se um aliado poderoso nas pesquisas
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 1 2 3 4 5 Á re a r e lativ a Dias G2 Óleo G3 rifamicina G4 Sol. Fisiológica
destinadas a avaliação da cicatrização, pois permite tanto avaliar a evolução do próprio indivíduo, quanto comparar diferentes indivíduos ou tratamentos. Isso torna cada vez mais precisas as pesquisas dessa linha, demonstrando o carácter interdisciplinar que a modelagem matemática é capaz de alcançar.
CONCLUSÃO
A análise computacional de imagens digitalizadas permitiu aferir de forma precisa a área de feridas cutâneas experimentais em ratas Wistar.
O processamento da imagem digital aliado à análise estatística ofereceu dados objetivos para investigação da cicatrização das referidas lesões sob distintos tratamentos.
O uso do óleo essencial puro de Alecrim-do-campo em feridas limpas de ratas Wistar, não contribuiu com a cicatrização, causando irritação local com formação de secreção serosanguinolenta.
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