MICROSCOPIA
Conceitos fundamentais da microscopia
O olho humano tem poder de resolução de aproximadamente 0,1 mm (100 m)
Se olharmos dois pontos separados por uma distância menor que 100 m, esses pontos aparecerão como um ponto único
Como visualizar células ???
Existem duas categorias de microscópia:
1) Microscopia luminosa ou ótica- sistema de lentes para direcionar o caminho que o feixe de luz percorre entre o objeto a ser estudado e o olho. Os principais tipos são: Microscopia luminosa, de campo escuro, de ultravioleta, de fluorescência e de contraste de fase
3) Microscopia eletrônica- Feixe de elétrons controlado por um sistema de campo magnético. Os principais tipos
são:Microscopia eletrônica de transmissão (TEM); Microscopia eletrônica de varredura (SEM)
Microscopia de Tunelamento Microscopia de Força Atômica
Microscópio simples ou lente de aumento
usada por Anton von Leeuwenhoek
Microscópio inventado pelo britânico Robert
Hooke por volta de 1670
Microscópios compostos desenvolvidos
durante os séculos XVII e XVIII
Microscópios do final do
século XIX
Microscópio de luz –microscópio composto que
apresenta um conjunto de lentes, e utiliza a luz visível
como fonte de iluminação.
A ampliação da amostra é obtida quando os raios de luz de um iluminador ( fonte de luz) passam através de um
condensador, que possuem
lentes que dirigem os raios de luz através da amostra. Em seguida os raios de luz passam para as lentes
objetivas. A imagem da
amostra é novamente ampliada pela lente ocular, junto aos olhos
Ampliação total da amostra =
potência de ampliação de lentes objetiva + lente ocular
Luz
Lente
condensadora
Lente
Objetiva
Lente
Ocular
Observador
Esquema simplificado do caminho da luz em um
microscópio de luz comum
Todos os fenômenos, exceto a transmissão
reduz a resolução
É a Capacidade do sistema em distinguir objetos que
estão muito próximos.
Limite de resolução de um microscópio de Luz (LR)
Para um microscópio, o limite de resolução é dado
pela seguinte fórmula:
( LR) = K x / AN
= Comprimento de onda da luz
visível (0.4 a 0,7 m)
K é uma constante avaliada em 0,61
AN representa a abertura numérica, a qual é dada por:
AN= n.sen
Microscopia de luz
Alteração do índice de refração ocorre quando a amostra é colorida.
A ampliação alta da imagem colorida com boa resolução, óleo de imersão são utilizados entre a lâmina de vidro e a lente objetiva de imersão – este método produz imagens com resolução melhor em ampliações maiores que 100xRefração no microscópio composto, utilizando lentes objetivas em óleo de imersão.
Como os índices de refração da Lâmina de vidro e do óleo são os mesmos, os raios de luz não são refratados quando passam de um meio para outro.
A vantagem de utilizar o óleo de imersão é que este possui um índice de refração de 1,5 o qual é semelhante ao do vidro
b) Microscopia de Campo Escuro
Observação de micro-organismos não corados, suspensos em líquidos – preparações a fresco e em gota pendente.
A microscopia de fase é utilizada para observar células e tecidos vivos e é particularmente útil para o estudo da mitose em células cultivadas in vitro.
tem um sistema óptico especial que torna
possível a distinção de materiais biológicos que diferem ligeiramente devido aos seus índices de refração.
d) Microscópio de fluorescência
Fluorescência é a propriedade de algumas substâncias que após serem
excitadas com radiação de baixo comprimento de onda (ultravioleta),
emitirem radiação de maior comprimento de onda.
Micro-organismos corados por um corante fluorescente (fluorocromos)
são observados sob um microscópio de fluorescência, com uma luz
ultravioleta ou próxima, aparecem como objetos brilhantes contra um
fundo escuro.
Microscópio de Confocal
As amostras são coradas com fluorocromos;
O plano de uma pequena região de uma amostra é iluminada com um laser; Cada plano corresponde a uma imagem de um corte fino que foi fisicamente seccionado de uma amostra;
Os planos e as regiões sucessivas são iluminados até que toda a mostra tenha sido examinada;
Imagens bidimensionais excepcionalmente claras são obtidas , com resolução ate 40% melhor que a dos outros microscópios.
Microscópio confocal
Medula
humana
MF
MC
e) Microscópio de ultravioleta
A radiação utilizada é o ultravioleta que tem um
comprimento de onda perto de 0,2 a 0,3 μm, inferior
ao valores de λ para a luz visível, o que permite
melhorar o limite de resolução comparativamente ao
microscópio de campo luminoso.
A óptica é constituída por lentes de quartzo já que o
vidro não transmite este tipo de radiação.
O poder de resolução do microscópio óptico está limitado pela abertura numérica e pelo comprimento de onda da radiação. Não sendo possível
aumentar a abertura numérica, a solução passou pela utilização de radiação de menor comprimento de onda (λ).
Em 1924 Louis de Broglie, um físico francês, demonstrou que os elétrons têm propriedades ondulatórias, à semelhança da luz visível, ultravioleta e raios x.
O comprimento de onda de um elétron em movimento depende da sua velocidade e esta da energia de aceleração que lhe é imprimida.
O comprimento de onda de um elétron é dado por:
λ=h/mv
Nesta fórmula λ representa o comprimento de onda, h é a constante de Planck (6,62559 x 10-34 J.s-1), m é a massa da partícula e v a velocidade da partícula. Os elétrons podem ser acelerados por uma diferença de potencial, sendo a
velocidade diretamente proporcional a essa diferença de potencial (tabela 3).
Comprimento de onda de um elétron em função da diferença de potencial aplicada
Para efeitos de cálculo, valores aproximados para o comprimento de onda dos elétrons podem ser obtidos pela seguinte fórmula:
Elétrons acelerados por diferença de potencial de 50 000 a 100 000 volts têm um comprimento de onda cerca de 100 000 vezes menor que o da luz visível.
Com o valor de λ reduzido é possível aumentar o poder de resolução. O limite de resolução do microscópio eletrônico de transmissão atinge 0,4 a 0,5 nm(excepcionalmente 0,2 nm) o que representa, relativamente ao microscópio óptico, um poder resolvente cerca de 500 vezes maior.
Ao invés de utilizar lentes de vidro o ME utiliza lentes eletromagnéticas
Existem dois tipos de Microscopia eletrônica: Microscopia eletrônica de Transmissão
Microscopia de Tunelamento
Utiliza uma fina sonda de metal que varre uma amostra e produz uma imagem que revela as depressões dos átomos na superfície da amostra
A potência de resolução é muito maior que de um microscópio eletrônico
Microscopia de Força Atômica
Uma sonda de metal e diamante é suavemente forçada sobre a amostra. A medida que a sonda se move ao longo da superfície da amostra, seus movimentos são registrados e uma imagem tridimensional é produzida. Não requer preparo especial da amostra.
Preparação da Amostra
Exame a fresco
No exame a fresco, os microrganismos em suspensão em água, soro fisiológico, meio de cultura, produto biológico, etc, são colocados entre lâmina e lamínulas e observados ao microscópio utilizando normalmente a objetiva de 40X, o condensador em baixo e o diafragma ligeiramente fechado de modo a que não entre demasiada luz. O exame a fresco permite uma primeira observação da morfologia e modo de agrupamento dos microrganismos. Uma vez que as células são observadas vivas, o exame a fresco permite ainda o estudo da eventual mobilidade microbiana.
