GUSTAVO FERREIRA ALVES
Efeitos da inibição da fosfodiesterase-4 sobre parâmetros cardiovasculares e inflamatórios durante a sepse
Florianópolis 2019
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Mestre em Farmacologia.
Alves, Gustavo Ferreira
Efeitos da inibição da fosfodiesterase-4 sobre parâmetros cardiovasculares e inflamatórios durante a sepse / Gustavo Ferreira Alves ; orientador, Daniel Fernandes, 2019.
124 p.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2019.
Inclui referências.
1. Farmacologia. 2. Sepse. 3. Fosfodiesterase-4. 4. cAMP. 5. Cardiovascular. I. Fernandes, Daniel. II. Universidade Federal de Santa Catarina.
Este trabalho é dedicado à minha mãe, Leoni Ferreira Alves em gratidão aos ensinamentos, por todo apoio e amor incondicional.
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, agradeço ao Prof. Dr. Daniel Fernandes pela oportunidade, pela confiança depositada em mim, pela excelente orientação ao longo destes anos, incentivando e ajudando desde a iniciação científica, mas principalmente por compartilhar seus excelentes ensinamentos que com certeza contribuíram muito para meu crescimento pessoal e profissional, além da amizade e ótimo convívio no laboratório. Muito obrigado.
Em especial à minha família, que, mesmo de longe, sempre estiveram perto apoiando, incentivando e ajudando em todos os momentos de dificuldade.
Ao Junior Garcia de Oliveira e Marcelo de Almeida Nakashima, que além de colegas de laboratório, são grandes amigos que a pós-graduação proporcionou. Obrigado por toda ajuda com os experimentos e incentivos, esse trabalho só foi possível com a ajuda de vocês.
Aos professores do Curso de Pós Graduação em Farmacologia da UFSC, pelos ricos ensinamentos transmitidos durante esse período.
Em especial aos Professores Dr. Jamil Assreuy e Dr. José Eduardo da Silva-Santos por disponibilizarem seus laboratórios para o desenvolvimento de muitos dos experimentos realizados, que foram fundamentais para este trabalho. Além de sempre se disporem para discussões e por compartilharem grandemente seus ensinamentos. Por fim, por aceitarem em participar da avaliação do meu trabalho. Muito obrigado.
À Prof. Dra. Regina de Sordi por toda ajuda e ensinamentos desde a iniciação científica.
À Prof. Dra. Aurea Elizabeth Linder, por disponibilizar a estrutura e reagentes de seu laboratório para o desenvolvimento de alguns experimentos.
À Adriane Madeira, por toda ajuda nas diversar necessidades técnicas. Aos alunos do LabCardio, Nariana Pereira, Elaine Anton, Angélica Bernardelli e Thiago Correa por me ensinarem diferentes técnicas que foram fundamentais para meu trabalho, além da boa convivência.
Ao Lucas Braga, novo IC do laboratório que já começou ajudando a todos.
Ao Prof. Dr. Geisson Nardi pelas contribuições ao meu trabalho e por ter aceitado participar da banca de avaliação.
Ao Prof. Dr. Andre Sampaio Pupo, por ser sempre muito gentil, além de sua disponibilidade e boa vontade em vir até Florianópolis participar da minha banca. Muito obrigado.
À Universidade Federal de Santa Catarina e ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico pelo apoio financeiro.
RESUMO
Sepse é um grande problema de saúde pública em todo o mundo. Atualmente sepse é definida como “disfunção de órgãos potencialmente fatal causada por uma resposta desregulada do hospedeiro frente a uma infecção”. Inicialmente, pacientes com sepse desencadeiam uma resposta inflamatória, a qual rapidamente torna-se não controlada, provocando o desequilíbrio homeostático dos sistemas cardiovascular, metabólico, neurológico, dentre outros. A terapia destinada aos pacientes com sepse ainda consiste em abordagens de suporte básicas preconizadas pelos hospitais, sem haver um tratamento específico para esta condição clínica. Assim, a melhor compreensão da fisiopatologia da sepse é o passo inicial para promoção de terapias mais específicas e promissoras. Sendo assim, evidências têm demonstrado que a sepse leva a um prejuízo generalizado nas vias de sinalização da adenosina 3’-5’- monofosfato cíclico (cAMP), a qual em condições normais está envolvida na estabilização da barreira endotelial, contratilidade cardíaca e atividade anti-inflamatória. Portanto, aumentar os níveis de cAMP que estão reduzidos durante a sepse pode ser uma alternativa para retomar a homeostase desta via. Desta forma, utilizamos neste estudo o Roflumilaste (RFM) na dose de 0,3 mg/kg, um inibidor seletivo da enzima fosfodiesterase-4 (PDE-4), a qual é responsável pela degradação de cAMP. Foram utilizados ratos machos e a sepse foi induzida através do modelo CLP (do inglês, Cecal Ligation
and Puncture). O tratamento foi administrado 6 h após a indução da sepse
e os parâmetros foram avaliados 24 h após os procedimentos cirúrgicos. A sepse ocasionou hipotensão, taquicardia, redução do fluxo sanguíneo renal (FSR), hiporreatividade a vasoconstritores, alterações hematológicas, metabólicas, inflamatórias, aumentou os níveis de nitrato + nitrito (NOx), além de aumentar a permeabilidade vascular e os níveis de marcadores bioquímicos de dano tecidual. O tratamento com RFM melhorou a perfusão tecidual, indicada pela restauração do FSR, dos níveis de alanina aminotransferase (ALT) e do lactato sérico, também, melhorou a resposta renal para angiotensina II e fenilefrina in vivo e reduziu os níveis de NOx durante a sepse. Portanto, a inibição da PDE-4 através do RFM demonstrou ser um tratamento promissor na sepse, pois reestabeleceu a homeostase de diferentes sistemas que estão prejudicados durante o quadro clínico, podendo ser uma alternativa de tratamento coadjuvante na sepse, servindo de suporte para as terapias convencionais. Palavras-chave: Sepse; CLP; cAMP; PDE-4; Roflumilaste.
ABSTRACT
Sepsis is a major public health problem worldwide, with high mortality rates. Nowadays sepsis is defined as “potentially fatal organ dysfunction caused by a dysregulated host response to an infection”. Initially, septic pacients develop an inflammatory response, which quickly becomes uncontrolled, causing the homeostatic imbalance of the cardiovascular, metabolic and neurological systems, among others. Treatment for septic patients still consists of basic support approaches recommended by hospitals, without a specific treatment for this clinical condition. Thus, the better comprehension of the physiopathology of sepsis is an urgent need to increase the therapeutic options in the treatment. Therefore, several evidences have shown that sepsis leads to a generalized impairment in 3’-5’-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) signaling pathways, which is involved in the stabilization of the endothelial barrier, cardiac contractility, anti-inflammatory activity, among others. Thus, increasing cAMP levels during sepsis may be an alternative to recover the homeostasis of this pathway, reducing the complications caused by sepsis. We used in this study Roflumilast (RFM) at a dose of 0.3 mg/kg, a selective inhibitor of the enzyme phosphodiesterase-4 (PDE-4), which is responsible for the degradation of cAMP. Male rats were submitted to cecal ligation and puncture (CLP), an experimental model of sepsis. Treatment was given 6 h after induction of sepsis and parameters were evaluated 24 h after surgical procedures. Experimental sepsis caused hypothension, tachycardia, reduced renal blood flow (RBF), hyporeactivity to vasoconstrictors, hematological, metabolic and inflammatory changes, increased levels of nitrate + nitrite (NOx) and, increased vascular permeability and biochemical markers of tissue damage. RFM treatment improved tissue perfusion, indicated by restoration of RBF, alanine aminotransferase (ALT) and serum lactate levels, also improved renal response to angiotensin II and phenylephrine
in vivo and reduced NOx levels during sepsis. Therefore, PDE-4 inhibition with RFM has been shown to be a promising treatment in sepsis, since it has reestablished the homeostasis of different systems that are impaired during the sepsis, and it could be an alternative of adjuvant treatment of this disease, providing addional support for conventional therapies. Key-words: Sepsis; CLP; cAMP; PDE-4; Roflumilast.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Operacionalização dos critérios clínicos para identificação de pacientes com sepse e choque séptico. ... 29 Figura 2 - Número de publicações relacionadas a sepse, NO e cAMP ao longo dos anos. ... 36 Figura 3 - Mecanismos básicos da função e regulação do cAMP. ... 37 Figura 4 - Diversidade de organização dos domínios das isoformas de PDE-4. ... 42 Figura 5 - Efeitos da inibição da PDE-4 na regulação de respostas inflamatórias. ... 44 Figura 6 - Regulação do miócito cardíaco pelas isoformas de PDE-4. 46 Figura 7 - Hipótese: efeitos da inibição da PDE-4 sobre as desordens da sepse. ... 49 Figura 8 - Representação do modelo experimental de sepse por CLP. 55 Figura 9 – Registro típico da análise de dados para reatividade vascular
in vivo. ... 57
Figura 10 – Representação esquemática do procedimento de avaliação da PA, FSR e reatividade vascular. ... 57 Figura 11 – Representação esquemática do procedimento de avaliação da reatividade vascular ex vivo em artéria mesentérica superior. ... 59 Figura 12. Representação esquemática dos procedimentos experimentais gerais. ... 68 Figura 13. Mensuração temporal dos níveis glicêmicos de animais submetidos ao procedimento de ligadura e perfuração do ceco. ... 70 Figura 14. Avaliação dos efeitos da inibição da PDE-4 sobre as alterações cardiovasculares induzidas pela sepse em ratos. ... 72
Figura 15. Avaliação da responsividade a angiotensina II na PAM durante a sepse (delta). ... 73 Figura 16. Avaliação da responsividade a angiotensina II na PAM durante a sepse (integral). ... 75 Figura 17. Avaliação da responsividade a angiotensina II no FSR durante a sepse. ... 75 Figura 18. Avaliação da responsividade a fenilefrina na PAM durante a sepse (delta). ... 76 Figura 19. Avaliação da responsividade a fenilefrina na PAM durante a sepse (integral). ... 78 Figura 20. Avaliação da responsividade a fenilefrina no FSR durante a sepse. ... 78 Figura 21. Avaliação da responsividade a noradrenalina na PAM durante a sepse (delta). ... 79 Figura 22. Avaliação da responsividade a noradrenalina na PAM durante a sepse (integral). ... 80 Figura 23. Avaliação da responsividade a noradrenalina no FSR durante a sepse. ... 81 Figura 24. Reatividade vascular em artéria mesentérica superior em sistema de órgão isolado. ... 82 Figura 25. Medida de extravasamento vascular em animais submetidos ao CLP ou Sham após receberem vasoconstritores. ... 84 Figura 26. Medida da atividade da enzima mieloperoxidase em tecidos de ratos sujeitados ao modelo experimental de sepse. ... 86 Figura 27. Caracterização da produção de NO através da dosagem de nitrato + nitrito (NOx) no plasma de ratos sujeitados a cirurgia de ligadura e perfuração do ceco. ... 87
Figura 28. Avaliação do perfil de expressão da enzima NOS-2 em fígado de animais submetidos à sepse experimental. ... 88 Figura 29. Mensuração dos marcadores bioquímicos séricos em animais sépticos – Efeitos da inibição da PDE-4. ... 90
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Critérios do escore SOFA (Sequential [Sepsis-Related] Organ
Failure Assessment) ... 27
Tabela 2. Critérios qSOFA (Quick SOFA). ... 28 Tabela 3. Classificação das enzimas fosfodiesterases. ... 40 Tabela 4. Parâmetros hematológicos avaliados em sangue total de animais submetidos aos procedimentos CLP e Sham. ... 69 Tabela 5. Avaliação da reatividade vascular in vivo para angiotensina II. ... 74 Tabela 6. Avaliação da reatividade vascular in vivo para fenilefrina. .. 77 Tabela 7. Avaliação da reatividade vascular in vivo para noradrenalina. ... 80 Tabela 8. Avaliação da reatividade vascular ex vivo em artéria mesentérica superior – potência e eficácia. ... 83
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AC – Adenilato Ciclase
ALT – Alanina aminotransferase ANOVA – Análise de variância ASC – Área sob a curva
AST – Aspartato aminotransferase ATP – Adenosina trifosfato
BCA – Ácido bicinconínico (do inglês, bicinchoninic acid) Bcl-6 – Do inglês, B-Cell Lymphoma 6 Protein
BPM – Batimentos por minuto BSA – Albumina do soro bovino
cAMP – Adenosina 3’-5’- monofosfato cíclico
CASP – Perfuração do colo ascendente através de um stent (do inglês,
colon ascendens stent peritonitis)
CBP – Proteína de ligação ao CREB (do inglês, CREB Binding Protein) CE50 – Concentração efetiva capaz de gerar 50% do efeito máximo CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais
cGMP – Guanosina 3’-5’- monofosfato cíclico CID – Coagulação Intravascular Disseminada CK-Total – Creatina quinase total
CLP – Ligadura e Perfuração do Ceco (do inglês, Cecal Ligation and
Puncture)
CNG – Canais regulados por nucleotídeos cíclicos (do inglês,
Cyclic-Nucleotide Gated)
CONCEA – Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal CREB – Proteína de ligação do elemento responsivo ao cAMP (do inglês, cAMP response element-binding protein)
CS – Massa fecal (do inglês, cecal slurry) D.O. – Densidade óptica
DAMPs – Padrões moleculares associados a danos (do inglês,
Danger-Associated Molecular Patterns)
DE50 – Dose efetiva 50% DL50 – Dose letal 50% DMSO – Dimetilsulfóxido
DPOC – Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica DrotAA – Drotrecogina alfa ativada
E.P.M. – Erro padrão da média
EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético Emáx – Efeito máximo atingido
ERK – Do inglês, Extracelullar Signal-Regulated Kinase FC – Frequência cardíaca
FDA – Do inglês, U.S. Food and Drug Administration FE – Fenilefrina
FiO2 – Fração de oxigênio inspirado FSR – Fluxo sanguíneo renal
GETs – Fatores de troca de nucleotídeo guanina (do inglês,
Guanine-Nucleotide Exchange Factors)
GPCRs – Receptores acoplados à proteína G (do inglês, G-Protein
Coupled Receptors)
HTAB – Brometo de hexadeciltrimetilamônio I.m. – Intramuscular I.p. – Intraperitoneal I.t. – Intratraqueal I.v. – Intravenosa IL-10 – Interleucina 10 IL-1β – Interleucina 1β IL-6 – Interleucina 6 Km – Constante de Michaelis-Menten LDH – Lactato desidrogenase LPS – Lipopolissacarídeo
LR1 e 2 – Do inglês, Linker Region 1 or 2
LTCC – Canais de cálcio do tipo L regulados por voltagem (do inglês,
L-Type Calcium Channel)
MPO – Mieloperoxidase NA – Noradrenalina
NFĸB – Fator de transcrição nuclear kappa B (do inglês, nuclear factor
kappa B)
NO – Óxido nítrico (do inglês, nitric oxide) NOS-2 – Óxido nítrico sintase induzida NOx – Nitrato e nitrito
PA – Pressão arterial
PaCO2 – Pressão parcial de gás carbônico PAD – Pressão arterial diastólica
PAM – Pressão arterial média
PAMPs – Padrões moleculares associados a patógenos (do inglês,
Pathogen-Associated Molecular Patterns)
PaO2 – Pressão parcial de oxigênio PAS – Pressão arterial sistólica PDE-4 – Fosfodiesterase-4
PDE-5 – Fosfodiesterase-5
PKA – Proteína quinase A (do inglês, Protein Kinase A) PLB – Fosfolambana (do inglês, Phospholamban) PPi – Pirofosfato
PRR – Receptores de reconhecimento padrão (do inglês, Pattern
Recognition Receptors)
qSOFA – Do inglês, Quick Sequential Organ Failure Assessment RAP1 – Do inglês, Ras-related protein 1
RFM – Roflumilaste
RYR2 - Receptores de rianodina (do inglês, Ryanodine Receptor 2) SDS-PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida (do inglês, sodium
dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)
SERCA2a - Do inglês, Sarcoplasmic Endoplasmic Reticulum Calcium
ATPase 2a
sGC – Guanilato Ciclase solúvel
SIRS – Síndrome da resposta inflamatória sistêmica (do inglês, systemic
inflammatory response syndrome)
SOFA – Do inglês, Sequential [Sepsis-Related] Organ Failure
Assessment)
SSC – Do inglês, Surviving Sepsis Campaign TLR – Do inglês, Toll-like receptors
TNF-α – Fator de necrose tumoral α (do inglês, Tumor Necrosis Factor
α)
UA – Unidades Arbitrárias
UCR – Do inglês, Upstream Conserved Region UFSC – Universidade Federal de Santa Catarina UI – Unidades Internacionais
UTI – Unidade de Terapia Intensiva VE – Ventrículo esquerdo
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 25 1.1 SEPSE: CONCEITOS E EPIDEMIOLOGIA ... 25 1.2 FISIOPATOLOGIA DA SEPSE ... 31 1.2.1 Disfunção cardiovascular ... 32 1.2.2 Disfunção respiratória ... 33 1.2.3 Disfunção renal ... 33 1.2.4 Disfunção neurológica ... 33 1.2.5 Disfunção hematológica ... 34 1.2.6 Disfunção hepática ... 34 1.3 ESTUDOS BASEADOS EM EVIDÊNCIAS ... 35 1.4 SEPSE E CAMP ... 36 1.5 SEPSE E FOSFODIESTERASES ... 40 1.6 ROFLUMILASTE ... 46 2 HIPÓTESE ... 49 3 OBJETIVOS ... 51 3.1 OBJETIVO GERAL ... 51 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 51 4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 53 4.1 ANIMAIS ... 53 4.2 COMPOSTOS E REAGENTES ... 53 4.3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ... 54 4.3.1 Indução de sepse por ligadura e perfuração do ceco ... 54 4.3.2 Avaliação dos parâmetros cardiovasculares ... 55 4.3.2.1 Pressão arterial (PA) e frequência cardíaca (FC) ... 55 4.3.2.2 Fluxo sanguíneo renal (FSR) ... 56 4.3.2.3 Reatividade vascular in vivo sobre a PAM e FSR ... 56 4.3.2.4 Reatividade vascular ex vivo ... 58 4.3.3 Avaliação da permeabilidade vascular ... 59 4.3.4 Ensaio da atividade enzimática mieloperoxidase (MPO) 60 4.3.5 Dosagem de nitrato e nitrito (NOx) ... 60
4.3.6 Imunoeletroforese (Western blotting) ... 61 4.3.6.1 Preparo de amostras ... 61 4.3.6.2 Eletroforese, eletrotransferência e imunodetecção ... 62 4.3.7 Análises hematológicas ... 63 4.3.8 Análises bioquímicas ... 63 4.3.8.1 Lactato Desidrogenase (LDH) ... 64 4.3.8.2 Creatina Quinase Total (CK-Total) ... 64 4.3.8.3 Aspartato aminotransferase (AST) ... 64 4.3.8.4 Alanina aminotransferase (ALT) ... 65
4.3.8.5 Lactato ... 65 4.3.9 Glicemia ... 66 4.3.10 Protocolos experimentais ... 66 4.3.10.1 Coleta e armazenamento de tecidos ... 66 4.3.10.2 Grupos experimentais e tratamentos ... 67 4.3.11 Análise dos resultados e testes estatísticos ... 68 5 RESULTADOS ... 69 5.1 ANÁLISE DO PERFIL HEMATOLÓGICO DE ANIMAIS SUBMETIDOS À LIGADURA E PERFURAÇÃO DO CECO – AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA INIBIÇÃO DA PDE-4 ... 69
5.2 AVALIAÇÃO DOS VALORES DE GLICOSE SANGUÍNEA
EM ANIMAIS SUBMETIDOS AO MODELO EXPERIMENTAL DE SEPSE ... 70
5.3 AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES
CARDIOVASCULARES INDUZIDAS PELA SEPSE
EXPERIMENTAL ... .71 5.3.1 Parâmetros cardiovasculares basais avaliados in vivo .... 71 5.3.2 Avaliação da reatividade vascular in vivo ... 73 5.3.3 Reatividade vascular ex vivo em artéria mesentérica superior ... 81
5.4 AVALIAÇÃO DA PERMEABILIDADE VASCULAR APÓS
DESAFIO COM VASOCONSTRITORES NA SEPSE ... 83 5.5 INVESTIGAÇÃO DO EFEITO DA INIBIÇÃO DA PDE-4 NA RESPOSTA INFLAMATÓRIA DE RATOS SUBMETIDOS À LIGADURA E PERFURAÇÃO DO CECO ... 85 5.5.1 Avaliação do recrutamento de neutrófilos para tecidos através da atividade da MPO ... 85 5.5.2 Quantificação dos níveis plasmáticos de nitrato + nitrito (NOx) ... 86
5.5.3 Avaliação do perfil de expressão da enzima óxido nítrico sintase induzida (NOS-2) em fígado ... 87 5.6 EFEITOS DO RFM NOS MARCADORES BIOQUÍMICOS DE DANO DE ÓRGÃOS DURANTE A SEPSE EXPERIMENTAL . 88 6 DISCUSSÃO ... 91 7 CONCLUSÕES ... 105 8 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 107 9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 109
1 INTRODUÇÃO
1.1 SEPSE: CONCEITOS E EPIDEMIOLOGIA
A palavra sepse é derivada do grego (σηψις), que significa “decomposição da matéria orgânica animal ou vegetal na presença de bactérias”. Foi derivada do verbo “sepo” (σηπω), que significa “apodrecer”. É uma síndrome muito antiga, em que as primeiras descrições no âmbito medicinal foram mencionadas em poemas de Homero. Além disso, manifestações clínicas já constavam nos escritos do grande filósofo e médico Hipócrates, entre 460-370 a.C. (GEROULANOS; DOUKA, 2006). Embora antiga, ainda não há um padrão ouro para as definições de sepse, bem como o diagnóstico precoce e o tratamento apropriado permanecem sendo um desafio.
Em um passado não muito remoto, os resultados dos ensaios clínicos que avaliavam os tratamentos para a sepse na década de 80 acabavam sendo obscurecidos por uma discrepância nas definições entre os termos utilizados, tais como infecção, bacteremia, sepse, septicemia, síndrome séptica, dentre outros (BONE et al., 1987). Portanto, em 1991, em uma conferência de consenso, as sociedades The American College of
Chest Physicians e Society of Critical Care Medicine reuniram-se em
Chicago e estabeleceram as primeiras definições para sepse. Sepse foi então definida como sendo a síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS, do inglês, systemic inflammatory response syndrome) frente a uma infecção. O diagnóstico de SIRS era estabelecido quando o paciente apresentava duas ou mais das seguintes manifestações clínicas: (1) temperatura corporal > 38 °C ou < 36 °C; (2) frequência cardíaca > 90 bpm; (3) taquipneia, manifestada como frequência respitarória > 20 movimentos/minuto ou hiperventilação, indicado pela pressão parcial de gás carbônico (PaCO2) < 32 mmHg; (4) leucocitose > 12.000/mm3 ou leucopenia < 4.000/mm³; ou ainda, presença de mais de 10% de bastonetes. Entretanto, a etiologia da SIRS não era apenas infecciosa, mas sim por vários outros insultos não-infecciosos, tais como pancreatite, trauma, isquemia e queimadura sendo os mais frequentes. Além disso, também foram definidas as condições de sepse grave, que correspondia ao paciente séptico com disfunção de órgãos, hipoperfusão ou hipotensão e choque séptico, um subconjunto de sepse grave, com hipotensão persistente apesar de adequada reposição volêmica, com necessidade da terapia inotrópica ou vasopressora (BONE et al., 1992).
Estes conceitos estabelecidos em 1991 foram criticados por muitos clínicos da época, relatando que tais definições de sepse permaneciam amplas e não forneciam clareza suficiente (POEZE et al., 2004). Portanto, em 2001, dez anos após a primeira conferência, ocorreu a segunda reunião de consenso e os critérios para sepse foram atualizados. Os critérios diagnósticos foram mantidos, além dos termos sepse, sepse severa e choque séptico que não foram alterados, no entanto, as definições para cada um deles foram modificadas. Em suma, a conferência focou em determinar com maior riqueza de detalhes os sinais e sintomas de sepse (LEVY et al., 2003).
Anos depois, uma nova definição foi requerida devido aos avanços na epidemiologia e manejo da sepse. Publicado em fevereiro de 2016, o novo relatório do consenso enfatiza a disfunção de órgãos e considera os fatos de que os critérios SIRS apresentam baixa sensibilidade e especificidade na discriminação de sepse. Desta forma, segundo a última atualização, sepse é definida como “disfunção de órgãos potencialmente fatal causada por uma resposta desregulada do hospedeiro frente a uma infecção”. O termo sepse severa foi abolido das definições, sendo considerado supérfluo. Além disso, as definições para choque séptico foram também atualizadas e se tornou um subconjunto da sepse em que anormalidades subjacentes (circulatórias e metabólicas/celulares) são profundas o suficiente para aumentar substancialmente a mortalidade. Desta maneira, pacientes com choque séptico podem ser clinicamente identificados pela hipotensão persistente, requerendo terapia vasopressora para manter a pressão arterial média (PAM) ≥ 65 mmHg e apresentando um nível de lactato sérico > 2 mmol/L, apesar da adequada reposição volêmica. Contudo, a severidade da disfunção de órgãos em pacientes com suspeita de infecção passou a ser determinada pelo sistema de pontuação SOFA (do inglês, Sequential [Sepsis-Related] Organ
Failure Assessment) (Tabela 1). Este escore SOFA é calculado na
admissão do paciente e uma vez a cada 24 h, o qual determina o nível de disfunção em 6 sistemas (respiratório, coagulação, hepático, cardiovascular, renal e neurológico). De tal forma, foi estabelecido que a disfunção de órgãos é definida com o aumento de 2 ou mais pontos na escala SOFA e isto, por sua vez, tem sido correlacionado com o aumento de mais de 10% na mortalidade hospitalar (SINGER et al., 2016).
Tabela 1. Critérios do escore SOFA (Sequential [Sepsis-Related] Organ
Failure Assessment).
Sistema Escore SOFA
0 1 2 3 4
Respiratório ---- com suporte respiratório ----
PaO2/FiO2 (mmHg) ≥400 <400 <300 <200 <100 Coagulação Plaquetas x 10³/mm³ ≥150 <150 <100 <50 <20 Hepático Bilirrubina (mg/dL) <1,2 1,2 - 1,9 2,0 – 5,9 6,0 – 11,9 >12,0 Cardiovascular Hipotensão PAM ≥70 mmHg PAM <70 mmHg Dopamina <5 ou Dobutamina (qualquer dose)a Dopamina 5,1 – 15 ou adrenalina ≤0,1 ou noradrenalina ≤0,1a Dopamina >15 ou adrenalina >0,1 ou noradrenalina >0,1a Neurológico Escore de coma de Glasgowb 15 13 - 14 10 - 12 6 - 9 <6 Renal Creatinina (mg/dL) <1,2 1,2 – 1,9 2,0 – 3,4 3,5 – 4,9 >5,0 Débito urinário (mL/d) - - - <500 <200
Abreviações: PaO2, pressão parcial de oxigênio, FiO2, fração de oxigênio inspirado, PAM, pressão arterial média.
a Doses de catecolaminas dadas µg/kg/min por pelo menos 1 h.
b Escore da escala de coma de Glasgow variam de 3 – 15, maior pontuação indica melhor função neurológica.
Fonte: Adaptado de SINGER et al., 2016.
Além do escore SOFA, foi desenvolvido o qSOFA (do inglês,
Quick Sequential Organ Failure Assessment) com o objetivo de prevenir
a disfunção de órgãos relacionada à sepse principalmente fora das unidades de terapia intensiva (UTIs) e no departamento de emergência, na tentativa de iniciar o tratamento adequado precocemente, acelerar a internação em terapia intensiva e aumentar a frequência de monitoramento. Embora o sistema qSOFA seja menos robusto que o sistema SOFA, este não requer testes laboratoriais e pode ser avaliado rapidamente e repetidamente. O sistema respiratório, estado mental e a pressão arterial são os parâmetros analisados pelo sistema qSOFA (Tabela 2) e foi determinado que um aumento de 2 ou mais pontos no
escore qSOFA corresponde a um aumento de 3 a 14 vezes na mortalidade hospitalar. Nesse sentido, um aumento de 2 ou mais pontos no escore qSOFA deve-se criar uma suspeita de sepse e a avaliação da disfunção de órgãos deve ser realizada. Por fim, o fluxograma representado na Figura 1 resume o processo de operacionalização dos critérios clínicos para identificação de pacientes com sepse e choque séptico (SINGER et al., 2016).
Tabela 2. Critérios qSOFA (Quick SOFA). Critérios qSOFA (Quick SOFA)
Taxa respiratória ≥ 22 movimentos/minuto
Alterações do estado mental (Escore da escala de coma de Glasgow <15) Pressão arterial sistólica ≤ 100 mmHg
Figura 1. Operacionalização dos critérios clínicos para identificação de pacientes com sepse e choque séptico.
Fonte: Adaptado de SINGER et al., 2016.
Sepse é uma grande preocupação de saúde pública em todo o mundo. Apesar disso, os dados de uma maneira global são ainda escassos. Os estudos epidemiológicos atuais ainda são acometidos pela falta de consenso nas definições de sepse ao longo dos anos, o que gerou, portanto, falta de conhecimento abrangente sobre as reais taxas mundiais de incidência e mortalidade por sepse. No entanto, Feischmann e colaboradores (2016) realizaram uma meta-análise com estudos epidemiológicos que datavam entre 1979-2015. Baseado nos dados da última década, os autores reportam uma estimativa de mais de 30 milhões de casos por ano mundialmente. Além disso, estimaram que a sepse pode
causar ou contribuir para mais de 5,3 milhões de mortes por ano em todo o mundo.
Nos Estados Unidos, sepse é a principal causa de doença e morte, afetando mais de 1,5 milhões de Americanos a cada ano (HERSHEY; KAHN, 2017). Adicionalmente, segundo os dados da Agência Americana (Agency for Healthcare Research and Quality), em 2013, sepse sozinha, foi a condição mais cara tratada, correspondendo a 23,7 bilhões de dólares, ou então 6,2% dentre todos os custos de hospitalização. Da mesma forma, geograficamente distante, os dados da National Health
Service no Reino Unido, em sua última atualização em 2016, trazem que
a sepse gera em torno de 250.000 casos por ano de acordo com a UK
Sepsis Trust e, pelo menos 46.000 pessoas morrem a cada ano como
resultado desta condição.
Embora não haja dados representativos da incidência de sepse em países de baixa e média renda (FLEISCHMANN et al., 2016), dados extrapolados de estudos de países de alta renda, sugerem que apenas 15% da incidência de sepse são provindos destes países de alta renda, enquanto que os 85% restantes são oriundos dos de baixa e média renda (ADHIKARI et al., 2010). De tal forma, um estudo observacional realizado recentemente no Brasil traz dados atuais sobre a incidência e mortalidade por sepse. Os dados foram estimados a partir da análise de 2.632 pacientes internados em 227 UTIs distribuídas por todas as regiões do país. Os resultados denotam que cerca de 420.000 casos de sepse por ano ocorrem no Brasil atualmente, que por sua vez resulta em uma alta taxa de mortalidade, com mais de 56% de fatalidade por sepse ao ano (MACHADO et al., 2017). Estes dados são um tanto contrastantes com os países de alta renda, demonstrando que não há homogeneidade de incidência e mortalidade entre países com diferentes classes econômicas.
Portanto, a alta incidência e mortalidade por sepse são representantes de um grande problema de saúde pública em todo o mundo e, embora tenha sido promissor a implementação das diretrizes Surviving
Sepsis Campaign (RHODES et al, 2016), que consiste em recomendações
baseadas em evidências para o manejo e tratamento da sepse, mais estudos e novas abordagens terapêuticas devem ser consideradas para melhorar esta condição clínica alarmante.
1.2 FISIOPATOLOGIA DA SEPSE
Sepse é uma síndrome altamente complexa e heterogênea que é ocasionada por uma resposta desregulada do hospedeiro frente uma infecção. Além disso, é importante ressaltar que, embora a infecção seja o evento desencadeante nessa definição de sepse, a resposta imune descontrolada geralmente permanece, mesmo após o tratamento bem-sucedido da infecção (POLL et al., 2017).
Os sítios de infecções mais comuns que conduzem a sepse são: o sistema respiratório (64% dos casos), seguido pelas infecções abdominais (20%), da corrente sanguínea (15%) e do trato genitourinário e renal (14%) (VINCENT et al., 2006, 2009; KARLSSON et al., 2007). Junto a isso, os principais patógenos isolados em pacientes com sepse incluem as bactérias Gram-positivas (Streptococcus pneumoniae e Staphylococcus
aureus), Gram-negativas (Escherichia coli, Klebsiella spp., e Pseudomonas aeruginosa) e, em menor instância fungos (Candida spp)
(MARTIN et al., 2003; VINCENT et al., 2009). Após a infecção, o patógeno invasor é reconhecido por células do sistema imune inato do hospedeiro através dos receptores de reconhecimento padrão (PRRs, do inglês, Pattern Recognition Receptors), tais receptores reconhecem estruturas conservadas dos patógenos, denominados padrões moleculares associado a patógenos (PAMPs, do inglês, Pathogen-Associated
Molecular Patterns). Além disso, os PRRs também reconhecem sinais
endógenos de perigo, denominados padrões moleculares associados a danos (DAMPs, do inglês, Danger-Associated Molecular Patterns) que são liberados durante o estresse inflamatório e, portanto, ativando complementarmente o sistema imune do hospedeiro (TAKEUCHI; AKIRA, 2010).
Os principais componentes celulares dos microrganismos que desencadeiam a ativação celular e a cascata de eventos plasmáticos nesta fase inicial são: o ácido lipoteicóico e peptidoglicanos, derivados de bactérias Gram-positivas (exotoxinas); o lipopolissacarídeo (LPS), das bactérias Gram-negativas (endotoxinas); e Manosídeos O-ligados, que são polissacarídeos encontrados em membranas de leveduras (Candida spp). Todos estes fatores são reconhecidos pelos PRRs e sequencialmente desencadeiam a cascata de ativação (NDUKA; PARRILLO, 2009). Diversas classes de PRRs já foram identificadas, no entanto, uma classe de interesse para a sepse são os receptores Toll-like (TLRs), os quais já
foram identificados 10 diferentes isoformas em humanos. Os TLRs quando reconhecem PAMPs e DAMPs desencadeiam uma cascata de transdução de sinal por diferentes vias de sinalização intracelular, resultando em um dos principais mecanismos descritos, sendo a translocação do NFĸB (do inglês, Nuclear Factor ĸB) citoplasmático para o núcleo, que por sua vez, promove ativação de genes alvo e, portanto, promove a transcrição de um arsenal de citocinas inflamatórias (LAWRENCE, 2009). A sepse é caracterizada por um desbalanço de citocinas pró- e anti-inflamatórias. Inicialmente ocorre uma superprodução de citocinas pró-inflamatórias, tais como o fator de necrose tumoral α (TNF-α, do inglês, Tumour Necrosis Factor α), Interleucina 1β (IL-1β), IL-6, dentre outras, que estão envolvidas no processo de migração celular, ativação do sistema complemento e da cascata de coagulação. Todos esses mecanismos em conjunto conduzem ao dano tecidual causado pela inflamação excessiva. Por outro lado, há uma fase de imunossupressão caracterizada pela transcrição de citocinas anti-inflamatórias (IL-10), apoptose de linfócitos, dentre outros, que juntos conduzem a um quadro de susceptibilidade a infecções secundárias (WIERSINGA et al., 2013).
O efeito desta resposta inapropriada à infecção conduz à disfunção celular e, em última instância, à falência de órgãos. Embora qualquer órgão possa ser afetado na sepse, por razões práticas com que a função dos órgãos possa ser avaliada, seis sistemas são geralmente avaliados na prática clínica e têm sido os mais amplamente estudados: cardiovascular, respiratório, renal, sistemas neurológicos, hematológicos e hepáticos. 1.2.1 Disfunção cardiovascular
A hipotensão arterial é o fator mais comum da disfunção cardiovascular em pacientes com sepse. O principal fator contribuinte para a fisiopatologia da hipotensão arterial é a hipovolemia, redução do tônus vascular e depressão miocárdica, que pode ser grave e estar associada com a diminuição global da fração de ejeção ventricular direita e esquerda (ANTONUCCI et al., 2014). Neste contexto há a importante participação do óxido nítrico (NO, do inglês, Nitric Oxide) (FERNANDES; ASSREUY, 2008), por seus efeitos no relaxamento do músculo liso vascular via guanilato giclase solúvel (sGC) e guanosina 3’-5’- monofosfato cíclico (cGMP), o que contribui para a persistente hipotensão arterial na sepse (FERNANDES et al., 2009). Além disso, as
anormalidades circulatórias são observadas em um panorama macro e microvascular, com formação de microtrombos, presença da disfunção endotelial, aumento da permeabilidade vascular e formação de edema, que em conjunto, conduzem ao colapso cardiovascular (LELUBRE; VINCENT, 2018).
1.2.2 Disfunção respiratória
Uma diminuição na pressão parcial arterial de oxigênio (PaO2), ou hipoxemia, é uma característica da disfunção pulmonar em pacientes com sepse, a qual é evidente clinicamente como hiperventilação (aumento da frequência respiratória). Esta condição também é chamada de síndrome da angústia respiratória aguda, a qual é heterogênea e caracterizada por uma permeabilidade aumentada das células endoteliais capilares e das células epiteliais alveolares. A causa inicial tem sido demonstrada ser pelo dano direto do patógeno invasor, assim como pelos diversos mediadores inflamatórios liberados durante a sepse. O tratamento da hipoxemia requer administração de oxigênio, e nos casos mais graves, ventilação mecânica é necessária, além da remoção do foco infecioso (KIM; HONG, 2016).
1.2.3 Disfunção renal
Os pacientes sépticos com disfunção renal apresentam como principal problema um menor volume de urina (oligúria). Dentre os fatores contribuintes para esta disfunção estão as mudanças hemodinâmicas causadas pela sepse, como a hipovolemia e a isquemia renal. Outros fatores como a inflamação renal e a alteração da função tubular, além do próprio manejo hospitalar com o uso de antibióticos nefrotóxicos e contrastes para exames de imagens podem contribuir para certa toxicidade renal (HONORE et al., 2015). Além disso, é comum o aumento dos níveis séricos de ureia e creatinina nestes pacientes, associado com menores taxas de sobrevivência a longo prazo (LINDER
et al., 2014).
1.2.4 Disfunção neurológica
Os sinais de estado mental alterados que podem ocorrer nos pacientes sépticos variam desde confusão, desorientação e até mesmo o estado de coma. A encefalopatia associada a sepse se define como uma
disfunção cerebral difusa que acompanha a sepse na ausência de infecção direta do sistema nervoso central (GOFTON; YOUNG, 2012). A mortalidade é maior nos pacientes que a desenvolvem (SPRUNG et al., 1990), além de permanecerem com sequelas cognitivas e funcionais. Alguns dados em estudos animais demonstram que o NO, juntamente com o LPS e citocinas pró-inflamatórias, contribuem para a disfunção da barreira hemato-encefálica, facilitando a passagem de fatores neurotóxicos. Além disso, a neurotransmissão, o metabolismo e a microcirculação cerebral também estão alterados nesta condição (CHAUDHRY; DUGGAL, 2014).
1.2.5 Disfunção hematológica
A disfunção hematológica nos pacientes com sepse se apresenta, na sua maioria, como coagulopatias. Desordens de coagulação são comuns, indicadas pela prolongação do tempo de protrombina e tempo de tromboplastina parcial ativada. Frequentemente, os pacientes também apresentam baixa contagem de plaquetas e elevados níveis de dímero-D, um fragmento proteico presente na circulação após ativação do sistema de coagulação (por exemplo, em situação de Coagulação Intravascular Disseminada, ou CID) (LELUBRE; VINCENT, 2018). A CID ocorre em aproximadamente 35% dos pacientes com sepse, apresentando-se como tromboses em vasos de pequeno e médio porte e contribuindo para a disfunção de múltiplos órgãos (LEVI; VAN DER POLL, 2017), além de estar associada com mortalidade em pacientes com choque séptico (FOURRIER et al., 1992).
1.2.6 Disfunção hepática
A função alterada do fígado na sepse se reflete pelo aumento dos níveis de bilirrubina e das transaminases (AST e ALT). Os patógenos e suas toxinas, bem como a resposta desregulada do sistema imune com inflamação exacerbada, contribuem para a disfunção hepática. A hipoperfusão do fígado também contribui para a disfunção hepática associada a sepse, que ocorre em cerca de 34% a 46% dos pacientes. Por fim, diversos sistemas têm a homeostase desregulada por consequência das disfunções do fígado, como o sistema de coagulação, o sistema imune e o sistema metabólico. O importante papel do fígado na depuração de bactérias e das toxinas liberadas pelos microrganismos, como o LPS,
também está desregulado e contribui para a disfunção sistêmica de órgãos (YAN; LI; LI, 2014).
1.3 ESTUDOS BASEADOS EM EVIDÊNCIAS
A abordagem terapêutica na clínica ainda consiste em intervenções básicas preconizadas nos hospitais, sem haver um tratamento específico para a sepse. No entanto, as múltiplas disfunções de órgãos citadas anteriormente, em última instância, conduzem o paciente ao óbito pelo diagnóstico tardio e, consequentemente pela falta de suporte terapêutico precoce, o que demonstra a complexidade da síndrome e, portanto, a importância dos estudos sobre a base fisiopatológica para melhor esclarecimento e assim surgir novas terapias eficazes.
A partir da década de 40, os estudos sobre sepse foram tomando grandes proporções (Figura 2) e graças aos inúmeros estudos publicados ao longo dos anos, grandes avanços no entendimento sobre a fisiopatologia da doença já foi alcançado. No entanto, ainda necessita de maiores esclarecimentos, bem como a busca por alternativas terapêuticas eficazes permanecem sendo o alvo da comunidade científica. Englobando isso, determinadas vias de sinalização relacionadas a fisiopatologia da sepse se tornam alvo de grandes investigações, como é o caso do NO, que após sua descoberta na década de 80, teve seus olhares voltados para esta molécula de grande relevância para a patologia da sepse. Além disso, outras moléculas muito importantes que são conhecidas há mais tempo, nunca foram tão estudadas quanto o NO, como é o caso da adenosina 3’-5’- monofosfato cíclico (cAMP), uma molécula ubíqua, que participa da homeostase de diversas vias de sinalização, parece ter um papel fundamental nos processos fisiopatológicos da sepse, no entanto não tem chamado muito a atenção ao longo dos anos e merece ser melhor abordada.
Figura 2. Número de publicações relacionadas a sepse, NO e cAMP ao longo dos anos. Para busca foi utilizada a seguinte ferramenta (sepsis OR septic shock); (sepsis OR septic shock AND nitric oxide OR NO); (sepsis OR septic shock AND cAMP);
Fonte: Pubmed. 1.4 SEPSE E CAMP
O cAMP é um segundo mensageiro intracelular que foi descoberto por Earl Sutherland em meados de 1960 durante seus estudos de regulação hormonal do metabolismo hepático e cardíaco em mamíferos (RALL; SUTHERLAND; BERTHET, 1957; SUTHERLAND; RALL, 1958). Em vertebrados, o cAMP é sintetizado por 10 isoformas diferentes de adenilato ciclase (AC), categorizadas em membranares (AC1-AC9) e uma isoforma solúvel (sAC) (DEFER; BEST-BELPOMME; HANOUNE, 2000). Quando uma variedade de ligantes extracelulares ativam receptores acoplados a proteína G (GPCRs, do inglês,
G-Protein-Coupled Receptors) e consequentemente ativam as enzimas AC, estas
enzimas catalisam a conversão de adenosina trifosfato (ATP) em pirofosfato e cAMP. Adicionalmente, além das AC, a concentração e a distribuição de cAMP intracelular são regulados pelas enzimas fosfodiesterases (PDEs, do inglês, Phosphodiesterases), as quais convertem o cAMP em 5’-AMP (inativo) (CONTI; BEAVO, 2007). Geralmente, os numerosos sinais extracelulares desencadeiam uma série de mudanças conformacionais nas GPCRs da superfície celular, influenciando os níveis de cAMP intracelular, que por sua vez podem
ativar a proteína quinase A (PKA, do inglês, Protein Kinase A), fatores de troca de nucleotídeo guanina (GETs, do inglês, Guanine-Nucleotide
Exchange Factors) ou canais regulados por nucleotídeos cíclicos (CNG,
do inglês, Cyclic-Nucleotide Gated), para então regular inúmeros processos biológicos chave sob condições fisiológicas e patológicas (Figura 3), incluindo sinalização neuronal, gliconeogênese, glicogenólise, lipogênese, relaxamento do músculo liso, contração do cardíaco, processos secretórios, condutância de canais iônicos, aprendizado e memória, dentre outros (BEAVO; BRUNTON, 2002).
Figura 3. Mecanismos básicos da função e regulação do cAMP. O esquema representa a síntese, a via regulatória e os alvos básicos do cAMP. Receptores acoplados a proteína G (GPCRs); Adenosina trifosfato (ATP); Pirofosfato (PPi); Fosfodiesterases (PDEs); Adenosina 5’-monofosfato (5’-AMP); Proteína quinase A (PKA); Fatores de troca de nucleotídeo guanina (GEFs); canais regulados por nucleotídeos cíclicos (CNG).
Fonte: Adaptado de (BEAVO; BRUNTON, 2002).
De maneira geral, a relação cAMP e sepse é bem direta e tem sido demonstrada por atuais evidências que os níveis de cAMP tecidual hepáticos (FENG et al.,2017) e do ventrículo esquerdo cardíaco (THANGAMALAI et al., 2014; NEVIERE et al., 2016) encontram-se
reduzidos durante a sepse experimental. Além disso, Risøe e colaboradores (2011) mostraram que após a indução da sepse em um modelo animal, ocorre uma redução da expressão de mRNA de diversas isoformas de AC em rim, fígado e baço, o que sugere uma possível redução da expressão proteica de AC e, portanto, resulte em diminuição dos níveis de cAMP. Da mesma forma, diversos outros trabalhos a seguir trazem que vias específicas do cAMP estão comprometidas durante a sepse.
Mais especificamente, indícios da desregulação da via cAMP já foram descritas desde a década de 80, sendo demonstrado através de biópsias ventriculares, que pacientes com falência cardíaca refratários à agentes inotrópicos positivos poderiam apresentar deficiência na formação de cAMP tecidual (FELDMAN et al., 1987). Neste sentido, Böhm e colaboradores (1995) investigaram a causa da refratariedade às catecolaminas durante o choque séptico em tecido cardíaco de pacientes. Os autores partiram do princípio que ambos os subtipos de proteínas G, estimulatórias (Gsα) e inibitórias (Giα) da enzima AC, as quais são responsáveis por controlar a formação de cAMP, poderiam estar alteradas durante a sepse. Sendo assim, eles avaliaram os níveis de expressão destas proteínas e demonstraram que embora os níveis do subtipo Gsα não estivessem alterados, os níveis de expressão da proteína Giα estavam aumentados. Corroborando estes achados, mais recentemente, um estudo chinês utilizando modelo animal de sepse, demonstrou que nos momentos tardios da sepse realmente há um aumento da expressão das proteínas Giα-2 e -3 na membrana sarcolemal cardíaca destes animais, sem haver alterações nos níveis de expressão das proteínas Gsα. Além disso, este mesmo estudo provou que a atividade da enzima AC estava comprometida nos estágios tardios da sepse, tanto em condições basais, quanto em condições estimulatórias com isoproterenol (WU et al., 2003). Combinado a estes achados, dados atuais também são condizentes e demostram que a via cAMP cardíaca está desregulada durante a sepse, desde uma reduzida densidade dos receptores β1-adrenérgicos até uma importante redução dos níveis de cAMP teciduais (THANGAMALAI et
al., 2014). Contudo, as marcantes evidências mostram que a sepse altera
diferentes elementos da via de sinalização, culminando na redução dos níveis de cAMP e, esta redução, por sua vez, parece estar relacionada com os mecanismos de desregulação da contratilidade cardíaca. Desta forma, talvez aumentar os níveis de cAMP farmacologicamente, possa normalizar tais disfunções cardíacas observadas na sepse.
Aliado a isto, aumentar os níveis de cAMP sistemicamente tem sido demonstrado estabilizar a barreira endotelial, diminuir a permeabilidade vascular e consequentemente melhorar o fluxo microcirculatório em modelos animais de sepse (SCHICK et al., 2012; HOLTHOFF et al., 2013; FLEMMING et al., 2014). A regulação rigorosa da barreira endotelial é necessária para limitar a troca de fluidos com o tecido circundante e a quebra desta barreira contribui para a falência de múltiplos órgãos na inflamação (MICHEL; CURRY, 1999; LEE; SLUTSKY, 2010). A estrutura da barreira endotelial microvascular é composta pelas células endoteliais, as quais são conectadas por um conjunto de proteínas extracelulares aderentes e juncionais, que por sua vez, estão estabilizadas por uma complexa rede intracelular de proteínas de ancoragem. Desta maneira, está bem estabelecido que o cAMP regula a estabilidade das junções intracelulares por vias dependente de PKA ou EPAC (do inglês, Exchange Protein Directly Activated by cAMP) /Rap1 (do inglês, Ras-related protein 1), que culminam na ativação de Rac1, a qual parece ser uma molécula de sinalização central na estabilização das junções (RADEVA; WASCHKE, 2017). Sendo assim, Schlegel e colegas (2009) demonstraram em células endoteliais microvasculares de humanos uma redução nos níveis de cAMP 1 e 2 horas após receberem LPS. Similarmente, Schick e colaboradores (2012) corroboraram estes achados
in vitro e mostraram in vivo que animais que receberam LPS
sistemicamente apresentaram redução nos níveis de cAMP em microvasos mesentéricos. Portanto, estes estudos demonstraram, que componentes inflamatórios levam a redução do cAMP intracelular e, a falta deste mediador intracelular está envolvido na desestabilização das junções endoteliais, provocando, portanto, aumento da permeabilidade vascular. Logo, mais uma vez, aumentar sistemicamente os níveis de cAMP pode contribuir positivamente para a homeostase microcirculatória durante a sepse.
Sendo assim, aumentar farmacologicamente os níveis de cAMP intracelular, pode representar uma alternativa promissora na restauração destas vias, as quais comprometidas na sepse. Para potencialização e/ou normalização destas vias existem alternativas, como por exemplo, a promoção da síntese de cAMP, ou então através da inibição de sua degradação. No entanto, segundo Bender e Beavo (2006) inibir a degradação parece ser a opção mais eficiente do que aumentar a síntese do ponto de vista de chegar a concentrações intracelulares maiores e de
forma mais rápida. Desta forma, inibidores seletivos de PDEs são uma classe de fármacos apropriados para esta finalidade.
1.5 SEPSE E FOSFODIESTERASES
As fosfodiesterases são enzimas que catalisam seletivamente a hidrólise da ligação fosfodiester dos nucleotídeos cíclicos (cAMP e cGMP), tornando-os inativos. Atualmente 11 famílias de PDEs já foram identificadas, as quais são codificadas por 21 genes diferentes, além do
splicing alternativo que gera pelo menos > 100 isoformas diferentes.
Estão distribuídas por quase todos os sistemas, podendo haver predominância de determinadas isoformas em determinados tecidos. Essas isoenzimas diferem principalmente na sua especificidade do substrato e propriedades cinéticas (BENDER; BEAVO, 2006; ESKANDARI et al., 2015). A Tabela 3 resume essas distinções entre as enzimas.
Tabela 3. Classificação das enzimas fosfodiesterases. FAMÍLIA SUBTIPOS
(VARIANTES) SUBSTRATO EXPRESSÃO TECIDUAL
PDE-1
PDE1A (1-9)
cAMP/cGMP
Ampla expressão. Significante em miócitos cardíacos e vasculares, neurônios centrais e periféricos, células linfoides e mieloides, testículos e espermatozoides.
PDE1B (1-2)
PDE1C (1-7)
PDE-2 PDE2A (1-4) cAMP/cGMP
Ampla expressão. Significante no cérebro, miócitos cardíacos, fígado, córtex adrenal, endotélio e plaquetas.
PDE-3
PDE3A (1-3)
cAMP/cGMP
Ampla expressão. Significante em miócitos cardíacos e vasculares, cérebro, fígado, tecido adiposo, células β pancreáticas, endotélio, epitélio, oócitos e plaquetas.
PDE3B (1)
PDE-4
PDE4A (1-7)
cAMP
Ampla expressão. Significante em células dos sistemas cardiovascular, neural, imune e inflamatório.
PDE4B (1-4) PDE4C (1-7) PDE4D (1-9)
PDE-5 PDE5A (1-3) cGMP
Ampla expressão. Significante em miócitos vasculares, miócitos cardíacos (em situação patológica), pulmão, cérebro, plaquetas, rins, tecidos gastrintestinais e pênis.
PDE-6
PDE6A (1)
cGMP Expressão limitada aos fotorreceptores (retina) e glândula pineal.
PDE6B (1) PDE6C (1)
PDE-7
PDE7A (1-3)
cAMP Ampla expressão. Significante no baço, cérebro, pulmão, rins, células linfoides e mieloides. PDE7B (1-4)
PDE-8
PDE8A (1-5)
cAMP Ampla expressão. Significante nos testículos (PDE8A) e tireoide (PDE8B).
PDE8B (1-6)
PDE-9 PDE9A (1-20) cGMP Ampla expressão. Significante no baço, cérebro e células intestinais.
PDE-10 PDE10A (1-6) cAMP/cGMP Expressão limitada ao cérebro e testículos.
PDE-11 PDE11A (1-4) cAMP/cGMP Expressão limitada à próstata, testículos e glândulas salivar e pituitária.
Fonte: Adaptado de BENDER; BEAVO, 2006; MAURICE et al., 2014. Dentre as 11 famílias, apenas as PDEs 4, 7 e 8 são seletivas para cAMP. Suas diferenças são principalmente os tecidos em que estão expressas e nos valores de Km (Constante de Michaelis-Menten) que estas enzimas apresentam pelo cAMP. A PDE-4 apresenta um Km de 4 µM, seguido de 0,2 µM para PDE-7 e 0,06 µM para PDE-8. Embora apresentem essas diferenças entre os valores de Km, todas são altamente seletivas e apresentam alta afinidade pelo cAMP (ESKANDARI et al., 2015). No entanto, a PDE-4 é a única isoenzima dentre as três que apresenta inibidores seletivos aprovados clinicamente para uso em humanos, a PDE-7 e -8 contam apenas com inibidores para estudos in
vitro. Além disso, a PDE-4 tem uma maior distribuição tecidual
comparada às outras duas (MAURICE et al., 2014). Por esses motivos, a PDE-4 destaca-se como um possível alvo farmacológico para aumentar os níveis de cAMP na sepse.
A PDE-4 compõe a maior família, com mais de 20 isoformas codificadas por 4 genes (A, B, C e D). Todas as isoformas apresentam um núcleo catalítico carboxi-terminal altamente conservado. No entanto, cada isoforma tem uma única região N-terminal e, isso tem sido demonstrado ser determinante no direcionamento da localização subcelular de cada isoforma de PDE-4 (HUSTON et al., 2006; FERTIG; BAILLIE, 2018). Adicionalmente, a região N-terminal contem regiões conservadas (UCR1 e 2, do inglês, Upstream Conserved Regions 1 or 2), as quais se ligam entre elas e também ao sítio catalítico através de regiões de ligação (LR1 e 2, do inglês, Linker Region 1 or 2). Baseado na presença e tamanho das regiões UCR1 e UCR2, as isoformas da PDE-4 podem ser categorizadas em longa, curta, muito curta e extremamente curta (Figura 4) (FERTIG; BAILLIE, 2018). Essas regiões UCR1 e 2 desempenham importantes papeis, destacando-se a regulação das funções das isoformas, que é mediada pela fosforilação destas regiões pela PKA e ou pela quinase regulada por sinal extracelular (ERK, do inglês, Extracellular
Signal-Regulated Kinase). Portanto, a presença ou ausência destes domínios
determinam os diferentes efeitos observados entre as diferentes isoformas (SETTE; CONTI, 1996; MACKENZIE et al., 2002).
Figura 4. Diversidade de organização dos domínios das isoformas de PDE-4. Domínio alvo (TD), Regiões de ligação (LR1/2), Regiões conservadas upstream (UCR1/2).
Fonte: Adaptado de FERTIG; BAILLIE, 2018.
A ampla distribuição tecidual das PDE-4 reforça a hipótese que sua inibição aumentará os níveis de cAMP sistemicamente, sobretudo, em localizações prejudicadas durante a sepse, como o endotélio e o sistema cardíaco, promovendo possíveis benefícios sobre a permeabilidade vascular e contratilidade cardíaca. Além disso está bem estabelecido os
potenciais efeitos da inibição da PDE-4 sobre a inflamação. As isoformas da PDE-4 são altamente expressas em células inflamatórias (incluindo, células T, monócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas e eosinófilos) (CHIRICOZZI et al., 2016). Combinado a isso, evidências crescentes têm demonstrado que pacientes que sofrem de doenças inflamatórias apresentam uma expressão maior de PDE-4 do que indivíduos saudáveis (SCHAFER et al., 2016). Sendo assim, a inibição da PDE-4 pode elevar os níveis intracelulares de cAMP nestas células e modular a subsequentemente resposta inflamatória e manter o equilíbrio imune (MAURICE et al., 2014).
Os principais mecanismos pelos quais a inibição da PDE-4 diminui a inflamação são mediados por efeitos downstream da via do cAMP, sendo estes detalhados na Figura 5. Em última instância, o efeito resultante da inibição da PDE-4 em células inflamatórias são uma diminuição da síntese de citocinas pró-inflamatórias, redução da proliferação celular e um aumento da síntese de citocinas anti-inflamatórias, por diferentes vias intracelulares (LI; ZUO; TANG, 2018).
Figura 5. Efeitos da inibição da PDE-4 na regulação de respostas inflamatórias. A PDE-4 regula a produção de citocinas pró- e anti-inflamatórias e a proliferação celular via degradação de cAMP. A inibição da PDE-4 conduz ao acúmulo de cAMP intracelular, o qual pode ativar diretamente a PKA e EPAC1/2. A ativação da PKA resulta na fosforilação da proteína de ligação ao elemento de resposta ao cAMP (CREB, do inglês, cAMP-Responsive Element Binding Protein) e do fator ativador da transcrição (ATF-1, do inglês, Activating Trasncriotion Factor 1), conduzindo ao aumento da síntese de citocinas anti-inflamatórias. Por outro lado, nas vias downstream do receptor PRR ativado, a atividade transcricional do NF-ĸB pode ser regulada pela ativação da PKA através da modulação de suas interações com a proteína de ligação ao CREB (CBP, do inglês, CREB Binding Protein) ou p300; enquanto isso, a ativação da PKA pode interferir com a síntese de citocinas pró-inflamatórias e proliferação de células imunes, as quais são mediadas pela proteína Bcl-6 (do inglês, B-Cell Lymphoma 6 Protein). A compartimentalização do cAMP intracelular contribui para a formação do sinalossoma dos fatores de transcrição do Epac, ou seja, pequenas GTPases (Rap1), as quais servem como mecanismo alternativo promissor para combater a inflamação e proliferação celular.
Por fim, além das atribuições da PDE-4 no envolvimento das vias inflamatórias e, reforçando as evidências mencionadas no item 1.4. sobre o comprometimento da via do cAMP nas células cardíacas, tem sido demonstrado que a hiporresponsividade à agonistas β-adrenérgicos cardíacos é conferida por uma atividade total de PDEs aumentada durante a sepse experimental. Interessantemente os autores destacam a isoforma PDE-4D como mediadora principal dessa desordem devido aos elevados níveis de mRNA cardíacos mensurados em camundongos sépticos (SAKAI et al., 2017). Complementarmente, as isoformas (A, B e D) da PDE-4 são altamente expressadas no coração, distribuídas em vários microdomínios que estão em proximidade das seguintes proteínas, incluindo receptores β1- e β2-adrenérgicos, canais de cálcio regulados por voltagem do tipo L (LTCC, do inglês, L-type calcium channel), receptores de rianodina (RyR2, do inglês, ryanodine receptor 2), fosfolambana (PLB, do inglês, phospholamban), SERCA2a (do inglês, sarcoplasmic
endoplasmic reticulum calcium ATPase 2a) e são responsáveis pelo
controle da contratilidade cardíaca basal via SERCA2a e LTCC (KOKKONEN; KASS, 2017).
Durante o pré-condicionamento isquêmico ou sob alta estimulação com catecolaminas, as isoformas PDE-4D3 e D5 são recrutadas para a membrana pela β-arrestina, limitando a sinalização do cAMP e a abertura de LTCC (PERRY et al., 2002). Este recrutamento das isoezimas para a mebrana também resulta na mudança das proteínas Gsα para Giα nos receptors β-adrenérgicos, limitando ainda mais a produção de cAMP (BAILLIE et al., 2003). Além disso, a PDE-4B interage com LTCC, limitando o influxo de íons Ca++, se contrapondo à ativdade do LTCC induzida pela PKA. A presença da PDE-4 impede a produção excessiva de cAMP, o que impede a hiperfosforilação do RyR2 pela PKA, a qual promove o vazamento de Ca++. Por fim, a diminuição de cAMP, diminui a ativação da PKA, que por sua vez não fosforila a PLB e, portanto, permite que a PLB inative a SERCA2a (KOKKONEN; KASS, 2017). A Figura 6 representa esquematicamente todos os processos mencionados
Portanto, o aumento da atividade das isoformas da PDE-4 ou diminuição global da produção de cAMP sob determinadas condições patológicas, como no caso da sepse, conduzem a uma diminuição da capacidade contrátil do coração, aumento dos processos inflamatórios, assim como desestabilização da barreira endothelial. Assim, inibir seletivamente as enzimas PDE-4 através de ferramentas farmacológicas
pode representar uma alternativa promissora para retomar a homeostase destas vias e assim, evitar a disfunção de órgãos. Desse modo, dentre os inibidores seletivos da PDE-4 disponíveis, roflumilaste torna-se uma opção atraente para essa finalidade, baseado em seus benefícios de uso.
Figura 6. Regulação do miócito cardíaco pelas isoformas de PDE-4. Fonte: Adaptado de KOKKONEN; KASS, 2017.
1.6 ROFLUMILASTE
O roflumilaste (RFM) foi identificado em 1993 a partir de uma série de benzamidas em um programa de triagem como um potente inibidor de PDE-4 (AMSCHLER, 1995). Apresentou uma ampla ação anti-inflamatória e imunomodulatória in vitro (HATZELMANN; SCHUDT, 2001). Experimentos in vivo demonstraram que roflumilaste é muito efetivo em inibir mastócitos, eosinófilos, neutrófilos, linfócitos T e macrófagos (BUNDSCHUH et al., 2001). Desta forma, em 2011, foi aprovado pelo FDA (do inglês, U.S. Food and Drug Administration) para o tratamento da Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) (BOSWELLSMITH; CAZZOLA; PAGE, 2006; CALVERLEY et al., 2009).
O roflumilaste é utilizado na clínica na dose de 500 µg/dia via oral, e apresenta uma biodisponibilidade de 79%. Em adultos, o tempo de meia-vida (T1/2) plasmática é de 17 h. Além disso, após a ingestão oral, ocorre a metabolização do roflumilaste pelas isoenzimas do citocromo P450 (CYP) 3A4 e 1A2 ao seu metabólito primário ativo (roflumilaste N-óxido), o qual possui um perfil de seletividade e potência para inibição da PDE-4 muito semelhante ao fármaco primário. O T1/2 plasmática do metabólito ativo é de 27 h. A concentração plasmática máxima é atingida em menos de 1 h para o Roflumilaste e cerca de 4 h para seu metabólito, a qual permanece constante com pequenas flutuações por 6-8 h. Além disso, estima-se que o metabolito N-óxido represente cerca de 90% dos efeitos farmacológicos globais de Roflumilaste. Assim, o metabólito N-óxido é considerado o principal contribuidor da eficácia clínica global do Roflumilaste (RABE, 2011).
Já foram demonstrados em alguns estudos experimentais que o pré-tratamento com doses sucessivas de Roflumilaste reduziu os níveis de expressão de citocinas pró-inflamatórias e preservou a função hepática de animais sépticos (FENG et al., 2017). Além deste, em um modelo endotoxêmico, roflumilate diminuiu a permeabilidade vascular por aumentar os níveis de cAMP em microvasos de ratos (SCHICK et al., 2012). No entanto estes trabalhos avaliaram outros propósitos na sepse.
Diante das complicações ocasionadas pela sepse, no presente estudo, optamos por utilizar o roflumilaste, como um inibidor potente e seletivo das enzimas PDE-4, para promover o aumento dos níveis de cAMP e assim, melhorar os parâmetros cardíacos, vasculares e inflamatórios com o objetivo de evitar a disfunção de órgãos durante a sepse e, portanto, prover um tempo vital para que as terapias de suporte usadas durante a sepse e choque séptico exerçam efeito.
2 HIPÓTESE
A inibição seletiva da PDE-4 promove a restauração dos níveis de cAMP estabilizando a barreira endotelial, melhorando a contratilidade cardíaca e reduzindo a inflamação, tudo isso, em conjunto, levando a melhora da perfusão tecidual, que por sua vez diminui a disfunção de órgãos durante a sepse.
Figura 7. Hipótese: efeitos da inibição da PDE-4 sobre as desordens da sepse. Fonte: O autor.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar os efeitos da inibição da PDE-4 sobre os parâmetros cardiovasculares e inflamatórios da sepse, através do modelo experimental de ligadura e perfuração do ceco em ratos.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Induzir a sepse experimental através do modelo de ligadura e perfuração do ceco, visando reproduzir algumas das alterações cardiovasculares e inflamatórias observadas na clínica.
2. Avaliar se o modelo experimental de sepse prejudica parâmetros cardiovasculares como a pressão arterial, a frequência cardíaca, o fluxo sanguíneo renal e a reatividade vascular in vivo e ex vivo e, se o tratamento com RFM é capaz de atenuar estes danos. 3. Verificar se a sepse experimental danifica a permeabilidade
vascular e se a inibição de PDE-4 previne esta alteração. 4. Investigar a resposta inflamatória induzida pelo modelo
experimental de sepse através do recrutamento de neutrófilos para tecidos indiretamente pela atividade da MPO, da quantificação dos níveis plasmáticos de nitrato + nitrito (NOx) e da avaliação do perfil de expressão da enzima NOS-2. Avaliar se o aumento dos níveis de cAMP via inibição de PDE-4 pode melhorar possíveis alterações.
5. Verificar o perfil hematológico dos animais submetidos a sepse experimental e possíveis efeitos da inibição da PDE-4.
6. Quantificar níveis de marcadores bioquímicos sanguíneos de dano de órgãos durante a sepse, visando observar se o modelo experimental é capaz de aumentá-los e se o tratamento com o RFM pode prevenir uma piora nestes parâmetros.
