UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
FABRICIO DE OLIVEIRA FERREIRA
ANTIPARASITÁRIOS EM SOLOS BRASILEIROS: ESTUDO DE SORÇÃO, DESSORÇÃO E DISSIPAÇÃO
CAMPINAS 2017
FABRICIO DE OLIVEIRA FERREIRA
ANTIPARASITÁRIOS EM SOLOS BRASILEIROS: ESTUDO DE SORÇÃO, DESSORÇÃO E DISSIPAÇÃO
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Susanne Rath
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO FABRICIO DE OLIVEIRA FERREIRA E ORIENTADO PELA PROFA. DRA. SUSANNE RATH.
CAMPINAS 2017
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Química Camila Barleta Fullin - CRB 8462
Ferreira, Fabricio de Oliveira,
F413a FerAntiparasitários em solos brasileiros : estudo de sorção, dessorção e dissipação / Fabricio de Oliveira Ferreira. – Campinas, SP : [s.n.], 2017.
FerOrientador: Susanne Rath.
FerTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química.
Fer1. Fármacos veterinários. 2. Solos brasileiros. 3. Sorção. 4. Dissipação de fármacos veterinários. 5. On-line SPE-UHPLC-MS/MS. I. Rath, Susanne, 1962-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Antiparasitics in brazilian soils : sorption, desorption and dissipation study
Palavras-chave em inglês: Veterinary drugs
Brazilian soils Sorption
Dissipation of veterinary drugs On-line SPE-UHPLC-MS/MS
Área de concentração: Química Analítica Titulação: Doutor em Ciências
Banca examinadora: Susanne Rath [Orientador] Álvaro José dos Santos Neto Mary Rosa Rodrigues de Marchi Isabel Cristina Sales Fontes Jardim Marcia Cristina Breitkreitz
Data de defesa: 29-09-2017
Programa de Pós-Graduação: Química
Profa. Dra. Susanne Rath (Orientadora)
Prof. Dr. Álvaro José dos Santos Neto (IQSC-USP-São Carlos)
Profa. Dra. Mary Rosa Rodrigues de Marchi (IQ-UNESP-Araraquara)
Profa. Dra. Isabel Cristina Sales Fontes Jardim (IQ- UNICAMP)
Profa. Dra. Marcia Cristina Breitkreitz (IQ-UNICAMP)
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).
Este exemplar corresponde à redação final da Tese de Doutorado defendida pelo(a) aluno(a) FABRICIO DE
OLIVEIRA FERREIRA, aprovada pela Comissão
Primeiramente ao criador.
A Professora Dra. Susanne Rath pela orientação e as discussões.
A todos os professores do IQ pelo aprendizado e contribuição durante o desenvolvimento dessa tese.
Aos professores que participaram das bancas examinadoras dos exames de qualificação geral, de área e da defesa da tese pela contribuição e discussão.
Aos funcionários da Unicamp pela atenção e colaboração.
Aos funcionários da fazenda onde foram realizados os estudos de campo. Aos colegas de pesquisa da Unicamp (IQ e FEC) pelas discussões ao longo de seus trabalhos de pesquisa.
A todos os meus amigos, pela amizade e contribuição durante o desenvolvimento desta tese.
À Universidade Estadual de Campinas - Unicamp, especialmente ao Instituto de Química - IQ, por toda a infraestrutura disponibilizada para a realização deste trabalho.
As agências de fomento CNPq (Processo: 476501/2013-0) e a Fapesp (Processo: 2013/09543-7) pelos auxílios aos projetos de pesquisa.
Agradeço novamente à Fapesp pela concessão da minha bolsa de estudo e auxílio durante o desenvolvimento do doutorado (Processo: 2013/25670-9).
como insumos farmacêuticos ativos na medicina veterinária, assim como em formulações de agrotóxicos para o controle de pragas na agricultura. Embora a utilização destes insumos acarrete em benefícios ao agronegócio, os mesmos podem impactar o ambiente, visto que uma grande parte destas substâncias pode chegar ao solo e águas, por meio das excretas dos animais tratados e através da aplicação direta nas lavouras. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o comportamento da eprinomectina, doramectina e moxidectina em três tipos de solos do Estado de São Paulo, por meio da realização de estudos de sorção, dessorção e dissipação aeróbia, conforme as orientações dos Guias 106 e 307 da OECD. Os parâmetros cinéticos de sorção dos fármacos nos solos entre os tempos de 0 e 48 horas foram avaliados e os parâmetros termodinâmicos de sorção e dessorção foram obtidos pela construção das isotermas ajustadas ao modelo de Freundlich. Os estudos indicaram alta afinidade dos fármacos aos solos, com coeficientes de sorção e dessorção de Freundlich entre 14 e 424 μg g-1 mL1/n μg-1/n e entre 31 e 565 μg
g-1 mL1/n μg-1/n, respectivamente, indicando baixa mobilidade destes nos solos
avaliados e fraca tendência à lixiviação (GUS entre -1,10 e 0,08). A dissipação dos fármacos nos solos foi avaliada em câmara de estabilidade a 22 °C e 71% de umidade relativa, na ausência de luz. Os valores de DT50 foram de 9 a 16
dias. Também foi desenvolvido e validado um método analítico utilizando um sistema de extração em fase sólida on-line à cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (on-line SPE-UHPLC-MS/MS) para a determinação de eprinomectina, abamectina, doramectina, ivermectina e moxidectina em solos. O método apresentou faixa linear para os fármacos de 0,5 a 10 ng g-1, com linearidade maior que 0,99 e
limite de quantificação menor do que 0,2 ng g-1. O método foi aplicado em um
estudo de dissipação da abamectina em campo, após aplicação em uma cultura de laranja.
Palavras-Chave: Fármacos veterinários, Solos brasileiros, Sorção, Dissipação, on-line SPE-UHPLC-MS/MS.
Avermectins and milbemycins are antiparasitic agents widely used as active pharmaceutical ingredients in veterinary medicine, as well as in pesticides formulations for pests control in agriculture. Although the use of these compounds brings benefits to the agribusiness, they can impact the environment, since a large part of these substances reaches the soil and water, through the excreta of the treated animals and direct application in the crops. The present work had the objective of evaluating the behavior of eprinomectin, doramectin and moxidectin in three types of soils of the State of São Paulo, through sorption, desorption and aerobic dissipation studies, according to the recommendations of the OECD Guidelines 106 and 307. The sorption kinetic parameters of the veterinary drug in the soils, between 0 and 48 hours, were evaluated and the sorption and desorption thermodynamic parameters were obtained by the construction of the isotherms adjusted to the Freundlich model. The studies indicated high affinity of the veterinary drugs to the soil, with Freundlich sorption and desorption coefficients of 14 to 424 μg g-1 mL1/n μg-1/n
and 31 to 565 μg g-1 mL1/n μg-1/n, respectively, indicating low mobility of the
drugs in the evaluated soils and low tendency to leaching (index of GUS -1.10 to 0.08). Dissipation of the veterinary drugs in soils was evaluated in a stability chamber at 22 °C, 71% relative humidity and protected from light. DT50 values
ranged from 9 to 16 days. Finally, an analytical method was developed and validated using an on-line solid-phase extraction technique coupled with ultra-high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry (on-line SPE-UHPLC-MS/MS) for the determination of eprinomectin, abamectin, doramectin, ivermectin and moxidectin in soils. For the veterinary drugs, the method presented a linear range of 0.5 to 10 ng g-1, with linearity greater than
0.99 and limit of quantification lower than 0.2 ng g-1. The method was applied
in a study of dissipation of abamectin in a crop, after application in an orange plantation.
Keywords: Veterinary drugs, Brazilian soils, Sorption, Dissipation, on-line SPE-UHPLC-MS/MS.
porcentagens de argila, silte e areia. ... 24 Figura I.2. Mapa pedológico do Estado de São Paulo com os principais tipos de solo. ... 27 Figura I.3. Participação dos setores da indústria, serviços, agropecuária e do PIB brasileiro nos anos de 2013 ao primeiro trimestre de 2017. ... 29 Figura I.4. Faturamento do mercado veterinário nacional e mundial. ... 30 Figura I.5. Porcentagem do faturamento do mercado veterinário nacional por classe terapêutica. ... 31 Figura I.6. Estrutura geral das avermectinas e milbemicinas. ... 33 Figura I.7. Possíveis vias de exposição ambiental devido ao uso de medicamentos veterinários na produção animal. Adaptado de. ... 36 Figura III.8. Fluxograma simplificado que resume as etapas realizadas no estudo de sorção e dessorção, conforme o Guia 106 da OECD. ... 48 Figura III.9. Etapas do desenvolvimento do método de extração dos fármacos da solução de solo no estudo de sorção. ... 53 Figura III.10. Etapas do desenvolvimento do método de extração dos fármacos do solo no estudo de sorção. ... 54 Figura III.11. Etapas do estudo de estabilidade dos fármacos na solução de CaCl2 0,01 mol L-1 no estudo de sorção. ... 58
Figura III.12. Etapas do estudo de sorção dos fármacos nas paredes dos frascos. ... 59 Figura III.13. Etapas do estudo da razão solo/solução de CaCl2 0,01 mol L-1.
... 60 Figura III.14. Etapas do estudo para determinar o tempo de equilíbrio e os parâmetros cinéticos de sorção dos fármacos nos solos. ... 61 Figura III.15. Etapas do estudo para construir as isotermas de sorção... 65 Figura III.16. Etapas do estudo para construir as isotermas de dessorção.65 Figura III.17. Estrutura geral das avermectinas e milbemicinas, com destaque o grupo benzofurano diidroxilado. ... 70
Figura III.19. Formação do grupo fluoróforo pela reação do reagente de acilação no anel benzofurano na presença de 1-metilimidazol. ... 71 Figura III.20. Comparação dos cromatogramas com e sem adição de ácido acético (HAc). ... 72 Figura III.21. Estudo da temperatura na derivatização dos fármacos durante 45 minutos à 1,00 μg mL-1. ... 73
Figura III.22. Estudo do tempo de aquecimento na derivatização dos fármacos à 0,10 μg mL-1. ... 73
Figura III.23. Estabilidade dos fármacos formados após a reação de derivatização. Erro relativo a área do pico inicial com o tempo pós-derivatização. ... 74 Figura III.24. Resultado obtido da varredura do comprimento de onda de excitação (250 a 380 nm) fixando o de emissão (458 nm), no modo 3D, na análise de um padrão de 1,00 μg mL-1 dos fármacos. ... 76
Figura III.25. Resultado obtido da varredura do comprimento de onda de emissão (390 a 540 nm) fixando o de excitação (360 nm), no modo 3D, na análise de um padrão de 1,00 μg mL-1 dos fármacos. ... 77
Figura III.26. Cromatograma dos fármacos a 1 μg mL-1, em acetonitrila, no
HPLC-FLD. ... 78 Figura III.27. Cromatograma dos fármacos a 1 μg mL-1, em acetonitrila, no
UHPLC-FLD. ... 79 Figura III.28. Extração dos fármacos eprinomectina, moxidectina e doramectina da solução de CaCl2 0,01 mol L-1, usando diferentes solventes
extratores. ... 81 Figura III.29. Extração dos fármacos eprinomectina, moxidectina e doramectina no solo LVe, usando diferentes solventes extratores. ... 82 Figura III.30. Extração dos fármacos eprinomectina, moxidectina e doramectina no solo LVAd, usando diferentes solventes extratores. ... 83 Figura III.31. Extração dos fármacos eprinomectina, moxidectina e doramectina no solo RQo, usando diferentes solventes extratores. ... 83
Figura III.33. Cromatogramas dos fármacos a 0,50 µg mL-1, em CaCl2 0,01
mol L-1 e nas soluções de solo LVe, LVAd e RQo para avaliação do efeito matriz
por UHPLC-FLD. ... 86 Figura III.34. Cromatogramas dos brancos da solução de solo LVe, LVAd e RQo e da solução de CaCl2 0,01 mol L-1 para avaliação da seletividade no
UHPLC-FLD. ... 87 Figura III.35. Recuperação da EPRI na solução de CaCl2 0,01 mol L-1 e nas
paredes dos frascos, no estudo de sorção nos frascos à 1 μg mL-1. ... 90
Figura III.36. Recuperação da MOXI na solução de CaCl2 0,01 mol L-1 e nas
paredes dos frascos, no estudo de sorção nos frascos à 1 μg mL-1. ... 91
Figura III.37. Recuperação da DORA na solução de CaCl2 0,01 mol L-1 e nas
paredes dos frascos, no estudo de sorção nos frascos à 1 μg mL-1. ... 91
Figura III.38. Sorção dos fármacos nos solos LVe, LVAd e RQo em função do tempo de agitação. ... 95 Figura III.39. Sorção dos fármacos nos solos LVe, LVAd e RQo, ajustados ao modelo de pseudo-segunda-ordem. ... 99 Figura III.40. Isotermas de sorção e dessorção do fármaco EPRI nos solos LVe, LVAd e RQo. A: Forma não linearizada. B: Forma linearizada. ... 102 Figura III.41. Isotermas de sorção e dessorção do fármaco MOXI nos solos LVe, LVAd e RQo. A: Forma não linearizada. B: Forma linearizada. ... 103 Figura III.42. Isotermas de sorção e dessorção do fármaco ABA nos solos LVe, LVAd e RQo. A: Forma não linearizada. B: Forma linearizada. ... 104 Figura III.43. Isotermas de sorção e dessorção do fármaco DORA nos solos LVe, LVAd e RQo. A: Forma não linearizada. B: Forma linearizada. ... 105 Figura III.44. Isotermas de sorção e dessorção do fármaco IVER nos solos LVe, LVAd e RQo. A: Forma não linearizada. B: Forma linearizada. ... 106 Figura III.45. Valores de KF de sorção dos fármacos nos solos LVe, LVAd e
RQo. ... 108 Figura III.46. Valores de KF de dessorção dos fármacos nos solos LVe, LVAd
Figura IV.48. Fluxograma simplificado que resume as etapas que foram realizadas no estudo de dissipação, conforme o Guia 307 da OECD. ... 116 Figura III.49. Etapas do método de extração dos fármacos do solo no estudo de dissipação. ... 120 Figura III.50. Etapas do estudo de dissipação dos fármacos no solo. ... 123 Figura IV.51. Cromatograma dos fármacos a 100 ng mL-1, em metanol, no
UHPLC-FLD. ... 129 Figura IV.52. Cromatogramas dos extratos brancos dos solos LVe, LVAe, LVAd e RQo e da solução padrão dos fármacos a 25 µg g-1, em metanol, para
avaliação da seletividade no UHPLC-FLD. ... 131 Figura IV.53. Comparação do estudo cinético de dissipação da ABA no solo RQo in natura, na determinação do DT50 e DT90 (n=3). A: Ensaio com o fármaco
separado. B: Ensaio com todos os fármacos juntos. ... 134 Figura IV.54. Curvas cinéticas de dissipação do fármaco EPRI nos solos LVe, LVAe, LVAd e RQo in natura, ajustadas ao modelo de primeira-ordem. .... 135 Figura IV.55. Curvas cinéticas de dissipação do fármaco MOXI nos solos LVe, LVAe, LVAd e RQo in natura, ajustadas ao modelo de primeira-ordem. .... 136 Figura IV.56. Curvas cinéticas de dissipação do fármaco ABA nos solos LVe, LVAe, LVAd e RQo in natura, ajustadas ao modelo de primeira-ordem. .... 136 Figura IV.57. Curvas cinéticas de dissipação do fármaco DORA nos solos LVe, LVAe, LVAd e RQo in natura, ajustadas ao modelo de primeira-ordem. .... 137 Figura IV.58. Curvas cinéticas de dissipação do fármaco IVER nos solos LVe, LVAe, LVAd e RQo in natura, ajustadas ao modelo de primeira-ordem. .... 137 Figura IV.59. Concentração dos fármacos (EPRI, MOXI, ABA, DORA e IVER) nos solos LVe, LVAe, LVAd e RQo esterilizados em função do tempo. ... 140 Figura V.60. Fluxograma simplificado que resume as etapas que foram realizadas no desenvolvimento, validação e aplicação do método por on-line SPE-UHPLC-MS/MS. ... 148 Figura V.61. Local de um ponto de coleta das amostras do solo LVAe para o estudo de dissipação em campo. ... 151
no sistema SPE-UHPLC-MS/MS. ... 158 Figura V.64. Área dos picos cromatográficos usando diferentes aditivos na fase móvel. ... 162 Figura V.65. Área dos picos cromatográficos usando diferentes proporções de 5 mmol L-1 acetato de amônio/acetonitrila (v/v) no eluente. ... 163
Figura V.66. Curvas analíticas para o estudo do melhor sorvente da coluna de SPE (XBridge C8 ou Oasis HLB), para a ivermectina. ... 164 Figura V.67. Recuperação para cada fármaco na coluna de SPE Waters XBridge C8 usando diferentes volumes de injeções no sistema de SPE-UHPLC-MS/MS. ... 165 Figura V.68. Área dos picos cromatográficos usando diferentes proporções de água/metanol (v/v) como fase móvel no carregamento da amostra no sistema de SPE-UHPLC-MS/MS. ... 166 Figura V.69. Área dos picos cromatográficos usando diferentes proporções de água/metanol na ressuspensão do extrato da amostra antes da análise no sistema de SPE-UHPLC-MS/MS. ... 167 Figura V.70. Estabilidade dos fármacos em água/metanol (40/60, v/v). . 168 Figura V.71. Cromatogramas (SRM) dos fármacos EPRI, ABA, DORA, MOXI, IVER e o padrão interno IVER-d2, extraídos de um solo LVAe branco fortificado
com 2,5 ng g-1 e analisados no sistema de SPE-UHPLC-MS/MS. ... 169
Figura V.72. Local do estudo de dissipação de abamectina em campo. A: Área delimitada (100 m2) com os noves pontos de coleta. B: Foto de um ponto de
coleta, após as seis coletas realizadas neste ponto. ... 172 Figura V.73. Curva de dissipação do fármaco ABA no solo LVAe do estudo em campo, na determinação do DT50 e DT90, ajustadas ao modelo de
Tabela I.1. Propriedades físico-químicas das avermectinas e da milbemicina. ... 34 Tabela III.2. Propriedades químicas e físicas dos solos utilizados nos estudos de sorção. ... 68 Tabela III.3. Parâmetros de conformidade do sistema cromatográfico HPLC e UHPLC para os fármacos em solução de CaCl2 0,01 mol L-1. ... 80
Tabela III.4. Comparação entre as eficiências de extração dos fármacos nos solos usando metanol, sem e com a aplicação do ultrassom. ... 84 Tabela III.5. Tempos de retenção e as concentrações obtidas dos analitos em CaCl2 0,01 mol L-1 e nas soluções de solo LVe, LVAd e RQo para avaliação do
efeito matriz, na concentração de 0,50 µg mL-1. ... 86
Tabela III.6. Resultados dos parâmetros de validação do método desenvolvido para determinação dos fármacos na solução de CaCl2 0,01 mol L -1 por UHPLC-FLD. ... 88
Tabela III.7. Comparação entre os valores de recuperação nas extrações dos fármacos nas soluções de solo e em diferentes tipos de solos no estudo da razão solo/solução de CaCl2 0,01 mol L-1. ... 93
Tabela III.8. Porcentagens de sorção dos fármacos no tempo de equilíbrio aparente definido (24 h) para cada tipo de solo. ... 96 Tabela III.9. Comparação da sorção da ABA e da IVER nos ensaios com o fármaco estudado individualmente e no mesmo meio com todos os fármacos (EPRI, MOXI, ABA, DORA e IVER). ... 97 Tabela III.10. Parâmetros cinéticos de sorção dos fármacos nos solos LVe, LVAd e RQo obtido pelo ajuste do modelo de pseudo-segunda-ordem, e valor experimental de qt no tempo de equilíbrio aparente definido (24 h). ... 100
Tabela III.11. Parâmetros de sorção e dessorção dos fármacos para cada tipo de solo estudado, obtidos pelo modelo de Freundlich na forma logarítmica. ... 107 Tabela IV.12. Parâmetros de sorção e dessorção das avermectinas em diferentes tipos de solo, obtidos da literatura. ... 113
os fármacos em metanol. ... 129 Tabela IV.15. Resultados dos parâmetros de validação do método desenvolvido para determinação dos fármacos nos solos por UHPLC-FLD. 132 Tabela IV.16. Resultados dos parâmetros cinéticos de dissipação aeróbia dos fármacos para cada tipo de solo in natura e a atividade microbiana (respirometria). ... 138 Tabela IV.17. Parâmetros relacionados com a dissipação dos fármacos nos solos. ... 141 Tabela IV.18. Parâmetros cinéticos de dissipação aeróbia das avermectinas em diferentes tipos de solo, obtidos da literatura. ... 143 Tabela IV.19. Índice de vulnerabilidade de águas subterrâneas (GUS) para os fármacos nos solos. ... 145 Tabela V.20. Condições do espectrômetro de massas utilizado nas análises no modo direto e no modo SPE on-line. ... 155 Tabela V.21. Condições cromatográficas utilizadas no sistema on-line SPE-UHPLC-MS/MS. ... 157 Tabela V.22. Parâmetros de validação do método para determinação dos fármacos por on-line SPE-UHPLC-MS/MS. ... 170 Tabela V.23. Parâmetros cinéticos de dissipação da abamectina no solo LVAe do estudo de campo. ... 174
Equação III.1 ... 62 Equação III.2 ... 62 Equação III.3 ... 62 Equação III.4 ... 63 Equação III.5 ... 63 Equação III.6 ... 64 Equação III.7 ... 66 Equação III.8 ... 66 Equação III.9 ... 66 Equação III.10 ... 67 Equação IV.11 ... 121 Equação IV.12 ... 122 Equação IV.13 ... 124 Equação IV.14 ... 124 Equação IV.15 ... 124 Equação IV.16 ... 125 Equação IV.17 ... 125 Equação IV.18 ... 126
ATFA Anidrido trifluoracético
AVM Avermectinas
CO Carbono orgânico
CTC Capacidade de troca catiônica DAD Detector por arranjo de fotodiodos
DORA Doramectina
DPR Estimativa do desvio padrão relativo
DT50 Tempo que corresponde a redução de 50% da
concentração inicial
DT90 Tempo que corresponde a redução de 90% da
concentração inicial
EMA Agência Europeia de Medicamentos (European Medicines Agency)
EPRI Eprinomectina
ERA Avaliação de risco ambiental
(Environmental Risk Assessment) FLD Detector por fluorescência
FQ Fluoroquinolonas
FV Fármacos veterinários
GSI Groundwater Screening Index
GUS Índice de vulnerabilidade de águas subterrâneas (Groundwater Ubiquity Score)
H Histerese
HAc Ácido acético
HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência
HPLC-FLD Cromatografia líquida de alta eficiência associada ao detector por fluorescência
IAC Instituto Agronômico de Campinas
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística INMET Instituto Nacional de Meteorologia
IVER Ivermectina
IVER-d2 Ivermectina deuterada com dois deutérios
LQ Limite de quantificação
LVAd Latossolo Vermelho-Amarelo distrófico LVAe Latossolo Vermelho-Amarelo eutrófico LVe Latossolo Vermelho eutrófico
MBM Milbemicina
MeCN Acetonitrila
MI 1-Metilimidazol
MO Matéria orgânica
MOXI Moxidectina
MS/MS Espectrômetro de massas sequencial
OECD Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (Organisation for Economic Co-operation
and Development)
PIB Produto interno bruto
RQo Neossolo Quartzarênico óptico
SiBCS Sistema Brasileiro de Classificação de Solos
SINDAN Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Saúde Animal
SPE Extração em fase sólida (Solid Phase Extraction) SPE-UHPLC-MS/MS Sistema de extração em fase sólida on-line acoplado a
cromatografia líquida de ultra-alta eficiência associada a espectrometria de massas sequencial
SULFAS Sulfonamidas
UHPLC Cromatografia líquida de ultra-alta eficiência
UHPLC-FLD Cromatografia líquida de ultra-alta eficiência associada ao detector por fluorescência
USDA Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (United States Department of Agriculture)
WHC Capacidade de retenção de água (Water Holding Capacity)
I.1 Solo e suas características ... 23
I.2 Mercado agropecuário ... 28
I.3 Avermectinas e milbemicinas ... 32
I.4 Fármacos veterinários no ambiente ... 35
I.5 Comportamento dos fármacos veterinários nos solos: sorção, dessorção e dissipação ... 37
I.6 Métodos analíticos para a determinação de fármacos veterinários em solos ... 39
I.7 Justificativa da pesquisa ... 41
CAPÍTULO II. OBJETIVOS ... 44
CAPÍTULO III. SORÇÃO E DESSORÇÃO DOS FÁRMACOS NOS SOLOS 46 III.1 Parte experimental ... 49
III.1.1 Padrões analíticos, reagentes e solventes ... 49
III.1.2 Equipamentos e colunas cromatográficas ... 49
III.1.3 Preparo das soluções padrão ... 50
III.1.4 Amostras de solo ... 51
III.1.5 Preparo da solução de solo (extrato de solo) ... 51
III.1.6 Desenvolvimento do método de extração dos fármacos da solução de solo ... 52
III.1.7 Desenvolvimento do método de extração dos fármacos do solo . 53 III.1.8 Etapa de derivatização ... 54
III.1.9 Desenvolvimento do método cromatográfico para determinação dos fármacos nas soluções de solo ... 55
III.1.10 Estudos preliminares para realização do estudo de sorção/dessorção ... 58
III.1.11 Estudo cinético de sorção ... 62
III.2.2 Desenvolvimento do método analítico ... 69
III.2.3 Estudos preliminares para realização do estudo de sorção e dessorção ... 89
III.2.4 Cinética de sorção ... 97
III.2.5 Isotermas de sorção e dessorção dos fármacos nos solos ... 101
CAPÍTULO IV. DISSIPAÇÃO DOS FÁRMACOS NOS SOLOS ... 115
IV.1 Parte experimental ... 117
IV.1.1 Padrões analíticos, reagentes e solventes ... 117
IV.1.2 Equipamentos e colunas cromatográficas ... 117
IV.1.3 Preparo das soluções padrão... 118
IV.1.4 Amostras de solo ... 118
IV.1.5 Condições cromatográficas para determinação dos fármacos nos solos ... 119
IV.1.6 Método de extração dos fármacos nos solos ... 120
IV.1.7 Etapa de derivatização ... 120
IV.1.8 Validação do método analítico para determinação dos fármacos nos solos por UHPLC-FLD ... 121
IV.1.9 Estudo da dissipação aeróbia ... 122
IV.1.10 Determinação da atividade microbiana dos solos ... 124
IV.1.11 Avaliação do potencial de risco de contaminação das águas subterrâneas pelos fármacos ... 125
IV.2 Resultados e discussão ... 126
IV.2.1 Resultado da análise e classificação do solo ... 127
IV.2.2 Método cromatográfico para determinação dos fármacos nos solos ... 128
IV.2.5 Dissipação aeróbia ... 133
IV.2.6 Avaliação do potencial de risco de contaminação das águas subterrâneas pelos fármacos ... 144
CAPÍTULO V. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO ON-LINE SPE-UHPLC-MS/MS PARA DETERMINAÇÃO DE AVERMECTINAS E MILBEMICINA EM SOLOS E ENSAIO DE DISSIPAÇÃO DE ABAMECTINA EM CAMPO ... 146
V.1 Parte experimental ... 149
V.1.1 Padrões analíticos, reagentes e solventes ... 149
V.1.2 Equipamentos e colunas cromatográficas ... 149
V.1.3 Preparo das soluções padrão ... 150
V.1.4 Amostras de solo... 150
V.1.5 Desenvolvimento do Método on-line SPE-UHPLC-MS/MS ... 152
V.2 Resultados e discussão ... 159
V.2.1 Resultado da análise e classificação do solo ... 159
V.2.2 Desenvolvimento do Método SPE-UHPLC-MS/MS ... 159
CAPÍTULO VI. CONCLUSÕES ... 175
I.1 Solo e suas características
O solo é um material complexo e heterogêneo sob a superfície terrestre, produto da ação e interação dos fenômenos biológicos, geológicos e hidrológicos que atuaram no material de origem (rocha, sedimento ou outro solo) ao longo do tempo. É constituído por quantidades variáveis de minerais, matéria orgânica, água, ar e organismos vivos, incluindo plantas, bactérias, fungos, protozoários, invertebrados e outros animais (CETESB, 2017; HARTEMINK, 2016; SPOSITO, 2008).
O perfil típico de um solo é distribuído em camadas distintas denominadas de horizontes O, A, B, C e R, as quais diferem entre si em várias propriedades, como: cor, textura, estrutura e espessura. O horizonte O é a camada superior do solo contendo material orgânico em decomposição. Já o horizonte A possui fração mineral escurecida, é a região mais fértil com acumulação da matéria orgânica onde se concentram as raízes e se formaram na superfície do solo ou abaixo de um horizonte O. Resultado da iluviação dos horizontes O e A, o horizonte B tem formação mineral pelo acúmulo de silicatos, óxidos de ferro, de alumínio, carbonatos e argilas. O horizonte C, subjacente ao horizonte B, é formado por material não consolidado (rochas soltas) e saprólito, pouco afetado por processos pedogênicos e sem as propriedades dos horizontes anteriores, podendo acumular os compostos mais solúveis. Por fim, a rocha matriz do solo, denominado horizonte R, que compreende em grandes e contínuas rochas (granito, basalto, quartzo, arenito) que não podem ser escavadas à mão (DITZLER, 2017; MCCAULEY et al., 2005; USDA, 2014).
Os horizontes, o teor mineral e orgânico, a sua espessura, estrutura, textura, porosidade, cor, teor e tipos de argila, composição química, pH, grau de intemperismo, material de origem, formação geológica, clima, vegetação e relevo, auxiliam na diferenciação, classificação, mapeamento e utilização dos solos (MENDONÇA, 2010).
A textura ou a granulometria de um solo é o termo que descreve o tamanho das partículas do solo e corresponde à proporção relativa das frações de areia (2,00 a 0,053 mm), silte (0,053 a 0,002 mm) e argila (<0,002 mm). A textura do solo pode ser utilizada como um instrumento qualitativo
importante para classificar e verificar as características físicas (aeração, infiltração, drenagem e retenção de água) e químicas (absorção de água, fixação de nutrientes e capacidade de troca catiônica) dos solos. A classificação de um solo pela sua textura é realizada de maneira rápida, simples e eficaz, utilizando o diagrama conhecido como triângulo textural, apresentado na Figura I.1 (CAMARGO et al., 2009; USDA, 2014).
Figura I.1. Triângulo textural para classificação do solo quanto as porcentagens de
argila, silte e areia (USDA, 2014).
A composição mineralógica das frações areia e silte são, na sua maioria, de minerais resistentes ao intemperismo, como quartzo, além de outros minerais primários em quantidades variáveis, que preservam as características da rocha de origem e são os fornecedores de nutrientes para a fase líquida do solo e de elementos químicos para a formação dos minerais secundários. A fração argila é formada por minerais de natureza secundária, resultantes dos processos de alteração física, química e biológica de outros minerais, ou por
Argilo-siltosa Franco- argilo-siltosa Franco-argilosa Argilo-arenosa % Areia separada Franco-argilo-arenosa Franca Argilosa Franca-siltosa Siltosa Franco-arenosa
recombinação de elementos contidos na fase líquida do solo. Esta fração possui a maior superfície específica e representa a maior parte da fase sólida do solo. Sua natureza coloidal com alta retenção de cátions é constituída principalmente por silicatos e os óxidos de alumínio, magnésio e ferro, que apresentam cargas elétricas negativas responsáveis, juntamente com a matéria orgânica decomposta, pela capacidade de troca de cátions (MENDONÇA, 2010; MOTA et al., 2007).
A matéria orgânica do solo é um sistema complexo, em constante renovação, e que constitui numa mistura de resíduos de plantas e animais em vários graus de decomposição, tendo sua origem os organismos vivos (vegetal ou animal) e seus produtos de excreção. A matéria orgânica é composta por diferentes substâncias, que vão desde as mais simples (ácidos orgânicos, aminoácidos e carboidratos), às macromoléculas, como os biopolímeros (polissacarídeos, lipídios, proteínas e lignina) e as macromoléculas derivadas de biopolímeros chamadas de substâncias húmicas (mistura altamente heterogênea e estável). As substâncias húmicas contêm em sua estrutura muitos grupos fenólicos e carboxílicos e podem ser divididos em três frações dependendo de sua solubilidade: os ácidos fúlvicos (solúveis em soluções ácidas e básicas), os ácidos húmicos (solúveis em soluções básicas) e as huminas (insolúveis em qualquer pH) (CUNHA et al., 2015; FAO, 2005; HUANG et al., 2003).
A matéria orgânica tem influência em muitas das propriedades do solo. Do ponto de vista físico, promove maior agregação das partículas do solo e, dessa forma, influencia na estabilidade dos agregados, volume e tamanho dos poros. Quimicamente, a matéria orgânica decomposta influencia a capacidade de adsorção de cátions pelo solo, denominada capacidade de troca catiônica (CTC), por apresentar grupos químicos que adquirem carga negativa dependendo do pH do meio, estando diretamente envolvida na retenção de metais pesados, fármacos veterinários, agrotóxicos e outras substâncias químicas (MCCAULEY et al., 2005).
Os solos brasileiros são ácidos em sua grande maioria e esta acidez pode ser de origem natural e estar relacionada ao material de origem, ser pobre em cálcio, magnésio, potássio e sódio, que são as bases trocáveis do solo ou devido
à intensidade dos processos de intemperização, que provoca o aumento da concentração hidrogeniônica (H+) e alumínio (Al3+). A exploração agrícola é
um outro fator que pode levar à acidez do solo, seja pela absorção de nutrientes pela planta, lixiviação de nutrientes do solo (bases trocáveis), pelo aumento da degradação da matéria orgânica do solo (intensificação do ciclo) ou pelo manejo do solo com a aplicação de fertilizantes com efeito acidificante (MENDONÇA, 2010).
O Brasil tem um sistema taxonômico (hierárquico, multicategórico e aberto) próprio de classificação dos solos, de modo a classificar todos os tipos de solo de seu território nacional. O Sistema Brasileiro de Classificação de Solos (SiBCS), coordenado pela Embrapa Solos, é composto por seis níveis categóricos de classificação: ordem, subordem, grande grupo, subgrupo, família e série. Este sistema foi desenvolvido para classificar os solos tropicais, uma vez que não havia sistema que o complementava totalmente, devido a diversidade e as peculiaridades desses solos (SANTOS et al., 2013).
A superfície do estado de São Paulo é coberta por 84,4% pelas seguintes classes de solo (ordem e subordem): argilossolo vermelho-amarelo, latossolo vermelho, latossolo vermelho-amarelo e o neossolo quartzarênico. A Figura I.2 mostra o mapa pedológico do estado de São Paulo. Este mapa foi adquirido pelo banco de dados do mapa digital dos solos do Estado de São Paulo, cedido pelo Dr. Jener Fernando Leite de Moraes, pesquisador do Laboratório de Geoprocessamento do Instituto Agronômico de Campinas (IAC), e o mapa elaborado por tratamento de dados em programa Arc-GIS, com colaboração do Dr. Adelsom Soares Filho, do Instituto de Geociências da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).
O Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA), órgão responsável pelo registro dos agrotóxicos comercializados no Brasil, recomenda que os estudos de comportamento dos agrotóxicos no solo sejam realizados nos seguintes tipos de solo: argilossolo, latossolo, gleissolo e neossolo.
Figura I.2. Mapa pedológico do Estado de São Paulo com os principais tipos de solo.
Os argilossolos são solos minerais que apresentam nítida diferenciação entre os horizontes, quanto à cor, estrutura e textura, especialmente pelo aumento nos teores de argila em profundidade. Apresentam cor forte (amarelada, brunada ou avermelhada), maior coesão e maior plasticidade e pegajosidade em profundidade, devido ao maior teor de argila. A fertilidade é variável, dependente principalmente de seu material de origem. São juntamente com os latossolos, os solos mais expressivos do Brasil, sendo verificados em praticamente todas as regiões (IAC, 2017; MENDONÇA, 2010; SANTOS et al., 2013).
Os solos da classe dos latossolos são os de maior representação geográfica no Brasil (50 a 60 % do território nacional) e típicos de regiões equatoriais e tropicais. Estes solos são de elevado estágio de intemperização, muito evoluídos, variam de fortemente a bem drenados e são ácidos. São caracterizados por serem muito profundos, tem sequência de horizontes A, B e C, os teores da fração argila aumentam gradativamente com a profundidade ou permanecem constantes ao longo do perfil e praticamente ausência de minerais primários de fácil intemperização. Os latossolos bruno, amarelo, vermelho e vermelho-amarelo diferenciam-se principalmente pela coloração e teores de óxidos de ferro. Alguns apresentam cores avermelhadas acentuadas,
devido aos teores mais altos e à natureza dos óxidos de ferro presentes no material de origem. A cor amarelada de alguns latossolos é causada pela predominância do mineral goethita em relação à hematita (IAC, 2017; KER, 1997; MENDONÇA, 2010; SANTOS et al., 2013).
Os gleissolos são solos constituídos por material mineral formados em condições permanentes ou periodicamente de saturação com água, presentes principalmente em planícies ou várzeas inundáveis. Os gleissolos têm coloração pouco viva, esmaecida, com tendência às cores acinzentadas. Sua textura, variável de arenosa à argilosa, e sua fertilidade, variável de baixa à elevada, são bastante dependentes dos solos do seu entorno e de solos de outras posições à montante. As limitações mais comuns dos gleissolos são sua elevada frequência de inundação e o longo período de solo saturado por água, consequência de cheias dos cursos d’água ou da elevação do lençol freático (IAC, 2017; MENDONÇA, 2010; SANTOS et al., 2013).
Os neossolos são solos pouco evoluídos, não apresentam alterações expressivas em relação ao material de origem, devido à resistência deste material ao intemperismo ou por influência de fatores de formação, como clima, relevo ou tempo, que podem impedir ou limitar o desenvolvimento dos solos. Caracterizam-se pelo predomínio de areias quartzosas e pela presença de camadas distintas herdadas dos materiais de origem. Os neossolos quartzarênicos apresentam baixa coesão e elevada permeabilidade, características que conferem fragilidade aos solos e elevada susceptibilidade à erosão (IAC, 2017; MENDONÇA, 2010; SANTOS et al., 2013).
I.2 Mercado agropecuário
O Brasil possui o maior rebanho comercial bovino do mundo e o segundo maior rebanho efetivo, com mais de 215 milhões de cabeças. Em 2016 foram abatidas 29,7 milhões de cabeças (IBGE, 2017a).
No setor agrícola é o maior produtor e exportador mundial de laranja, tendo produzido quase 360 milhões de caixas da fruta na safra de 2016/2017 (IBGE, 2017a). O setor agropecuário em 2016 passou por uma forte queda, entretanto, as perspectivas para o ano de 2017 indicam que o agronegócio
será o setor de destaque na economia brasileira, podendo ser o responsável por deixar a taxa do PIB brasileiro positivo, sendo o único setor com crescimento expressivo, comparado com os setores da indústria e de serviços (Figura I.3) (IBGE, 2017b).
Figura I.3. Participação dos setores da indústria, serviços, agropecuária e do PIB
brasileiro nos anos de 2013 ao primeiro trimestre de 2017 (IBGE, 2017b).
A bovinocultura é um dos principais destaques do agronegócio brasileiro no cenário mundial. Desde 2004, assumiu a liderança nas exportações, com um quinto da carne comercializada internacionalmente e vendas em mais de 150 países. A cada ano, a participação brasileira no comércio internacional vem crescendo, com destaque para a produção de carne bovina, suína e de frango (IBGE, 2017a). O aumento significativo na produção de alimento de origem animal e vegetal somente tem sido possível pelo emprego de medicamentos veterinários e de agrotóxicos, respectivamente, durante o manejo, permitindo aumentar e alavancar a competitividade do agronegócio a nível nacional e internacional. -5,5% -5,0% -4,5% -4,0% -3,5% -3,0% -2,5% -2,0% -1,5% -1,0% -0,5% 0,0% 0,5% 1,0% 1,5% 2,0% 2,5% 3,0% 3,5% 4,0% -10% -8% -6% -4% -2%0% 2% 4% 6% 8% 10% 12% 14% 16% 18% 20% 22% Taxa a cu m u la d o d o P IB Taxa a cu m u la d a d os setores Período em Trimestres
Participação dos setores da economia e do PIB
Embora a utilização destes medicamentos e agrotóxicos tragam benefícios a pecuária e a agricultura, os mesmos impactam o ambiente, visto que uma grande parte destas substâncias entra no ambiente, em sua forma metabolizada ou não, por meio das fezes e urina dos animais tratados e através da aplicação direta nas lavouras. Apesar da ampla utilização destes produtos, a falta de informações sobre a produção, a venda, a utilização e a dosagem são comuns à maioria dos países, sendo os Estados Unidos da América e alguns países da Europa os que apresentam mais dados, embora ainda incompletos (BOXALL, et al., 2003, SARMAH et al., 2006; REHMAN et al., 2015).
No Brasil, o mercado de medicamentos veterinários vem aumentando e movimentou em 2016 R$ 5 bilhões de reais e no mercado internacional movimentou US$ 30 bilhões de dólares em 2016 (Figura I.4) (SINDAN, 2017; STATISTICA, 2017). Os fármacos veiculados nos medicamentos veterinários pertencem a diferentes classes terapêuticas, tais como: antimicrobianos, antiparasitários, anti-inflamatórios, anestésicos, antissépticos, entre outros. Dentre esses, os antiparasitários e os antimicrobianos têm sido os de maior destaque. No Brasil, 31% do mercado de medicamentos veterinários é referente à comercialização de antiparasitários, 21% de biológicos (vacinas) e 14% de antimicrobianos (Figura I.5).
Figura I.4. Faturamento do mercado veterinário nacional e mundial (SINDAN, 2017;
STATISTICA, 2017). 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 Bi lhõ e s (R$ ) -N acio na l Ano do Faturamento
Faturamento de Medicamentos Veterinários
Mercado Nacional Mercado Mundial
Bi lhõ e s (U S $ ) -M un d ial
Figura I.5. Porcentagem do faturamento do mercado veterinário nacional por classe
terapêutica (SINDAN, 2017).
O mercado de agrotóxicos no Brasil movimentou US$ 9,56 bilhões de dólares em 2016 e no mercado internacional movimentou US$ 54,6 bilhões de dólares em 2015 (SINDIVEG, 2016), sendo o Brasil o maior consumidor de agrotóxicos do mundo. No ano de 2009 mais de 1 milhão de toneladas de agrotóxicos foram utilizadas na produção agrícola do Brasil. As classes dos agrotóxicos mais consumidas, em 2016, no Brasil foram: 33% de fungicidas, 32,5 % de herbicidas e 29% de inseticidas (SINDIVEG, 2016). Cabe destacar que o Brasil é um dos maiores produtores agrícolas do mundo e possui um clima que pode favorecer a proliferação de doenças e pragas na agricultura. Dados do Programa de Análises de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos (PARA) da ANVISA, no período de 2013 a 2015, mostrou que a laranja foi o alimento que apresentou maiores porcentagens de amostras contaminadas por agrotóxicos em suas análises (ANVISA, 2016).
Uma classe de substâncias, bastante usada na pecuária e na agricultura como nematicida e inseticida/acaricida, respectivamente, são as avermectinas. Estas são bastante usadas no rebanho bovino no controle de endo e ectoparasitas e na cultura de citros, como por exemplo na laranja, no controle de ácaros e insetos. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 34% 31% 32% 27% 25% 26% 26% 21% 21% 24% 25% 25% 30% 29% 29% 27% 31% 31% 18% 18% 16% 15% 15% 15% 15% 15% 14% 8% 8% 8% 13% 13% 13% 14% 14% 15% 4% 3% 4% 6% 7% 7% 8% 8% 8% 13% 15% 15% 9% 10% 10% 11% 11% 11% P o rc e ntag e m no F atura m e nto Ano do Faturamento
Porcentagem das Classes Terapêuticas no Mercado Nacional
I.3 Avermectinas e milbemicinas
O grupo das lactonas macrocíclicas compreende as avermectinas (AVM) e as milbemicinas (MBM), sendo a avermectina B1a (abamectina B1a) o produto
natural da fermentação do microrganismo Streptomyces avermitilis. Com a mutação genética deste microrganismo foi possível a obtenção da doramectina. As demais avermectinas, ivermectina e eprinomectina, são obtidas a partir de modificações químicas por síntese da abamectina B1a. A milbemicina
moxidectina é obtida a partir da modificação química do produto natural da fermentação (nemadectina) do microrganismo Streptomyces cyaneogriseus. (PRICHARD et al., 2012; RATH et al., 2016a)
Tanto as avermectinas quanto as milbemicinas apresentam propriedades estruturais e físico-químicas semelhantes (SHOOP et al., 1995). A principal diferença entre as AVM e as MBM é um substituinte monossacarídeo ou dissacarídeo na posição 13 do anel macrocíclico presente somente nas AVM (DANAHER et al., 2006; PRICHARD et al., 2012). Entre as avermectinas mais usadas na medicina veterinária destacam-se a abamectina (ABA), ivermectina (IVER), doramectina (DORA) e eprinomectina (EPRI) e das milbemicinas, a moxidectina (MOXI), sendo estas registradas no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) para utilização em medicamentos veterinários. Outras avermectinas como a selamectina e a benzoato de emamectina não são registradas no MAPA, portanto, não podem ser comercializadas no Brasil. Entretanto, o MAPA tem autorizado a comercialização do benzoato de emamectina, em caráter emergencial, nas regiões onde foi decretado estado de emergência sanitária, para combater a praga da Helicoverpa armígera (lagarta que ataca principalmente às lavouras de milho, soja e algodão). Já as outras milbemicinas, nemadectina e a milbemicina oxima, não possuem produtos cadastrados no Compêndio de Produtos Veterinários do SINDAN (Sindicato Nacional da Indústria de Produtos Para Saúde Animal) e no Sistema de Agrotóxicos Fitossanitários (AGROFIT) do MAPA.
As estruturas químicas e as propriedades físico-químicas das AVM e da MBM são apresentadas na Figura I.6 e na Tabela I.1, respectivamente.
Figura I.6. Estrutura geral das avermectinas e milbemicinas. (*C13-H).
As características dos fármacos ABA, DORA, EPRI, IVER e MOXI, conforme suas propriedades físico-químicas, são a baixa solubilidade em água, alta lipofilicidade e não ter tendência a dissociação em meio aquoso.
As avermectinas e a milbemicina são os componentes ativos de alguns inseticidas e acaricidas utilizados na agricultura e o nematicida mais utilizados em medicina veterinária na prevenção de doenças parasitárias.
Avermectinas e Milbemicina R1 R2 R3 C22-X-C23 Abamectina – B1a (>80%): C48H72O14 -OH -H -CH(CH3)CH2CH3 -CH=CH- – B1b (<20%): C49H74O14 -OH -H -CH(CH3)2 -CH=CH- Doramectina – A1a: C50H74O14 -OH -H -C6H11 -CH=CH- Eprinomectina – B1a (>90%): C50H75NO14 -NH-COCH3 -H -CH(CH3)CH2CH3 -CH=CH- – B1b (<10%): C49H73NO14 -NH-COCH3 -H -CH(CH3)2 -CH=CH- Ivermectina – B1a (>80%): C48H74O14 -OH -H -CH(CH3)CH2CH3 -CH2-CH2- – B1b (<20%): C47H72O14 -OH -H -CH(CH3)2 -CH2-CH2- Moxidectina – B1a: C37H53NO8 * =NOCH3 -C(CH3)CHCH(CH3)2 -CH2-C- 1 2 5 7 12 15 19 22 23 25 X 13 4' 4'' 1' 1'' R2 O O C H3 R1 O CH3 O O O C H3 CH3 CH3 C H3 O O O H O O O R3 CH3 CH3 OH
Tabela I.1. Propriedades físico-químicas das avermectinas e da milbemicina. Fármacos (Número CAS) Massa molar (g mol-1) Ponto de fusão (°C) Solubilidade em Água (mg L-1) Log Kow pKa Abamectina B1a (71751-41-2) 873,1 161,8 - 169,4 1,21 4,4 Não há (pH 1 a 12) Doramectina A1a (117704-25-3) 899,1 160,5 - 162,2 0,025 4,41 12,4 Eprinomectina B1a (123997-26-2) 914,1 163 - 166 3,5 5,4 Não há (pH 3 a 10) Ivermectina B1a (70288-86-7) 875,1 155 - 157 4 3,22 12,47 Moxidectina B1a (113507-06-5) 639,8 145 - 154 0,51 4,77 < 2
Fonte: (DRUGBANK, 2017; EUROPEAN FOOD SAFETY, 2016; FAO, 1998; FORT-DODGE, 2001; KUMIRSKA et al., 2016; MERCK, 1996; MERIAL, 1996; O'NEIL, 2006; PFIZER, 1996).
A ivermectina tem sido a mais amplamente usada no campo, uma vez que apresenta atividade antiparasitária em baixas dosagens contra os dois maiores filos de parasitas (nematoides e artrópodes) (CAMPBELL et al., 1983; OMURA & CRUMP, 2004). Devido à resistência por partes de alguns parasitas para com o fármaco ivermectina (CEZAR et al., 2010; GRAEF et al., 2013; WILLIAMS et al., 1999; WOLSTENHOLME & KAPLAN, 2012), o uso cada vez mais frequente dos outros fármacos como a eprinomectina e doramectina é verificado.
As avermectinas tem aplicação em bovinos, suínos, equinos, caprinos e ovinos, é considerada segura em relação à dose para as espécies (CAMPBELL, 2012; DANAHER et al., 2006; WANG et al., 2009), sendo utilizadas também na aquicultura (HERNANDO et al., 2007; TURNIPSEED et al., 1999) e na agricultura (BREWER et al., 2004; KOLAR et al., 2008; PARK et al., 2013). Cabe destacar que a ivermectina é indicada no tratamento de pessoas infectadas por miíase (infecção de pele causada por larvas de moscas) e por vermes causadores da oncocercose (cegueira dos rios) e filariose (elefantíase). Em 2015, os pesquisadores Satoshi Omura e William Campbell ganharam o prêmio Nobel de Medicina pela descoberta e isolamento da avermectina B1a
(abamectina B1a) e pela sua aplicação na medicina no combate a doenças
As avermectinas e milbemicinas são amplamente usadas no Brasil no controle de ecto e endoparasitas na bovinocultura, sendo gastos mais de R$ 1,55 bilhões de reais em 2016 em medicamentos antiparasitários (SINDAN, 2017). Este gasto é bem inferior aos prejuízos causados pelos parasitas a pecuária nacional, sendo estimado em quase US$ 14 bilhões de dólares de prejuízo no ano de 2011 (GRISI et al., 2014).
I.4 Fármacos veterinários no ambiente
A taxa de excreção dos fármacos veterinários (FV) pelos animais tratados depende, entre outros, das propriedades físico-químicas da substância administrada, do modo de aplicação, da espécie animal e do tempo de tratamento. Estima-se que em alguns casos até 90% da dose administrada seja eliminada (fezes e urina), em sua forma não metabolizada ou como metabólitos, já que a absorção destas substâncias geralmente ocorre de forma incompleta no organismo animal (KEMPER, 2008).
Existem várias vias de entrada dos fármacos para o ambiente dos quais as principais estão apresentadas na Figura I.7. Deste modo, grandes quantidades de insumos farmacêuticos são lançados no ambiente a cada ano, o que faz com que os impactos causados por sua dispersão alcancem grandes proporções, à medida que as águas superficiais e subterrâneas, o ar, solos, plantas, organismos terrestres e aquáticos são ameaçados e a disseminação de bactérias resistentes ocorre no ambiente.
É importante destacar que alguns fármacos veterinários também são usados como agrotóxicos na agricultura, por exemplo a abamectina, o que pode ter como via de entrada a aplicação direta no ambiente por meio das pulverizações em diferentes tipos de plantações.
A presença e a dispersão dos FV no ambiente dependem de vários fatores, tais como: propriedades físico-químicas do fármaco e do solo, assim como natureza do ambiente (JØRGENSEN & HALLING-SØRENSEN, 2000). Os processos de degradação (biodegradação, fotodegradação, termodegradação) podem também afetar significativamente a concentração dos FV no ambiente (KAY et al., 2005; KOLZ et al., 2005; TEETER & MEYERHOFF, 2003). Muitas
dessas substâncias são encontradas em efluentes de estações de tratamento de esgotos (ETE), águas de abastecimento oriundas de estações de tratamento de água (ETA) e em outras matrizes ambientais, tais como solo, sedimento e águas naturais, em concentrações na faixa de µg kg-1 ou µg L-1 e ng L-1 ou ng
kg-1 (BOXALL et al., 2004; HALLING-SØRENSEN et al., 1998; REHMAN et al.,
2015; TERNES, 1998) e a sua presença no ambiente tem gerado muita preocupação e discussão na comunidade científica (JJEMBA, 2002; JONES et al., 2004; SARMAH et al., 2006; REHMAN et al., 2015).
Figura I.7. Possíveis vias de exposição ambiental devido ao uso de medicamentos
veterinários na produção animal. Adaptado de (ANDREU et al., 2007).
Até os dias atuais, não existem legislações que estabeleçam limites específicos para a concentração de FV no solo. Somente no ano de 2001 a Agência Europeia de Medicamentos (European Medicines Agency - EMA) recomendou um limite genérico de 100 µg kg-1 para FV em solo. Este valor foi
estabelecido com base em estudos toxicológicos realizados com os fármacos autorizados nos Estados Unidos e está abaixo dos níveis prejudiciais observados em minhocas, microrganismos e plantas.
I.5 Comportamento dos fármacos veterinários nos solos: sorção, dessorção e dissipação
Os estudos de sorção, dessorção e dissipação de fármacos em solos são úteis para fornecer informações a respeito da mobilidade, distribuição e tempo de permanência destes no solo e na água.
Uma vez no solo, os compostos podem ser potencialmente transportados para os sistemas aquáticos. O grau de particionamento entre sólido e água determina seu comportamento e destino no ambiente. A ligação de um composto ao solo, em grande parte, determina se o mesmo é susceptível de contaminar águas subterrâneas ou de ser transportado em águas de escoamento (GRUBER et al., 1990; LITSKAS et al., 2011). Fármacos com alta capacidade de sorção tenderão a se acumular no solo e em sedimentos, enquanto compostos com baixa capacidade de sorção serão lixiviados e poderão contaminar águas superficiais, lençóis freáticos e até mesmo água potável.
Entender sobre a persistência de uma substância química no ambiente é um dos indicativos sobre o impacto ambiental que esta pode causar no mesmo. Há diversas vias de dissipação dos medicamentos veterinários nos solos, sendo a biodegradação aeróbia do solo a principal via (CUNNINGHAM et al., 2010). Entretanto, dependendo da natureza da substância química, podem ocorrer outros mecanismos de degradação e depleção, incluindo a fotólise e a hidrólise (WOLTERS & STEFFENS, 2005). Após os processos de dissipação ou degradação, os medicamentos veterinários podem formar outros produtos, chamados de produtos de degradação. Esses produtos de degradação, em alguns casos, podem ser de maior preocupação ambiental do que a substância original, pois alguns têm toxicidade semelhante ou maior, alguns são mais persistentes e outros são mais móveis (BOXALL et al., 2003; KOLZ et al., 2005). Portanto, é importante que o destino dos produtos de degradação nos solos seja considerado ao avaliar o impacto de um fármaco veterinário no ambiente.
O transporte, a transformação e a biodisponibilidade destes compostos em solos e sedimentos, águas subterrâneas ou águas superficiais é dependente dos processos de sorção, degradação/dissipação e lixiviação, que por sua vez, são regulados pelas propriedades físico-químicas das substâncias, tais como a estrutura, a dimensão, a forma, a solubilidade, hidrofobicidade e especiação; do solo, como pH, quantidade de matéria orgânica, textura, mineralogia, teor de argila, força iônica e capacidade de troca catiônica, além das condições climáticas locais e da presença de bactérias específicas que se desenvolveram para degradar grupos de medicamentos (DORETTO & RATH, 2013; INGERSLEV & HALLING-SØRENSEN, 2001; SARMAH et al., 2006).
Segundo determinação da Agência Europeia de Medicamentos, os estudos de sorção e dessorção devem ser realizados conforme recomendações do Guia 106 da OECD (OECD, 2000). Já o estudo de dissipação é realizado segundo as recomendações do Guia 307 da OECD (OECD, 2002). Numerosos fenômenos e mecanismos envolvidos no processo de sorção e dissipação de um composto no solo não podem ser completamente definidos por um modelo laboratorial simplificado, como recomendado pelos Guias citados. No entanto, é capaz de fornecer informações valiosas sobre a relevância ambiental de sorção e tempo de permanência de uma substância no solo.
Estudos na literatura mostram que o tempo de meia-vida (DT50) das
avermectinas varia significativamente em diferentes condições de campo. Portanto, há uma necessidade de realizar novos estudos em diferentes solos e em diferentes condições climáticas de modo a melhor entender a persistência destes fármacos no ambiente (BAI & OGBOURNE, 2016; LI, 2014).
Há poucos trabalhos publicados na literatura sobre os estudos de dissipação dos fármacos veterinários da classe das avermectinas em solo para a EPRI (LITSKAS et al., 2013), ABA (BULL et al., 1984; LIU et al., 2011; MOYE et al., 1987), DORA (ERŽEN et al., 2005; TAYLOR, 1999) e IVER (KROGH et al., 2009). Apenas a ABA (DIONISIO & RATH, 2016) e a IVER (RATH et al., 2016b) foram estudadas em solos do Brasil. Para a milbemicina MOXI não foi encontrado nenhum estudo de dissipação publicado, apenas uma referência de um livro informando o seu DT50 (CUNNINGHAM et al., 2010).
Poucos estudos cinéticos em solos foram realizados também com as avermectinas EPRI (LITSKAS et al., 2016; LITSKAS et al., 2011), ABA (GRUBER et al., 1990) e IVER (HALLEY et al., 1989; KROGH et al., 2008b), e apenas a ABA (DIONISIO & RATH, 2016) e IVER (RATH et al., 2016b) foram estudadas em solos do Brasil. Não foram encontrados na literatura estudos cinéticos para a DORA e MOXI. Sendo assim, há necessidade de avaliar o comportamento destes fármacos em solos e de disponibilizar métodos analíticos sensíveis e adequados para o monitoramento dos mesmos no ambiente.
I.6 Métodos analíticos para a determinação de fármacos veterinários em solos
Devido à presença de muitos concomitantes, além dos analitos, e a complexidade da matriz solo, as etapas de extração e limpeza dos extratos são fundamentais para que a determinação dos resíduos de fármacos nesta matriz, bem como nos estudos de sorção, dessorção e dissipação apresentem resultados confiáveis.
A extração de FV em solos, lodos e estercos é usualmente realizada por sonicação ou agitação da amostra com solventes adequados (DÍAZ-CRUZ et al., 2006; KEMPER, 2008). Técnicas mais avançadas como a extração assistida por micro-ondas (MAE) e a extração líquida pressurizada (PLE) também têm sido utilizadas para a extração destes compostos de matrizes sólidas ambientais.
A limpeza dos extratos (clean-up) é geralmente feita por extração em fase sólida (SPE) ou extração líquido-líquido (LLE). Posteriormente, as fases obtidas podem ser separadas por centrifugação e concentradas por evaporação. Entretanto, nem sempre este tipo de clean-up é eficiente, devido ao sorvente da SPE não ser específica para os analitos (fármacos) de interesse. A técnica mais utilizada e descrita na literatura para a determinação de fármacos veterinários é a cromatografia líquida de alta eficiência associada ao detector por ultravioleta ou fluorescência (CAMPILLO et al., 2013; DIONISIO & RATH, 2016; WANG et al., 2009) e à espectrometria de massas (KROGH et
al., 2008a; RÜBENSAM et al., 2013). A baixa concentração dos FV no ambiente (solo e água), na ordem de ng g-1 a pg g-1, e a falta de sensibilidade limita o
uso do detector de ultravioleta. Separação por cromatografia líquida seguida de detecção por fluorescência, após formação de derivados fluorescentes, é a técnica mais comumente aplicada no que diz respeito aos limites de detecção e quantificação, apresentando melhor detectabilidade, com vantagens em termos de custos de equipamentos, o que a torna uma escolha atrativa para a determinação de resíduos de avermectinas (RÜBENSAM et al., 2013; XIE et al., 2012). Devido ao fato da espectrometria de massas sequencial (MS2)
possuir baixo limite de detecção, alta seletividade e informar a respeito da estrutura dos compostos, o acoplamento desta técnica com a cromatografia líquida na análise de amostras ambientais tem sido crescente (FERREIRA et al., 2016; RAICH-MONTIU et al., 2011; WANG et al., 2011).
Devido à complexidade das amostras ambientais, a etapa da extração em fase sólida (SPE) é fundamental para realizar a pré-concentração dos analitos e a limpeza dos extratos antes da quantificação, a fim de minimizar os efeitos de matriz e aumentar a seletividade. Muitas vezes, é necessário usar mais de um cartucho de SPE (VAZQUEZ-ROIG et al., 2010). Os sorventes comumente usados nos cartuchos de SPE de bancada (off-line) para a limpeza das amostras de solo contendo AVM são os de balanço hidrofílico-lipofílico HLB (KROGH et al., 2008a), C8 (CANNAVAN et al., 2000; GIL-DÍAZ et al., 2011) e C18 (XIE et al., 2012). Esses procedimentos off-line são demorados e exigem manuseio substancial de amostras, aumentando a incerteza do método e a possibilidade de contaminação da amostra. As desvantagens da SPE off-line podem ser superadas usando um método SPE on-line que requer volumes menores de solventes e oferece tempos de análise mais curtos, menor manuseio de amostras e melhor reprodutibilidade analítica (FARRÉ et al., 2012; HEUETT et al., 2015; SHEN et al., 2013; TOGOLA et al., 2014).
Poucos trabalhos da literatura têm reportado a presença das avermectinas no ambiente na matriz solo. Pesquisadores americanos determinaram ivermectina (0,1 a 2,0 ng g-1) na superfície do solo (0 a 7,6 cm)
coletado de uma área de confinamento de bovinos após 28 dias de tratamento dos animais com o antiparasitário (NESSEL et al., 1989). Os pesquisadores
espanhóis descreveram a ocorrência da doramectina (0,8 a 4,0 ng g-1) em
amostras de solo (0 a 90 cm), seis meses após adubação do solo com esterco de porco (GIL-DÍAZ et al., 2011). Já pesquisadores chineses determinaram as avermectinas, abamectina (9,3 a 12.806 ng g-1), emamectina (17,2 ng g-1) e
a ivermectina (106,8 a 2.352 ng g-1) em amostras de solo de diferentes origens
(pomares, campo de cultivo de vegetais e de criadouros de porcos) (XIE et al., 2012). Em outros estudos (KROGH et al., 2008a; PARK et al., 2013) foram relatados que a concentração das avermectinas nas amostras de solo estavam abaixo do limite de detecção dos métodos, indicando a necessidade de aprimoração de métodos.
I.7 Justificativa da pesquisa
A contaminação do ambiente provocada pela presença de medicamentos veterinários e agrotóxicos é uma realidade atual. Entretanto, um número limitado de estudos foi publicado nesta área, principalmente em países do hemisfério sul. Sendo assim, existe uma carência de dados quantitativos que estimem a extensão desta contaminação, de estudos sobre a mobilidade destes compostos, de métodos adequados para a determinação dos mesmos no solo e dos impactos ambientais provocados por sua presença no ambiente. Tanto os antiparasitários como os acaricidas/inseticidas, da classe das avermectinas, são largamente empregados na criação de bovinos e na cultura de laranja, respectivamente, tendo o Brasil enfrentado diversos embargos na exportação de carne pela presença de ivermectina acima dos limites máximos de resíduos. Existem mais de 180 produtos registrados e comercializados no Brasil com as avermectinas e milbemicinas em diferentes formulações para medicamentos veterinários e 19 produtos registrados para uso na agricultura. Não existe dúvida quanto ao largo emprego destes compostos na agropecuária brasileira, no entanto, pouco se sabe sobre o comportamento destes no ambiente. Esses compostos podem atingir o solo pela aplicação direta na agricultura ou pelos excrementos de animais tratados. Já existem estudos que relatam a toxicidade de resíduos destes fármacos para alguns organismos do solo.
A maioria dos estudos reportados na literatura restringe-se à detecção de fármacos em água. A obrigatoriedade de avaliação de risco ambiental (Environmental Risk Assessment - ERA) para que a comercialização de um novo medicamento (para humano ou animal) seja autorizada foi implementada pela “U.S. Food and Drug Administration” (FDA) em 1980 e pela Comunidade Europeia em 1997 (BOXALL et al., 2003). Atualmente, novos protocolos de ERA vêm sendo discutidos no âmbito internacional com a participação de vários países da Comunidade Europeia, Japão e Estados Unidos da América, e sob a observação da Austrália, do Canadá e da Nova Zelândia (International Cooperation on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Veterinary Medicinal Products). No Brasil ainda não existe regulamentação relativa a ERA dos medicamentos de uso veterinário, mas certamente terá que ser discutida no futuro.
A maioria dos estudos visando à sorção/dessorção e determinação de FV tem sido realizada em países como a Dinamarca, Alemanha e Reino Unido (KEMPER, 2008). Uma vez que a mobilidade de substâncias no solo é influenciada pela composição do solo, clima, pH, incidência de chuvas e de raios solares, necessita-se de uma avaliação mais ampla já que estes fatores variam de região para região, não sendo idênticos àqueles encontrados em países de clima temperado. Estudos que foram realizados com solos brasileiros tratam em especial da sorção/dessorção de agrotóxicos.
O Brasil é um grande produtor de fármacos veterinários e o maior consumidor de agrotóxicos do mundo. De acordo com o BNDES e o INCA, o país é um dos cinco maiores mercados veterinários e o maior consumidor de agrotóxicos do mundo, sendo detentor do maior rebanho comercial bovino do mundo e o maior produtor mundial de laranja. Atualmente, o Brasil conta com o Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes (PNCRC) do MAPA e o Programa de Análises de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos (PARA) da ANVISA. Contudo, não existe programa responsável pelo acompanhamento de fármacos e agrotóxicos no ambiente. Sendo assim, há necessidade urgente de avaliações do comportamento de fármacos e agrotóxicos em solos brasileiros e da disponibilização de métodos analíticos sensíveis e adequados para o monitoramento dos mesmos.
Em nosso grupo de pesquisa foram realizados estudos (sorção, degradação e dissipação em solos) com a ivermectina e a abamectina. Portanto, para este trabalho foram selecionadas as outras duas avermectinas (eprinomectina e doramectina) e a milbemicina (moxidectina) para serem estudadas.
