UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de Biologia
JULIANA YURI YAMADA
FILOGENIA MOLECULAR DE BRACHYCEPHALUS
(ANURA: BRACHYCEPHALIDAE)
A MOLECULAR PHYLOGENY OF BRACHYCEPHALUS
(ANURA: BRACHYCEPHALIDAE)
CAMPINAS 2017
JULIANA YURI YAMADA
FILOGENIA MOLECULAR DE BRACHYCEPHALUS (ANURA: BRACHYCEPHALIDAE)
A MOLECULAR PHYLOGENY OF BRACHYCEPHALUS (ANURA: BRACHYCEPHALIDAE)
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestra em Biologia Animal, na área de concentração de Biodiversidade Animal
Dissertation presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master in Animal Biology, in the concentration area of Animal Biodiversity
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA JULIANA YURI YAMADA, ORIENTADA PELO PROF. DR. SÉRGIO FURTADO DOS REIS E COORIENTADA PELA DRA. PRIANDA RIOS LABORDA
Orientador: SÉRGIO FURTADO DOS REIS Co-Orientadora: PRIANDA RIOS LABORDA
CAMPINAS
Campinas, 06/10/2017.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Sérgio Furtado dos Reis (Orientador)
Profa. Dra. Marlene Tiduko Ueda
Prof. Dr. Márcio Silva Araújo
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Agradecimentos
Aos meus pais, Luiza e Reinaldo, por todo amor e suporte que me deram até hoje. Sem eles nada disso seria possível.
À tia Akemi, por ser minha segunda mãe e por me dar apoio em minhas escolhas. À minha irmã Priscila, por ser meu exemplo de dedicação aos estudos desde que éramos crianças.
Ao prof. Dr. Sérgio Furtado dos Reis, pela paciência durante todo o tempo que estive em seu laboratório, pelas conversas e orientações.
À Dra. Prianda Laborda, por me orientar no projeto, por ser tão gentil sempre, por me ensinar e me acompanhar em todos os experimentos, pelas conversas durante os almoços e cafés, por mostrar seu amor pela genética e pela pesquisa.
À Dra. Rute Carvalho, por toda contribuição em nosso projeto, pela paciência em tirar esclarecer minhas dúvidas mesmo estando longe.
Ao Dr. Ivan Perez, por nos ajudar em todas nossas análises e por ter me ensinado tantas coisas quando veio ao laboratório.
Ao Dr. Benilton, por nos mostrar um pouquinho desse mundo da estatística e por nos contar as melhores histórias sobre viagens e sobre as peripécias da Betina. Ao Dr. Mathias Pires, pelas conversas sobre vida acadêmica, por compartilhar suas experiências com os alunos, por ser humilde e profissional.
Às professoras, Dra. Silmara Allegretti, Dra. Selma Giorgio e Dra. Marlene Ueda por participarem da qualificação e da pré banca do nosso projeto.
Aos colegas de laboratório Bárbara, Carlos e Carolina por toda ajuda que me deram durante o projeto, pelas risadas, pelos cafés e pela companhia.
Às pessoas queridas que me apoiaram durante o mestrado e são meus companheiros para vida, Leandro Fonseca, Renata Yamada, Ronaldo Okubo, Mariana Carvalho, Danielle Fonseca, Pedro Longo, Jair Mendes, Rodrigo Castro,
Thiago Peluzzo, Benito Trento, Ana Carolina, Maria Eduarda, Mariana Rosa, Eduardo Palou e Frederico Abreu.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo financiamento da bolsa de mestrado.
Resumo
Os anfíbios do gênero Brachycephalus são um exemplo notável do processo de miniaturização, dado que todas as espécies têm comprimento rostro-anal menor que dois centímetros. A maioria das espécies tem distribuição alopátrica, ocorrendo acima de 600 m do nível do mar na Mata Atlântica, no leste do Brasil. Brachycephalus possui espécies não hiperossificadas, parcialmente hiperossificadas e hiperossificadas – características morfológicas relacionadas ao grau de ossificação que as espécies apresentam. Porém, as diferenças morfológicas não são suficientes para obtermos uma filogenia bem resolvida do gênero Brachycephalus. Nesse estudo abordamos aspectos fundamentais da variação no nível molecular, com o objetivo de compreender as relações filogenéticas de Brachycephalus. Na primeira parte, nossas análises resolveram a maioria das relações filogenéticas entre as espécies não hiperossificadas, parcialmente ossificadas e hiperossificadas do gênero. Na segunda parte, focamos nas espécies hiperossificadas e conseguimos melhorar a resolução da filogenia estimada, aumentando a confiança das relações filogenéticas. Esse trabalho serve como base para novos estudos filogenéticos do gênero Brachycephalus, dado que inúmeras novas espécies foram descritas no último ano.
Abstract
Amphibians of the genus Brachycephalus are a notable example of the miniaturization process, given that all species have snout-vent lengths <2 centimeters. Most species have allopatric distribution, occurring above 600 m of sea level in the Atlantic Forest, in Eastern Brazil. Brachycephalus have non-hyperossified, partially hyperossified and hyperossified species. Despite the morphological differences, the phylogenetic relationships of these species are not completely known. In this study, we address the fundamentals of the organization of molecular variation, with the purpose of understanding the Brachycephalus phylogenetic relationships. In the first part, our analyses solved most of the phylogenetic relationships among the non-hyperossified, partially hyperossified and hyperossified species groups of the genus. In the second part, we focused on the hyperossified group and managed to improve the resolution of the estimated phylogeny, increasing the degree of certainty of phylogenetic relationships. This work serves as the basis for new phylogenetic studies of the genus Brachycephalus, since innumerable new species were described in the last year.
Lista de figuras
Figura 1: Diversidade de cores em Brachycephalus ... 14
Figura 2: Três condições de hiperossificação em Brachycephalus ... 17
Figura 3: Árvore de espécies estimada para o gênero Brachycephalus ... 19
Figura 4: Processo de lineage sorting ... 21
Figura 5: Árvore de espécies estimada ... 27
Figura 6: Árvore de espécies dos Brachycephalus hiperossificados ... 29
Figura 7: Rede de haplótipos para o gene 12S ... 31
Figura 8: Rede de haplótipos para o gene 16S ... 32
Figura 9: Rede de haplótipos para o gene CYTB ... 33
Figura 10: Rede de haplótipos para o gene COI ... 34
Figura 11: Demografia histórica de B. ephippium ... 35
Figura 12: A relação da filogenia com o grau de hiperossificação ... 37
Lista de tabelas
Tabela 1: Super família Brachycephaloidea... 13
Tabela 2: Estruturas ausentes ou reduzidas ... 16
Tabela 3: Número de indivíduos utilizados nas redes de haplótipos ... 30
Tabela 4: Medidas de variação (Gene 12S) ... 31
Tabela 5: Medidas de variação (Gene 16S) ... 32
Tabela 6: Medidas de variação (Gene CYTB) ... 33
Tabela 7: Medidas de variação (Gene COI) ... 34
Sumário Introdução ... 12 Objetivos ... 23 Materiais e métodos ... 24 Resultados ... 27 Discussão ... 36 Considerações finais ... 41 Referências ... 42 Anexos ... 47
Introdução
1. O gênero Brachycephalus
A superfamília de anfíbios do Novo Mundo Brachycephaloidea, também conhecida como Terrarana, contém mais de 1.000 espécies que se reproduzem em ambientes terrestres e têm desenvolvimento direto dos ovos, sem a formação de girinos (Heinicke et al., 2009; Padial et al., 2014). Brachycephaloidea inclui três famílias diagnosticadas com base em sequências de DNA: Brachycephalidae, Craugastoridae e Eleutherodactylidae (Padial et al., 2014). A família Craugastoridae contém três subfamílias, Holoadeninae, Craugastorinae e Pristimantinae, ao passo que a família Eleutherodactylidae compreende apenas duas subfamílias, Eleutherodactylinae e Phyzelaphryninae. A composição taxonômica da superfamília Brachycephaloidea está delineada na Tabela 1.
A família Brachycephalidae é composta por dois gêneros: Ischnocnema e Brachycephalus (Padial et al., 2014), sendo que o gênero Brachycephalus tem atualmente 32 espécies descritas (Frost, 2017). Embora a primeira espécie de Brachycephalus tenha sido descrita em 1824, mais da metade das espécies atualmente conhecidas foram descritas nos últimos 15 anos, sugerindo que a diversidade atual do gênero está subestimada (Ribeiro et al., 2015). Faz-se necessário compreender as principais características do gênero para embasar as relações filogenéticas.
Tabela 1. Superfamília Brachycephaloidea organizada por gêneros e famílias (Padial et al., 2014).
1.1 Características
Um dos aspectos notáveis nas espécies desse gênero é a diversidade de cores (Figura 1). Algumas espécies são predominantemente da cor laranja como B. margaritatus, B. alipioli, B. ephippium e B. guarani, ao passo que em outras a cor laranja é acompanhada dos pigmentos de cor marrom presentes tanto no dorso quanto nas laterais do corpo como, por exemplo, B. ferruginus.
Figura 1. Diversidade de cores em Brachycephalus: (A) B. alipioi; (B) B. ephippium; (C) B. guarani;
(D) B. ferruginus; (E) B. didactylus; (F) B. pulex; (G) B. pernix; (H) B. toby; (I) B. garbeana.
Já B. pitanga pode apresentar o dorso totalmente coberto de vermelho ou apresentar manchas vermelhas irregulares nesta região. Há também espécies predominantemente marrons como B. didactylus, B. hermogenesi, B. pulex e B. sulfuratus. Estas quatro espécies são conhecidas como flea toads em alusão à capacidade de saltar longas distâncias, ao contrário das demais espécies de Brachycephalus que realizam saltos curtos (Napoli et al., 2011; Condez et al., 2016).
Algumas espécies de Brachycephalus apresentam coloração aposemática. O aposematismo é um fenômeno relacionado à coloração em alguns animais que apresentam cores chamativas. Esta coloração sinaliza para os possíveis predadores a presença de algum atributo indesejado (sabor e/ou toxicidade), o que diminui a probabilidade de predação (Poulton, 1890). Em Brachycephalus, porém, não há uma relação entre aposematismo e a presença de toxinas. Algumas espécies aposemáticas não apresentam toxinas e outras que não são aposemáticas produzem toxinas.
A toxicidade foi identificada em apenas três espécies de Brachycephalus: B. nodoterga, B. ephippium e B. pernix (Pires et al., 2005). A maior concentração da toxina tetrodotoxina foi encontrada na pele, seguida do fígado e ovários tanto em B. ephippium quanto em B. pernix. É importante ressaltar que ainda não existem estudos ecológicos em relação aos aspectos adaptativos da coloração nos Brachycephalus.
Outra característica marcante do gênero é o tamanho reduzido dos indivíduos. A espécie com menor tamanho rostro-anal descrita é B. sulfuratus com 7,4mm de comprimento (Condez et al., 2016) e a espécie com maior comprimento,18,9mm, é B. margaritatus (Pombal & Izecksohn, 2011). De acordo com Clarke (1996), as espécies de anfíbios com comprimento menor ou igual a 20mm são miniaturizadas e, consequentemente, Brachycephalus teria evoluído pelo processo de miniaturização. A miniaturização é o processo de evolução que resulta em um tamanho corpóreo extremamente pequeno, no qual ocorrem mudanças na morfologia, fisiologia e ecologia do organismo (Hanken & Wake, 1993; Yeh, 2002). As consequências do processo de miniaturização são mais evidentes no esqueleto, que pode sofrer (1) redução da ossificação, (2) hiperossificação e/ou (3) apresentar novidade morfológica (Hanken & Wake, 1993). A grande diversidade morfológica do gênero ocorre, portanto, devido ao processo de miniaturização.
A redução da ossificação (diminuição do número de ossos) e a simplificação estrutural podem ocorrer no crânio, vértebras, membros e/ou mãos e pés (Hanken, 1993). Em Brachycephalus, o número de dedos tanto nas mãos quanto nos pés varia entre as espécies, podendo ser ausentes, presentes ou reduzidos (Tabela 2).
Tabela 2. Estruturas ausentes ou reduzidas por consequência da miniaturização em Brachycephalus.
A hiperossificação é o crescimento dos ossos ou a calcificação em excesso dos ossos em relação ao ancestral (Hanken, 1993). Brachycephalus têm três estados em relação ao grau de hiperossificação: hiperossificados (B. ephippium, B. garbeana) parcialmente hiperossificados (B. vertebralis, B. nodoterga, B. pitanga e B. alipioli) e não hiperossificados (B. ferruginus, B. izecksohni, B. pernix, B. pombali, B. brunneus, B. hermogenesi e B. didactylus (Clemente-Carvalho et al., 2009). Essa classificação baseia-se apenas em caracteres morfológicos. Uma novidade evolutiva surgiu nas espécies hiperossificadas de Brachycephalus na forma de uma placa dorsal, localizada sobre as vértebras pré-sacrais e os processos transversos (Figura 2; Hanken, 1993). A evolução das espécies de Brachycephalus ainda não foi datada, portanto, não se sabe quando a placa dorsal surgiu nos hiperossificados e também não há estudos que relatem um possível mecanismo de adaptação através da placa dorsal.
Figura 2. As três condições de hiperossificação em Brachycephalus. Imagens de microscopia
eletrônica de varredura: (A) Condição hiperossificada em B. ephippium; (B) Condição parcialmente hiperossificada em B. pitanga; (C) Condição sem hiperossificação em B. ferruginus. * Placa dorsal, novidade morfológica.
Do ponto de vista geográfico, a maioria das espécies de Brachycephalus ocorre em topos de montanha em altitudes que variam de 600 a 1800m (Alves et al., 2006; Siqueira et al., 2013). A área de ocorrência é a Floresta Atlântica do estado da Bahia até Santa Catarina (Frost, 2017). Dos pontos de vista evolutivo e taxonômico, o gênero Brachycephalus é um grupo de vertebrados pouco conhecido. Atualmente, as sequências de DNA têm se tornado uma ferramenta padrão para resolver relações filogenéticas, complementando os estudos baseados apenas em caracteres fenotípicos (Leliaert et al., 2014). As sequências de DNA não guardam somente instruções essenciais para a vida, mas também guardam registros de sua ancestralidade e descendência (Avise, 2006).
1.2 Relações Filogenéticas
A reconstrução de árvores filogenéticas é fundamental nas áreas de taxonomia e sistemática. Em ambas as áreas, buscam-se padrões e variações de evolução em linhagens monofiléticas. Estudos nesse contexto são realizados em diferentes níveis de complexidade de organização e em diferentes escalas espaciais e temporais.
Clemente-Carvalho et al. (2011) estimaram uma árvore de espécies do gênero Brachycephalus combinando informações de três genes mitocondriais: (1) Citocromo b (CYTB), (2) 12S rRNA (12S) e (3) 16S rRNA (16S), e dois genes nucleares: (1) gene ativador da recombinação 1 (RAG1) e (2) Tirosinase (TYR) em uma amostra de 14 espécies de Brachycephalus, usando uma sequência por espécie.
Essa filogenia molecular resultou em uma tricotomia basal, com as seguintes linhagens: espécies hiperossificadas, B. garbeana e B. ephippium; espécies parcialmente-hiperossificadas, B. alipioi, B. pitanga, B. vertebralis, B. nodoterga, B. toby, B. didactylus e B. hermogenesi; e espécies não-hiperossificadas, B. brunneus, B. izecksohni, B. pombali, B. ferruginus e B. pernix. Todavia, essa filogenia molecular não resolve as relações filogenéticas entre as espécies de Brachycephalus devido aos baixos valores de suporte estatístico (Figura 3).
Figura 3. Árvore de espécies estimada para o gênero Brachycephalus (Clemente-Carvalho et al.,
2011). Cada bifurcação apresenta um número que indica a probabilidade a posteriori. Quanto mais próximo de 1 maior é a probabilidade de que na árvore verdadeira aquela bifurcação tenha ocorrido da forma que está representada. Os quadrados azuis representam relações estimadas com mais de 95% de confiabilidade.
Evidentemente não podemos afirmar se a árvore estimada resulta de um processo de ramificação simultâneo gerando três linhagens ou se os dados obtidos não contêm informação suficiente para estimar o processo de ramificação.
1.3. Estimação de árvore de espécies usando o Modelo Coalescente para Múltiplas Espécies
As sequências de DNA têm sido predominantemente usadas para entendermos a história evolutiva das espécies (Swofford et al., 1996). Utilizam-se informações contidas nas sequências de um loco, gerando uma árvore gênica. A árvore gênica é uma árvore de relações ancestral-descendente de um gene (ou um loco), na qual o mesmo gene é amostrado de um conjunto de indivíduos (Degnan
& Rosenberg, 2009). As árvores de genes estão contidas dentro de uma árvore de espécies. A árvore de espécies é uma árvore de relações ancestral-descendente para um conjunto de populações (Degnan & Rosenberg, 2009). Investigações sistemáticas de espécies que surgiram recentemente são frequentemente mal resolvidas devido a dois tipos de incongruências: (1) entre as árvores de genes e (2) entre árvore de genes e a árvore de espécies (Carstens & Knowles, 2007).
Diversos processos biológicos podem gerar tais incongruências, portanto, seria desejável integrar os possíveis processos biológicos aos modelos matemáticos para descrever a distribuição de probabilidade das árvores de genes geradas pela árvore de espécies (Liu et al., 2015). Os modelos utilizados, nesse contexto, têm a suposição de que cada árvore de gene pode ter uma história evolutiva diferente.
No modelo de Coalescência para Múltiplas Espécies, temos como ponto de partida as espécies contemporâneas e voltamos no tempo, até o ancestral comum mais recente. As incongruências geradas pelos processos biológicos podem surgir devido à transferência horizontal (incluindo hibridação), lineage sorting, duplicação gênica e extinção. Define-se lineage sorting como cópias gênicas que não coalesceram em uma cópia ancestral comum até o evento de especiação mais recente ter ocorrido (Maddison, 1997). A Figura 4 representa a ocorrência de um processo de lineage sorting gerando a discordância entre a árvore de espécies e as árvores de genes.
Figura 4. Processo de lineage sorting (Rannala & Yang, 2008). No eixo Y, temos o tempo do
passado para o presente (de cima para baixo); as letras H (Humanos),C (Chimpanzés) e G (Gorilas) representam espécies contemporâneas. O retângulo cinza HCG representa a população ancestral contendo as três espécies, e o retângulo cinza HC representa a população ancestral HC. De acordo com a árvore de espécies representada pelo contorno preto (externo), temos a espécie H mais relacionada com C, e ambas, compartilham um ancestral comum com G. A árvore de genes representada pela linha de cor azul concorda com essa relação entre as espécies, (G (H, C)). Por outro lado, a árvore de genes, representada pela linha vermelha, nos mostra que a espécie C é mais relacionada com a espécie G e não com H. Essa discordância é chamada de lineage sorting.
Um modelo bastante utilizado para esse contexto é o Modelo Coalescente para Múltiplas Espécies, o qual apresenta uma boa performance, independente do grau de lineage sorting que ocorre na história evolutiva no nível do DNA.
Nesse estudo, utilizamos dados de sequências de DNA de 19 espécies do gênero Brachycephalus para reconstruir a árvore filogenética desse grupo, considerando a árvore estimada por Clemente-Carvalho e colaboradores (2011) como referência. Esperamos que ao adicionar mais espécies e mais indivíduos de cada espécie, as relações filogenéticas tornem-se mais evidentes, assim como se espera que a confiabilidade para cada ramo seja maior conforme aumentamos a quantidade de informações utilizadas para estimar a filogenia.
Nesse estudo, estimamos a filogenia das espécies apesar de termos conhecimento de que muitas das espécies contemporâneas que observamos não tenham registros claros da história evolutiva em seu DNA, ou seja, mesmo analisando molecularmente esse grupo, talvez sua evolução não seja clara devido
às recentes especiações. Assim, este estudo tem o intuito de contribuir com mais dados, melhorar e discutir esta história evolutiva do gênero.
Objetivo Geral
Resolver a tricotomia basal na filogenia de Brachycephalus incorporando novas amostras de espécies para estimar uma árvore de espécies combinando as árvores gênicas de quatro genes.
Objetivos Específicos
A partir da árvore de espécies estimada, esperamos responder às seguintes perguntas:
1. É possível resolver as relações filogenéticas de Brachycephalus aumentando o tamanho da amostra em termos de espécies e número de indivíduos?
2. Espécies hiperossificadas, parcialmente-hiperossificadas e não-hiperossificadas têm ancestrais comuns mais recentes para cada nível de ossificação e espécies hiperossificadas, parcialmente-hiperossificadas seriam mais aparentadas entre elas?
3. Espécies que têm cor marrom, corpo semelhante à rã e que saltam longas distâncias têm um ancestral comum mais recente relativo às demais espécies?
Materiais e Métodos
Amostras biológicas
As seguintes amostras foram avaliadas:
Brachycephalus ephippium (64 amostras): Rio de Janeiro: Floresta da
Tijuca (n = 2); Teresópolis (n = 15). São Paulo: Atibaia (n = 10); Mogi das Cruzes (n = 7); Joaquim Egídio (n = 10); São Francisco Xavier (n = 10). Jundiaí: Serra do Japi (n = 10). Brachycephalus garbeana: Rio de Janeiro: Macaé de Cima (n = 12).
Brachycephalus crispus: São Paulo: Cunha (n = 1). Brachycephalus guarani:
São Paulo: Morro Prumirim (n = 1). Brachycephalus margaritatus: Rio de Janeiro: Petrópolis (n = 4). Brachycephalus pulex: Serra Bonita: Bahia (n = 1).
Brachycephalus n. sp: São Paulo: Paranapiacaba (n = 4).
Isolamento de DNA, amplificação e sequenciamento
O DNA foi extraído seguindo protocolos delineados por (Miyaki et al., 1998) e fragmentos de quatro genes mitocondriais (12S, 16S, CYTB e COI) e um nuclear (RAG1) foram amplificados com os iniciadores utilizados por (Goebel et al., 1999; Clemente-Carvalho et al., 2011). As reações de sequenciamento foram feitas para as fitas leve e pesada, utilizando o Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit − Applied Biosystems. O sequenciamento foi feito pela MACROGEN, Seul, Coréia do Sul.
Nas análises, usamos também sequências de DNA disponibilizadas no National Center for Biotechnology Information (NCBI) das seguintes regiões: CYTB (HQ435703–HQ435717), 12S (HQ435676–HQ435689), 16S (HQ435690– HQ435702), RAG1 (HQ435718–HQ435731), para as espécies B. alipioi, B. garbeana, B. didactylus, B. vertebralis, B. hermogenesi, B. pitanga, B. toby, B. ephippium, B. nodoterga, B. brunneus, B. pernix, B. ferrugius, B. pombali e B. izecksohni.
Edição e alinhamento de sequências
As sequências foram editadas no programa BioEdit (Hall, 1999) e
alinhadas com o programa MAFFT (Katoh et al., 2014). As sequências dos genes mitocondriais 12S, 16S, CYTB e COI foram combinados por pertencerem à região mitocondrial.
Seleção de modelos de substituição de nucleotídeos
O melhor modelo estimado pelo software MEGA 7 (Kumar et al., 2016) para os genes mitocondriais foi o modelo geral reversível no tempo (GTR), no qual seis tipos de substituições de nucleotídeos são permitidos e, para cada nucleotídeo, tem-se uma taxa de substituição. Para o gene nuclear RAG1, o melhor modelo de substituição estimado foi o proposto por Tamura-Nei (1993), que permite três tipos de substituições: (1) transições entre purinas, (2) transições entre pirimidinas e (3) transversões. O critério usado para escolha desses modelos foi o critério de informação Bayesiano (BIC). Esses modelos foram utilizados para a estimativa da árvore de espécies.
Estimação da árvore de espécies
A árvore de espécies foi estimada utilizando-se o método de coalescência para múltiplas espécies implementado no programa BEAST v.2.4.3 (Bouckaert et al., 2014). Esse método incorpora informações das árvores gênicas na estimação da árvore de espécies (Heled & Drummond, 2010). Os parâmetros dos modelos de substituição foram estimados por simulação de Cadeias de Markov de Monte Carlo por 50 milhões de gerações e as estimativas dos parâmetros foram registradas a cada 10.000 gerações. Os resultados obtidos no programa foram examinadas no programa Tracer 1.6 e os resultados foram sumarizados pelo software TreeAnnotator 1.7 (Drummond et al., 2012).
Rede de haplótipos
Com o intuito de verificar a existência de estrutura genética em B. ephippium, usamos os genes mitocondriais dos indivíduos de cada região geográfica para reconstruir a rede de haplótipos - com exceção das amostras de Joaquim Egídio para o gene 16S - pois não obtivemos sequências para esse gene. Usamos o programa PopArt (Leigh, 2015) baseado no método TCS. Também foram calculados a estatística D de Tajima, o número de sítios segregantes e as quantidades de variação dentro e entre as populações.
Demografia histórica
Usamos o método Bayesian Skyline Plot (BSP) implementado pelo software BEAST 2.4.3 (Bouckaert et al., 2014) para estimar a demografia histórica de B. ephippium. Os genes mitocondriais foram concatenados e o melhor modelo de substituição estimado pelo MEGA 7 (Kumar et al., 2016), foi o GTR, usando o critério BIC. O modelo de relógio molecular lognormal relaxado foi aplicado, com a taxa de substituição de 0,0034 por sítio, pelo período de um milhão de anos. Não tivemos acesso a nenhum fóssil para calibração e, por isso, informações de evidências geológicas de trabalhos anteriores foram utilizadas (Heinicke et al., 2007). As simulações de Cadeia de Markov de Monte Carlo foram realizadas em dez milhões de gerações, com descarte de 10%. O programa Tracer 1.6 (Rambaut et al., 2014) foi utilizado para análise demográfica. O parâmetro de tamanho efetivo da amostra é usado para verificar a confiabilidade da análise. Um valor baixo de tamanho efetivo da amostra significa que a análise contém muitas amostras correlacionadas e por isso pode não representar bem a distribuição a posteriori. Portanto usamos um valor de tamanho efetivo de amostras maior que 200.
Resultados
Relações filogenéticas em Brachycephalus
O alinhamento usado para gerar a árvore de espécies contém 836 bp do gene 12S, 1223 bp do 16S, 836 bp do CYTB, 993 bp do COI e 836 bp do RAG1, totalizando 4724 nucleotídeos. Os valores apresentados em cada nó na topologia são as probabilidades a posteriori, sugerindo que essa é a topologia que melhor representa as relações entre as espécies.
A maioria das relações filogenéticas entre as espécies de Brachycephalus foi resolvida na árvore de espécies (Figura 5). Em uma linhagem, B. pulex, uma flea toad, divergiu primeiro com valor de suporte 0,604. A espécie B. hermogenesi, também uma flea toad, é o grupo-irmão das espécies não-hiperossificadas (B.pernix, B. ferruginus, B. pombali, B. izecksohni (flea toad), e B. brunneus) com valor de suporte 0,996. As espécies não-hiperossificadas compartilham um ancestral comum com valor de suporte 1 e as relações entre essas espécies são corroboradas por valores de suporte > 0,95.
Figura 5. Árvore de espécies estimada para Brachycephalus. Cada bifurcação possui um número
que representa a probabilidade a posteriori. Os quadrados azuis indicam a probabilidade a posteriori maior que 95%. Quanto mais próximo de 1, maior é a probabilidade que na árvore verdadeira aquela bifurcação tenha ocorrido da forma como está representada.
Na outra linhagem, B. didactylus, uma flea toad, é o grupo-irmão das espécies hiperossificadas, B. ephippium, B. garbeana, B. margaritatus e B. n.sp, e das espécies parcialmente hiperossificadas (B. alipioi, B. crispus, B. guarani, B. nodoterga, B. pitanga, B. toby e B. vertebralis) com valor de suporte 0,995. As espécies hiperossificadas e parcialmente hiperossificadas compartilham um ancestral comum com valor de suporte 0,994. As relações filogenéticas entre as espécies parcialmente hiperossificadas são bem resolvidas com valores de suporte altos (> 0,95), exceto pela relação entre B. crispus e B. pitanga, cujo valor de suporte é 0,551. As relações entre as espécies hiperossificadas também são bem resolvidas com valores de suporte altos (> 0,989), exceto pela relação entre B. ephippium e B. margaritatus que tem valor de suporte 0,479.
Na árvore de espécies estimada somente para o grupo dos hiperossificados (Figura 6), aumentamos o número de sequências utilizadas para cada espécie. Em relação à árvore de espécies da Figura 5, tivemos um aumento do valor de suporte de 0,48 para 1 entre B. ephippium e B. margaritatus. A relação da linhagem formada por essas duas espécies com a espécie nova teve uma redução no valor de suporte de 1 para 0,96. A relação dessa última linhagem com a espécie B. garbeana se manteve com valor de suporte 1.
Figura 6. Árvore de espécies dos Brachycephalus hiperossificados. A árvore possui seis populações
de B. ephippium, uma população de B. margaritatus, duas populações de Brachycephalus espécie nova e uma população de B. garbeana.
Redes de haplótipos
As redes de haplótipos geradas a partir dos genes mitocondriais resultaram em 4 redes, uma para cada gene. Cada um dos círculos representa um haplótipo diferente e os tamanhos dos círculos variam de acordo com o número de indivíduos que possui esse haplótipo. Os círculos estão ligados uns aos outros por linhas. Cada linha indica que os círculos ligados possuem um nucleotídeo diferente entre eles. Nos casos em que há mais de um nucleotídeo diferente, traços menores foram colocados adjacentes às linhas que ligam os círculos, indicando mais um nucleotídeo diferente por traço adjacente. Nessas representações de haplótipos, o comprimento das linhas não tem relação com a distância genética entre as populações.
B. ephippium (Atibaia – SP) B. ephippium (Serra do Japi – SP)
B. ephippium (Mogi das Cruzes – SP)
B. ephippium (Atibaia - SP;
Mogi das Cruzes - SP)
B. ephippium (Joaquim Egídio – SP)
B. ephippium (São Franscisco Xavier - SP) B. ephippium (Floresta da Tijuca – SP) B. margaritatus (Petrópolis – RJ) B. espécie nova (Paranapiacaba - SP) B. espécie nova (Teresópolis – RJ)
Tabela 3: Número de indivíduos utilizados por região geográfica para cada um dos genes.
12S 16S CYTB COI
Regiões
Atibaia (AT) 10 10 10 9
São Francisco Xavier (SF) 9 9 9 9
Joaquim Egídio (JE) 10 0 10 10
Mogi das Cruzes (MG) 7 7 7 7
Serra do Japi (SJ) 10 10 10 10
Total 46 36 46 4
Foram identificados 22 haplótipos para as amostras analisadas. Para cada uma das quatro regiões genômicas, temos um haplótipo ancestral, no qual, a partir dele se originam haplótipos descendentes. O número de indivíduos utilizados está na Tabela 3.
Na rede de haplótipos do gene 12S, observamos cinco haplótipos diferentes (Figura 7). O haplótipo ancestral possui aproximadamente a mesma quantidade de indivíduos de cada região. Observa-se, de maneira decrescente em número de indivíduos, um haplótipo na população de Joaquim Egídio (JE) com nove indivíduos, um haplótipo na população de Atibaia (AT) com oito indivíduos e dois haplótipos distintos para a população de São Franscisco Xavier (SF) com um indivíduo cada. A variação dentro das populações é maior que a variação entre as populações, como mostra a AMOVA (Tabela 4). O resultado para o Teste D de Tajima foi negativo (Tabela 8), e há uma baixa freqüência de sítios segregantes
Figura 7. Rede de haplótipos do gene 12S. Apresenta cinco haplótipos diferentes sendo duas de São
Francisco Xavier (SF), uma de Atibaia (AT), uma de Joaquim Egídio (JE) e o haplótipo ancestral (círculo maior), contendo todos os haplótipos.
Tabela 4: Medidas de variação entre e dentro das populações do gene 12S.
Variação Graus de
liberdade
Soma dos
quadrados Sigma^2 Variação (%)
Entre populações 4 3.481 0.056 19.57 Dentro das populações 41 9.389 0.229 80.42
Total 45 12.870 0.285
Em seguida, na rede de haplótipos do gene 16S temos quatro haplótipos diferentes (Figura 8). O haplótipo ancestral com três populações aproximadamente na mesma freqüência de indivíduos, um haplótipo de dez indivíduos para São Franscisco Xavier (SF) e dois haplótipos diferentes para a região de Serra do Japi (SJ) com apenas um indivíduo cada. A variação é maior entre as populações do que dentro das populações (Tabela 5). O Teste D de Tajima foi negativo (Tabela 8) e também apresenta baixa freqüência de sítios segregantes.
Figura 8. Rede de haplótipos do gene 16S. Apresenta quatro haplótipos diferentes sendo duas da
Serra do Japi (SJ), uma de São Francisco Xavier (SF) e o haplótipo ancestral (círculo maior) contendo os haplótipos de Atibaia (AT), Serra do Japi (SJ) e Mogi das Cruzes (MG).
Tabela 5: Medidas de variação entre e dentro das populações do gene 16S.
Variação Graus de
liberdade
Soma dos
quadrados Sigma^2 Variação (%)
Entre populações 3 30.072 0.823 84.30 Dentro das populações 32 4.900 0.153 15.69
Total 35 34.972 0.976
A rede de haplótipos para o gene CYTB apresenta seis haplótipos diferentes (Figura 9). Um haplótipo ancestral com quatro das cinco populações, ficando de fora apenas a região de São Franscisco Xavier (SF). As populações com esse haplótipo estão em freqüência aproximadamente igual. A partir dele origina-se um haplótipo para a região de Atibaia (AT) com apenas um indivíduo. A partir do haplótiplo ancestral também é formada uma estrutura com quatro haplótipos para a região de São Franscisco Xavier (SF), um dos haplótipos contem dez indivíduos, e outros três haplótipos contem um indivíduo cada. A AMOVA (Tabela 6) mostra que a variação é maior entre as populações do que dentro delas. O Teste D de Tajima,
diferente dos demais é positivo (Tabela 8), porém a freqüência de sítios segregantes é baixa.
Figura 9. Rede de haplótipos do gene CYTB. Apresenta seis haplótipos diferentes sendo quatro de
São Francisco Xavier (SF), um de Atibaia (AT) e o haplótipo ancestral (círculo maior), contendo haplótipos de Atibaia (AT), Serra do Japi (SJ), Mogi das Cruzes (MG) e Joaquim Egídio (JE).
Tabela 6: Medidas de variação entre e dentro das populações do gene CYTB.
Variação Graus de
liberdade
Soma dos
quadrados Sigma^2 Variação (%)
Entre populações 4 29.957 0.572 78.42 Dentro das populações 41 6.456 0.157 21.57
Total 45 33.413 0.730
Por fim, o último gene mitocondrial, COI, apresenta sete haplótipos distintos (Figura 10). Pode-se observar um haplótipo ancestral com quatro das cinco regiões, em freqüência aproximadamente igual entre eles. Além disso, dois haplótipos diferentes para a região de Serra do Japi (SJ) com um indivíduo cada, um haplótipo para a região de São Franscisco Xavier (SF) com um indivíduo, um
haplótipo para a região de Mogi das Cruzes (MG) com um indivíduo e dois haplótipos para a região de Joaquim Egídio (JE) que está relacionada ao haplótipo de Mogi das Cruzes (MG). A variação entre populações é maior que a variação dentro das populações como mostra a AMOVA (Tabela 7). O Teste D de Tajima foi negativo (Tabela 8) e a frequência de sítios segregantes é baixo.
Figura 10. Rede de haplótipos do gene COI. Apresenta sete haplótipos diferentes sendo dois de
Serra do Japi (SJ), dois de Joaquim Egídio (JE), um de São Francisco Xavier (SF), um de Mogi das Cruzes (MG) e o haplótipo ancestral (círculo maior), contendo os haplótipos de Atibaia (AT), Serra do Japi (SJ), São Francisco Xavier (SF) e Mogi das Cruzes (MG).
Tabela 7: Medidas de variação entre e dentro das populações do gene COI.
Variação Graus de
liberdade
Soma dos
quadrados Sigma^2 Variação (%)
Entre populações 4 18.865 0.401 66.04 Dentro das populações 40 8.246 0.206 33.95
Tabela 8: Teste D de Tajima realizado para os genes mitocondriais. Valores negativos para o Teste D de Tajima e baixos valores de sítios segregantes indicam flutuação populacional.
12S 16S CYTB COI
Teste D de Tajima -1.926 -1.069 1.02x10-9 -1.554
P 0.984 0.850 0 0.947
Sítios segregantes 5 5 5 0
Demografia histórica
A análise no Bayesian Skyline Plot, baseada no conjunto de genes mitocondriais, identificou um crescimento populacional que já estava ocorrendo e recentemente se estabilizou (Figura 11).
Figura 11. Demografia histórica de Brachycephalus ephippium estimado no Bayesian Skyline Plot
Discussão
O gênero Brachycephalus tem sido bastante estudado nos últimos anos, com muitas espécies novas sendo descritas (Ribeiro et al., 2015; Guimarães et al., 2017). Porém, o grupo ainda é pouco conhecido em relação à sua história natural. Das 32 espécies descritas atualmente, poucos estudos abordam aspectos como toxicidade, ecologia, dieta e comportamento que abrangem apenas as espécies B. ephippium, B. didactylus, B. brunneus e B. garbeana, respectivamente (Sebben et al., 1986, Almeida-Santos et al., 2011, Fontoura et al., 2011, Dorigo et al., 2012). Esses aspectos são de fundamental importância para complementar os estudos feitos no nível molecular, nos dando embasamento para gerar hipóteses sobre a evolução do gênero. A filogenia conhecida, portanto, é baseada apenas em análises moleculares.
Árvore de espécies
A árvore de espécies estimada nesse estudo resolveu a tricotomia, mostrando que as três linhagens se originaram em momentos diferentes, sendo que a linhagem mais ancestral é a dos não hiperossificados, seguida dos parcialmente hiperossificados e por último, a linhagem dos hiperossificados. As relações entre as espécies contemporâneas apresentam baixa resolução devido à própria natureza do processo, pois são espécies que divergiram recentemente. Todas as espécies, incluindo aquelas que não constavam no estudo de Clemente-Carvalho et al., (2011) estão posicionadas em linhagens que estão de acordo com sua morfologia, exceto B. didactylus, que apesar de ser morfologicamente classificado como não hiperossificado, está na linhagem dos parcialmente hiperossificados. Uma das nossas hipóteses era que as espécies com padrões de ossificação semelhantes compartilhassem um ancestral comum. Porém, com B. didactylus posicionado em outra linhagem que não corresponde à sua classificação morfológica, não se pode afirmar que essa hipótese seja verdadeira. A associação entre a árvore de espécies e o grau de ossificação foi destacada na Figura 12.
Figura 12. A árvore de espécies estimada apresenta concordância com o grau de ossificação das
espécies, com exceção ao B. didactylus. A linha de cor roxa destaca os hiperossificados, a linha de cor amarela destaca os parcialmente hiperossificados e a linha de cor vermelha destaca os não hiperossificados.
Outra hipótese era que as espécies que saltam (flea toads) e têm coloração marrom (B. didactylus, B. hermogenesi e B. pulex), tivessem um ancestral comum Devido às suas características morfológicas, fisiológicas e dado que a árvore de espécies encontrada na literatura mostra que B. hermogenesi e B. didactylus compartilhando um ancestral comum (Clemente-Carvalho et al., 2011). No entanto, ao estimarmos a nova árvore de espécies, nota-se que elas se separam. Isso pode ser um indício de que as características que nos fizeram gerar essa hipótese provavelmente não são as responsáveis por unir essas espécies em um único ancestral comum (Figura 13).
Figura 13. As espécies de Brachycephalus que são flea toads, B. didactylus, B. hermogenesi e B. pulex são destacados com a cor vermelha. Estas espécies não possuem um ancestral comum,
apesar de apresentarem morfologia e fisiologia semelhantes.
Em relação à árvore de espécies estimada apenas para os hiperossificados, ao adicionarmos mais indivíduos mantivemos altos níveis de suporte para as relações entre as quatro espécies apesar de alguns níveis de suporte terem diminuído. Isso ocorre devido à maior quantidade de informações que adicionamos à árvore de espécies, resultando em uma alta resolução das relações entre as espécies. Observa-se também que todos os indivíduos descritos como B. ephippium estão mais relacionados entre si, apesar de serem de localidades distintas. Na literatura, o primeiro indivíduo descrito como B. ephippium pertencia à região da Floresta da Tijuca (Cochran, 1995). A linhagem mais relacionada com B. ephippium é a linhagem de B. margaritatus, na qual todos os indivíduos estão fortemente relacionados entre si.
A espécie nova apresenta duas posições diferentes na árvore de espécies, sendo os indivíduos de Paranapiacaba (SP) mais relacionados à linhagem de B. margaritatus do que aos indivíduos de Teresópolis (RJ). Esse resultado não era esperado devido à localidade das populações amostradas. A população de Teresópolis (RJ) está geograficamente mais próxima da espécie B. margaritatus em Petrópolis (RJ) do que à população de Paranapiacaba (SP). Já a linhagem mais ancestral entre os hiperossificados é B. garbeana em que todos os indivíduos
mostram forte relação filogenética entre si e estão geograficamente mais distantes dos demais hiperossificados.
Por serem espécies recentes, aceitamos a hipótese de que as relações filogenéticas não sejam claras devido ao processo de lineage sorting – falha das linhagens em coalescer - que acaba gerando incongruência entre as árvores de genes e entre as árvores de genes e a árvore de espécies.
Rede de haplótipos
Uma árvore de genes é o pedigree de um conjunto de genes e existe independentemente de potenciais mutações. A única região da árvore de genes que pode ser estimada com dados moleculares é a região marcada por potenciais eventos de mutação que definem alelos diferentes ou haplótipos diferentes (Posada & Crandall, 2001). Redes de haplótipos são estimadas para se obter uma melhor resolução entre indivíduos proximamente relacionados, como indivíduos que pertencem a uma mesma população, por exemplo.
A diversidade genética e a distribuição (dentro e entre) populações são determinadas principalmente pelo tamanho efetivo da população e pelo fluxo gênico entre elas (Blouin et al., 1992). Dos quatro genes de B. ephippium, três deles apresentaram maior variação genética entre populações, o que era esperado devido ao isolamento geográfico em cada uma das populações amostradas. Se as populações estão separadas geograficamente e encontram-se nos topos dos morros de cada região, é improvável que ocorra fluxo gênico entre elas. Isso explicaria a maior variação genética entre populações em relação à variação genética dentro das populações.
Nota-se também que a população de São Franscisco Xavier é aquela que apresenta maior número de haplótipos diferentes nos genes 12S, 16S e CYTB. Essa relação é corroborada pela árvore de espécies dos hiperossificados na qual os exemplares de B. ephippium de São Franscisco Xavier são os mais distantes filogeneticamente das demais populações de B. ephippium. Em todas as redes de haplótipos dos genes, observamos que os haplótipos ancestrais não possuem
derivações em abundância, indicando que as populações foram formadas recentemente.
Demografia Histórica
Os B. ephippium tiveram um aumento populacional recente e que atualmente se mantêm estável. O Teste D de Tajima corrobora essa afirmação, dado que três dos quatro genes foram negativos para o teste e apresentam baixos números de sítios segregantes – fatores que indicam uma flutuação no tamanho populacional (Zhang et al., 2017).
Considerações finais
O gênero Brachycephalus apresenta espécies com características peculiares, como a miniaturização, assim como uma grande diversidade morfológica. Trata-se de um grupo para o qual ainda são escassos os estudos que esclarecem os processos que atuam na diversificação das espécies.
Nesse estudo, apresentamos uma hipótese filogenética para o grupo. A maioria das relações foi resolvida com a adição de novas espécies, descritas nos últimos anos, assim como a adição de mais indivíduos de cada espécie. Algumas questões ainda não foram resolvidas, como o fato das espécies de Brachycephalus de coloração marrom e que saltam não apresentarem um ancestral comum. E o fato de que nem todas as espécies na filogenia se agrupam de acordo com seu grau de ossificação.
Em estudos futuros, seria interessante obtermos mais informações sobre a história natural do gênero para relacionarmos essas características à filogenia molecular. Dessa forma, teríamos mais informações para embasar hipóteses filogenéticas e verificar se, de fato, elas fazem sentido ou se são apenas resultado de uma amostragem que não é grande o suficiente. Mesmo com o avanço das filogenias moleculares, estudos morfológicos são fundamentais para uma melhor descrição e fundamentação dos estudos em qualquer nível de complexidade de organização.
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ANEXOS
COORDENADORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO INSTITUTO DE BIOLOGIA
Universidade Estadual de Campinas
Caixa Postal 6109. 13083-970, Campinas, SP, Brasil Fone (19) 3521-6378. email: cpgib@unicamp.br
DECLARAÇÃO
Em observância ao §5º do Artigo 1º da Informação CCPG-UNICAMP/001/15, referente a Bioética e Biossegurança, declaro que o conteúdo de minha Dissertação de Mestrado, intitulada “Filogenia molecular de Brachycephalus”, desenvolvida no Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal do Instituto de Biologia da Unicamp, não versa sobre pesquisa envolvendo seres humanos, animais ou temas afetos a Biossegurança.
Declaração
As cópias de artigos de minha autoria ou de minha coautoria, já publicados ou submetidos para publicação em revistas científicas ou anais de congressos sujeitos a arbitragem, que constam da minha Dissertação/Tese de Mestrado/Doutorado, intitulada Filogenia molecular de Brachycephalus, não infringem os dispositivos da Lei n.° 9.610/98, nem o direito autoral de qualquer editora.
Campinas, 07 de Novembro de 2017.
