Desenvolvimento de métodos analíticos utilizando espectroscopia Raman intensificada pela superfície e quimiometria

Texto

(1)UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Instituto de Química. CARLOS DIEGO LIMA DE ALBUQUERQUE. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS UTILIZANDO ESPECTROSCOPIA RAMAN INTENSIFICADA PELA SUPERFÍCIE E QUIMIOMETRIA. CAMPINAS 2016.

(2) CARLOS DIEGO LIMA DE ALBUQUERQUE. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS UTILIZANDO ESPECTROSCOPIA RAMAN INTENSIFICADA PELA SUPERFÍCIE E QUIMIOMETRIA. Tese. apresentada. ao. Instituo. de. Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Ciências.. Orientador: Ronei Jesus Poppi. ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO CARLOS DIEGO LIMA DE ALBUQUERQUE, E ORIENTADA PELO PROF.DR. RONEI JESUS POPPI.. CAMPINAS 2016.

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(5) DEDICATÓRIA. Aos meus pais, Célia Regina e José Carlos, principalmente a minha mãe guerreira que sempre me instruiu a estudar. Amo vocês.. Ao meu irmão e minha avó Maria (in memorian) pelo carinho e amor que sempre me deram..

(6) AGRADECIMENTOS Primeiramente gostaria de agradecer a Deus e a Nossa Senhora Aparecida por terem me guiado o meu caminho até este momento ímpar. Ao meu orientador Ronei J. Poppi, o qual agradeço pela confiança, pelos ensinamentos: específicos e de vida; que sempre tão solicito e preocupado com a formação e durante o desenvolvimento deste trabalho. Orgulho-me muito por ter participado do seu grupo de pesquisa. Ao professor Alexandre B. Brolo, por ter me recebido muito bem no seu grupo de pesquisa na University of Victoria – CA, na qual pude ter uma das experiências mais marcantes de vida, cultural e também academicamente. Ao professor Márcio P. Pedroso, por ser um dos grandes responsáveis pela minha vinda para a Unicamp. Aos meus amigos e colegas do LAQQA: Paulo R. Filgueras, Guilherme L. Alexandrino, Marina, Humberto, Felipe, Javier, Monica, Guto, Carlos Texeira, Luciana Oliveira, Thiago, Luciana Terra e Mariana; pelo agradável convívio e discussões proveitosas. Aos amigos da University of Victoria: Leo Furini, Fernando, Muyang (Mike), Regie, Nick, JiaYi He, Alex, Mahdieh, Sabrina, Koh Yiin; pelo agradável convívio e discussões proveitosas. Aos meus amigos do futebol da Química e da academia: Rodrigão, P2, Dênio e outros; pela agradável convívio e ajuda para sair da rotina nos momentos difíceis. Ao Instituto de Química e a Unicamp por fornecerem toda a estrutura e pessoal para ser possível o desenvolvimento deste trabalho. Ao CNPq (processo no140706/2013-5), a Funcamp (processo no5028) e o programa Ciência sem Fronteiras (processo no10880/14-3) pelo apoio financeiro..

(7) RESUMO A espectroscopia Raman apresenta diversas vantagens analíticas práticas: mínimo preparo de amostra, ser não destrutiva e permitir trabalhar em soluções aquosas; porém, a falta de sensibilidade é um fator limitante desta técnica. Por outro lado, a espectroscopia Raman intensificada pela superfície (SERS) contorna este problema, permitindo alcançar baixos limites de detecção, até no regime de uma única molécula (single-molecule), e com as mesmas vantagens práticas da técnica Raman. Desde a descoberta de SERS até os dias atuais aconteceram importantes avanços no desenvolvimento de novas nanopartículas para o aumento da intensificação do sinal incluindo o desenvolvimento de novos substratos com alto padrão de reprodutibilidade. Sendo assim, esta tese de doutorado visou demonstrar e avaliar a técnica SERS para diferentes aplicações no âmbito da química analítica com o suporte de robustos métodos de calibração e resolução multivariadas. Na primeira aplicação, a quantificação de dois hormônios, 17β-estradiol e noradrenalina, em soro de cães foi proposta empregando calibração multivariada pelo método probabilístico floresta randômica. Na segunda aplicação, a identificação in situ do agrotóxico, malation, em cascas de frutas foi realizada utilizando diferentes métodos de resolução multivariada de curvas. Na terceira aplicação, um novo método foi desenvolvido para a calibração multi-produto de melamina em duas diferentes matrizes de leite. A quarta aplicação, consistiu no desenvolvimento de um método para solucionar o desafio na quantificação SERS em soluções extremamente diluídas, na qual foi determinado um contaminante emergente em água: o enrofloxacin..

(8) ABSTRACT Raman spectroscopy has several practical analytical advantages: minimal sample preparation, non-destructivity and it allows working with aqueous solutions; however, the lack of sensitivity is a limiting factor from this technique. On the other hand, surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) solves this problem, allowing to reach low limits of detection, single-molecule, and with the same practical advantages of Raman spectroscopy. Since SERS was discovery until nowadays several advances had been occurred in the development of new nanoparticles for improving the signal enhance and new substrate with high reproducibility pattern. So, this thesis was focused to show and to evaluate the SERS technique for different applications in analytical chemistry scope with the support of the robust methods of multivariate calibration and resolution. In the first study, the quantification of two hormones, 17β-estradiol and noradrenaline in dog serum was performed by multivariate calibration using the probabilistic method: random forest. In the second study, the in situ identification of pesticide: malathion; in fruit peels was done using different multivariate curve resolution methods. In the third study, a new method was developed for multiproduct calibration of melamine in two different milks matrices. In the fourth study, the development of method/algorithm for solving the challenge in the SERS quantification in ultra-low diluted solutions, emergent contaminant (enrofloxacin), was carried out..

(9) LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 2.1. (A) Esquema dos espalhamentos elásticos (Stokes e Anti-Stokes) e inelásticos (Rayleigh) (Modificado de Sasic & Ozaki [14]) (B) esquema dos mecanismos quânticos de espalhamento e absorção........................................................ 26 Figura 2.2. Esquema ilustrando a geração de ressonância de plasmons de superfície localizada (LSPR) sobre as nanopartículas de ouro. ......................................................... 30 Figura 2.3. Formação dos “hotspots” (A) imagens de TEM de AuNPs; (B) Aumento do campo elétrico local devido ao acoplamento entre os campos elétricos de duas nanopartículas esféricas (Adaptado de [20]). ...................................................................... 31 Figura 2.4. Superfície recoberta com AuNPs em (A) alta concentração do analito: SERS average, (B) baixíssima concentração do analito: SM-SERS; Histograma de frequência para (C) SERS average e (D) SM-SERS. Em roxo as AuNPs imobilizadas sobre uma superfície de vidro, em amarelo os “hotspots”, em vermelho o analito e a linha vermelha é valor médio das intensidades................................................................... 33 Figura 2.5. Representação esquemática do experimento do bianalito para o SM-SERS. (A) evento nulo; (B) molécula verde, (C) molécula azul e (D) ambas as moléculas no “hotspot”. .................................................................................................................................... 34 Figura 3.1. Esquema de equipamento Raman moderno com notch filters e um detector CCD. ........................................................................................................................................... 36 Figura 3.2. Esquema representando um sistema com monocromador tipo echelle contido no espectrômetro PerkinElmer Raman Station (400F) utilizado nesta tese (aplicações 1 a 3). .................................................................................................................... 37 Figura 3.3. Espectrômetro Raman para obtenção de imagem hiperespectral. .............. 38 Figura 3.4. Esquema de aquisição de espectros Raman pontuais em: (A) alta concentrações; (B) baixas concentrações; e (C) mapeamento pontual. ......................... 39 Figura 3.5. Esquema de um microscópio Raman confocal baseado no equipamento Raman inVia da Renishaw. (A) acoplamento espectrômetro microscópio; (B) Esquema óptico do microscópio. ............................................................................................................. 39 Figura 4.1. Representação da organização dos dados na forma de uma matriz de respostas ( X ) e um vetor de concentrações ( y ) para o desenvolvimento de um modelo matemático multivariado num procedimento de calibração. ............................................. 43 Figura 4.2. Representação dos dados partindo do modelo univariado ao multivariado com suas respectivas vantagens em relação a manipulação de interferentes baseado no ponto de vista da química analítica. ................................................................................. 44 Figura 4.3. Correção da linha base pelo AsLS (A) antes e (B) depois da correção. ..... 46 Figura 4.4. Representação hipotética de um fluxograma baseado em árvores. IMC – índice de massa corpórea. ...................................................................................................... 49 Figura 4.5. Esquema hipotético exemplificando um procedimento de classificação utilizando árvores de decisão pelo método classificação e regressão de árvores (CART). (A) etapa de treinamento e (B) etapa de classificação. ...................................... 51 Figura 4.6. Esquema mostrando o procedimento de reamostragem bagging (bootstrap aggregation) utilizado em floresta randômica. ..................................................................... 54 Figura 4.7. Esquema hipotético exemplificando um procedimento de regressão utilizando árvores de decisão pelo método classificação e regressão de árvores (CART). ...................................................................................................................................... 55.

(10) Figura 5.1. Solução coloidal de nanopartículas de ouro (AuNPs) sintetizadas pelo método clássico de Lee-Meisel [57]. (A) solução coloidal; (B) AuNPs após o procedimento de concentração; (C) Espectro de extinção das AuNPs antes do procedimento de concentração; (D) imagens de TEM das AuNPs antes do procedimento de concentração (tamanho médio aproximado de 62 nm). ...................... 63 Figura 5.2. (A) Substrato de vidro funcionalizada com APTMS e recoberto com AuNPs; (B) suporte em alumínio utilizado para as medidas. Imagens de AFM (C) em 2 dimensões e (D) 3 dimensões................................................................................................ 64 Figura 6.1. Esquema resumido das etapas da metodologia de análise desenvolvida para a quantificação dos hormônios nos soros de cães. ................................................... 70 Figura 6.2. Espectros de extinção da solução coloidal de ouro. A linha na vertical em verde indica a linha do laser utilizado (785 nm). ................................................................. 71 Figura 6.3. Pré-processamento do espectros descrito em etapas. AsLS: do inglês asymmetric least squares. ...................................................................................................... 72 Figura 6.4. Resultados para o erro relativo percentual calculado para a calibração/validação para (A) estradiol e (B) noradrenalina.............................................. 74 Figura 6.5. Resíduos dos modelos de calibração para (A) estradiol e (B) noradrenalina. Teste de permutação aplicado para (C) estradiol e (D) noradrenalina. Linha em verde na vertical é o valor de b2 calculado antes da permutação. Número de permutações igual 50.000 e os polinômios ajustados foram o de 2º grau. ............................................. 75 Figura 6.6. Estimativa das importâncias das variáveis para o modelo RF (A) 17βestradiol (E2) e (B) noradrenalina (NE). ............................................................................... 77 Figura 7.1. Esquema do procedimento utilizado para a detecção dos resíduos de pesticidas. .................................................................................................................................. 83 Figura 7.2. Esquema do tratamento de dados realizado para obtenção das imagens químicas e espectros puros. ................................................................................................... 84 Figura 7.3. Espectros SERS pontuais; (a) Espectros SERS do malation em todas as condições de trabalho; (b) Espectros SERS para o tomate e para o malation nas concentrações de 12,3 mg L-1. (c) Espetros SERS para a ameixa e para o malation nas concentrações de 12,3 mg L-1. ............................................................................................... 85 Figura 7.4. (a) todos os espectros do mapeamento do tomate pré-processados por normalização e AsLS; (b) comparação entre o desvio padrão e média do espectro SERS; (c) matriz de covariância do erro (ECv); (d) matriz de correlação do erro (ECr) para os canais entre 1768-892 cm-1. ..................................................................................... 87 Figura 7.5. (a) Todo os espectros do mapeamento da ameixa pré-processados por AsLS; (b) comparação entre o desvio padrão e a média do espectro SERS (c) matriz de covariância do erro (ECv) e (d) matriz de correlação do erro (ECr) para os canais na faixa entre 1712-696 cm-1. ................................................................................................. 88 Figura 7.6. Comparação dos espectros recuperados do tomate e do malation recuperado pelos métodos NMF-ALS e MCR-ALS. ........................................................... 90 Figura 7.7. Resultados do NMF-ALS para o tomate; (a) recuperação do NMF-ALS para os espectros do tomate e da ameixa; (b) mapeamento para o tomate (c) mapeamento para o malation (12,30 a 0,12 mg L-1). .................................................................................. 91 Figura 7.8. Resultados do MCR-WALS para a ameixa; (a) recuperação do MCR-WALS para os espectros de fluorescência, ameixa e malation; (b) mapeamento para a fluorescência; (c) mapeamento para a ameixa (d) mapeamento para o malation (12.3 a 0.123 mg L-1). ............................................................................................................................ 92.

(11) Figura 7.9. (A) Escores médios do NMF-ALS versus concentração esperada na casca para o tomate e (B) Escores médios do MCR-WALS versus concentração esperada na casca para a ameixa. ............................................................................................................... 93 Figura 8.1. Esquema ilustrando o NMF-ALS com restrição de correlação múltipla. ..... 99 Figura 8.2. Esquema ilustrando o procedimento experimental realizado para o desenvolvimento dos modelos de calibração de melamina nos diferentes produtos. 102 Figura 8.3. Espectros SERS dos conjuntos de calibração e validação para os diferentes produtos antes (A) e depois (B) da correção da linha base pelo algoritmo quadrados mínimos assimétricos (AsLS). .......................................................................... 102 Figura 8.4. Curva de calibração dos escores do NMF sem restrição de correlação múltipla versus concentração nominal para ambos os produtos. ................................... 103 Figura 8.5. Perfis espectrais recuperados pelo método NMF com restrição de correlação múltipla para ambos os produtos contaminados com melamina. ............... 104 Figura 8.6. Concentração prevista pelo NMF-ALS com correlação múltipla versus concentração nominal para ambos os produtos................................................................ 105 Figura 9.1. Esquema do procedimento de decomposição dos dados por NMF-ALS para as imagens hiperespectrais e a etapa de digitalização dos escores para o desenvolvimento da curva de calibração digital. ............................................................... 112 Figura 9.2. Esquema resumido do procedimento experimental realizado para a aquisição dos dados de imagem hiperespectral. .............................................................. 114 Figura 9.3. Resultados PCA para os dados de enrofloxacin. (A) loadings com os 4 fatores mais importantes; (B) Histograma de frequência para as diferentes concentrações de enrofloxacin. A linha vermelha representa o valor médio das intensidades calculados pelos escores............................................................................... 116 Figura 9.4. Curva de calibração para os valores em (A) SERS average e (B) SMSERS; Histograma mostrando a concentração de 200 ppm (SERS average versus o (D) SM-SERS. ......................................................................................................................... 118 Figura 9.5. Resultados obtidos após o procedimento de calibração SERS digital: (A) Mapas de concentrações digitalizados (B) Curva de calibração SERS digital; (C) Comparação dos espectros médios calculados para o valor digital “0” e valor digital “1”. ................................................................................................................................................... 119 Figura 9.6. Prova do conceito do SM-SERS. (A) Representação dos espectros recuperados pelo NMF-ALS para o ciprofloxacin (CIPRO) e seu isótopo (CIPRO-ISO); (B) Mapa digital dos resultados para CIPRO (azul) e CIPRO-ISO (vermelho). Os círculos em verde representam quando as duas moléculas estavam presentes nos “hotspots”. ................................................................................................................................ 120.

(12) LISTA DE TABELAS Tabela 6.1. “Performance” dos modelos RF para a quantificação dos hormônios em soro de cães. ............................................................................................................................. 73 Tabela 7.1. Resultados dos modelos de resolução de curvas.......................................... 89 Tabela 8.1. Comparação entre os modelos NMF-ALS com restrição de CL e o PLSR. ................................................................................................................................................... 106 Tabela 8.2. Figuras de mérito para os dados de validação utilizando a calibração pseudo-univariada calculada a partir do modelo NMF-ALS com restrição de correção múltipla. .................................................................................................................................... 107 Tabela 8.3. Figuras de mérito adicionais para o modelo NMF-ALS com restrição de correlação múltipla. ................................................................................................................ 108.

(13) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. (Fast Combinatorial NNLS, FCNNLS), 57 (LOF, Lack of fit), 60 (NMF, non-negative matrix factorization), 57 (WALS, do inglês weighted alternating least squares), 58 AFM, do inglês atomic force microscopy, 63 APTMS (do inglês, 3Aminopropyl)trimethoxysilane), 63 AsLS, do inglês asymmetric least squares, 45 ASTM, do inglês american society for testing and materials, 69 AuNPs, do inglês gold nanoparticles, 20 bootstrapping aggregation (bagging), 52 CART, do inglês classification and regression trees, 50 CCD, do inglês Charge-Coupled Device, 36 CCα, do inglês decision limit, 106 CIPRO, ciprofloxacin, 111 CIPRO-ISO, do inglês isotopicallyciprofloxacin, 120 DC-SERS, do inglês digital calibration SERS, 112 D-SERS, do inglês digital SERS, 111 E2, 17β-estradiol, 66 EC, do inglê European Commission, 107 ECM, error covariance matrix, 81 EF, do inglês enhancement fator, 29 EFA, do inglês envolving factor analysis, 56 ELISA, do inglês enzyme-linked immunosorbent assay, 21 ENRO, enrofloxacin, 111 FDA (do inglês, Food and Drug Administration), 80 HPLC, do inglês high performance liquid chromatography, 80 ICA, do inglês independent component analysis, 121 importância das variáveis (ImpVar), 56. índice de massa corpórea (IMC), 49 LC-MS-MS, do inglês liquid chromatography tandem mass spectrometry, 96 LOD, do inglês limit of detection, 106 LSPR, do inglês localized surfasse plasmon ressonance, 29 matriz covariância do erro (ECv), 59 matriz de erro de correlação (ECr), 60 MCR-ALS, do inglês multivariate resolution curve with alternating least squares, 20 MRL, do inglês maximum residue limit, 96 NE, noradrenalina, 66 NNLS (FNNLS, Fast NNLS), 57 out-of-bag (OOB), 52 PCA, do inglês principal componente analysis, 97 PLS, do inglês partial least squares, 47 PLSR, do inglês partial least squares regression, 98 PURE, do inglês purest variable detection method, 56 quadrados mínimos não negativos (NNLS, Non-Negative Least Square), 57 RF, do inglês random forest, 22 RMSE, root-mean squares error, 68 RMSEOOB, do inglês root-mean squares error out-of-bag, 68 RR, do inglês resonance Raman, 27 SERS, do inglês surface enhanced Raman spectroscopy, 19 SIMPLISMA, do inglês simple-to-use interactive self-modeling mixture analysis, 56 SM-SERS, do inglês single-molecule surface enhanced Raman spectroscopy, 21 TEM, do inglês transmission electron microscopy, 62 UHT, do inglês ultra-high temperature, 22.

(14) Sumário 1.. Introdução ................................................................................................... 19 1.1.. Introdução Geral .................................................................................... 19. 1.2.. Objetivo Geral ....................................................................................... 20. 1.2.1. 1.3. 2.. Objetivos específicos....................................................................... 20. Estrutura da tese ................................................................................... 21. Espectroscopia Raman intensificada pela superfície (SERS) ........................... 25 2.1.. A espectroscopia Raman intensificada pela superfície (SERS) .................. 25. 2.1.1.. O espalhamento Raman .................................................................. 25. 2.1.2. O mecanismo do espalhamento Raman intensificado pela superfície (SERS) 28 2.1.2.1.. Efeito químico.............................................................................. 29. 2.1.2.2.. Efeito eletromagnético .................................................................. 29. 2.1.2.3.. Espectro de extinção .................................................................... 30. 2.2.. 3.. Detecção no regime de uma única molécula (SM-SERS) .......................... 30. 2.2.1.. Os Hotspots e o Sinal SERS ............................................................ 31. 2.2.2.. A estatística complexa do SM-SERS ................................................ 32. 2.2.3.. Série isotopóloga ............................................................................ 33. Equipamentos Raman .................................................................................. 36 3.1.. Espectrômetro Raman ........................................................................... 36. 3.1.1.. 4.. Equipamento Raman dispersivo ....................................................... 36. 3.2.. Equipamento Raman para imagens hiperespectrais ................................. 37. 3.3.. Equipamento Raman acoplado a um microscópio confocal ....................... 39. Métodos quimiométricos ............................................................................... 42 4.1.. Quimiometria......................................................................................... 42. 4.2.. Pré-processamento dos dados ............................................................... 45. 4.2.1.. Correção da linha base .................................................................... 45. 4.2.1.1.. Mínimos quadrados assimétricos (AsLS) ....................................... 45. 4.2.1.2.. Normalização .............................................................................. 46. 4.3.. Calibração multivariada .......................................................................... 47. 4.3.1.. Quadrados mínimos parciais (PLS)................................................... 47. 4.3.2.. Métodos probabilísticos baseados em árvores de decisão .................. 48. 4.3.2.1.. Classificação e regressão de árvores (CART) ................................ 50.

(15) 4.3.2.2. 4.4.. Métodos baseados na resolução multivariada de curvas ........................... 56. 4.4.1.. Fatoração não negativa de matriz (NMF-ALS) ................................... 57. 4.4.2.. MCR com mínimos quadrados alternados ponderados (MCR-WALS) .. 58. 4.5.. Avaliação dos modelos quimiométricos.................................................... 60. 4.5.1. 5.. Floresta randômica (RF) ............................................................... 52. Avaliação dos modelos MCR............................................................ 60. Síntese, imobilização e caracterização das AuNPs ......................................... 62 5.1.. Solução coloidal .................................................................................... 62. 5.2.. Imobilização das AuNPs......................................................................... 63. 6. Aplicação 1: SERS e métodos de calibração multivariada usando Floresta Randômica para a quantificação de hormônios em soro de cães ............................ 66 6.1.. Introdução............................................................................................. 66. 6.2.. Procedimento experimental .................................................................... 67. 6.2.1.. Coleta das amostras de soro ............................................................ 67. 6.2.2.. Síntese e concentração das nanopartículas....................................... 67. 6.2.3.. Instrumentação ............................................................................... 68. 6.2.4.. Método de referência ELISA ............................................................ 68. 6.2.5.. Tratamento dos dados ..................................................................... 68. 6.3.. Resultados e discussão.......................................................................... 69. 6.3.1.. Metodologia desenvolvida ................................................................ 69. 6.3.2. Caracterização das nanopartículas e espectros SERS dos hormônios nas amostras de soro ......................................................................................... 70 6.3.3.. Desenvolvimento e validação dos modelos de calibração ................... 73. 6.3.4.. Importância das variáveis para a floresta randômica .......................... 75. 6.4.. Conclusões ........................................................................................... 77. 7. Aplicação 2: SERS e métodos de resolução multivariada de curvas para a detecção in situ de agrotóxico em casca de frutas ................................................. 80 7.1.. Introdução............................................................................................. 80. 7.2.. Procedimento experimental .................................................................... 81. 7.2.1.. Solucões e reagentes ...................................................................... 81. 7.2.2.. Síntese do colóide........................................................................... 82. 7.2.3.. Espectrômetro Raman de Imagem ................................................... 82. 7.2.4.. Análise e tratamento dos dados........................................................ 82. 7.3.. Resultados e discussão.......................................................................... 84.

(16) 7.3.1.. Detecção por SERS ........................................................................ 84. 7.3.2.. Pré-processamento ......................................................................... 85. 7.3.3.. Medida da matriz de covariância dos erros (ECMs) ............................ 86. 7.3.4.. Resultados para o MCR-ALS, NMF-ALS e MCR-WALS...................... 88. 7.3.5.. Resultados quantitativos para o MCR-ALS, NMF-ALS e MCR-WALS .. 92. 7.4.. Conclusões ........................................................................................... 93. 8. Aplicação 3: Desenvolvimento de um método para quantificação de melamina em diferentes matrizes de leite .................................................................................. 96 8.1.. Introdução............................................................................................. 96. 8.1.1. 8.2.. NMF-ALS com restrição de correlação múltipla .................................. 98. Procedimento experimental .................................................................. 101. 8.2.1.. Síntese do colóide......................................................................... 101. 8.2.2.. Espectrômetro Raman ................................................................... 101. 8.2.3.. Conjuntos de calibração e validação ............................................... 101. 8.2.4.. Medidas ....................................................................................... 101. 8.3.. Resultados e discussão........................................................................ 102. 8.3.1.. “Performance” e espectros recuperados .......................................... 102. 8.3.2.. Comparação com o método de calibração multivariada .................... 105. 8.3.3.. Validação ..................................................................................... 106. 8.4.. Conclusões ......................................................................................... 108. 9. Aplicação 4: Desenvolvimento de um método para quantificação de enrofloxacin em águas em concentrações ultra-diluídas utilizando calibração SERS digital ........ 110 9.1.. Introdução........................................................................................... 110. 9.2.. Calibração SERS digital (DC-SERS) ..................................................... 111. 9.3.. Procedimento experimental .................................................................. 113. 9.3.1.. Síntese do coloide e preparação do substrato ................................. 113. 9.3.2.. Espectrômetro Raman confocal ...................................................... 113. 9.3.3.. Procedimento experimental ............................................................ 113. 9.4.. Resultados e discussão........................................................................ 114. 9.4.1.. Caracterização das AuNPs e do substrato....................................... 114. 9.4.2.. Avaliação preliminar dos dados ...................................................... 115. 9.4.3.. Calibração SERS average versus SM-SERS ................................... 117. 9.4.4.. Digital SERS................................................................................. 119. 9.4.5.. Experimento da série isotopóloga ................................................... 120.

(17) 9.5.. Conclusões ......................................................................................... 121. Considerações finais ......................................................................................... 123 Perspectivas futuras.......................................................................................... 125 Referências bibliográficas .................................................................................. 127.

(18) Capítulo1: Introdução. 18.

(19) 1. Introdução 1.1. Introdução Geral A partir das observações realizadas por Fleischmann et al. [1] em 1974 do efeito da intensificação do sinal Raman da piridina adsorvida numa superfície rugosa de um eletrodo de prata, foi aberta uma nova fase para aplicações da espectroscopia Raman. Com o procedimento adotado foi contornado a baixa secção de choque da técnica, quando comparada a outras técnicas espectroscópicas, e fez surgir a espectroscopia Raman intensificada pela superfície (SERS, do inglês surface enhanced Raman spectroscopy). O efeito SERS é caracterizado pela intensificação do espalhamento Raman, em várias ordens de magnitude (104 a 107 vezes), que ocorre devido à interação da radiação eletromagnética com as nanopartículas metálicas, tais como Ag, Au ou Cu. SERS apresenta como principais vantagens baixos limites de detecção e quantificação, chegando até o regime de uma única molécula [2], que apresenta. características. interessantes. para. a. química. analítica,. principalmente, devido à simplicidade e à ausência da necessidade de preparo de amostra na maioria dos casos. Isso permite sua aplicação em diversificadas áreas e em ambientes totalmente adversos, como: in vivo, in situ, in vitro e ex vivo, na investigação de drogas [3], na identificação e detecção de pesticidas [4], no monitoramento ambiental intracelular [5] e na quantificação em amostras biológicas como urina [6] e soro [7]. Com os recentes avanços na área de nanofabricação e síntese das nanopartículas metálicas [8], praticamente o conhecido problema de falta de reprodutibilidade em SERS foi minimizado [9, 10], elevando consideravelmente o número de aplicações em química analítica. Entretanto, do ponto de visto analítico, as aplicações com amostras reais de alta complexidade ainda têm sido um desafio. Por exemplo, realizar a calibração na presença de interferentes muitas das vezes desconhecidos, que podem depreciar o sinal SERS e dificultar a detecção e quantificação do analito de interesse. Para resolver este problema é adequado o uso de ferramentas estatísticas mais robustas, tais como as contidas em quimiometria, como realizado no trabalho 19.

(20) descrito por Mamián-López & Poppi [11]. Os autores utilizaram o método resolução multivariada de curvas com mínimos quadrados alternados (MCRALS, do inglês multivariate resolution curve with alternating least squares) e o método de adição de padrão para a determinação de nicotina em urina, na qual a quantificação pode ser realizada na presença de interferentes não conhecidos sem a sua separação física. Como vantagens práticas do método podem-se. destacar. o. não. pré-tratamento. de. amostras,. apenas. um. procedimento de diluição foi necessário, e o uso de uma síntese clássica muito simples de nanopartículas de ouro (AuNPs, do inglês gold nanoparticles). Além disso, outros trabalhos têm surgido na literatura [4, 7] aliando o alto potencial da técnica SERS com métodos quimiométricos de resolução de curvas e calibração multivariada, possibilitando o desenvolvimento de novas ferramentas para análise em matrizes complexas.. 1.2. Objetivo Geral Como objetivo geral dessa tese, pretende-se utilizar a espectroscopia Raman intensificada pela superfície (SERS) aliada a métodos quimiométricos para o desenvolvimento de novas metodologias analíticas aplicadas a matrizes complexas, para os quais os métodos convencionais apresentam limitações.. 1.2.1. Objetivos específicos 1) Desenvolver um método automatizado para a calibração multivariada de dois hormônios, 17β-estradiol e noradrenalina, em soro de cães após a suplementação de medicamentos contra hipertensão utilizando SERS e Floresta Randômica; 2) Desenvolver um método para a detecção in situ do pesticida malation em cascas de tomate e ameixa utilizando imagem hiperespectral SERS e diferentes métodos de resolução multivariada de curvas; 3) Desenvolver um novo método/algoritmo para a calibração multiprodruto de melamina em matrizes lácteas, UHT e Fórmula Infantil, utilizando. 20.

(21) SERS e uma nova abordagem de metodologia para resolução multivariada de curvas com múltipla restrição de correlação; 4) Desenvolver um novo método/algoritmo para a calibração multivariada do antibiótico, enrofloxacin, em soluções extremamente diluídas utilizando SERS, resolução multivariada de curvas e calibração SERS digital.. 1.3. Estrutura da tese Nesta Tese foram desenvolvidos métodos para a identificação e determinação de hormônios, pesticida, contaminante de matrizes lácteas e contaminante emergente em água baseados em SERS e quimiometria. Os resultados estão resumidos em quatro aplicações distintas entre si, estruturadas na forma de capítulos. No primeiro capítulo, é composto pela introdução geral, objetivo geral e objetivos específicos e uma breve discussão sobre a estrutura desta Tese. No segundo capítulo é apresentada de forma simplificada a teoria SERS e seus mecanismos, assim como a teoria do single-molecule SERS (SM-SERS), que faz parte da última aplicação. No terceiro capítulo são apresentados os equipamentos Raman utilizados e suas principais diferenças e vantagens num ponto de vista prático. No quarto capítulo é abordada a teoria que envolve os métodos quimiométricos de calibração e resolução multivariada de curvas que foram empregados nas aplicações descritas a seguir. No quinto capítulo foi discutido a síntese e caracterização das AuNPs utilizadas em todas as aplicações da tese. Na primeira aplicação, sexto capítulo, é apresentado o desenvolvimento da metodologia para quantificação dos hormônios 17β-estradiol e noradrenalina em soro de cães após a suplementação de medicamentos contra hipertensão utilizando SERS e Floresta Randômica. Inicialmente, as concentrações dos dois hormônios foram determinadas pelo método de referência ELISA e estes valores foram utilizados para desenvolver modelos de calibração multivariada utilizando os seus respectivos espectros SERS. Este método teve como vantagem. prática. a. automação 21. das. leituras. SERS,. reduzindo.

(22) consideravelmente o tempo das medidas. Este fato é importante uma vez que o método de referência possui procedimentos laboriosos, os quais demandam em torno de 2 a 3 dias para a obtenção dos resultados. Em contrapartida, com a metodologia proposta foi possível realizar 96 medidas em menos de 2 h. Outra novidade que foi apresentada nesta aplicação foi utilizar o método probabilístico de floresta de decisão: floresta randômica (RF, do inglês random forest); que pela primeira vez foi estudada pelo nosso grupo de pesquisa. Os resultados obtidos com a RF foram comparáveis também aos erros obtidos pelo método de referência. Esta aplicação gerou um artigo publicado na revista Microchemical Journal [7]. A segunda aplicação, sétimo capítulo, consistiu em desenvolver uma metodologia que fosse simplificada e sem qualquer pré-tratamento de amostra para a identificação do pesticida malation em cascas de frutas: tomate e ameixa. Para isso, a estratégia tomada foi obter a imagem hiperespectral SERS das cascas dos alimentos e utilizar as ferramentas quimiométricas de resolução de curvas multivariada para a obtenção dos perfis espectrais puros separados, para a identificação do pesticida. Cabe ressaltar, que os métodos de resolução de curvas utilizados foram inicializados sem o conhecimento prévio dos respectivos espectros puros, uma vez que esta informação nem sempre é disponível. Esta aplicação gerou um artigo publicado na revista Analytica Chimica Acta [4]. Na terceira aplicação, oitavo capítulo, foi desenvolvido um método/algoritmo para a calibração multiproduto de melamina em duas diferentes matrizes lácteas, leite UHT e fórmula infantil, simultaneamente numa mesma curva de calibração. O algoritmo baseou-se em uma nova abordagem para resolução multivariada de curvas, no qual foi inserida uma restrição de correlação global, para a previsão do contaminante nos dois diferentes produtos utilizando apenas um único modelo global. Através do uso deste método foi possível obter a chamada “vantagem de segunda ordem” empregando dados de primeira ordem, ou seja, permitiu realizar o procedimento de calibração na presença de interferentes desconhecidos. Esta aplicação gerou um manuscrito que está submetido na revista Talanta. Na quarta e última aplicação, nono capítulo, realizada durante um período de estágio no Canadá (University of Victoria – CA), foi desenvolvido um 22.

(23) método/algoritmo para a calibração em soluções extremamente diluídas de um antibiótico contaminante emergente em água: o ciprofloxacin. O método desenvolvido, chamado de calibração SERS digital, baseou-se na contagem das moléculas presentes nos “hotspots”, no qual são as que mais contribuem para a intensidade total do espectro SERS. Como conclusão, através deste método mostrou-se ser possível realizar o procedimento de calibração SERS em soluções ultra-diluídas. Após, o regime single molecule-SERS (SM-SERS) foi constatado através do experimento da série isotopóloga, utilizando o antibiótico ciprofloxacin e seu isótopo deuterado. Esta aplicação apresenta um grande potencial para contribuir nos estudos de SM-SERS e na aplicação da técnica na área de Química Analítica. Esta aplicação gerou um resumo de um congresso internacional e um manuscrito que está em fase de redação.. 23.

(24) Capítulo 2: Espectroscopia Raman intensificada pela superfície (SERS). 24.

(25) 2. Espectroscopia Raman intensificada pela superfície (SERS) 2.1. A espectroscopia Raman intensificada pela superfície (SERS) A espectroscopia Raman intensificada pela superfície (SERS), observada pela primeira vez por Fleischmann et al. em 1974 [1], foi incialmente descrita como intensificação do sinal Raman devido ao aumento da área do eletrodo de prata. Entretanto, posteriormente, este efeito foi descrito por Jeanmaire e Van Duyne [12] e Albretch e Creighton [13], em dois trabalhos independentes, como tendo outras causas e não apenas devido ao eletrodo. O efeito SERS, como o nome já diz, é o efeito de intensificação do espalhamento Raman, em várias ordens de magnitude (104 a 107 vezes), que ocorre devido à interação radiação da eletromagnética com nanopartículas metálicas, Ag, Au e Cu, gerando as chamadas ressonâncias de plasmons de superfície. Embora o SERS seja uma espectroscopia de superfície, as mesmas regras de seleção do Raman também são válidas.. 2.1.1. O espalhamento Raman A espectroscopia Raman é baseada no fenômeno de espalhamento da luz [14]. Nela, uma fonte de radiação monocromática coerente e colimada (E=hνex) é utilizada para excitação de uma molécula (Figura 2.1A). Durante este processo, parte desta radiação (ou desses fótons) irá transpassar sem colidir com a matéria (molécula) e outra parte irá se espalhar elasticamente ou de forma inelástica. O que ocorre naturalmente é que a maioria desses fótons são espalhados elasticamente, portanto, sem interagirem com a amostra. Este efeito é chamado de espalhamento de Rayleigh, e os fótons espalhados possuem a mesma energia que a inicial (E=hνex). Por outro lado, uma pequena parcela é espalhada de forma inelástica, ou seja, com energia diferente que a inicial (E=hνex±νvib). Caso ela seja de energia maior que a inicial, o efeito é denominado espalhamento Anti-Stokes (E=hνex+νvib), caso contrário, é denominado espalhamento Stokes (E=hνex-νvib).. 25.

(26) Figura 2.1. (A) Esquema dos espalhamentos elásticos (Stokes e Anti-Stokes) e inelásticos (Rayleigh) (Modificado de Sasic & Ozaki [14]) (B) esquema dos mecanismos quânticos de espalhamento e absorção.. De acordo com o mecanismo quântico (Figura 2.1B), um fóton da radiação incidente colide com a molécula no estado fundamental (ν = 0), promovendo a espécie a um estado de maior energia chamado de estado virtual (nominal), no qual ao retornar para um estado de menor energia novamente ocorrerá a reemissão de um novo quantum de energia. Além disso, se esse estado for de mesma energia do inicial (ν = 0), teremos o efeito Rayleigh ou, então, o efeito Stokes, no caso de retornar para um estado mais excitado (ν = 1). Essa diferença de energia entre a radiação incidente e a espalhada (Figura 2.1B) corresponde à energia com que átomos presentes na área estudada estão vibrando, fornecendo informações sobre as vibrações moleculares. Porém, pode ser que ocorra também de o fóton encontrar a molécula no estado vibracional excitado (ν = 1), e neste caso o fóton liberado terá energia maior que os anteriores. Normalmente, de acordo com a distribuição de 26.

(27) Boltzmann, este estado é mais difícil de ser encontrado. Portanto, o espalhamento anti-Stokes é menos intenso que o Stokes. Por outro lado, pode ser que, ao invés de ocorrer a transição para um estado virtual, ocorra a transição para um estado eletrônico excitado, chamado de efeito Raman ressonante (RR) [15, 16]. A origem deste fenômeno está relacionada à coincidência entre o comprimento de onda da radiação de excitação com uma banda de absorção eletrônica do analito, no qual acontece a promoção de um elétron para um estado eletrônico excitado seguido de uma imediata relaxação de volta para o estado fundamental. Ao contrário disso, pode ser que ocorra um efeito de relaxação para um estado eletrônico excitado antes da volta para o estado fundamental; nesta situação teremos o efeito de fluorescência. A observação do fenômeno de fluorescência não é desejável, pois ele compete com efeito de espalhamento Raman e isso promoverá uma depreciação do sinal Raman. Um caso comum de intensificação por RR é o ocorrido em corantes, pois muitos deles apresentam estruturas macrocíclicas que absorvem os comprimentos de onda de excitação do laser na região visível. No espectro Raman, assim como no infravermelho, as bandas são relacionadas a modos vibracionais intrínsecos das moléculas, portanto, elas contêm a impressão digital das moléculas, uma importante vantagem dessas técnicas. Entretanto, no infravermelho a molécula para ser ativa necessita de ter variação no momento de dipolo, enquanto que na espectroscopia Raman a polarizabilidade da molécula deve variar. Quando a radiação incidente interage com a molécula, ela promove uma →. alteração no momento de dipolo induzido ( P ) da molécula, →. →→. P = αE. (2.1) →. →. no qual, α é o tensor de polarizabilidade da molécula e E é o campo elétrico da radiação incidente. Fica evidente nesta equação que o momento de dipolo induzido é influenciado pelo campo elétrico da radiação incidente, e a intensidade do espalhamento Raman ( I mn ) é dada por:. 27.

(28) I mn. 2  16π 2  =  4  I exν 4 ∑∑ (α ij )mn i j  9c . (2.2). na qual, I ex é intensidade da radiação excitante é proporcional à quarta potência da frequência ν . Portanto, quanto maior a frequência da radiação excitante, maior será a intensidade do espalhamento, porém mais susceptível ela será as interferências por transições de fluorescência. A probabilidade de ocorrência do espalhamento não elástico (Raman) é muito baixa, devido à baixa secção cruzada de choque. Por exemplo, se 106 moléculas foram emitidas apenas 1 delas será espalhada de forma não elástica. Essa limitação da técnica Raman é perceptível na falta sensibilidade em alguns casos em específico, principalmente, quando comparada com outras técnicas espectroscópicas moleculares, tais como Uv-vis, infravermelho e fluorescência.. 2.1.2. O mecanismo do espalhamento Raman intensificado pela superfície (SERS) Ao contrário da espectroscopia Raman, a espectroscopia SERS é uma técnica bem sensível, comparável à técnica de fluorescência molecular. O mecanismo de amplificação do sinal Raman pode ser explicado por dois fatores: o mecanismo químico e o eletromagnético. No primeiro, é fundamental que a molécula adsorva na superfície do metal, para que ocorra a transferência de cargas entre o metal e a molécula. No segundo, o mais importante, o efeito é dependente da ressonância de plasmons de superfície, na qual é gerado o sinal de intensificação do sinal SERS. A geração dos plasmons é dependente do tipo do metal utilizado (normalmente Ag ou Au), da estrutura/formato da nanopartícula metálica, estado de agregação, assim como demais fatores. De fato, ambos os mecanismos contribuem com uma parcela para o mecanismo de intensificação do SERS, no entanto, para compreendê-los, é preciso avaliar a contribuição de cada um deles, separadamente, como veremos a seguir.. 28.

(29) 2.1.2.1.. Efeito químico. Como foi dito anteriormente, é de suma importância para que o efeito SERS ocorra que o analito esteja adsorvido quimicamente ou fisicamente na superfície do metal. A formação deste complexo, metal-molécula, permite que ocorra a transferência de carga entre molécula/metal, afetando o tensor de →. polarizabilidade da molécula ( α ). Como consequência disso, a intensificação do espectro Raman é observada em ordem de grandeza exponencial.. 2.1.2.2.. Efeito eletromagnético. Apesar de o efeito químico ser importante para que o efeito SERS ocorra, a sua contribuição no fator de intensificação (EF, do inglês enhancement fator) é pequena comparada ao efeito eletromagnético [17, 18]. Como pode ser observado no esquema da Figura 2.2, o campo elétrico da radiação eletromagnética induz a oscilação dos elétrons da camada de valência da nanopartícula, promovendo uma variação do campo local, conhecida como ressonância de plasmons localizado (LSPR, do inglês localized surface plasmon. ressonance).. Considerando. um. conjunto. de. nanopartículas. suportadas num substrato, essa nuvem de elétrons deslocalizados é propagada para as demais partículas dependendo da distância inter-partículas. Outro importante fator é que essa alteração local no momento de dipolo induzido do metal também é válida para a molécula, de acordo com as regras de seleção também observada no espalhamento Raman. Sendo assim, um efeito adicional é observado com um aumento significativo da intensificação do sinal.. 29.

(30) Figura 2.2. Esquema ilustrando a geração de ressonância de plasmons de superfície localizada (LSPR) sobre as nanopartículas de ouro.. 2.1.2.3.. Espectro de extinção. O mecanismo de extinção da luz, que nos compostos moleculares é denominado absorção, porém devido aos LSPR para as nanopartículas metálicas é composto por dois outros mecanismos: de absorção e de espalhamento. Medidas de absorção de luz pelo plasmon de nanopartículas metálicas podem ser obtidas nas regiões do ultravioleta, visível e infravermelho próximo. O aumento no tamanho das nanopartículas resulta em um deslocamento da banda do plasmon de superfície do metal para a região espectral de maior comprimento de onda. Assim, conclui-se que dessa forma a cor da nanopartícula, em função da ressonância plasmônica, está associada às dimensões da própria partícula.. 2.2. Detecção no regime de uma única molécula (SM-SERS) Em 1997, a técnica SERS foi utilizada pela primeira vez para estudar a detecção no regime de uma única molécula (SM-SERS) por dois grupos de forma independente [2, 19]. De acordo com Nie e Emory [2], o efeito observado foi mais intenso e mais estável quando comparado com o SM utilizando a técnica de fluorescência, além de possuir a vantagem da técnica Raman de fornecer a impressão digital molecular. Essas características colocam o SM-. 30.

(31) SERS num grupo seleto de técnicas importantes para o estudo e entendimento de processos de dinâmica molecular e com um atrativo para aplicações na área de Química Analítica, devido aos baixos limites de detecção alcançados.. 2.2.1. Os Hotspots e o Sinal SERS Como foi mencionada anteriormente, a intensificação do sinal SERS é devido à geração dos LSPRs sobre as nanopartículas, existindo dependência do ambiente dielétrico que as contêm e do seu estado de agregação [20]. Caso as nanopartículas estejam próximas uma das outras, existe a possibilidade de formar dímeros, trímeros ou outras estruturas, dependendo da distância interpartículas [21]. Nesta condição, os LSPRs entre duas (ou mais) nanopartículas esféricas podem se acoplar, formando os chamados “hotspots”, e gerar um forte fator de intensificação do sinal SERS. Na Figura 2.3 está representada a formação dos “hotspots” e o aumento do campo elétrico local. Como pode ser observado na Figura 2.3A, na solução coloidal podem existir monômeros, dímeros, trímeros e outras estruturas e isso pode promover a formação de um “hotspot” (Figura 2.3B).. Figura 2.3. Formação dos “hotspots” (A) imagens de TEM de AuNPs; (B) Aumento do campo elétrico local devido ao acoplamento entre os campos elétricos de duas nanopartículas esféricas (Adaptado de [20]).. 31.

(32) A presença dos “hotspots” é de suma importância para a formação e contribuição do sinal SERS. De acordo com um experimento de Fang et al. [22], dois terços das moléculas (por volta de 106 moléculas) sobre uma superfície recoberta por nanopartículas de prata, contribuíram menos de 5% para a intensidade de todo o sinal SERS. Por outro lado, menos de 0,1% destas moléculas, o que seria por volta de 63 moléculas, seriam responsáveis por um terço de toda a intensidade SERS. Isso indica uma forte dependência do sinal SERS dos “hotspots” e sua importância para obter limites de detecção no regime SM-SERS. Um fato interessante é que estima-se que em menos de 1% da área deste substrato tem-se realmente “hotspots” ativos [23], ou seja, uma ínfima parcela de todo material.. 2.2.2. A estatística complexa do SM-SERS Desde a primeira observação do SM-SERS [2, 19], já era conhecido o efeito de flutuação do sinal sobre os resultados. De forma a compreender melhor a origem destas variações no sinal, um esquema é mostrado na Figura 2.4.. Na Figura 2.4A pode ser observado que em regime de alta concentração do analito (em vemelho) toda a superfície do material, AuNPs imobilizadas sobre uma superfície de vidro, está recoberta, inclusive todos os “hotspots” estão preenchidos, formando uma monocamada de Langmuir. Ao iluminar-se toda essa região dividida em 11 x 11 pixels, totalizando 121 espectros SERS, pode-se construir um histograma de distribuição das intensidades médias normalizadas entre 0 e 1 (Figura 2.4C). Pode-se observar que a distribuição das intensidades segue o formato de uma gaussiana (distribuição normal), ou seja, o valor médio segue o chamado teorema do limite central, representado pela linha vermelha na vertical. Este caso é chamado na literatura por SERS average [24]. Em contrapartida, em concentração muito baixa (ultra-low) é observado que não existem moléculas suficientes do analito para formar uma monocamada e muito menos para serem adsorvidas em todos os “hotspots” (Figura 2.4B), alcançando o regime SM-SERS. Como consequência deste fato, cerca de 60% dos eventos são governados por eventos nulos (null events), 32.

(33) embora dois dos valores de intensidades sejam bem altos (Figura 2.4D), os quais representam apenas as duas moléculas que estão acomodadas nos “hotspots” (Figura 2.4C). Neste caso, os dados não seguem uma distribuição normal, mas uma distribuição chamada de cauda longa [25].. Figura 2.4. Superfície recoberta com AuNPs em (A) alta concentração do analito: SERS average, (B) baixíssima concentração do analito: SM-SERS; Histograma de frequência para (C) SERS average e (D) SM-SERS. Em roxo as AuNPs imobilizadas sobre uma superfície de vidro, em amarelo os “hotspots”, em vermelho o analito e a linha vermelha é valor médio das intensidades.. 2.2.3. Série isotopóloga O experimento do bianalito é o experimento mais utilizado para provar a existência do efeito SM-SERS [24]. O seu objetivo é provar a capacidade do SM-SERS em acomodar mais de uma molécula no “hotspot”. Como pode ser observado na Figura 2.5A, no primeiro caso nenhuma das moléculas estão presentes no “hotspot”, portanto, o evento é considerado nulo, 33.

(34) ou seja, não apresenta espectro, apenas ruído instrumental. No segundo caso (Figura 2.5B), a molécula verde está contida no “hotspot” e, portanto, um forte sinal é observado para a mesma. O mesmo acontece para a molécula em azul no terceiro caso mostrado na Figura 2.5C. No último caso (Figura 2.5D), ambas as moléculas podem visitar o “hotspot”, dessa forma, o espectro total terá tanto informações da molécula azul quanto da verde. Isso é um forte indicativo da observação do efeito SM-SERS [24].. Figura 2.5. Representação esquemática do experimento do bianalito para o SM-SERS. (A) evento nulo; (B) molécula verde, (C) molécula azul e (D) ambas as moléculas no “hotspot”.. Embora o experimento do bioanalito seja muito utilizado para a observação do efeito SM-SERS, o mesmo possui algumas limitações. A principal delas é a preferência de adsorção pela superfície por umas das moléculas [24, 26]. Neste caso, uma das moléculas pode ficar mais tempo adsorvida nos “hotspots”, e será observado na maior parte do tempo o seu espectro. Uma forma alternativa para contorna este problema é utilizando o experimento conhecido na literatura como “série isotopóloga”, ou seja, utilizando um isótopo deuterado de uma respectiva molécula, sendo que ambos os isótopos têm a mesma chance de adsorver na superfície. Recentemente, o grupo do professor Van Duyne propôs o uso do experimento multianalito [27].. 34.

(35) Capítulo 3: Equipamentos Raman. 35.

(36) 3. Equipamentos Raman 3.1. Espectrômetro Raman 3.1.1. Equipamento Raman dispersivo Até meados da década de 80, os espectrômetros Raman não eram muito populares. Muito disso se deve a diversos problemas e limitações que eram encontrados, pois os espectrômetros disponíveis não eram projetados para este tipo de aplicação em específico [16]. Mais tarde, a técnica ressurgiu, principalmente devido a três importantes fatores: o uso e o desenvolvimento de novas linhas de lasers de excitação: íon argônio (488 ou 514,5 nm), íon criptônio (530,9 ou 647,1 nm), Hélio-neônio (632,8 nm), diodo (785 ou 830 nm), Nd-YAG (1064 nm); o uso de filtros de rejeição (notch filters); e o uso de detectores do tipo carga acoplada (CCD, do inglês Charge-Coupled Device). Um equipamento Raman com esses componentes é apresentado na Figura 3.1.. Figura 3.1. Esquema de equipamento Raman moderno com notch filters e um detector CCD.. As principais funções dos notch filters são eliminar a radiação de baixa frequência (ruídos) e evitar que os sinais Raman anti-Stokes e Rayleigh cheguem ao detector (Figura 3.1). Outra grande vantagem do equipamento Raman moderno é o uso dos espectrômetros com monocromador do tipo echelle [14], como o PerkinElmer Raman Station (400F) utilizado nas aplicações 1 a 3 nesta Tese (Figura 3.2).. 36.

(37) Figura 3.2. Esquema representando um sistema com monocromador tipo echelle contido no espectrômetro PerkinElmer Raman Station (400F) utilizado nesta tese (aplicações 1 a 3).. Como pode ser observado na Figura 3.2, o monocromador tipo echelle possui duas grades de difração posicionadas ortogonalmente, sendo que a primeira separa o feixe em faixas de comprimentos de onda para depois o segundo monocromador realizar uma separação mais detalhada dentro destas faixas. A grande vantagem dessa abordagem é a possibilidade de obter um espectro Raman simultaneamente em toda a faixa espectral compreendida entre 3600-100 cm-1, em tempos relativos curtos e com grande resolução, pois não existem partes móveis.. 3.2. Equipamento Raman para imagens hiperespectrais Outra característica relevante dos equipamentos Raman atuais é a possibilidade da obtenção de imagens hiperespectrais, nas quais um espectro completo é obtido a cada pixel da imagem. Esta prática foi primeiramente reportada décadas atrás [14] e tem se mostrado até os dias atuais como uma potente ferramenta analítica, pois permite que espectros possam ser adquiridos em diversas regiões de interesse e obter informações sobre a distribuição do analito em uma superfície. Normalmente, são utilizados estágios de posicionamento x,y,z para selecionar a região onde será obtido o espectro, conforme mostrado na Figura 3.3. 37.

(38) Figura 3.3. Espectrômetro Raman para obtenção de imagem hiperespectral.. Na Figura 3.4 está representado um esquema dos diferentes tipos de aquisição dos espectros. Nos pontuais (Point Microspectroscopy), Figuras 3.4A e B, diversos espectros são adquiridos em determinadas regiões de interesse, na escala, por exemplo, de 100 µm. Esta abordagem não gera imagens, mas fornece uma boa noção do micro-espaço amostral. A principal desvantagem deste método é que, se a concentração do analito é baixa na amostra, o sinal também será depreciado (Figura 3.4B). Por outro lado, no mapeamento pontual (Point Mapping), Figura 3.4 C, uma micro-área é selecionada (mapping) e um espectro é adquirido a cada ponto da região selecionada, chamado de pixel. A área e o tamanho dos pixels utilizados são pré-determinados pelo usuário via software e através de uma mesa motorizada (motorized stage) (Figura 3.3). A adição da informação espacial permite a construção das chamadas imagens químicas. (Chemical. Imaging),. utilizando-se. uma. banda. do. espectro,. normalmente a mais intensa, ou os escores calculados por um modelo quimiométrico (que será discutido no próximo capítulo). As duas principais vantagens da análise por imagens hiperespectrais são obter a informação de um analito, de concentração global relativamente baixa, no entanto, alta em respectivos pontos da superfície monitorada (pixels) e, além disso, conhecer a distribuição deste composto ao longo de uma superfície pré-estabelecida (Figura 3.4). Por outro lado, esse tipo de medida pode ser bastante demorada, devido ao tempo de exposição do laser e/ou do tamanho da área mapeada.. 38.

(39) Figura 3.4. Esquema de aquisição de espectros Raman pontuais em: (A) alta concentrações; (B) baixas concentrações; e (C) mapeamento pontual.. 3.3. Equipamento Raman acoplado a um microscópio confocal Em 1981 [28], surgiram os equipamentos Raman acoplados a um microscópio confocal chamada de microscopia Raman (ou micro-Raman). Essa configuração permite o uso de diversas lentes de aumento: 5x, 10x, 20x, 50x, 100x; que possibilitam a aquisição de espectros Raman em amostras de escala micrométrica, podendo chegar a resolução espacial mínima próxima do limite de difração da luz, 1 µm2. Um esquema do equipamento Raman inVia da Renishaw, que foi utilizado nesta Tese na quarta aplicação, está representado na Figura 3.5.. Figura 3.5. Esquema de um microscópio Raman confocal baseado no equipamento Raman inVia da Renishaw. (A) acoplamento espectrômetro microscópio; (B) Esquema óptico do microscópio.. 39.

(40) Além de permitir alcançar alta resolução espacial, o micro-Raman permite a eliminação de grande parte da radiação espalhada espúria, evitando que grande parte dela chegue ao detector (Figura 3.5B).. 40.

(41) Capítulo 4: Métodos quimiométricos. 41.

(42) 4.. Métodos quimiométricos. 4.1. Quimiometria A Quimiometria tem como objetivo extrair o máximo de informação de dados químicos altamente complexos pela otimização, calibração, classificação ou resolução dos mesmos. A Quimiometria reúne conhecimentos altamente interdisciplinares: matemática, estatística multivariada, ciência da computação e química. O advento da quimiometria surgiu na primeira metade dos anos 70, embora a sua evolução tenha ocorrido mais tarde de forma significativa, na década de 80, junto com o surgimento dos microcomputadores [29]. Uma importante diferença do uso da quimiometria em relação aos métodos convencionais univariados para tratamento de dados é a utilização de toda informação contida neles, de forma multivariada. Como exemplo, os dados multivariados podem ser agrupados em uma matriz X (Figura 4.1), na qual nas linhas estão contidas as informações sobre as amostras ( I ), espectros SERS em diferentes concentrações, e nas colunas sobre as variáveis ( J ), intensidades SERS em cada deslocamento Raman. Também para o caso de calibração, para cada espectro haverá um valor de resposta que estará contida num vetor de concentrações y (Figura 4.1). Posteriormente, um modelo matemático será desenvolvido que relacionará de maneira multivariada as informações contidas em X e y .. 42.

(43) Figura 4.1. Representação da organização dos dados na forma de uma matriz de respostas ( X ) e um vetor de concentrações ( y ) para o desenvolvimento de um modelo matemático multivariado num procedimento de calibração.. Uma importante vantagem de se utilizar os modelos multivariados em relação aos convencionais está na possibilidade de lidar com interferentes sem a necessidade da sua separação física. Do ponto de vista da química analítica, as amostras reais, como sangue, urina, leite, dentre outras, são altamente complexas devido à presença de compostos que são denominados interferentes, os quais podem apresentar sobreposição da sua resposta instrumental com a do analito. Para este caso, o maior número de informações possível é importante para aumentar a “performance” e qualidade dos resultados. Um esquema demonstrando a progressão dos dados univariados a multivariados. baseado. no. aumento. representado na Figura 4.2.. 43. da. complexidade. do. sinal. está.