CAMPINAS 2020
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
KAREN SLIS RAGGIO SANTOS
ANÁLISE DE VITAMINAS DO COMPLEXO B UTILIZANDO ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO PRÓXIMO E
CAMPINAS 2020
KAREN SLIS RAGGIO SANTOS
ANÁLISE DE VITAMINAS DO COMPLEXO B UTILIZANDO ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO PRÓXIMO E
RESOLUÇÃO MULTIVARIADA DE CURVAS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Química na área de Química Analítica.
Orientador: Prof. Dr. Ronei Jesus Poppi
O arquivo digital corresponde à versão final da Dissertação defendida pela aluna Karen Slis Raggio Santos e orientada pelo Prof. Dr. Prof. Dr. Ronei Jesus Poppi.
Simone Luiz Alves - CRB 8/9094
Santos, Karen Slis Raggio,
Sa59a SanAnálise de vitaminas do complexo B utilizando espectroscopia na região do infravermelho próximo e resolução multivariada de curvas / Karen Slis Raggio Santos. – Campinas, SP : [s.n.], 2020.
SanOrientador: Ronei Jesus Poppi.
SanDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química.
San1. Espectrometria de luz próxima ao infravermelho. 2. Vitaminas. 3. Resolução multivariada de curvas. I. Poppi, Ronei Jesus. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Analysis of B complex vitamins using near infrared region spectroscopy and multivariate curve resolution
Palavras-chave em inglês: Spectroscopy, Near-Infrared Vitamins
Multivariate curve resolution
Área de concentração: Química Analítica
Titulação: Mestra em Química na área de Química Analítica Banca examinadora:
Marcia Cristina Breitkreitz Dosil Pereira de Jesus
Juliana Azevedo Lima Pallone Data de defesa: 28-08-2020
Programa de Pós-Graduação: Química Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0002-8559-6653 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/8259603090344605
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Marcia Cristina Breitkreitz (Presidente da comissão examinadora)
Prof. Dr. Dosil Pereira de Jesus (IQ-Unicamp)
Profa. Dra. Juliana Azevedo Lima Pallone (FEA-Unicamp)
A Ata da defesa assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
Este exemplar corresponde à redação final da Dissertação de
Mestrado defendida pela aluna
KAREN SLIS RAGGIO SANTOS
aprovada pela Comissão Julgadora em 28 de agosto de 2020
Dedico esta dissertação a meu pai Pedro Miguel, minha mãe Alicia, meus irmãos Henry, Erick, Stephania e a meu marido Karl.
"...Liberdade, essa palavra que o sonho humano alimenta que não há ninguém que explique e ninguém que não entenda..."
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, gostaria de agradecer ao meu orientador, Prof. Dr. Ronei Jesus Poppi, In memoriam, pela orientação e por todo ensinamento na área de
química analítica. A Prof.a Dra. Márcia Cristina Breitkreitz, pela disponibilidade em me
auxiliar na fase final de minha dissertação.
Aos meus pais, Pedro e Alicia, por me apoiarem no caminho que venho seguindo na Química. A minha irmã Stephania, colega de turma na Unicamp e minha melhor amiga, obrigada pelo apoio em todos os momentos da minha vida. Aos meus irmãos Henry e Erick, pelos momentos que passamos desde a nossa infância e ao meu marido Karl, obrigada pelo auxílio nas revisões da dissertação, pelo companheirismo e por todo carinho.
Agradeço também aos amigos que a profissão me proporcionou conhecer, Ana, Armando, Evandro, Luiz, Mariana e Rafaela, são pessoas que me ensinaram muito profissionalmente e que fizeram, e fazem, os meus dias de trabalho mais leve e divertidos.
Agradeço aos colegas do laboratório de pesquisa LAQQA, por toda ajuda e compartilhamento de conhecimento nestes anos de mestrado.
Ao funcionário do IQ, Daniel, colega de turma de pós graduação, pelo auxilio na realização dos experimentos.
Ao Instituto de Química da Unicamp, por ser uma referência na área para mim, e a Deus, que sem Ele ao meu lado, nada disso seria possível.
RESUMO
Vários métodos são descritos em farmacopeias para a quantificação de vitaminas do complexo B, em grande parte utilizando técnicas cromatográficas. Nos últimos tempos as técnicas espectroscópicas têm despertado grande interesse na indústria farmacêutica pela possibilidade de fornecer informações importantes sobre propriedades de interesse, tanto na pesquisa e desenvolvimento de produtos, quanto no monitoramento e diagnóstico de processos. A espectroscopia na região do infravermelho próximo (NIRS) é uma técnica quantitativa, versátil, rápida, potencialmente não-destrutiva e frequentemente requer pouco ou nenhum preparo de amostra. Com o espectrômetro NIR Spotlight 400N FT-NIR Imaging System da Perkin-Elmer, é possível tanto adquirir um único espectro de uma amostra, quanto mapear uma superfície, gerando imagens químicas (NIR-CI). Neste modo, uma determinada área de interesse ao longo da amostra é subdividida e o espectro NIR de cada subdivisão, denominada pixel, é adquirido, possibilitando observar a disposição espacial dos componentes. Este trabalho tem como objetivo quantificar a concentração das vitaminas B1, B6 e B12 em amostras de multivitamínicos utilizando espectroscopia NIR pontual e obter a distribuição espacial de vitamina B6 por mapeamento de superfície em baixas dosagens. Os resultados de imageamento foram comparados com cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), a técnica de referência, para avaliar a concentração destes analitos. Utilizando-se a espectroscopia pontual, foram obtidas recuperações próximas a 100% para as vitaminas B1, B6 e B12 e, por NIR-CI, foi possível quantificar vitamina B6 em concentrações baixas, obtendo-se teores equivalentes ao obtidos por cromatografia líquida (HPLC).
ABSTRACT
Several methods are described in pharmacopoeias regarding the quantification of vitamins of the B complex, most of which use chromatographic techniques. Recently, spectroscopic techniques have gained interest in the pharmaceutical industry due to the possibility of providing relevant information about the properties of interest, in the research and development of products and also in process monitoring. Spectroscopy in the near infrared region (NIRS) is a quantitative, versatile, quick and nondestructive technique and frequently requires little or no sample preparation. With the NIR spectrometer Spotlight 400N FT-NIT Imaging System from Perkin-Elmer, it is possible to obtain a single spectrum of a sample, and to map a surface, generating chemical images (NIR-CI). The latter is a technique where a specific area on the surface of the sample is subdivided and the NIR spectrum of each subdivision, named pixel, is acquired enabling to observe the spatial disposition of the components. This work aims to quantify the concentration of vitamins B1, B6 and B12 in multivitamin commercial products using conventional NIR, and obtain the spatial distribution of vitamin B6 in low dosages by surface mapping. The imaging results were compared to high performance liquid chromatography (HPLC), a reference technique used to evaluate the concentration of these analytes. Using point-mode NIR, it was possible to obtain assay results near 100% for the vitamins B1, B6 and B12. By NIR-CI, it was possible to quantify vitamin B6 in low quantities, with similar results comparing to liquid chromatography (HPLC).
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Consumo médio per capita de vegetais, medido em relação às recomendações da Organização Mundial da Saúde (OMS), que varia de 200 a 250g por dia. [5] Em azul, países com uma ingestão média per capita abaixo de 250g por
pessoa por dia; em verde, maiores que 250g. Dados de 2017. ... 20
Figura 2. Consumo médio per capita de frutas no mundo em 2013, medido em relação às diretrizes da Organização Mundial de Saúde (OMS), que recomenda 200g por dia. [5] Em azul, países com uma ingestão média per capita abaixo de 200g por pessoa por dia; em verde, maiores que 200g. Dados de 2017. ... 21
Figura 3. Estrutura do cloridrato de tiamina. ... 23
Figura 4. Estruturas de (A) vitamina B6 e (B) coenzimas da vitamina B6. ... 25
Figura 5. Estrutura do ativo cloridrato de piridoxina. ... 25
Figura 6. Concentração de vitamina B6 em alimentos. [15] ... 26
Figura 7. Estrutura da cianocobalamina. ... 27
Figura 8. Regiões do espectro eletromagnético. ... 29
Figura 9. Estiramento e deformação de moléculas. ... 31
Figura 10. Oscilador harmônico. Baseada em [42]. ... 31
Figura 11. Sobreposição dos modelos dos osciladores harmônico e anarmônico. Baseada em [42]. ... 32
Figura 12. Equipamento Spotlight 400N FT-NIR Imaging System da Perkin-Elmer. (A) compartimento da óptica do equipamento de imagem; (B) espectrofotômetro NIR; (C) posicionador de amostra; (D) joystick controlador do posicionador de amostras. ... 33
Figura 13. Esquema mostrando cada pixel em uma amostra e seu respectivo espectro... 33
Figura 14. Diferentes tipos de estrutura de dados analíticos. Baseada em [52]. .... 34
Figura 15. Representação matricial do modelo bilinear do MCR. ... 35
Figura 16. Exemplos de restrições no MCR: não negatividade, unimodalidade e balanço de massa. Baseada em [61]. ... 39
Figura 17. Esquema de implementação da restrição de correlação na otimização via MCR-ALS (Adaptado de Debus et al.) ... 40
Figura 18. Espectro processado médio dos compostos puros antes e após pré-processamento pela primeira derivada. (A) Cloridrato de tiamina (Vitamina B1); (B) Cloridrato de piridoxina (Vitamina B6); (C) Cianocobalamina (Vitamina B12); (D) Celulose microcristalina... 47
Figura 19. Espectro médio dos compostos puros após pré-processamento por primeira derivada, mostrando a região eliminada do espectro, em azul. ... 48
Figura 20. Espectro médio dos princípios ativos vitamina B1, B6 e B12 pura após pré-processamento por primeira derivada ... 48
Figura 21. Construção da matriz de dados para quantificação de cada uma das vitaminas. ... 49
Figura 22. Valores esperados contra previstos pelo MCR para os ativos e excipientes. ... 50
Figura 23. Sobreposição das primeiras derivadas das amostras nas concentrações de 50%, 80%, 100%, 120% e 200% da concentração teórica dos ativos. ... 53
Figura 24. Gráfico de barras representando a recuperação médias em relação à concentração teórica e barra de erro representando o desvio padrão em relação à média (DPR) das ,vitaminas (A) B1, (B) B6, (C) B12 nas diferentes formulações analisadas por espectro pontual. A linha tracejada em vermelho representa a recuperação teórica de 100%. ... 54
Figura 25. Gráfico de barras representando o DPR% das vitaminas B1, B6, B12 nas diferentes formulações analisadas por NIR no modo pontual. ... 55
Figura 26. Esquema do tratamento dos dados de imagem hiperespectral por MCR-ALS. Imagem baseada em [31]. ... 58 Figura 27. Obtenção de espectro médio nas amostras de calibração... 58 Figura 28. Estrutura da celulose microcristalina ... 63 Figura 29. Espectro médio do cloridrato de piridoxina (vitamina B6) e celulose microcristalina. ... 63
Figura 30. Primeira derivada do espectro médio dos compostos puros do ativo cloridrato de piridoxina (vitamina B6) e celulose microcristalina. Em azul está demarcada a região eliminada do espectro durante o processamento. ... 64
Figura 31. Conjunto espectral de uma amostra de cloridrato de piridoxina 1% (A) antes do pré-processamento e (B) após o pré-processamento pela primeira derivada. ... 64
Figura 32. Aquisição e transformação da imagem hiperespectral na matriz de dados D ... 65
Figura 33. Valores esperados contra previstos pelo MCR para a concentração da vitamina B6 na faixa de 0 a 5%, as barras em preto representam o desvio padrão de cada concentração. ... 66
Figura 34. Sobreposição dos espectros médios das amostras de calibração de
vitamina B6, em destaque a região em torno de 4500 cm-1. ... 67
Figura 35. Espectros puro e recuperado para vitamina B6 (A) e Celulose (B) de uma amostra a 1%. ... 68
Figura 36. Valores experimentais contra previstos pelo MCR-ALS para a calibração das amostras de validação de vitamina B6 nas concentrações de 0,5, 1,0 e 2,0 %(m/m). ... 69
Figura 37. Mapas de concentração das amostras de (A) vitamina B6; (B) celulose microcristalina nas concentrações de 0,5%, 1,0% e 2,0%. ... 70
Figura 38. Mapa de concentração das amostras de referência da vitamina B6 ... 72 Figura 39. Mapa de concentração das amostras de referência da celulose microcristalina. ... 72
Figura 40. Gráfico em barra dos erros relativos das amostras de referência (equivalente à 0,65 % (m/m) de vitamina B6) e referência dopadas (equivalente à 1,30 % (m/m) de vitamina B6). ... 74
Figura 41. Mapa de concentração da vitamina B6 nas amostras de referência de vitamina B6 dopada – análise de vitamina B6 ... 74
Figura 42. Mapa de concentração de celulose microcristalina nas amostras de referência dopadas. ... 75
Figura 43. Comparativo de teor médio obtido para amostras de referência e referência dopada pelas técnicas de HPLC e NIR-CI. O tracejado em vermelho representa o valor teórico da vitamina B6. ... 76
Figura 44. Cromatogramas de: (A) Placebo, (B) Matéria-prima cloridrato de piridoxina, (C) padrão interno ácido p-hidroxibenzoico, (D) padrão calibração (E) amostra referência com padrão interno, (F) amostra preparada no laboratório com padrão interno. ... 94
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Solubilidade e ingestão diária recomendada de 13 vitaminas. [3] ... 19 Tabela 2. Formulação de uma drágea do medicamento referência. ... 43 Tabela 3. Peso-médio, peso máximo, peso mínimo e desvio padrão em relação a média (DPR%) de amostras de referência. ... 44
Tabela 4. Porcentagem dos IFA´s vitamina B1, vitamina B6, vitamina B12 e excipiente celulose microcristalina necessária para construção da curva de calibração no modelo MCR. ... 45
Tabela 5. Resultados de calibração e validação NIR – Pontual para amostras
preparadas 50% da concentração teórica. ... 51
Tabela 6. Resultados de calibração e validação NIR – Pontual para amostras
preparadas 80% da concentração teórica. ... 51
Tabela 7. Resultados de calibração e validação NIR – Pontual para amostras
preparadas 100% da concentração teórica. ... 51
Tabela 8. Resultados de calibração e validação NIR – Pontual para amostras
preparadas 120% da concentração teórica. ... 52
Tabela 9. Resultados de calibração e validação NIR – Pontual para amostras
preparadas 200% da concentração teórica. ... 52 Tabela 10. Massa da vitamina cloridrato de piridoxina e excipiente celulose microcristalina utilizada na curva de calibração. ... 60
Tabela 11. Formulação de uma cápsula do medicamento de referência. ... 61 Tabela 12. Peso-médio, peso máximo, peso mínimo e desvio padrão em relação a média (DPR%) de amostras de referência. ... 61
Tabela 13. Resultados médio da avaliação do modelo e amostras a 0,5, 1 e 2,0% de Vitamina B6. ... 69
Tabela 14. Resultados da aplicação do modelo MCR-ALS em amostras de referência da vitamina B6 na concentração de 1,3 mg/cap. (equivalente 0,65%(m/m) de vitamina B6). ... 71
Tabela 15. Resultados de avaliação do modelo e amostras para amostras de referência dopadas de B6 2,6 mg/cap. (equivalente 1,30 % (m/m) de vitamina B6) . 73
Tabela 16. Resultados do teste-t para as amostras de referência, presumindo variâncias equivalentes. ... 75
Tabela 17. Resultados do teste-t para as amostras de referência dopadas,
presumindo variâncias equivalentes. ... 76
Tabela 18. Condições do método de análise. ... 88
Tabela 19. Critério de aceitação para adequação do sistema ... 91
Tabela 20. Tabelas de recuperação do guia AOAC [66]. ... 92
Tabela 21. Resultados dos testes de Adequação do Sistema. ... 92
Tabela 22. Recuperação e desvios dos padrões calibração, controle e verificação. ... 93
Tabela 23. Resultados da quantificação das amostras de referência, amostra de referência dopadas e amostras preparadas no laboratório. ... 95
EQUAÇÕES Equação 1 ... 35 Equação 2 ... 36 Equação 3 ... 36 Equação 4 ... 37 Equação 5 ... 37 Equação 6 ... 38 Equação 7 ... 38 Equação 8 ... 39 Equação 9 ... 44 Equação 10 ... 46 Equação 11 ... 46 Equação 12 ... 46 Equação 13 ... 59 Equação 14 ... 59 Equação 15 ... 62
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ALS - Alternating Least Squares
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária CG - Cromatografia Gasosa
DP – Desvio Padrão
DPR - Desvio Padrão em Relação à Média EP - European Pharmacopeia
FDA - U. S. Food and Drug Administration FT - Fourier Transform
FIR - Far InfraRed
HPLC - High-performance liquid chromatography IDR – Ingestão Diária Recomendada
IFA – insumo farmacêutico ativo
IMCR - Iterative Multivariate Curve Resolution MCR - Multivariate Curve Resolution
MCR-ALS - Multivariate Curve Resolution - Alternating Least Squares MIR - Mid InfraRed
NIMCR - Non-Itreative Multivariate Curve Resolution NIR - Near InfraRed
NIR-CI - Near Infrared Chemical Imaging NIRS - Near Infrared Spectroscopy OMS - Organização Mundial de Saúde PCR - Principal Component Regression PLS - Partial Least Squares
RDC - Resolução de Diretoria Colegiada
RMSEP - Root Mean Square Error of Prediction USP - United States Pharmacopeia
SUMÁRIO
Capítulo 1 ... 19
1.Introdução ... 19
1.1.Vitaminas ... 19
1.2.Vitaminas do complexo B ... 21
1.2.1.Deficiência de vitaminas do complexo B ... 21
1.2.2.Toxicidade de vitaminas do complexo B... 22
1.2.3.Vitamina B1 - Tiamina ... 22
1.2.4.Vitamina B6 24 1.2.5.Vitamina B12 - Cobalamina ... 26
1.3.Técnicas analíticas para quantificação de vitaminas do complexo B ... 28
1.4.Espectroscopia vibracional ... 29
1.4.1.Infravermelho próximo - NIR ... 29
1.5.Espectroscopia NIR de imagem – NIR-CI ... 32
1.6.Resolução multivariada de curva com mínimos quadrados alternantes ... 34
Capítulo 2 ... 41
2.Objetivos ... 41
2.1.Objetivos Gerais ... 41
2.2.Objetivos específicos ... 41
Capítulo 3 ... 42
3.Determinação de concentração das vitaminas B1, B6 e B12 em multivitamínicos por espectroscopia na região do infravermelho próximo ... 42
3.1.Considerações gerais ... 42
3.2.Materiais ... 42
3.3.Condições operacionais da aquisição dos espectros e pré-processamento43 3.4.Amostra de referência ... 43
3.5.Preparo das amostras no laboratório ... 44 3.6.Amostras de calibração ... 44 3.7.Amostras de validação ... 45 3.8.Resultados e Discussões ... 46 3.9.Conclusões ... 55 Capítulo 4 ... 57 4.1.Considerações gerais ... 57 4.2.Materiais ... 59 4.3.Amostras de calibração ... 60 4.4.Amostras de validação ... 60 4.5.Amostras de referência ... 60
4.6.Amostras de referência dopada ... 61
4.7.Quantificação de vitamina B6 por NIR-CI em amostras de referência e amostras de referência dopada ... 62
4.8.Condições operacionais da aquisição dos espectros por imagem e pré-processamento ... 62
4.9.Resultados e Discussões ... 63
4.10.Restrição de correlação para quantificação do teor de Vitamina B6 ... 65
4.11.Análise das amostras de calibração ... 66
4.12.Análise das amostras de validação ... 68
4.13.Análise das amostras de referência e referência dopadas ... 70
Considerações finais ... 78
Referências ... 79
1. Introdução 1.1. Vitaminas
As vitaminas são compostos orgânicos essenciais para manter as funções metabólicas do organismo. Por não ser possível sintetizá-las endogicamente, é necessária uma dieta equilibrada, com a ingestão diária de frutas frescas, legumes, carnes, leite e ovos. Elas geralmente atuam como catalisadores, aumentando a taxa de várias reações no organismo.[1][2] As deficiências vitamínicas têm sido relacionadas a uma infinidade de doenças que podem ser até letais em alguns casos. [3]
Atualmente, existem mais de 18 fitonutrientes que foram classificados como vitaminas, como mostra a Tabela 1. Esses compostos estão agrupados de acordo com sua solubilidade. [4]
Tabela 1. Solubilidade e ingestão diária recomendada de 13 vitaminas. [3]
Vitamina Composto IDR1 Solubilidade
Provitamina A α-Caroteno β-Caroteno β-Criptoxantina 900 RAE 2 Solúvel em gordura D Calciferol 15 – 20 µg E Tocoferois Tocotrienois 15 mg K1 Filoquinona 90-120 µg B1 Tiamina 1,2 mg Solúvel em água B2 Riboflavina 1,3 mg B3 Niacina 14-16 mg B5 Ácido Pantotenóico 5 mg B6 Piridoxal 1,3-1,7 mg Piridoxina Piridoxamina B7 Biotina 30 µg B9 Ácido Fólico 400 µg B12 Cobalamina 2,4 µg C Ácido Ascórbico 75-90 µg
1. Ingestão diária recomendada 2. Atividade equivalente de retinol
Levando em consideração que nos países subdesenvolvidos e em desenvolvimento, bilhões de pessoas sofrem de fome e/ou desnutrição, as deficiências de vitaminas podem ser consideradas um dos principais problemas de saúde (Figura 1 e Figura 2).
Por exemplo, a deficiência de vitamina A pode levar à cegueira e ao aumento da mortalidade infantil. De acordo com Organização Mundial de Saúde (OMS), estima-se que 250 milhões de crianças pré-escolares são deficiente em vitamina A, e mais de 250 mil delas ficam cegas a cada ano. [3]
Outras doenças relacionadas à deficiência de vitamina são os distúrbios que incluem escorbuto (vitamina C), beribéri (vitamina B1), pelagra (vitamina B3) e anemia (vitamina B6). [3]
Já em países desenvolvidos, os distúrbios relacionados às deficiências vitamínicas não são significativos, devido ao suprimento adequado de frutas frescas e vegetais ou devido à biofortificação de alimentos. No entanto, com base na OMS, acredita-se que o consumo médio de frutas e legumes fica muito aquém da dieta recomendada. (Figura 1 e Figura 2)
Figura 1. Consumo médio per capita de vegetais, medido em relação às recomendações da Organização Mundial da Saúde (OMS), que varia de 200 a 250g por dia. [5] Em azul, países com uma ingestão média per capita abaixo de 250g por pessoa por dia; em verde, maiores que 250g. Dados de 2017.
Figura 2. Consumo médio per capita de frutas no mundo em 2013, medido em relação às diretrizes da Organização Mundial de Saúde (OMS), que recomenda 200g por dia. [5] Em azul, países com uma ingestão média per capita abaixo de 200g por pessoa por dia; em verde, maiores que 200g. Dados de 2017.
1.2. Vitaminas do complexo B
Todas as vitaminas do complexo B listadas na tabela 1, são solúveis em água [1][4] e suas funções são muito variadas, dentre as quais pode-se destacar: auxilio na conversão de glicose em energia, metabolismo de gorduras e proteínas, reparação e p,roliferação celular, da pele, cabelos, olhos, cicatrização de feridas periodontais, além de contribuírem para o funcionamento do sistema nervoso. Cada tipo de vitamina do complexo B desempenha um papel específico no organismo, mas a sua ação conjunta também é importante. [6]
Quando indicada, uma suplementação por vitamina do complexo B pode ser realizada de diferentes formas farmacêuticas, e sua administração pode ser mono ou multivitamínica. [7]
1.2.1. Deficiência de vitaminas do complexo B
Há uma série de sintomas e doenças associadas à deficiência de vitaminas do complexo B. A deficiência de vitamina B12 é associada à sangramentos gengivais [1] e pode causar disfunção neurológica [8], a deficiência de vitamina B1, à síndrome de Wernicke-Korsakoff em humanos (déficits graves de aprendizado e memória). [9] A deficiência de vitamina B6 leva à dermatite hemorrágica, anemia microcítica,
convulsões epilépticas, depressão, doença de Parkinson e função cognitiva prejudicada. [8][10]
Comumente, a deficiência de vitaminas do complexo B pode ser observada em lesões da mucosa oral como queilite angular e glossites, bem como em doenças da pele. [11]
1.2.2. Toxicidade de vitaminas do complexo B
As vitaminas do complexo B são facilmente solúveis em água e, portanto, o organismo não é capaz de estocá-las. São excretadas pela urina e, por isso, o nível de toxicidade dessas vitaminas é baixo, embora alguns efeitos colaterais sejam observados em altas dosagens de vitaminas, como: a presença de fezes escurecidas, dor abdominal, prisão de ventre, náusea, vômito, mudança na cor da urina, aumento da frequência urinária, vermelhidão na pele, comichão e calor excessivo. [1]
1.2.3. Vitamina B1 - Tiamina
A vitamina B1, também conhecida como tiamina, é comercializada na forma de sal, como nitrato de tiamina ou cloridrato de tiamina. As formas são sensíveis à temperatura, alcalinidade, oxidação, luz UV, sendo o nitrato mais estável. Essa estabilidade pode ser explicada pela diferença de solubilidade, pH da solução e energia de ativação para a degradação. [12]
Os dois sais agem como coenzimas para metabolizar carboidratos e cadeias ramificadas de aminoácidos, na digestão, no sistema nervoso e na contração muscular. A tiamina é essencial para o funcionamento ideal do sistema nervoso e repara as bainhas de mielina dos nervos, atuando também na biossíntese de neurotransmissores e na produção de substâncias anti-estresse. [6] Além disso, a tiamina também age na resposta ao estresse oxidativo, regulação de genes, colinérgicos no sistema imunológico, função imune, canais de cloreto e neurotransmissão. [13]
A sua estrutura consiste em um anel de pirimidina (2,5-dimetil-6-aminopirimidina) e um anel tiazólio (4-metil-5-hidroxietil tiazol) unido por uma ponte de metileno, como mostra a Figura 3. [14]
Figura 3. Estrutura do cloridrato de tiamina.
A ingestão diária recomendada (IDR) de tiamina varia para o homem e para a mulher, em função da diferença de tamanho e consumo de energia. Para um homem a partir dos 19 anos, a IDR é de 1,2 mg/dia; para uma mulher, com a mesma idade, a IDR é de 1,1 mg/dia [6]. A gravidez e lactação aumentam a necessidade de tiamina para 1,4 mg/dia e 1,5 mg/dia, respectivamente. [6]
Alguns alimentos são ricos em vitamina B1, como a levedura de cerveja, o gérmen de trigo, a semente de girassol e o leite de vaca. [13] Porém, mesmo tendo uma ingestão diária de alimentos ricos em tiamina, existem perdas consideráveis que ocorrem durante o cozimento ou outro tipo de processamento térmico dos alimentos, além de compostos polifenólicos presentes no café e no chá que podem inativar a tiamina. [14]
A deficiência de tiamina é mais comum em alcoólicos e em pacientes com anorexia nervosa. Os seres humanos geralmente apenas têm reservas corporais de tiamina capazes de sustentar a demanda metabólica por aproximadamente 2 semanas, que podem se esgotar com a baixa ingestão alimentar ou mais rapidamente se houver outras condições patologia. [13]
A sua falta leva ao aparecimento da doença beriberi e também à insuficiência cardíaca. [6]
Anel Tiazol
1.2.4. Vitamina B6
As vitaminas B6 são derivadas da 3-hidroxi-2-metilpiridina, com diferenças nos grupos na posição 4 do anel, e na presença ou ausência de fosforilação no grupo hidroximetil da posição 5’. A saber, as vitaminas B6 sem fosforilação são piridoxina (PN, hidroximetil), piridoxal (PL, formil) e piridoxamina (PM, aminometil), e suas estruturas são mostradas na Figura 4 A. O piridoxal (PL) e a piridoxamina (PM) possuem formas 5’-fosforiladas, ambas coenzimas, cujas estruturas se encontram na Figura 4 B. [15]
PN e PM e também as suas formas fosforiladas são predominantes em alimentos derivados de plantas, enquanto PL e suas formas fosforiladas são provenientes de alimentos derivados de animal. No leite de vaca, por exemplo, 14% da vitamina B6 é encontrada na forma ligada e 86% na forma livre. São sensíveis a luz, ao aquecimento e parcialmente dependentes do pH do meio. PM e PN são mais estáveis que PL, particularmente à luz. Em soluções neutras e alcalinas a vitamina B6 é destruída pela luz UV. Todas as formas são estáveis a temperatura em pH ácido. [15]
No caso da pasteurização do leite, ocorre a perda de vitamina B6 em até 8%; aquecimento posterior leva à perda de até 10% e processos de esterilização, à perda de até 50% da vitamina B6. [15]
(A)
Piridoxina Piridoxal Piridoxamina
(B)
Coenzima 5´-Fosfato-piridoxal (PLP) Coenzima 5´-Fosfato-piridoxamina (PLM)
Figura 4. Estruturas de (A) vitamina B6 e (B) coenzimas da vitamina B6.
A vitamina B6 funciona como coenzima em muitas reações envolvendo o metabolismo de aminoácidos, carboidratos e lipídios. [16] A dose recomendada é de 1,5 mg/dia e 1,2 mg/dia, em homens e mulheres respectivamente. [15]
A estrutura do insumo farmacêutico ativo cloridrato de piridoxina, utilizado em formulações farmacêuticas, se encontra na Figura 5.
Figura 5. Estrutura do ativo cloridrato de piridoxina.
Algumas fontes de B6 são: carnes, peixe, grãos, como mostrado na Figura 6, que apresenta a concentração de vitamina B6 em alimentos. [10] [11]
Figura 6. Concentração de vitamina B6 em alimentos. [15]
A sua deficiência dificilmente é detectada, porque os sintomas se assemelham muito à deficiência de niacina e riboflavina (dermatites, como a pelagra). Em algumas crianças, podem ocorrer problemas neurológicos [15], além de aumento do risco à doenças cardiovasculares, podendo causar sintomas como fraqueza e dor nas extremidades. [16]
Alguns medicamentos reduzem a concentração de B6 no organismo, especialmente quando administrados cronicamente como hidrazinas, antibióticos e contraceptivos orais. [15] Baixos níveis de vitamina B6 são encontrados em idosos, indivíduos com fraturas femorais traumáticas e alcoólatras. [16]
1.2.5. Vitamina B12 - Cobalamina
A vitamina B12, também conhecida como cobalamina, é essencial para o desenvolvimento da saúde dos nervos e das células vermelhas do sangue. [17] É a única vitamina que contém um elemento metálico, o cobalto. Sua estrutura se encontra na Figura 7. [18]
Figura 7. Estrutura da cianocobalamina.
A Vitamina B12 é encontrada em produtos de origem animal, como carnes e leite. A ingestão diária recomendada desta vitamina deve ser de 2,4 µg, que pode ser facilmente encontrada em um adulto saudável. [14] [15] Contudo, se a dieta é baseada apenas em vegetais, ocorrerá uma deficiência desta vitamina. Além disso, embora uma pequena quantidade da vitamina possa ser absorvida passivamente, a maior parte é absorvida ativamente no íleo terminal, sendo essencial o fator intrínseco para esse processo. Consequentemente, condições como ressecção ileal ou diminuição do fator intrínseco, frequentemente encontrado em idosos, podem resultar em má absorção da vitamina. [19]
A deficiência de vitamina B12 afeta milhões de pessoas no mundo, sendo considerado um problema de saúde pública. Embora uma ingestão restrita de vitamina B12 seja mais comum em países pobres, a baixa absorção da vitamina, especialmente em idosos, também é uma causa central. Como a população com idade superior a 60 anos vem crescendo, é esperado um aumento de casos de deficiência desta vitamina. [19]
A Vitamina B12 é sintetizada por bactérias que habitam o trato gastrointestinal de ruminantes, e esses são as principais fontes na dieta humana. Para pessoas com dietas veganas é necessário a suplementação desta vitamina que é produzida pela fermentação de cultura de bactérias. [2][13] [15]
A deficiência prolongada de vitamina B12 leva à anemia megaloblástica (glóbulos vermelhos maiores, mas em menor número) e a degeneração da medula
espinhal, conduzindo a fraquezas nos braços, pernas, perda da sensação de toque que pode ser acompanhada de mudança na visão. [21]
1.3. Técnicas analíticas para quantificação de vitaminas do complexo B
Os métodos mais modernos para a quantificação utilizados para vitaminas solúveis em água dependem de análises por cromatografia líquida hifenizada com ultravioleta (UV), fluorescência, arranjo de diodo e técnicas de detecção eletroquímica [4], como exemplo, temos as metodologias propostas pelas farmacopéias [22] e presentes na literatura [23] [24], Além disso, a utilização de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS) tem sido utilizada [4], devido a sua sensibilidade, principalmente para a determinação de vitaminas em matrizes complexas.
Mesmo havendo diversas técnicas analíticas para a quantificação de vitaminas do complexo B, a análises destas em associações tem sido um grande problema na indústria farmacêutica, visto a instabilidade desses compostos e a falta de metodologias rápidas, específicas e de baixo custo.
Desta forma, a utilização da espectroscopia na região do infravermelho próximo (NIRS) [33] têm despertado grande interesse na indústria farmacêutica tendo em vista a possibilidade de fornecer informações importantes sobre propriedades de interesse tanto na pesquisa e desenvolvimento de produtos, quanto no monitoramento e diagnóstico de processos, devido à sua rapidez, reduzida necessidade de preparo da amostra e por fornecer informações qualitativas e quantitativas de uma gama muito grande de produtos farmacêuticos [17],[18], na análise de alimentos [36], fornecendo informações químicas e físicas sobre a mesma, tais como tamanho de partícula, o grau de cristalinidade, o teor de umidade, a forma polimórfica etc. [18][21][22][23][24] Existem alguns estudos na literatura de métodos de quantificação por NIR para análise de vitamina C [25] [26] [27] [28] [29] , porém poucos estudos para a quantificação de vitaminas do complexo B [30].
1.4. Espectroscopia vibracional
A espectroscopia vibracional abrange a região do espectro eletromagnético
compreendida entre 13.000 cm-1e 10 cm-1 (Figura 8), envolvendo fótons com energia
entre 2,65 x 10-19 a 7,96 x 10-20 J [31] e fornece informações sobre os estados
vibracionais de energias das ligações químicas. A região do infravermelho é
subdividida em três regiões: infravermelho distante (FIR – 400 – 100 cm-1),
infravermelho médio (MIR – 4.000 – 400 cm-1) e infravermelho próximo (NIR – 13.000
– 4.000 cm-1).
Figura 8. Regiões do espectro eletromagnético.
Os espectros na região do infravermelho resultam de transições entre estados quantizados de energia. As vibrações moleculares podem variar desde o simples movimento acoplado de dois átomos de uma molécula diatômica até movimentos em estruturas mais complexas de moléculas polifuncionais. [32]
1.4.1. Infravermelho próximo - NIR
Os princípios da análise NIR diferem dos métodos analíticos convencionais, como cromatografia em fase gasosa (CG) ou cromatografia líquida de alta eficiência
(HPLC), tradicionalmente usados em análises farmacêuticas, pois geralmente é necessária uma análise quimiométrica adicional devido à complexidade dos espectros obtidos. [34] A sua atratividade se deve principalmente pela facilidade da amostragem, que permite análises de materias gasosos, líquidos, sólidos, fibras e placas sem a necessidade de preparo da amostra. [41] Além disso, neste tipo de análise, o medicamento é considerado como um objeto completo, no qual a composição complexa dos insumos farmacêuticos ativos (IFAs), excipientes e condições de fabricação são levados em consideração. [34]
A espectroscopia NIR tem sido descrita na Farmacopeia Europeia (EP) desde 1997, com o controle de desempenho do instrumento e o estabelecimento de uma biblioteca de referência espectral para fins qualitativos. Em seguida, houve a revisão em 1998 do capítulo geral da Farmacopéia Americana (USP) de espectrofotometria e espalhamento de luz e a publicação de uma diretriz para a qualificação de instrumentos NIR.
As vibrações moleculares nas regiões do infravermelho próximo consistem em sobretons e combinações de estiramentos e deformações de vibrações dos grupos
XH, XH2, ou XH3 (onde X representa C, N, O, dentre outros). [41] Os estiramentos
são definidos como mudanças contínuas na distância interatômica ao longo do eixo entre dois átomos, e a deformação é definida como mudança no ângulo entre dois átomos. [42] Observam-se sobretons (primeiro, segundo e terceiro, vide Figura 8), que são transições que ocorrem do nível vibracional fundamental (n= 0) para os níveis vibracionais superiores (n = 2,3,4,...). Também se observa nessa região bandas de combinação, formadas por acoplamentos de duas ou mais transições vibracionais. Suas intensidades diminuem com o um aumento na frequência da soma. [42]
As vibrações de estiramento ocorrem em frequências mais altas (comprimentos de onda mais baixos) do que as deformações, podendo ser simétricas ou assimétricas, no plano ou fora do plano, conforme mostrado na Figura 9. Da frequência mais alta para mais baixa, os modos vibracionais são: estiramento, deformação simétrica no plano, deformação simétrica fora do plano, deformação assimétrica fora do plano e deformação assimétrica no plano. [42]
Figura 9. Estiramento e deformação de moléculas.
Na mecânica quântica, uma molécula pode apenas absorver (ou emitir) um fóton de energia igual ao espaçamento entre dois níveis. Para o oscilador harmônico Figura 10 (dipolo envolvendo dois átomos), as transições podem ocorrer apenas de um nível para o próximo nível superior (ou inferior). O espectro infravermelho de qualquer molécula exibirá uma banda correspondente à frequência da energia na qual a radição foi absorvida. [42]
Figura 10. Oscilador harmônico. Baseada em [42].
Porém, pela diferença de massas dos átomos envolvidos na ligação química, as transições de sobretons que não seriam permitidas, ocorrem devido ao fenômeno da anarmonicidade mecânica, conforme mostrado na Figura 11.
Figura 11. Sobreposição dos modelos dos osciladores harmônico e anarmônico. Baseada em [42].
Como na região do NIR muitos sobretons e bandas de combinação estão sobrepostos, a atribuição direta dos sinais aos grupos químicos é mais difícil e o uso de métodos quimiométricos para o tratamento de dados torna-se muito importante. [31]
1.5. Espectroscopia NIR de imagem – NIR-CI
A utilização da espectroscopia NIR para geração de imagens hiperespectrais gerou a técnica de espectroscopia vibracional de imagem (NIR-CI – em inglês Near Infrared-Chemical Imaging), que possui como principal característica a obtenção de informação espacial diretamente na superfície da amostra. [31] O NIR-CI é uma técnica que tem a vantagem de fornecer uma grande quantidade de informação tanto espectral quanto espacial, enquanto a técnica de NIR convencional fornece somente um espectro médio da superfície de cada amostra. [43]
Nesta técnica, um espectrômetro convencional é acoplado a um microscópio, conforme mostrado na Figura 12, permitindo o mapeamento de uma determinada região da amostra. Uma determinada área de interesse ao longo da amostra é definida e dividida em sub-regiões regulares, denominadas pixels, sendo então obtido um espectro por pixel.
Figura 12. Equipamento Spotlight 400N FT-NIR Imaging System da Perkin-Elmer. (A) compartimento da óptica do equipamento de imagem; (B) espectrofotômetro NIR; (C) posicionador de amostra; (D) joystick controlador do posicionador de amostras.
Como a técnica de NIR-CI fornece um espectro por pixel em cada imagem adquirida (Figura 13) são obtidas informações sobre toda a superfície da amostra mapeada, podendo ser medido uma ampla faixa de comprimentos de onda em cada pixel. [44] O resultado é um conjunto de dados 3D, conhecido como hipercubo espectral Figura 13. Para a estrutura da matriz D (X.Y.λ), os eixos X e Y representam as informações espaciais, e o eixo λ corresponde ao perfil espectral (comprimento de onda). [28], [29] [45][46]
Do ponto de vista químico, a principal vantagem da espectroscopia de imagem é a obtenção de informação quanto a distribuição dos compostos nas amostras, implicitamente expressa através dos respectivos espectros em cada pixel, e não apenas informações referentes as composições globais dos compostos em toda a região amostral analisada, como acontece quando utilizando a espectroscopia convencional.
A espectroscopia NIR de imagem tem sido utilizada para diferentes finalidades na área farmacêutica, tais como: estudos de homogeneidade de amostras de pós [47], homogeneidade de comprimidos [48], determinação do tamanho das partículas [49], composição do produto, a determinação da concentrações e distribuição de componentes em comprimidos sólidos [50], uniformidade de conteúdo [43], para identificação de medicamentos falsificados [51], entre outros.
1.6. Resolução multivariada de curva com mínimos quadrados alternantes
Métodos de calibração multivariada são grupos de técnicas com o objetivo de desenvolver modelos matemáticos que relacionam múltiplos sinais instrumentais não seletivos com concentrações de analitos. [52] A calibração pode ser dividida em zero, primeira, segunda ordem, etc [32], conforme mostrado na Figura 14. Nas metodologias de primeira ordem é necessário um número alto de amostras e elas devem ter composição semelhante à amostra desconhecida, ou seja, contendo os mesmos interferentes. Como exemplo de calibração de primeira ordem, temos a regressão por componentes principais (PCR) e o mínimo quadrado parcial (PLS). [52]
Figura 14. Diferentes tipos de estrutura de dados analíticos. Baseada em [52].
Já na calibração de segunda ordem, é possível compensar possíveis interferências que não estão incluídas no conjunto de calibração, o que é uma vantagem. Como exemplo, temos o método de Resolução Multivariada de Curvas (MCR do inglês multivariate curve resolution), e é uma ferramenta quimiométrica que visa a resolução de respostas de componentes múltiplos em misturas desconhecidas, ou seja, não resolvidas. [52]
Para o método MCR, deve-se avaliar se o sinal analítico obedece a uma relação semelhante à lei de Beer [53], isso é, se os dados espectrais têm uma relação linear com a concentração. O MCR é focado na extração de informações relevantes de componentes puros em uma mistura, através de modelos de decomposição bilinear
da matriz de dados do experimento D no produto das matrizes C e ST contendo a
concentração de cada componente e os espectros puros, respectivamente (Figura 15). [52] [54] A variação residual dos dados fica contida na matriz de erros E. [55]
Figura 15. Representação matricial do modelo bilinear do MCR.
O modelo bilinear geral de MCR pode ser descrito pela Equação 1.
( D1 D2 ⋮ D ) = ( C1 C2 ⋮ C ) + ( E1 E2 ⋮ E ) Equação 1
Onde D1, D2, ..., Di, são, respectivamente as matrizes de dados com os
sinais misturados que correspondem i= 1, 2, ..., I, e C1, C2, ..., Ci, são as matrizes de
concentração com os perfis dos componentes resolvidos em i = 1, 2, ..., I; ST é a matriz
de perfis espectrais desses componentes e E1, E2, ..., Ei, correspondem ao erros
A fim de fornecer modelos bilineares, vários algoritmos foram desenvolvidos desde o início do MCR. Em geral pode-se classificá-los em dois grupos, não iterativos (NIMCR) e iterativos (IMCR). [32] Algoritmos não-iterativos buscam encontrar soluções únicas, na qual a variável pura é definida de acordo com modelos matemáticos. São métodos mais rápidos, baseados em um único passo de algoritmo, porém que apresentam limitações. Só pode-se utilizar a restrição da não-negatividade e não é possível estender à dados de ordem superior, ou seja, as soluções dos métodos NIMCR dependem diretamente do grau de sobreposição dos sinais dos componentes na mistura e da possibilidade de definição correta de suas janelas seletivas. [32]
O algoritmo ALS (mínimos quadrados alternados), que pertence ao grupo de algoritmos iterativos, são preferidos na Quimiometria por gerarem soluções com significado químico, uma vez que restrições da solução matemática podem ser introduzidas no processo de otimização. [32] Por essa razão, esse algoritmo foi utilizado neste trabalho. Para a utilização do MCR-ALS é necessário inicialmente
fornecer o número de componentes, e estimativas iniciais de C ou ST [56].Os cálculos
são iniciados com uma estimativa espectral (Equação 2), e então uma estimativa da concentração é obtida (Equação 3) [57] :
𝐂 = 𝐃(𝐒𝐓)+ Equação 2
𝐒𝐓 = 𝐂+𝐃 Equação 3
Onde (+) indica as pseudoinversas das matrizes.
O processo de otimização é conduzido resolvendo por iteração as duas equações e levando em consideração as restrições escolhidas. O processo termina
quando a convergência de CST for satisfatória (ou seja, os erros são pequenos e
dentro do valor previamente estipulado). Em caso negativo, o processo deve ser iniciado novamente até se obter uma convergência satisfatória. [32]
Resumindo, o MCR-ALS é um algoritmo de resolução baseado nos seguintes passos: [58]
1. Determinar o número de constituintes na imagem do material analisado;
2. Gerar estimativas iniciais (ST) com base na seleção dos espectros de pixels
3. Dado D e ST, calcular C, sob restrições;
4. Dado D e C, calcular a ST, sob restrições;
5. Reproduzir D, do produto de C e ST;
6. Verifique se a convergência é alcançada, caso contrário, voltar para o passo 3. A principal vantagem do algoritmo ALS é a facilidade com que as informações podem ser implementadas no processo de otimização e a capacidade de se trabalhar com um ou vários conjuntos de estruturas de dados (ou seja, a análise simultânea de vários conjuntos de dados). [59] No entanto, devido ao fato de o MCR-ALS não apresentar soluções únicas, o modelo pode sofrer limitações e incertezas, como por exemplo, ambiguidades. O conceito de ambiguidade significa que diferentes
combinações de conjuntos de perfis de concentração C e perfis de resposta ST podem
reproduzir o conjunto de dados original com a mesma qualidade de ajuste. [60] Podemos observar três tipos de ambiguidades: [60]
• Ambiguidade de permutação: onde não há uma ordem definida para os
componentes no MCR. Portanto pode-se permutar a matriz C com a ST e
obter resultados idênticos.
• Ambiguidade de intensidade: duplas de perfis com o mesmo formato, mas diferentes escalas entre o perfil de concentração e a resposta pura relacionadas. O perfil reproduz igualmente bem o conjunto de dados original. A Equação 4 e Equação 5 exemplificam isto:
D= ∑ i Equação 4 D= ∑ ( ki) ( 1 ki) i Equação 5
onde ki é o fator de escala que pode ser diferente em cada componente puro em um sistema.
• Ambiguidade rotacional: conjuntos de perfis de concentração e espectro com diferentes formatos podem reproduzir os conjuntos de dados originais com a mesma qualidade de ajuste. Este é o mais relevante tipo de ambiguidade e pode ser expresso por:
D = C + E Equação 6
D = (C )( -1 ) + E Equação 7
onde T é qualquer transformação na matriz fornecendo perfis que ainda obedeça às restrições definidas na otimização do MCR.
Uma tentativa de minimizar as ambiguidades é a utilização de restrições no modelo, que são introduzidas por meio de condições matemáticas que direcionam o processo de otimização do MCR para as soluções finais com significado químico [60].
A confiabilidade da maioria das soluções MCR depende dos tipos de restrições aplicadas ao modelo durante a resolução dos perfis de componentes puros. As restrições podem ser consideradas propriedades químicas ou matemáticas que os
perfis de concentração (C) e ou espectrais (ST) devem cumprir. Porém, quando um
perfil particular é restrito, sua forma é modificada para atender a propriedade pré-selecionada [32]. Se nenhuma restrição for considerada nas decomposições de matrizes bilineares, um número infinito de soluções possíveis poderá representar equivalentemente o conjunto de dados medidos, podendo afetar a precisão das quantificações do analito realizadas pelo método MCR. [52]
As restrições de não negatividade provavelmente são as mais frequentemente usadas em dados analíticos, mas outras formas de restrições também podem ser aplicadas como relacionadas à forma do pico ou ao padrão de eluição sequencial dos compostos. [32] Entre as restrições mais conhecidas temos: [60] [61]
• Não negatividade: os perfis são forçados a valores nulos ou positivos. Pode ser utilizado pela substituição dos valores negativos por zero ou algoritmos mais suaves;
• Unimodalidade: a presença de um único máximo por perfil é permitida; • Balanço de massa: aplica-se a alguns perfis de concentração de sistemas
de reação;
• Perfis de espectro / concentração puros conhecidos: um tipo de restrição de igualdade, que torna o perfil de concentração e / ou espectro de uma componente seja igual a uma determinada forma conhecida predefinida.
Figura 16. Exemplos de restrições no MCR: não negatividade, unimodalidade e balanço de massa. Baseada em [61].
Outra forma de auxiliar o controle de ambiguidades é a utilização da restrição de correlação. Esse tipo de restrição baseia-se na construção de um modelo de calibração univariada entre os valores de concentração calculados pelo MCR, que possuem unidades arbitrárias e os valores de referência das amostras de calibração. Então, esse modelo é utilizado para a previsão das concentrações das amostras de validação. Dessa maneira, os perfis de concentração são expressos em unidades de concentração reais, o que minimiza o efeito da ambiguidade rotacional. [60] Com isso pode-se criar um método de calibração multiproduto, uma vez que é criado um modelo de calibração único para cada analito presente na amostra.
Nesse tipo de restrição, em cada iteração os valores de concentração
obtidos pelo MCR-ALS para as amostras de calibração (𝒄𝑐𝑎𝑙𝐴𝐿𝑆) são regredidos contra
os valores de referência do composto de interesse presente na amostra (𝒄𝑐𝑎𝑙𝑟𝑒𝑓). [60]
conforme mostrado na Figura 17.
onde a é o coeficiente angular e b o coeficiente linear que são obtidos pelo ajuste
linear do modelo de regressão de mínimos quadrados entre 𝒄𝑐𝑎𝑙𝐴𝐿𝑆 e 𝒄𝑐𝑎𝑙𝑟𝑒𝑓 .
Os coeficientes a e b estimados pela regressão são então usados para calcular os valores de concentração das amostras nos conjuntos de calibração e da validação. Os valores previstos compõem um novo vetor de concentração que é enviado de volta ao processo iterativo do ALS para otimização adicional. Esse procedimento é repetido até que o critério de convergência seja atingido, resultado em um perfil de concentração único para o composto de interesse avaliado (Figura 17).
Figura 17. Esquema de implementação da restrição de correlação na otimização via MCR-ALS (Adaptado de Debus et al.)
2. Objetivos
2.1. Objetivos Gerais
O objetivo desta dissertação é a quantificação das vitaminas do complexo B em formulações farmacêuticas sólidas, empregando espectroscopia na região do infravermelho próximo no modo convencional ou pontual (NIR) e acoplada a espectro de imagem (NIR-CI) como alternativa a quantificação por cromatografia líquida, utilizando para o tratamento dos dados, o método de resolução multivariada de curvas com os mínimos quadrados alternados (MCR-ALS).
2.2. Objetivos específicos
Estudar a aplicação de NIR na área farmacêutica para quantificação de vitaminas em formulações multivitamínicas, utilizando as vitaminas do complexo B.
Estudar a aplicação de NIR por imagem (NIR-CI) para a quantificação e mapeamento de superfície de pastilhas de vitamina B6 em baixa dosagem.
Comparação dos resultados obtidos de vitamina B6 no NIR por imagem com o método cromatográfico, já bem estabelecido em farmacopeias.
3. Determinação de concentração das vitaminas B1, B6 e B12 em multivitamínicos por espectroscopia na região do infravermelho próximo
3.1. Considerações gerais
Os comprimidos e cápsulas multivitamínicos são usados regularmente em controle, alimentação inadequada e fortalecimento. Assim, é necessário o desenvolvimento de métodos analíticos precisos e eficientes para sua determinação, que são considerados problemáticos e muito difíceis devido à complexidade das matrizes em que são usualmente analisadas, à semelhança espectral e às razões de concentração variáveis. [62]
Existe um número limitado de métodos para análise de multivitamínicos, em geral, utilizando cromatografia líquida (HPLC), [62] que demandam muito tempo para a análise, por isso, é interessante o desenvolvimento de um método por espectroscopia NIR, mais rápida.
Os estudos foram direcionados para a análise de amostras sólidas (pastilhas) de multivitamínicos em diferentes formulações, baseadas em uma formulação de multivitamínico de referência (comercial).
3.2. Materiais
Para a realização desta parte foram utilizados os insumos farmacêuticos ativos:
• Cloridrato de tiamina (vitamina B1) do fabricante DSM; • Cloridrato de piridoxina (vitamina B6) do fabricante DSM; • Cianocobalamina – vitamina B12 do fabricante Sanofi. Como excipiente foi utilizado:
• Celulose microcristalina do fabricante Sigma-Aldrich.
3.3. Condições operacionais da aquisição dos espectros e pré-processamento
Os espectros foram obtidos diretamente na região da superfície das pastilhas usando o espectrômetro da Perkin Elmer 100N, no modo de reflectância, na
faixa espectral de 7000 a 4000 cm-1, com resolução de 8 cm-1. O tratamento dos dados
foi realizado em ambiente Matlab® 2016b. Os espectros obtidos para o conjunto de
calibração foram transformados de % Reflectância para absorbância, através de 𝐴 = log 1/𝑅, que é proporcional à concentração dos analitos.
O pré-processamento por meio da primeira derivada foi executado através do PLS Toolbox 8.1.1 e os modelos de resolução multivariada de curvas (MCR) foram obtidos usando o MCR-ALS GUI 2.0 [56], utilizando em todos os casos 4 fatores nos cálculos. Esse número de fatores é devido a constituição das amostras que possuíam 3 vitaminas e um excipiente.
3.4. Amostra de referência
Foi utilizado um medicamento de referência (comercial) como base para a IFAs e excipientes (Tabela 2).
Tabela 2. Formulação de uma drágea do medicamento referência.
Formulação Componente Concentração
[mg/drágea] IFA(*) Vitamina B1 100 Vitamina B6 100 Vitamina B12 5 Excipientes
Carbonato de cálcio; celulose microcristalina; cera alba; cera de carnaúba; galactomanan;
carmelose sódica; amidoglicolato de sódio; dióxido de silício; dióxido de titânio; estearato de magnésio; farinha de trigo; gelatina; glicerol; goma arábica; hietelose; laca vermelha; lactose;
povidona; sacarose; talco.
q.s.p(**)
3.5. Preparo das amostras no laboratório
Inicialmente foi determinado o peso-médio da drágea de referência pela pesagem de 20 drágeas (Tabela 3).
Tabela 3. Peso-médio, peso máximo, peso mínimo e desvio padrão em relação a média (DPR%) de amostras de referência.
Peso médio [mg] (N=20) 723,99
Peso mínimo [mg] 641,73
Peso máximo [mg] 786,40
DPR% (N=20) 4,71
Sendo DPR%, o desvio padrão em relação à média:
DPR%= DP
Média X 100
Equação 9
A partir do valor obtido do peso-médio da amostra de referência (723,99 mg) foi possível determinar a porcentagem de ativo em cada drágea, sendo aproximadamente 14,0 % (m/m) de vitamina B1 e B6, e 0,7 % (m/m) de vitamina B12. Para o preparo das amostras no laboratório, foram pesadas 5 diferentes massas de cada vitamina (B1, B6 e B12) à 50, 80, 100, 120 e 200 % (m/m) em relação a concentração teórica dos IFA´s (insumos farmacêuticos ativos) declaradas pelo fabricante da marca de referência (comercial).
Cada ativo foi adicionado a um frasco de 15 mL devidamente identificado. Em cada frasco foi adicionado o excipiente celulose microcristalina (que é um dos excipientes majoritários) até que a massa final fosse de 1400 mg. A amostra foi levada ao vórtex durante 5 minutos e utilizando uma prensa foram feitas três pastilhas de cada mistura.
3.6. Amostras de calibração
Segundo a resolução da Anvisa RDC Nº166 de 24 de julho de 2017, seção
IV, artigo 32 inciso I, [63] para análise de quantificação de teor de ativos em formulações de medicamentos deve-se utilizar a faixa de trabalho de no mínimo 80% a 120% da concentração teórica do ativo. Desta maneira, para a calibração foram
preparadas formulações nas concentrações de 50 a 200% da concentração teórica comercial de cada vitamina (Tabela 4) e as pastilhas preparadas por prensagem em triplicata. Esta faixa de concentrações mais ampla foi selecionada para avaliar a capacidade do MCR em resolver e quantificar os ativos em concentrações mais baixas e altas em relação a concentração teórica.
Tabela 4. Porcentagem dos IFA´s vitamina B1, vitamina B6, vitamina B12 e excipiente celulose microcristalina necessária para construção da curva de calibração no modelo MCR.
Amostra B1 [%m/m] B6 [%m/m] B12 [%m/m] Celulose microcristalina [%m/m] 50% 6,91 6,91 0,35 85,84 80% 11,05 11,05 0,55 77,35 100% 13,81 13,81 0,69 71,68 120% 16,62 16,62 0,83 65,93 200% 27,66 27,62 1,38 43,37 3.7. Amostras de validação
A validação é uma etapa necessária em todas as análises quantitativas baseadas na calibração de procedimentos e visa testar a qualidade e a capacidade preditiva de um modelo de calibração geral quando usado em novas amostras independentes.
A validação é realizada usando um conjunto de amostras conhecidas (conjunto de validação), de natureza semelhante àquelas usadas no conjunto de calibração e com as informações disponíveis sobre a concentração dos analitos. Os espectros das amostras de validação são enviadas para o modelo de calibração e as informações quantitativas recuperadas são comparadas com os valores reais da concentração de referência. Se o erro na previsão apresentar um valor satisfatório, o modelo está validado e pronto para ser usado para previsão em amostras desconhecidas.
Como amostras de validação foram preparadas 5 amostras das concentrações de 50%, 80%, 100%, 120% e 200% da concentração de cada IFA e lidas uma única vez cada.
Para avaliação dos resultados, foram calculados a porcentagem de recuperação dos ativos presentes nas amostras (Equação 10), o desvio padrão em relação à média ( DPR(%)) (Equação 9), o desvio padrão (DP) (Equação 11) e o erro relativo (Equação 12), dos valores previstos para cada amostra.
Recuperação (%)= cO cT x 100 Equação 10 DP=√(xi-x̅) 2 n-1 Equação 11 erro relativo = (VM-VT) VT Equação 12
onde 𝑐𝑜 é a concentração obtida recuperada pelo MCR, 𝑐𝑇 a concentração teórica, 𝑥𝑖
a recuperação obtida da amostra, 𝑥̅ a recuperação média da amostra , 𝑛 o número de observações, DP é o desvio padrão, VM é o valor medido e VT o valor teórico.
3.8. Resultados e Discussões
A Figura 18 apresenta os espectros puros das vitaminas B1, B6 e B12 e do excipiente utilizado, celulose microcristalina, antes do pré-processamento e após o pré-processamento pela primeira derivada. Observa-se uma melhora na diferenciação dos sinais e melhora na linha de base após o pré-processamento, por isso a primeira derivada foi utilizada.
Figura 18. Espectro médio dos compostos puros antes e após pré-processamento pela primeira derivada. (A) Cloridrato de tiamina (Vitamina B1); (B) Cloridrato de piridoxina (Vitamina B6); (C) Cianocobalamina (Vitamina B12); (D) Celulose microcristalina.
Foi realizada a eliminação na região entre 4500 a 5500 cm-1, pois nessa
região existe alta sobreposição de bandas o que dificultou a recuperação pelo MCR. A região está ilustrada na Figura 19.
Figura 19. Espectro médio dos compostos puros após pré-processamento por primeira derivada, mostrando a região eliminada do espectro, em azul.
Uma diferença em heterocíclicos, como na vitamina B1 (Figura 3) e na vitamina B6 (figura 5) em relação a aromáticos pode ser encontrada na região de
C-H entre 6300 e 5700 cm-1 (Figura 20) [42].
Figura 20. Espectro médio dos princípios ativos vitamina B1, B6 e B12 pura após pré-processamento por primeira derivada
Na região entre 4000 a 5000 cm-1 são observadas as bandas de C-H e
bandas de combinação de aromáticos. Na região de 6256 cm-1 (Figura 20) há a
presença de picos de amida primária e amidas secundárias em poliamidas devido ao primeiro sobretom de estiramento de banda fundamental C=O e ligação plana N-H observados na estrutura da Vitamina B12 (Figura 7).[42]
A quantificação das vitaminas nas matrizes de dados para a decomposição pelo modelo de MCR-ALS foi realizada colocando-se na matriz as triplicatas de cada concentração de cada ativo (50%, 80%, 100%, 120% e 200%) utilizadas na etapa de restrição de correlação seguidas pelos espectros de cada amostra a ser analisada, conforme observado na Figura 21.
Figura 21. Construção da matriz de dados para quantificação de cada uma das vitaminas.
Em relação aos resultados de quantificação das vitaminas, a Figura 22 apresenta um gráfico que mostra os valores esperados de concentração contra os valores obtidos pelo MCR para uma amostra na calibração. Esses gráficos apresentaram uma correlação linear superior a 0,95 e RMSEC inferiores a 1,0% para os IFA´s, mostrando-se um bom modelo para verificar a relação linear obtida no MCR para os IFA´s analisados.
Figura 22. Valores esperados contra previstos pelo MCR para os ativos e excipientes.
Foi possível calibrar e validar todas as amostras de multivitamínicos, nas concentrações entre 7 e 28% de Vitamina B1 e Vitamina B6 e as amostras de B12 de concentrações entre 0,3 e 1,4%. Nas tabelas abaixo, estão representados os valores médios de cinco medidas em diferentes amostras, desvio padrão, desvio padrão em relação à média, recuperação, R e RMSEC.
0 10 20 30 0 10 20 30 Pre vis to (% ) Esperado (%) Vitamina B1 r = 0,99637 RMSEC = 0,61053
0
1
2
0
0,5
1
1,5
Prev sito (% ) Esperado (%) Vitamina B12 r = 0,95069 RMSEC = 0,12655 0 20 40 0 10 20 30 Prev sito (% ) Esperado (%) Vitamina B6 r= 0,99675 RMSEC = 0,58531Tabela 5. Resultados de calibração e validação NIR – Pontual para amostras preparadas 50% da concentração teórica. Componente B1 B6 B12 Celulose DP 1,08 0,70 0,12 1,87 DPR [%] 14,52 9,92 38,49 2,20 Recuperação [%] 102,06 99,61 97,58 99,76 Erro relativo 0,021 -0,004 -0,024 -0,002 R [n=5] 0,9962 0,9981 0,9698 1,0798 RMSEC [n=5] 0,6249 0,4437 0,0976 1,4201
Tabela 6. Resultados de calibração e validação NIR – Pontual para amostras preparadas 80% da concentração teórica. Componente B1 B6 B12 Celulose DP 0,46 0,34 0,13 1,92 DPR [%] 3,96 2,89 23,68 2,49 Recuperação [%] 101,64 103,04 95,00 100,45 Erro relativo 0,016 0,030 -0,050 0,005 R [n=5] 0,9904 0,9982 0,9767 0,9955 RMSEC [n=5] 0,6054 0,4309 0,0949 1,4244
Tabela 7. Resultados de calibração e validação NIR – Pontual para amostras preparadas 100% da concentração teórica. Componente B1 B6 B12 Celulose DP 0,95 0,91 0,23 3,05 DPR [%] 6,60 6,23 23,91 4,36 Recuperação [%] 102,14 104,44 134,86 98,25 Erro relativo 0,021 0,044 0,349 -0,018 R [n=5] 0,9962 0,9982 0,9846 0,9959 RMSEC [n=5] 0,6212 0,4368 0,0597 1,3448
Tabela 8. Resultados de calibração e validação NIR – Pontual para amostras preparadas 120% da concentração teórica. Componente B1 B6 B12 Celulose DP 1,14 0,64 0,21 1,91 DPR [%] 6,46 3,48 21,18 3,05 Recuperação [%] 103,04 101,27 112,36 97,79 Erro relativo 0,030 0,013 0,124 -0,022 R [n=5] 0,9963 0,9982 0,9693 0,9953 RMSEC [n=5] 0,6139 0,4389 0,0987 1,4303
Tabela 9. Resultados de calibração e validação NIR – Pontual para amostras preparadas 200% da concentração teórica. Componente B1 B6 B12 Celulose DP 0,57 0,47 0,12 0,85 DPR [%] 1,99 1,62 8,45 2,03 Recuperação [%] 101,32 101,05 101,76 100,06 Erro relativo 0,013 0,011 0,018 0,001 R [n=5] 0,9964 0,9200 0,7952 1,0803 RMSEC [n=5] 0,6045 0,4331 0,0960 1,4254
A média dos espectros de cada concentração de vitamina na amostra encontram-se sobrepostos na Figura 23. É possível observar que ocorre variação de intensidade de sinal em todo o espectro conforme aumenta-se a concentração do IFA.
