Desinfestação de alecrim-pimenta utilizando hipoclorito de sódio.
Verônica F. Amancio1; Aline B. de Mendonça1*; Maria de F. Arrigoni-Blank1; Arie F.
Blank1; Ana da S. Ledo2; Renato Innecco3.
1UFS - Depto. de Eng. Agronômica, Av. Marechal Rondon s/n, 49100-000 São Cristóvão-SE; 2 Embrapa Tabuleiros Costeiros; 3 UFC - Depto. de Fitotecnia. afblank@ufs.br (Apoio: CNPq) (* Bolsista PIBIC/UFS).
RESUMO
O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de hipoclorito de sódio e tempos de imersão na desinfestação de L. sidoides, visando a futura conservação in vitro de germoplasma da espécie. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4 x 4, com quatro repetições. Avaliou-se o efeito de diferentes concentrações de hipoclorito de sódio (0,2; 0,4; 0,6 e 0,8%) e tempos de imersão (8, 12, 16 e 20 minutos). O meio de cultura básico utilizado foi o MS, acrescido de 30 g L-1 de sacarose e 7 g L-1 de ágar. Após a inoculação, os frascos com os explantes
foram colocados em sala de crescimento com temperatura controlada de 25 + 2 C e fotoperíodo de 16 horas luz. A solução de 0,8% de hipoclorito de sódio e os tempos de imersão de 12 e 16 minutos proporcionaram os melhores resultados quanto ao desenvolvimento de brotações e os menores índices de contaminação e oxidação.
Palavras-chave: Lippia sidoides; micropropagação; oxidação, contaminação.
ABSTRACT
Influence of sodium hypoclorite concentrations and immersion time on disinfection of
Lippia sidoides Cham.
The objective of this work was to evaluate the effect of different sodium chlorite concentrations and immersion time on disinfection of L. sidoides, aiming the future in vitro conservation of this specie. The completely randomized experimental design in a factorial scheme 4 x 4, with four replications was utilized. The effect of different sodium chlorite concentrations (0.2; 0.4; 0.6 and 0.8%) and immersion time (8, 12, 16 and 20 minutes) were evaluated. The basic MS medium added with 30 g L-1 of sucrose and 7 g L-1 of agar. After
inoculation the flasks with explants were maintained in grow room with controlled temperature of 25 + 2C and 16 hour light photoperiod. The 0.8% sodium chlorite solution and 12 and 16 minutes of immersion proportionate the best results for shoot development and lower index of contamination and oxidation.
Lippia sidoides Cham., pertencente à família Verbenaceae, é encontrada em todo o
Nordeste brasileiro, principalmente nos Estados do Ceará, Pernambuco e Rio Grande do Norte. Popularmente chamada de alecrim-pimenta, estrepa-cavalo, alecrim-do-nordeste, alecrim-bravo e alecrim-grande, é um subarbusto ou arbusto caducifólio, ereto, muito ramificado e quebradiço, de 2-3 m de altura, próprio da vegetação do semi-árido nordestino do Brasil (Lorenzi e Matos, 2002).
As folhas juntamente com as flores constituem a parte medicinal desta planta (Matos, 2000). Sua utilização é feita com a aplicação local do chá ou a tintura diluída, em forma de gargarejo ou bochecho, nas infecções da garganta e da boca, ou em lavagens vaginais, como desodorante e anti-séptico íntimo (Lorenzi e Matos, 2002). A tintura das folhas pode ser usada de forma tópica, em ferimentos e afecções da pele e do couro cabeludo (Matos, 2000). Ambas preparações são muito eficientes como medicação de uso externo para tratar acne, sarna infectada, pano branco, impingem, caspa e o mau-cheiro de pés, axilas e virilhas (Lorenzi e Matos, 2002).
O estudo químico do óleo essencial de L. sidoides mostrou presença de timol e carvacrol em alta concentração (Macambira et al., 1988; Costa et al., 2001). O óleo essencial da planta submetido a ensaio contra fungos e bactérias demonstrou atividade antimicrobiana (bactericida, bacteriostática, fungicida e fungistática) (Aguiar et al., 1984; Costa et al., 2001).
A propagação da L. sidoides é assexuada e se dá preferencialmente via estaquia, usando-se, de preferência, os ramos mais jovens (Lorenzi e Matos, 2002).
Em trabalho com Maytenus ilicifolia Mart., os segmentos nodais e apicais de plântulas com um ano de idade, mantidas em casa de vegetação, foram lavados em água corrente por duas horas, desinfestados em solução contendo álcool 70% durante 15 segundos e solução de hipoclorito de sódio 1% com 2 gotas de detergente durante 15 minutos. Posteriormente, foram lavados em água destilada e autoclavada, resultando em baixo índice de oxidação (1,5%) (Flores et al., 1998).
O objetivo do presente trabalho foi avaliar diferentes concentrações de hipoclotiro de sódio e tempos de imersão na desinfestação de Lippia sidoides, visando a futura conservação in vitro de germoplasma da espécie.
MATERIAL E MÉTODOS
A produção das mudas foi feita por estaquia, retirando-se as estacas das matrizes do Horto de Plantas Medicinais da Fazenda Experimental “Campus Rural da UFS”, localizado no município de São Cristóvão-SE. As estacas foram plantadas em bandeja de poliestireno com 72 alvéolos, utilizando-se o substrato terra vegetal + esterco bovino +
biofertilizante Vitasolo, na proporção de 1:1:1, em volume, e colocadas em estufa agrícola
protegido com tela sombrite 30%, com irrigação por aspersão. Após 70 dias, as mudas foram transplantadas para vasos de 5,5 litros com o substrato acima citado e mantidas na mesma estufa agrícola. Antes da coleta, as mudas foram pulverizadas com uma solução de Benomyl a 2 g L-1.
O ensaio foi realizado no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais e Melhoramento Vegetal do Departamento de Engenharia Agronômica (DEA) da Universidade Federal de Sergipe (UFS), localizado no município de São Cristóvão-SE, Brasil.
O meio de cultura utilizado foi o meio básico MS, estabelecido por Murashige e Skoog (1962), acrescido de 30 g L-1 de sacarose e 7 g L-1 de ágar. O pH do meio foi
ajustado para 5,71, solidificado com ágar e submetido a autoclavagem por 15 minutos a uma temperatura de 1211oC e pressão de 1,05 atm. As culturas foram mantidas em sala
de crescimento com temperatura controlada de 252oC, fotoperíodo de 16 horas de luz e
intensidade luminosa de 30 mol.m-2.s-1.
Utilizou-se como explantes segmentos nodais provenientes de plantas de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.) com cinco meses de idade, cultivadas em tela sombrite 30%. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4 x 4, com quatro repetições. Avaliou-se o efeito de quatro concentrações de hipoclorito de sódio (0,2; 0,4; 0,6 e 0,8%) e quatro tempos de imersão (8, 12, 16 e 20 minutos). Cada repetição constituiu-se de um frasco com meio de cultura, contendo três explantes.
Os ramos mais jovens foram coletados no período da manhã (entre seis e sete horas) e colocados num frasco com água destilada. No laboratório, foram lavados em água corrente durante uma hora, com a retirada do excesso de lâminas foliares. Em seguida, os segmentos nodais foram colocados em um recipiente com 10 gotas de detergente por 1L de água, durante dez minutos, com agitação e, posteriormente, lavados três vezes com água destilada para remoção do detergente. Na sala de inoculação, os segmentos foram submersos em álcool etílico 70% durante 30 segundos e, em seguida, lavados três vezes com água destilada e autoclavada para assim receberam os tratamentos. Após a aplicação dos tratamentos, os recipientes foram levados à câmara de fluxo laminar, onde os segmentos receberam três lavagens com água destilada e autoclavada. Em seguida, com o auxílio de um bisturi e uma pinça, constantemente flambados, os explantes foram seccionados com cerca de 10 a 15 mm de comprimento e inoculados em frascos de 250 mL com tampa antifúngica, contendo 20 mL do meio básico MS (Murashige e Skoog, 1962).
Aos 30 dias após implantação do ensaio, avaliou-se as variáveis contaminação (%), oxidação (%), número de brotações e número de folhas. Os dados obtidos foram
submetidos a análises de variância pelo teste F e, quando significativas, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey (p < 0,05).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Observa-se na Tabela 1 que houve diferença significativa entre as concentrações de hipoclorito de sódio para as variáveis oxidação, número total de folhas e número de folhas por brotação. A interação entre concentração de hipoclorito de sódio e tempo de imersão foi significativa para a porcentagem de oxidação dos explantes (Tabela 1).
TABELA 1. Resumo da análise de variância para as variáveis oxidação, contaminação, número total de brotações, número total de folhas e número de folhas por brotação de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.), em função da concentração de hipoclorito de sódio e tempo de imersão. São Cristóvão-SE, UFS, 2004.
Fontes de Variação GL QM
Oxidação Contaminação Número debrotações Número defolhas No de folhas porbrotação Hipoclorito de sódio (H) 3 1267,264** 1035,866 6,229 152,640* 11,617* Tempo de imersão (T) 3 202,565 1498,958 3,604 79,266 7,724
H x T 9 603,682* 2193,404 3,160 38,599 4,250
Erro 48 260,417 1603,039 3,104 50,359 4,146
* significativa a 5% de probabilidade; ** significativa a 1% de probabilidade.
Para as variáveis contaminação e número total de brotações não houve diferença significativa em função dos fatores testados (Tabelas 1 e 2). A concentração de 0,8% de hipoclorito de sódio promoveu alta emissão de folhas (11,375) e número de folhas por brotação (3,447), sugerindo que esta concentração foi responsável por uma alta desinfestação dos explantes, permitindo o desenvolvimento das folhas (Tabela 2).
Apesar de não terem sido observadas diferenças significativas para os tempos de imersão, observa-se na Tabela 3 que os tempos de 12 e 16 minutos promoveram menor porcentagem de contaminação.
TABELA 2. Contaminação (%), número total de brotações, número total de folhas e número de folhas por brotação de explantes de alecrim-pimenta (L. sidoides Cham.), em função de diferentes concentrações de hipoclorito de sódio. São Cristóvão-SE, UFS, 2004.*
Hipoclorito de
sódio (%) Contaminação (%) Número debrotações Número defolhas Número de folhaspor brotação
0,2 56,250 a 1,250 a 4,625 b 1,401 b
0,4 47,917 a 1,625 a 5,437 ab 2,169 ab
0,6 52,083 a 1,375 a 5,750 ab 2,573 ab
0,8 37,200 a 2,625 a 11,375 a 3,447 a
* Valores com letras iguais, nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p 0,05).
TABELA 3. Contaminação (%), número total de brotações, número total de folhas e número de folhas por brotação de explantes de alecrim-pimenta (L. sidoides Cham.), em função de diferentes tempos de imersão em hipoclorito de sódio. São Cristóvão-SE, UFS, 2004.*
Tempo de
Imersão (min.) Contaminação (%) Número debrotações Número defolhas Número de folhaspor brotação
8 52,084 a 1,250 a 5,062 a 2,401 a
12 39,583 a 2,062 a 8,812 a 3,010 a
16 41,666 a 2,187 a 8,625 a 2,754 a
20 60,417 a 1,375 a 4,687 a 1,425 a
* Valores com letras iguais, nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p 0,05).
Em relação à variável oxidação, houve interação entre o tempo de imersão e concentração de hipoclorito de sódio. A imersão por 8 minutos na concentração de 0,4% apresentou a maior porcentagem de oxidação (33,33%) (Tabela 4). A concentração de 0,8% de hipoclorito de sódio utilizada no processo de assepsia mostrou-se eficiente no controle da oxidação em todos os tempos testados (Tabela 4). Dentro dos tempos de imersão de 12 e 20 minutos não houve diferenças significativas entre as concentrações de hipoclorito de sódio (Tabela 4).
Em trabalho com Maytenus ilicifolia, espécie medicinal com alta taxa de oxidação, Flores et al. (1998) obtiveram baixos índices de oxidação (1,5%) utilizando 1% de hipoclorito de sódio por 15 minutos. Em protocolo de micropropagação de Ananas comosus, Teixeira et al. (2001) recomendam 0,5 a 1,0% de hipoclorito de sódio durante 10 a 20 minutos na obtenção de mudas. Os resultados acima descritos foram confirmados neste ensaio, onde a concentração de 0,8% de hipoclorito de sódio e 12 ou 16 minutos de tempo de imersão mostraram-se eficientes no controle da contaminação e oxidação de explantes de alecrim-pimenta.
TABELA 4. Porcentagem média de oxidação de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.), em função da interação da concentração de hipoclorito de sódio e do tempo de imersão. São Cristóvão-SE, UFS, 2004.*
Tempo de Imersão (min.) Hipoclorito de sódio (%) 10 20 30 40 % Oxidação 8 16,667 a AB 33,330 a A 0,000 a B 0,000 a B 12 8,332 a A 0,000 b A 16,665 a A 0,000 a A 16 33,332 a A 0,000 b B 25,000 a AB 0,000 a B 20 24,997 a A 0,000 b A 16,665 a A 0,000 a A
* Valores com letras iguais, minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p 0,05).
LITERATURA CITADA
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