The next generation sequencing

(1)

The next generation

sequencing

Cesar Martins (cmartins@ibb.unesp.br) Departamento de Morfologia

Instituto de Biociências , UNESP Universidade Estadual Paulista Botucatu, SP

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Sequenciamento de próxima geração

1 - melhor custo-benefício para projetos de alta demanda de dados; 2 custo por bp muito menor;

3 sequenciamento muito mais rápido e eficiente (> 40 Gbase/corrida). 4 versatilidade Genomas, expressão gênica, diagnóstico, gen. população, epigenética, metagenômica, entre outros

Análise genômica 2013

The next generation technologies

Roche 454

Solid

Illumina/Solexa

Ion Torrent

PacBio

Nanopore

Sequenciamento de

segunda geração

Sequenciamento de

terceira geração

Sequenciamento de

quarta geração

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5.292,39 0,09 -500,00 500,00 1.500,00 2.500,00 3.500,00 4.500,00 5.500,00 Se pte m be r-2001 Mar ch -2002 Se pte m be r-2002 Mar ch -2003 O cto be r-2003 Ja nu ar y-2004 Apr il-2004 Ju ly -2004 O cto be r-2004 Jan ua ry -2005 Apr il-2005 Jul y-2005 O cto be r-2005 Jan ua ry -2006 Apr il-2006 Jul y-2006 O cto be r-2006 Jan ua ry -2007 Apr il-2007 Jul y-2007 O cto be r-2007 Jan ua ry -2008 Ap ril -2008 Jul y-2008 O cto be r-2008 Jan ua ry -2009 Apr il-2009 Jul y-2009 O cto be r-2009 Jan ua ry -2010 Apr il-2010 Jul y-2010 O cto be r-2010 Jan ua ry -2011 Apr il-2011 Jul y-2011 Jan -2 01 2 (E ST ) http://genome.gov/splash.htm

CUSTO DO SEQUENCIAMENTO POR BASE

Roche 454 Illumina Solid e Helicos Análise genômica 2013 95.263.072 7.950 0 10.000.000 20.000.000 30.000.000 40.000.000 50.000.000 60.000.000 70.000.000 80.000.000 90.000.000 100.000.000 Se pt em be r-2001 Mar ch -2002 Se pte m be r-2002 Mar ch -2003 O cto be r-2003 Jan uar y-2004 Apr il-2004 Ju ly -2004 O cto be r-2004 Januar y-2005 Apr il-2005 Ju ly -2005 O cto be r-2005 Jan uar y-2006 Apr il-2006 Ju ly -2006 O cto be r-2006 Jan uar y-2007 Apr il-2007 Ju ly -2007 O cto be r-2007 Jan uar y-2008 Apr il-2008 Ju ly -2008 O cto be r-2008 Jan uar y-2009 Ap ril -2009 Ju ly -2009 O cto be r-2009 Jan uar y-2010 Apr il-2010 Ju ly -2010 O cto be r-2010 Jan uar y-2011 Apr il-2011 Jul y-2011 Jan -2 01 2 (E ST )

Genoma humano U$ 2 bi; ~3 bilhões bp; 11 anos; ~12X Genoma U$ 2.500,00; ~1 bilhão bp; alguns dias; ~40X

CUSTO DO SEQUENCIAMENTO POR GENOMA

http://genome.gov/splash.htm

Roche 454 Illumina

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e on DNA sequencing t echnology. Nat ur e, 2011.

Mardis. Science 2011 100 Gbase

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Kahn SD. Science 2011

Genoma humano - ~3 bilhões x 1= ~800 Alberts, 10 anos

Genoma da tilápia- ~1 bilhão x 40= ~40 bilhões = ~10.600 Alberts, alguns dias

Antes e hoje

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Objetivo rastrear as variações genéticas em populações humanas

Objetivo gerar conhecimento sobre o genoma de câncer com o intuito de gerar tratamentos e diagnósticos

Hoje

Objetivo analisar o genoma de 10 mil espécies de vertebrados

Hoje

Objetivo analisar o genoma de 5 mil espécies de insetos e outros artrópodos

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Maiores problemas dos

sequenciamentos em

larga escala!!!

Estocagem Montagem Análise Análise genômica 2013

454 Roche

Vídeo http://www.wellcome.ac.uk/Education- resources/Teaching-and-education/Animations/DNA/WTX056046.htm

Illumina

Vídeo http://www.wellcome.ac.uk/Education- resources/Teaching-and-education/Animations/DNA/WTX056051.htm

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Sequenciamento de

segunda geração

Roche 454

Solid

Illumina/Solexa

Ion Torrent

Análise genômica 2013 2004-2005

Roche 454 Life science

Utiliza tecnologia de pirosequenciamento - 1986

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Princípio

Mecanismo do

Pirosequenciamento

ATP-sulfurilase Conversão PPi ATP

Luciferase Usa ATP p/ converter luciferina oxyluciferina =

LUZ

Apirase degrada os ATPs e nucleotideos livres

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Zhou et al., 2010. Protein Cell http://www.youtube.com/watch?v=bFNjxKHP8Jc http://www.youtube.com/watch?v=JNqXgLKOzKU Biotin tag Streptavidin Análise genômica 2013

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Amplificação maciça utilizando

uma emulsão com milhares de

beads de agarose, com primers

ancoradores aos adapt. A reação

de PCR é realizada e o sequen.

ocorre na placa PTP (picotite

plate).

Roche GS FLX System

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12 SOLiD

Life Technologies

Emulsion PCR 13 2 Overview of Sequencing Technology Platforms

which the sequencing reactions begin. These high-throughput sequencing systems,

with the exception of PacBio RS, require

cation of the sequencing library

DNA to form spatially distinct and detectable sequencing features (Fig.

2.3 ).

cation can be performed in situ, in emulsion or in solution to generate

clus-ters of clonal DNA copies. Sequencing is performed using either DNA polymerase

synthesis for uorescent nucleotides or the ligation of uorescent oligonucleotides

Fig. 2.3 Generation of sequencing features. High-throughput sequencing systems have taken

different approaches in the generation of the detectable sequencing features. ( a ) Emulsion PCR is applied in the GS FLX and SOLiD systems. Single enrichment bead and sequencing library fragment are ed inside an aqueous reaction bubble. PCR is then applied to populate the surface of the bead by clonal copies of the template. Beads with immobilized clonal DNA collections are deposited onto a Picotiter plate (GS FLX) or on a glass slide (SOLiD). ( b ) Bridge-PCR is used to generate the in situ clusters of ed sequencing library fragments on a solid support. Immobilized cation primers are used in the process. ( c ) Rolling circle cation is used to generate long stretches of DNA that fold into nanoballs that are arrayed in the CGA technology. ( d ) Biotinylated DNA polymerase binds to bubble adapted template in the PacBio RS system. Polymerase/template complex is immobilized on the bottom of a zero mode w ave guide (ZMW)

P1andP2 adaptors http://gtc.soe.ucsc.edu/content/solid-technology-overview

SOLiD

Life Technologies

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Comparando metodologias

454, Solid

Illumina

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Não utiliza scaner e câmeras

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1 dNTP de cada vez

ñ utiliza nucleotídeos modificados e cascatas enzimáticas ñ utiliza detecção óptica (fluorescência e

quimioluminescência)

Chip: Array of microwells

DETECÇÃO DO SINAL

Chip: Array of microwells

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ISFET IonSensitiveField-EffectTransistor

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http://www.youtube.com/user/iontorrent

DETECÇÃO DO SINAL

PacBio RS sequencer

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Nanopore

Sequenciamento de quarta

geração

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Constituintes Principais

Camada lipídica

Constituintes Principais

Exonuclease

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Oxford Nanopore

Technologies, based in Oxford, UK expects to start selling its new machine in the second half of this year and also plans to launch the

sequencer the MinION which

will retail for less than US$900.

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Plataf. Comp (bp) Tempo de corrida (dias)

Gb por corrida Prós Contras

FLX

500-1kb 0,35 0,45 Reads longos; agilidade

Alto custo dos reagentes; alto erro *Illumina 100-150 9 35 Plataforma mais

utilizada

Baixa capacidade multiplexar amostras SOLiD 3 50 14 50 Sistema de correção

de erros

Demora na corrida PacificBioscience 3-20kb ? ? Reads mais longos Alto erro Nanopore 100kb 15 min ? Reads mais longos Alto erro

* HiSeq2000 gera um output com 600 Gb por corrida. Maior output atual.

...5ª geração, quando

será que sai??!!

Sequenciamento de próxima geração, 2ª, 3ª, 4ª geração!!!! AHHHHHH...

Assim eu não aguento!!!

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Análise genômica 2013

08-11 de Julho de 2013

Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, SP Curso de Férias