UTILIZAÇÃO PRETENDIDA

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Onclarity HPV Assay

UTILIZAÇÃO PRETENDIDA

O BD Onclarity HPV Assay (teste de HPV) é um teste de ADN amplificado para a deteção qualitativa dos tipos de alto risco do vírus do papiloma humano (HPV). O teste deteta todos os tipos de HPV de alto risco (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68) e possibilita a genotipagem de seis tipos de alto risco (HPV 16, 18, 31, 45, 51 e 52). As amostras cervicais que podem ser testadas com o BD Onclarity HPV Assay incluem o BD Onclarity HPV Cervical Brush Collection Kit (kit de colheita de escova cervical), BD SurePath Preservative Fluid (fluido conservante) e PreservCyt Solution (utilizando uma alíquota removida antes ou após o processamento para o teste de citologia BD SurePath ou ThinPrep Pap test). O BD Onclarity HPV Assay é realizado no BD Viper LT System.

RESUMO E EXPLICAÇÃO

O vírus do papiloma humano (HPV) é o vírus sexualmente transmitido mais comum em todo o mundo e 50% dos indivíduos sexualmente ativos apresentam HPV genital numa dada altura da vida. Muitas pessoas não sabem que estão infetadas e não tomam precauções para evitar a transmissão do vírus para outros. Existem mais de 40 tipos de HPV que podem infetar a região genital.1 Em muitos casos, as infeções de HPV são transitórias e o organismo elimina o vírus sozinho. No entanto, em alguns casos, o vírus é persistente e altera células normais para células anormais, resultando em cancro. Estes tipos oncogénicos de HPV são classificados de alto risco e incluem o HPV 16 e 18. Outros tipos são considerados de baixo risco, uma vez que não parecem levar ao aparecimento de cancro. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), o HPV é a segunda principal causa de mortalidade feminina devido a cancro ao nível mundial, sendo responsável por cerca de 250.000 mortes por ano. Só na Europa, esta doença é responsável por 15.000 mortes por ano.2 Foi estimado que cerca de 70% dos cancros cervicais são causados pelo HPV do tipo 16 e 18.3

Atualmente, os testes de citologia permitem aos médicos determinar se existem alterações nas células do colo do útero. Se essas células forem anómalas, pode ser realizado um teste do HPV para determinar se as alterações cervicais são provocadas por uma estirpe do HPV que pode resultar em cancro do colo do útero. Nem todos os testes moleculares têm a capacidade de distinguir entre os diferentes tipos de HPV.

O BD Onclarity HPV Assay, quando utilizado BD Viper LT System, consiste num teste de ADN amplificado para a deteção qualitativa dos tipos de alto risco do vírus do papiloma humano (HPV). O teste deteta os tipos de HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68 e, em simultâneo, permite a identificação dos tipos de alto risco 16, 18, 31, 45, 51, 52 e outros genótipos de alto risco notificados pelo grupo de genótipo (P1: 33/58; P2: 56/59/66; P3: 35/39/68). As amostras cervicais que podem ser testadas com o BD Onclarity HPV Assay incluem o BD SurePath Preservative Fluid (utilizando uma alíquota removida antes ou após o processamento para o teste de citologia BD SurePath Pap test), PreservCyt Solution (utilizando uma alíquota removida antes ou após o processamento para o teste de citologia PreservCyt Pap test) e o BD Onclarity HPV Cervical Brush Collection Kit. PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO

O BD Onclarity Human Papillomavirus (HPV) Assay foi concebido para ser utilizado com o BD SurePath Preservative Fluid (utilizando uma alíquota removida antes ou após o processamento para o teste de citologia BD SurePath Pap test), PreservCyt Solution (utilizando uma alíquota removida antes ou após o processamento para o teste de citologia PreservCyt Pap test) e o BD Onclarity HPV Cervical Brush Collection Kit, os reagentes aplicáveis, o BD Viper LT System e BD FOX Extraction. As amostras são submetidas a um passo de pré-aquecimento no BD Pre-warm Heater (aquecedor de pré-aquecimento) para homogeneizar a matriz, efetuar a lise das células e libertar o ADN para extração e amplificação. Após o arrefecimento, as amostras são colocadas no BD Viper LT System, o qual efetua todos os passos envolvidos na extração e amplificação do ADN alvo, sem mais necessidade de ação do utilizador. A amostra pré-aquecida é transferida para um tubo de extração que contém partículas de óxido férrico numa película dissolúvel. Em seguida, é adicionado ácido para reduzir o pH e induzir uma carga positiva no óxido férrico, o qual, por sua vez, se liga ao ADN com carga negativa. Em seguida, as partículas e o ADN ligado são puxados para as paredes do tubo de extração por ímanes e a amostra processada é aspirada para os resíduos. As partículas são lavadas e é adicionado um tampão de separação com um pH elevado para separar o ADN purificado. Por último, é utilizado um tampão de neutralização para ajustar o pH da solução separada a um valor ideal para a amplificação de ADN. O BD Onclarity HPV Assay baseia-se na amplificação e deteção simultâneas de ADN alvo, utilizando “primers” de amplificação e sondas de deteção com marcação fluorescente e a reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. Os reagentes são secados em três tubos (G1, G2 e G3) com capacidade de deteção dos 14 genótipos HPV e um controlo interno derivado da amostra, constituído por um fragmento de ADN do gene humano da beta-globina. Cada tubo individual contém os “primers” de amplificação, sondas de deteção com marcação fluorescente, ADN-polimerase, nucleótidos e outros reagentes necessários para a amplificação nos respetivos ensaios. O BD Viper LT System utiliza pipetas para transferir uma porção da solução de ADN purificado em cada tubo de extração para os três tubos BD Onclarity HPV PCR (G1, G2 e G3), os quais são seguidamente selados para impedir a contaminação. A presença ou ausência de ADN HPV é determinada pelo ciclo de PCR em que o sinal atinge um limiar pré-estabelecido. Além deste processo, o ensaio efetua a extração, amplificação e deteção de um fragmento do gene humano da beta-globina, o qual funciona como um controlo interno para avaliar o processamento da amostra, extração e amplificação.

REAGENTES E MATERIAL FORNECIDO:

Cada BD Onclarity HPV Assay Reagent Pack (embalagem de reagentes de ensaio) contém:

BD Onclarity HPV G1 PCR tubes (tubos), 2 x 96: cada tubo de PCR G1 contém aproximadamente 32,5 pmol de oligonucleótidos, 20 pmol de sondas de deteção com marcação fluorescente, 80 nmol dNTPs e 0,52 unidades de ADN-polimerase com componentes tampão e estabilizadores.



8089899(04) _2014-10

 442946 Português



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BD Onclarity HPV G3 PCR tubes, 2 x 96: cada tubo de PCR G3 contém aproximadamente 42,5 pmol de oligonucleótidos, 25 pmol de sondas de deteção com marcação fluorescente, 80 nmol dNTPs e 0,52 unidades de ADN-polimerase com componentes tampão e estabilizadores.

NOTA: Cada bolsa contém uma saqueta exsicante.

Control Set for the BD Onclarity HPV Assay (conjunto de controlo para o ensaio): 24 BD Onclarity HPV Positive Control tubes (tubos de controlo positivo) contendo aproximadamente 14.430 cópias de plasmídeos linearizados HPV 16, 8.325 cópias de plasmídeos linearizados HPV 18, 8.418 cópias de plasmídeos linearizados HPV 56 e 3.885 cópias de um plasmídeo com a sequência do gene humano da beta-globina em ácido nucleico de transporte, e 24 BD Onclarity HPV Negative Control tubes (tubos de controlo negativo) contendo apenas ácido nucleico de transporte. As concentrações do ácido nucleico de transporte e dos plasmídeos são determinadas por espectrofotometria.

BD Onclarity HPV Liquid Based Cytology Specimen (LBC) Diluent Tubes (tubos de diluente para amostras para citologia de base líquida): 400 tubos, cada um com aproximadamente 1,7 mL de tampão com sal, detergente e conservante.

BD FOX PCR Extraction Tubes (tubos de extração): 48 tiras de 8 tubos, cada um com aproximadamente 10 mg de óxido de ferro numa película dissolúvel.

BD Viper PCR Extraction Reagent Trough with Piercing Tool (canal de reagentes de extração com ferramenta de perfuração): cada Extraction Reagent Trough (canal de reagentes de extração) de 5 cavidades contém aproximadamente 16,5 mL de ácido ligante, 72,5 mL de tampão de lavagem, 25,4 mL de tampão de separação, 19,4 mL de tampão de neutralização com conservante e 15,5 mL de solução de neutralização de resíduos.

APARELHO, EQUIPAMENTO E ACESSÓRIOS

Material Fornecido: BD Onclarity HPV Cervical Brush Collection Kit (kit de colheita de escova cervical), aparelho BD Viper LT, BD Viper LT Instrument Plates (placas do aparelho), BD Viper LT Pipette Tips (pontas de pipeta), BD Viper LT Solid Waste Liners (recipientes de resíduos sólidos), BD Viper LT System PCR Tube/Tray Kit (kit de tabuleiro/tubos de PCR), BD Viper LT System PCR Accessory Kit (kit de acessórios para PCR), BD Viper Pre-warm Heater (aquecedor de pré-aquecimento), BD Viper LT Specimen Rack (suporte de amostras), BD Viper Neutralization Pouches (bolsas de neutralização), tubos de amostra e tampas para utilização no BD Viper System (Modo de Extração), BD ProbeTec Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/GC) Amplified DNA Assay Endocervical Specimen Collection and DRY TRANSPORT Kit (kit de colheita de amostras endocervicais e de TRANSPORTE A SECO para ensaio de ADN amplificado).

Material Necessário Mas Não Fornecido: Luvas de nitrilo, pipetas de deslocamento, pontas de polipropileno resistentes a aerossóis com a capacidade de administração de 0,5 ± 0,05 mL, misturador de vortex, hipoclorito de sódio a 0,5% (v/v), hipoclorito de sódio a 1% (v/v), peróxido de hidrogénio a 3% (p/v), álcool isopropílico, água graduada para biologia molecular isenta de nucleases.

Requisitos de Conservação e Manuseamento: O BD Onclarity HPV LBC Diluent (diluente para LBC) e o BD Onclarity HPV Cervical Brush Diluent (diluente para escova cervical) devem ser conservados a 2 – 25 °C. Todos os outros reagentes podem ser conservados a 2 – 33 °C. As embalagens de reagentes não abertas permanecerão estáveis até ao fim do prazo de validade. Depois da abertura de uma bolsa, os tubos de PCR permanecerão estáveis durante 4 semanas, desde que estejam corretamente selados ou até ao fim do prazo de validade, o que ocorrer primeiro. Não congelar.

ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES 1. Para uso diagnóstico in vitro.

2. Podem existir microrganismos patogénicos nas amostras clínicas, incluindo os vírus de hepatite e o vírus da imunodeficiência humana. No manuseamento de todos os itens contaminados com sangue e outros fluidos corporais, devem ser seguidas as “Precauções padrão”4-7_{e as diretrizes da instituição. Para obter advertências, precauções e observações adicionais} específicas para o BD Viper LT, consulte o Manual do Utilizador do Sistema BD Viper LT.

Amostra:

3. Para amostras de citologia em base líquida, utilize apenas os BD Onclarity HPV LBC Diluent Tubes (tubos de diluente). 4. Para amostras de escova cervical, utilize apenas o BD Onclarity HPV Cervical Brush Collection Kit (kit de colheita de escova

cervical).

5. Para obter um desempenho ideal do BD Onclarity HPV Assay, é necessário efetuar corretamente a colheita, a manipulação e o transporte das amostras.

6. Para reduzir a possibilidade de hemorragia desnecessária, não rode a escova cervical em demasia durante a colheita da amostra.

7. Todas as amostras enviadas para o laboratório deverão estar corretamente identificadas.

8. Ao partir a haste da escova cervical, tenha o cuidado de evitar o derramamento ou a criação de aerossóis. Evite contaminar a cabeça da escova cervical.

9. Tenha cuidado para evitar contaminação cruzada durante os passos de preparação da amostra. Certifique-se de que os recipientes de amostra não entram em contacto entre si, e elimine os materiais usados sem os passar por cima de recipientes abertos. Se as luvas entrarem em contacto com uma amostra, mude imediatamente de luvas para evitar a contaminação cruzada.

10. Uma administração insuficiente ou excessiva de amostra LBC num tubo de BD Onclarity HPV LBC Diluent poderá afetar o desempenho do ensaio. O enchimento excessivo dos tubos pode também resultar no extravasamento de líquido na plataforma do BD Viper LT, podendo resultar em contaminação.

11. As amostras cervicais devem ser colhidas e testadas antes do fim do prazo de validade do tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent ou do tubo BD Onclarity HPV Cervical Brush Diluent.

12. Utilize apenas pontas de pipeta de polipropileno resistentes a aerossóis para transferir amostras para os tubos BD Onclarity HPV LBC Diluent.

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Ensaio/Reagente:

13. Os BD Onclarity HPV Positive e Negative Controls (controlos positivos e negativos) têm de ser pré-aquecidos no prazo de 24 horas após a hidratação.

14. Utilize apenas tubos de amostras e de controlo com tampas perfuráveis no BD Viper LT System. Não retire as tampas perfuráveis antes da execução no aparelho. Certifique-se de que as tampas perfuráveis perfuradas são substituídas por tampas perfuráveis novas antes da execução no aparelho.

15. Não troque nem misture reagentes provenientes de kits com números de lote diferentes.

16. Não teste o tubo BD Onclarity HPV Cervical Brush Diluent se este for recebido no laboratório sem a escova. Poderá ocorrer um resultado de teste falso negativo.

17. Utilize apenas as pontas de pipeta BD Viper LT fornecidas pela BD juntamente com o BD Viper LT System.

18. BD Viper PCR Extraction Reagent Trough with Piercing Tool (canal de reagentes de extração com ferramenta de perfuração) PERIGO

H314 Provoca queimaduras graves e danos oculares. H302 Nocivo por ingestão.

P260 Não respirar as poeiras/fumos/gases/névoas/vapores/aerossóis. P280 Usar luvas de proteção/vestuário de proteção/proteção ocular/proteção facial. P303/361/353 SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE (ou o cabelo):

Despir/retirar imediatamente toda a roupa contaminada. Enxaguar a pele com água/tomar um duche. P304/340 EM CASO DE INALAÇÃO: Retirar a vítima para uma zona ao ar livre e mantê-la em repouso numa posição que não dificulte a respiração. P405 Armazenar em local fechado à chave. P501 Eliminar o conteúdo/recipiente de acordo com os regulamentos

locais/regionais/nacionais/internacionais.

19. Utilize apenas BD Viper LT Clear Plate Sealers (vedantes de placas transparentes) nos tubos de PCR com o BD Viper LT System.

20. As bolsas de reagentes com tubos de PCR não utilizados DEVEM ser cuidadosamente seladas novamente após a abertura. Antes de selar novamente as bolsas de reagentes, confirme a presença de um exsicante.

21. Os tubos de PCR DEVEM ser devidamente selados com os BD Viper LT Clear Plate Sealers antes de remover a placa do BD Viper LT System. A selagem garante uma reação fechada para a amplificação e a deteção, além de ser necessária para evitar a contaminação do aparelho e da área de trabalho com produtos da amplificação. Não retire o material vedante dos tubos de PCR em nenhum momento.

22. Para evitar a contaminação do ambiente de trabalho com produtos da amplificação, utilize os sacos de eliminação fornecidos no BD Viper LT System PCR Accessory Kit (kit de acessórios para PCR) para eliminar os tubos de PCR testados. Certifique-se de que os sacos estão bem fechados, antes de os eliminar.

23. Apesar de não serem necessárias áreas de trabalho dedicadas, devido ao facto de o desenho do BD Viper LT reduzir a possibilidade de contaminação por produtos de amplificação no ambiente de teste, são necessárias outras precauções para controlar a contaminação, especialmente para evitar a contaminação de amostras durante a preparação.

24. TROQUE AS LUVAS se estas entrarem em contacto com a amostra ou parecerem estar molhadas, para evitar contaminar outras amostras. Troque as luvas antes de sair e ao entrar na área de trabalho.

25. Em caso de contaminação, consulte as instruções de limpeza no Manual do Utilizador do Sistema BD Viper LT.

26. Contacte a Assistência Técnica e Suporte da BD se ocorrerem situações invulgares, tais como derrame no aparelho BD Viper LT ou contaminação com ADN que não possa ser removida através de limpeza.

COLHEITA E TRANSPORTE DE AMOSTRAS

As amostras cervicais que podem ser testadas com o BD Onclarity HPV Assay incluem o BD Onclarity HPV Cervical Brush Collection Kit, BD SurePath Preservative Fluid (utilizando uma alíquota removida antes ou após o processamento para o teste de citologia BD SurePath) e solução PreservCyt Solution (utilizando uma alíquota removida antes ou após o processamento para o teste de citologia ThinPrep).

Nas expedições dentro dos EUA e internacionais, as amostras devem ser identificadas de acordo com os regulamentos estatais, federais e internacionais aplicáveis ao transporte de amostras clínicas e agentes etiológicos/substâncias infeciosas. Durante o transporte, devem ser mantidas as condições de temperatura e duração.

COLHEITA DE AMOSTRAS DE ESCOVA CERVICAL

1. Insira a BD Onclarity HPV Cervical Brush (escova cervical) no endocérvix até que apenas as cerdas inferiores se encontrem exportas no orifício cervical. Rode lentamente entre ¼ e ½ de volta apenas num sentido. Para reduzir a possibilidade de hemorragia desnecessária, não rode a escova em demasia.

2. Remova a tampa do tubo de BD Onclarity HPV Cervical Brush Diluent e coloque imediatamente a escova no tubo. 3. Quebre cuidadosamente a haste pela marca. Evite derramar o conteúdo.

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CONSERVAÇÃO E TRANSPORTE DAS AMOSTRAS DE ESCOVA CERVICAL

As amostras de escova cervical nos tubos BD Onclarity HPV Cervical Brush Diluent devem ser conservadas e transportadas para o laboratório e/ou local de teste no prazo de 30 dias após a colheita, quando conservadas a 2 – 30 °C, ou no prazo de 30 dias após a colheita, quando forem mantidas congeladas a -20 °C. A conservação e transporte das amostras não deve exceder o prazo de validade do tubo Cervical Brush Diluent.

COLHEITA DE AMOSTRAS LBC

As amostras BD SurePath ou PreservCyt devem ser colhidas utilizando um dispositivo de colheita do tipo vassoura ou com uma combinação de escova/espátula endocervical, tal como descrito no folheto informativo BD SurePath ou PreservCyt. Após a colheita, as amostras BD SurePath ou PreservCyt podem ser conservadas e transportadas nos frascos originais durante um máximo de 30 dias a 2 – 30 °C, ou durante 30 dias quando mantidas congeladas a -20 °C, antes de transferir para os tubos BD Onclarity HPV LBC Specimen Diluent.

CONSERVAÇÃO E TRANSPORTE DE AMOSTRAS LBC

Transferência de Amostras LBC para os Tubos BD Onclarity HPV LBC Diluent - Antes ou Após a Remoção de uma Alíquota para Processamento para o Teste BD SurePath ou ThinPrep.

É transferida manualmente uma alíquota de 0,5 mL da amostra BD SurePath ou PreservCyt do frasco original para o tubo BD Onclarity HPV LBC Specimen Diluent antes ou após o processamento para o teste de citologia BD SurePath ou ThinPrep. Utilize luvas durante o manuseamento do tubo BD Onclarity HPV LBC Specimen Diluent e do frasco de amostra de BD SurePath ou PreservCyt. Se as luvas entrarem em contacto com a amostra, troque as luvas imediatamente para evitar a contaminação de outras amostras.

Transferência de Amostras BD SurePath Antes ou Após Processamento para o Teste BD SurePath

NOTA: Consulte o folheto informativo do BD PrepStain Slide Processor (processador de lâminas) ou do BD Totalys SlidePrep para obter instruções sobre a remoção de uma alíquota do frasco de amostra BD SurePath antes de executar o teste de citologia de base líquida BD SurePath.

NOTA: Manuseie apenas uma amostra de cada vez para processamento.

1. Coloque uma etiqueta no tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent com as informações de identificação do paciente. 2. Retire a tampa do tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent.

3. Para garantir uma mistura homogénea, misture o frasco de amostra BD SurePath em vortex durante 10 a 20 segundos. 4. Utilizando uma ponta resistente a aerossóis, transfira rapidamente 0,5 mL do frasco da amostra para o tubo BD Onclarity

HPV LBC Diluent, no período de um minuto após mistura em vortex. 5. Elimine a ponta da pipeta.

NOTA: É necessário utilizar uma ponta de pipeta diferente para cada amostra. 6. Aperte bem a tampa do tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent.

7. Inverta o tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent 3 a 4 vezes para garantir que a amostra e o diluente são bem misturados. Transferência de Amostras PreservCyt Antes ou Após Processamento no teste de citologia ThinPrep

NOTA: Consulte a Adenda do Manual do Utilizador do Sistema ThinPrep 2000/3000 para obter instruções sobre a remoção de uma alíquota do frasco de amostra PreservCyt antes de executar o teste ThinPrep.

NOTA: Manuseie apenas uma amostra de cada vez para processamento.

1. Coloque uma etiqueta no tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent com as informações de identificação do paciente. 2. Retire a tampa do tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent.

3. Para garantir uma mistura homogénea, misture o frasco de amostra PreservCyt em vortex, a uma velocidade elevada, durante 8 a 12 segundos.

4. Utilizando uma ponta resistente a aerossóis, transfira imediatamente 0,5 mL do frasco da amostra para o tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent.

5. Elimine a ponta da pipeta.

NOTA: É necessário utilizar uma ponta de pipeta diferente para cada amostra. 6. Aperte bem a tampa do tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent.

7. Inverta o tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent 3 a 4 vezes para garantir que a amostra e o diluente são bem misturados. Conservação e Transporte de Amostras Transferidas para os Tubos BD HPV LBC Diluent

Após a transferência manual para um tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent, a amostra diluída pode ser conservada a 2 – 30 °C durante um máximo de 15 dias, ou durante um máximo de 30 dias a -20 °C.

PROCEDIMENTO DE PROCESSAMENTO PARA TODAS AS AMOSTRAS

NOTA: Se amostras estiverem congeladas, certifique-se de que são totalmente descongeladas à temperatura ambiente e misturadas por inversão antes de prosseguir.

1. Utilize o Tube Layout Report (relatório de configuração de tubos) para colocar as amostras por ordem no BD Viper LT Specimen Rack (suporte de amostras) e bloquear a posição.

2. As amostras estão prontas para serem pré-aquecidas.

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PREPARAÇÃO DO CONTROLO DE QUALIDADE

1. Destape um BD Onclarity HPV Negative Control (controlo negativo) e um tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent. 2. Verta todo o conteúdo do tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent no BD Onclarity HPV Negative Control.

3. Volte a tapar o BD Onclarity HPV Negative Control reidratado. Volte a tapar e elimine o tubo vazio BD Onclarity HPV LBC Diluent.

4. Destape um tubo BD Onclarity HPV Positive Control (controlo positivo) e um tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent. 5. Verta todo o conteúdo do tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent no BD Onclarity HPV Positive Control.

6. Volte a tapar o BD Onclarity HPV Positive Control reidratado. Volte a tapar e elimine o tubo vazio BD Onclarity HPV LBC Diluent.

7. Utilize o Tube Layout Report para colocar o BD Onclarity HPV Negative Control reidratado na posição correta no BD Onclarity LT Specimen Rack.

8. Utilize o Tube Layout Report para colocar o BD Onclarity HPV Positive Control reidratado na posição correta no BD Onclarity LT Specimen Rack.

9. Os controlos estão preparados para pré-aquecimento em conjunto com as amostras. NOTA: Os devem ser pré-aquecidos no prazo de 24 horas após a hidratação.

PROCEDIMENTO DE PRÉ-AQUECIMENTO

NOTA: O procedimento de pré-aquecimento deve ser aplicado a todas as amostras para assegurar que a matriz de amostra é homogénea antes do carregamento no BD Viper LT System. Se o pré-aquecimento não for realizado corretamente, o desempenho do BD Onclarity HPV Assay e/ou BD Viper LT System poderá ser afetado.

NOTA: As amostras refrigeradas ou congeladas devem ser descongeladas completamente à temperatura ambiente antes do pré-aquecimento.

1. Introduza o BD Viper LT Specimen Rack (suporte de amostras) no BD Pre-warm Heater (aquecedor de pré-aquecimento) e selecione o protocolo de pré-aquecimento BD Onclarity HPV Assay no aparelho BD Viper LT.

2. O BD Pre-warm Heater efetua automaticamente o pré-aquecimento de amostras e controlos de acordo com o protocolo de pré-aquecimento BD Onclarity HPV Assay.

3. Após a conclusão do protocolo de pré-aquecimento BD Onclarity HPV Assay, retire o suporte do aquecedor e introduza-o no aparelho BD Viper LT.

4. Consulte a secção “Procedimento de teste” para obter instruções sobre o teste de amostras e controlos.

5. Após o pré-aquecimento, as amostras podem ser conservadas durante um máximo de 7 dias a 2 – 30 °C, ou durante um máximo de 30 dias a -20 °C sem pré-aquecimento adicional antes do teste no BD Viper LT System.

6. Após o pré-aquecimento, os controlos podem ser conservados durante um máximo de 24 h a 2 – 30 °C sem pré-aquecimento adicional antes do teste no BD Viper LT System.

PROCEDIMENTO DE TESTE

Consulte o Manual do Utilizador do Sistema BD Viper LT para obter instruções específicas sobre utilização e manutenção dos componentes do sistema. Foi demonstrado que as condições ambientais óptimas para o ensaio HPV se situam entre 18 e 27 °C com valores de humidade relativa entre 20 e 85%.

CONTROLO DE QUALIDADE

O controlo da qualidade tem de ser realizado de acordo com os regulamentos ou as exigências de acreditação aplicáveis locais e/ou nacionais e os procedimentos de Controlo da Qualidade em vigor no laboratório. É recomendado que o utilizador consulte as orientações do CLSI e os regulamentos da CLIA pertinentes sobre as práticas de controlo de qualidade apropriadas.

O Conjunto de Controlo para o BD Onclarity HPV Assay é fornecido separadamente. Deve ser incluído um Controlo Positivo e um Controlo Negativo em cada execução de ensaio e por cada novo número de lote de kit de reagentes. Os controlos têm de ser posicionados de acordo com o Manual do Utilizador do Sistema BD Viper LT. O Controlo Positivo HPV apenas deteta falhas substanciais dos reagentes. O Controlo Negativo HPV monitoriza a contaminação de reagentes e/ou ambiental. Podem ser testados controlos adicionais conforme exigido pelas diretrizes ou requisitos dos regulamentos ou organizações de acreditação locais, nacionais e/ou comunitários.

Informações Gerais de CQ para o BD Viper LT System:

A localização dos tubos de PCR é indicada num ecrã de disposição da placa com código de cores no monitor LCD. O símbolo mais (+) dentro do tubo indica uma amostra de CQ positiva. O símbolo menos (-) dentro do tubo indica uma amostra de CQ negativa. É necessário registar um par de CQ para cada número de lote de kit de reagentes. Se os pares de CQ não forem registados corretamente, é apresentada uma caixa de mensagem que não permite guardar o suporte nem prosseguir com a execução até à correção da situação. É possível registar tubos de CQ adicionais (opcionais) para teste. Estes tubos são testados como amostras normais e não afetam o estado Pass/Fail (Aprovado/Não aprovado) do ensaio. Consulte o Manual do Utilizador do Sistema BD Viper LT para obter instruções.

NOTA: Os Controlos BD Onclarity HPV devem ser hidratados manualmente antes de os carregar no BD Viper LT Specimen Rack (suporte de amostras).

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Interpretação dos Resultados do Controlo de Qualidade:

O BD Onclarity HPV Positive Control e BD Onclarity HPV Negative Control devem apresentar um resultado de teste positivo e negativo, respetivamente, para que seja possível obter resultados do paciente. Se o desempenho dos controlos não for o esperado, o processamento de ensaio é considerado inválido e o instrumento não apresenta os resultados do paciente. Se qualquer um dos controlos não fornecer os resultados esperados, repita toda a execução com um novo conjunto de controlos, novos tubos de extração, novo canal de extração de reagentes e novos tubos de PCR. Se o problema não for resolvido, contacte a Assistência Técnica e Suporte da BD para obter mais informações.

Quadro 1: Interpretação dos Resultados do Controlo de Qualidade

Tipo de controlo Símbolo do Tube Result Report Disposição CQ

BD Onclarity HPV Positive Control OK CQ aprovado

BD Onclarity HPV Positive Control CQ não aprovado

BD Onclarity HPV Negative Control OK CQ aprovado

BD Onclarity HPV Negative Control CQ não aprovado

Consulte “Interpretação dos resultados do teste” para obter uma descrição dos símbolos do Tube Result Report (relatório de resultados do tubo).

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS DO TESTE

O BD Onclarity HPV Assay utiliza a reação em cadeia da polimerase em tempo real para detetar a presença do vírus do papiloma humano (HPV) em amostras clínicas. Todos os cálculos são efetuados automaticamente pelo software BD Viper LT. A presença ou ausência de ADN HPV com relevância clínica é determinada pelo ciclo de PCR (Ct) em que o sinal atinge um limiar pré-estabelecido. O ensaio efetua a extração, amplificação e deteção de um fragmento do gene humano da beta-globina, o qual funciona como um controlo interno para avaliar o processamento da amostra, extração e amplificação, e para indicar a presença de inibidores da PCR. Se o sinal específico do HPV for superior ao limiar de um ciclo, o controlo interno é utilizado pelo algoritmo na interpretação do resultado. Se o sinal específico do HPV for inferior ou igual ao limiar de um ciclo, o controlo interno é ignorado pelo algoritmo.

Nas amostras de HPV, um resultado “HR” (a combinação de todos os genótipos) é apresentado no Tube Results Report. Um símbolo positivo nesta coluna indica que um ou mais genótipos detetáveis pelo ensaio HPV apresentou um resultado positivo. A coluna “GT” é utilizada para indicar resultados para genótipos não disponíveis na região do utilizador. Estes resultados não podem ser adquiridos.

São indicados genótipos específicos e genótipos combinados nas colunas. Se os resultados para um genótipo tiverem sido adquiridos, esses resultados são apresentados conforme descrito abaixo. Se os resultados para um determinado genótipo não estiverem configurados para compra automática, esses resultados são ocultados com um símbolo de chave.

O aparelho pode ser configurado para adquirir/apresentar genótipos específicos quando a execução é concluída. Consulte o Manual do Utilizador do Sistema BD Viper LT para obter instruções sobre a autorização do relatório automático de genótipos. Se os resultados do controlo do ensaio forem diferentes do esperado, os resultados do paciente não são apresentados. Consulte a secção “Controlo da qualidade” acerca dos valores de controlo esperados. Os resultados apresentados são determinados como indicado a seguir.

Quadro 2: Interpretação dos Resultados de Teste de Genótipos HPV de Alto Risco para o BD Onclarity HPV Assay

Resultado HPV de Alto Risco Interpretação Resultado

HR Positivo para tipos HPV de alto risco (HR) Positivo para HPV HR HR Negativo para tipos HPV de alto risco Negativo para HPV HR

ADN HPV indetetável, mesmo que presente. Falha do controlo interno ADN HPV indetetável, mesmo que presente. Falha na transferência da extração ADN HPV indetetável, mesmo que presente. Falha do nível de líquido ADN HPV indetetável, mesmo que presente. Erro

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Quadro 3: Interpretação dos Resultados de Teste de Genótipos HPV Específicos para o BD Onclarity HPV Assay Resultado de Genótipo

HPV

Interpretação Resultado

16 Positivo para HPV tipo 16 HPV tipo 16 Positivo

16 Negativo para HPV tipo 16 HPV tipo 16 Negativo

P1 Positivo para HPV tipos 33 e/ou 58 HPV tipo 33 e/ou 58 Positivo P1 Negativo para HPV tipos 33 e/ou 58 HPV tipo 33 e/ou 58 Negativo

P2 Positivo para HPV tipos 56, 59 e/ou 66 HPV tipo 56, 59 e/ou 66 Positivo P2 Negativo para HPV tipo 56, 59 e/ou 66 HPV tipo 56, 59 e/ou 66 Negativo

P3 Positivo para HPV tipos 35, 39 e/ou 68 HPV tipo 35, 39 e/ou 68 Positivo P3 Negativo para HPV tipos 35, 39 e/ou 68 HPV tipo 35, 39 e/ou 68 Negativo GT Resultado(s) de Genótipo HPV Positivo não disponível _{na sua região} Resultado(s) de Genótipo HPV Positivo _restrito

GT Resultado(s) de Genótipo HPV Negativo não disponível _{na sua região} Resultado(s) de Genótipo HPV Negativo _restrito Resultado de genótipo HPV disponível para compra Resultado de genótipo bloqueado

▬ ▬ Resultado de genótipo HPV não disponível para compra

Resultado HPV Negativo, Falha do controlo interno, Falha do nível do líquido ou Falha na transferência da

extração Monitorização da Presença de Contaminação por ADN

Pelo menos uma vez por mês, deve ser efetuado o procedimento de teste descrito em seguida, com vista a monitorizar a área de trabalho e as superfícies do equipamento relativamente à contaminação com ADN. A monitorização ambiental é essencial para detetar a contaminação antes que se desenvolva um problema.

1. Por cada área a testar, utilize uma zaragatoa de colheita limpa do BD ProbeTec Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/GC) Amplified DNA Assay Endocervical Specimen Collection and DRY TRANSPORT Kit.

2. Verta um pouco de água graduada para biologia molecular isenta de nucleases num pequeno recipiente limpo. 3. Mergulhe a zaragatoa na água graduada para biologia molecular isenta de nucleases e limpe a primeira área com um

movimento de varrimento amplo.

4. Remova a tampa de um tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent e introduza a zaragatoa no diluente. Agite a zaragatoa no BD Onclarity HPV Diluent durante 5 – 10 s para misturar. Pressione a zaragatoa contra a parede interior do tubo, de forma a que o líquido escorra para o fundo do tubo.

6. Remova cuidadosamente a zaragatoa do tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent para evitar salpicos. Elimine a zaragatoa. 7. Volte a tapar o tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent com a tampa perfurável preta, apertando bem.

8. Repita para cada área desejada.

9. Depois de todas as zaragatoas terem sido colhidas e pressionadas, efetue o processamento das mesmas de acordo com o “Procedimento de pré-aquecimento” e, em seguida, o “Procedimento de teste”.

Consulte o Manual do Utilizador do Sistema BD Viper LT para obter mais informações sobre a monitorização ambiental e os procedimentos de limpeza. Se uma ocorrência de contaminação não for resolvida, contacte a Assistência Técnica e Suporte da BD para obter mais informações.

(8)

LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO

1. O desempenho ideal do teste exige a colheita e a preparação adequadas das amostras. Consulte a secção “Colheita e transporte de amostras” deste folheto informativo.

2. Um resultado de teste negativo não exclui a possibilidade de infeção, uma vez que os resultados dos testes podem ser afetados pela colheita incorreta de amostras, erro técnico, troca de amostras, ou o número de organismos presentes na amostra poderá situar-se abaixo da sensibilidade do teste.

3. O BD Onclarity HPV Assay fornece resultados qualitativos.

4. A utilização do BD Onclarity HPV Assay está limitada a pessoas com formação adequada sobre o procedimento de ensaio e sobre o BD Viper LT System.

CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO

Foram colhidas amostras BD Onclarity HPV Cervical Brush, amostras BD SurePath e/ou amostras PreservCyt de 836 mulheres em conformidade com o protocolo encaminhadas para consultas de seguimento devido a infeção HPV ou resultado anómalo em teste de citologia, ou mulheres em consultas de rotina em dois locais clínicos geograficamente distintos na Europa. Foram colhidas duas amostras de cada participante na seguinte ordem: uma amostra BD SurePath (local A) ou uma amostra PreservCyt (local B), e uma amostra BD Onclarity HPV Cervical Brush (transportada num tubo BD Onclarity HPV Cervical Brush Diluent). Por cada frasco de citologia colhido, foi extraída uma alíquota de 0,5 mL para um tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent. Os resultados de citologia, resultados de ADN HPV (digene Hybrid Capture 2 (hc2) High-Risk HPV DNA Test) e resultados do teste Roche LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test (RLA) estiveram disponíveis para a maior parte das amostras. Os resultados de histologia estiveram disponíveis para a maior parte das participantes em clínicas de alto-risco.

Cada local também incluiu amostras residuais (BD SurePath ou PreservCyt ) com os resultados de citologia associados, resultados de ADN HPV (digene Hybrid Capture 2 High-Risk HPV DNA Test), resultados do teste Roche LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test e, quando aplicável, resultados de histologia. Por cada amostra incluída, foi extraída uma alíquota de 0,5 mL para um tubo BD Onclarity HPV LBC Diluent. Foram incluídas 510 amostras retrospetivas em conformidade, e estiveram disponíveis resultados de histologia para 234 mulheres.

Todas as amostras foram testadas no BD Viper LT System de acordo com o folheto informativo do ensaio e o manual do utilizador. Para cada tipo de meio, foi calculada a sensibilidade e especificidade clínicas para a deteção da doença, definidas como (1) Neoplasia Intraepitelial Cervical (CIN2) ou resultado histológico superior ou (2) Neoplasia Intraepitelial Cervical (CIN3) ou resultado histológico superior. A análise final dos dados inclui os resultados do BD Onclarity HPV Assay para 472 amostras BD SurePath, 361 amostras PreservCyt e um total de 515 amostras BD Onclarity HPV Cervical Brush: 247 amostras BD Onclarity HPV Cervical Brush (em BD Onclarity HPV Cervical Brush Diluent) para o Local A e amostras 268 BD Onclarity HPV Cervical Brush (em BD Onclarity HPV Cervical Brush Diluent) para o Local B. As estimativas de desempenho para a deteção de doença cervical de grau elevado para o BD Onclarity HPV Assay e para o ensaio hc2 são apresentadas nos Quadro 4 e 5 para o meio BD SurePath, Quadros 8 e 9 para o meio PreservCyt, e Quadros 12 e 13 para as amostras BD Onclarity HPV Cervical Brush.

Os resultados do BD Onclarity HPV Assay foram também comparados com os resultados de ADN HPV do teste digene Hybrid Capture 2 High-Risk HPV DNA Test e teste Roche LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test (comparador compósito). Um resultado positivo nos ensaios hc2 e RLA (alto risco) é definido como um comparador compósito positivo, um resultado negativo nos ensaios hc2 e RLA (alto risco) é definido como um comparador compósito negativo e, quando os dois ensaios não são concordantes (ou os resultados não estão disponíveis para os dois testes), o resultado do comparador compósito está definido como não resolvido. A concordância percentual positiva, negativa e geral foi calculada para cada tipo de meio em comparação com o comparador compósito. A análise final dos dados inclui os resultados do BD Onclarity HPV Assay e do comparador compósito (independentemente do estado histológico) para 670 amostras BD SurePath e 674 amostras PreservCyt. (Quadros 6 e 10) Foi calculado o risco absoluto de doença (CIN2+ e CIN3+) na população de estudo para cada tipo de meio para cada genótipo ou grupo de genótipos no BD Onclarity HPV Assay. Os riscos absolutos são calculados quando o genótipo (ou grupo de genótipos) está presente individualmente e/ou em conjunto com outros genótipos. É apresentado um quadro com os riscos absolutos para cada tipo de meio. Cada meio apenas foi colhido num dos locais; por este motivo, podem ser esperadas diferenças nas taxas de positividade HPV e de genótipos devido à variação entre populações. (Quadros 7 e 11)

Desempenho Clínico das Amostras BD SurePath

Quadro 4: Desempenho do BD Onclarity HPV Assay com Meio BD SurePath em Comparação com Resultados de Histologia (CIN2+)

Quadro 5: Desempenho do BD Onclarity HPV Assay com Meio BD SurePath em Comparação com Resultados de Histologia (CIN3+)

BD Onclarity HPV Assay Teste de ADN HPV hc2

Estimativa 95% Intervalo de confiança Estimativa 95% Intervalo de confiança Sensibilidade 97,7% (126/129) (93,4%, 99,2%) 98,4% (126/128) (94,5%, 99,6%) Especificidade 18,7% (64/343) (14,9%, 23,1%) 14,0% (48/342) (10,8%, 18,1%)

Estimativa 95% Intervalo de confiança Estimativa 95% Intervalo de confiança Sensibilidade 97,9% (190/194) (94,8%, 99,2%) 98,4% (190/193) (95,5%, 99,5%) Especificidade 22,7% (63/278) (18,1%, 27,9%) 17,0% (47/277) (13,0%, 21,8%)

(9)

Quadro 6: Desempenho do BD Onclarity HPV Assay com Meio BD SurePath em Comparação com o Comparador Compósito

Resultado do comparador compósito BD

Onclarity

HPV Assay Positivo Negativo

Não resolvido* Total Concordância percentual positiva (intervalo de confiança de 95%) Concordância percentual negativa (intervalo de confiança de 95%) Concordância percentual geral (intervalo de confiança de 95%) Positivo 532 6 27 565 98,5% (97,1%, 99,2%) 89,3% (78,5%, 95,0%) 97,7% (96,1%, 98,6%) Negativo 8 50 47 105 Total 540 56 74 670

*Os resultados hc2 e RLA não são concordantes ou os resultados não estiveram disponíveis para ambos os testes. Quadro 7: Risco Absoluto de CIN2+ e CIN3+ para Genótipos BD Onclarity HPV Assay em Meio BD SurePath

Genótipo BD Onclarity HPV Assay Infeção devido a um ou mais genótipos Infeção devido a um único genótipo ou grupo de genótipos Infeção devido a um ou mais genótipos Infeção devido a um único genótipo ou grupo

de genótipos Risco absoluto CIN2+ Intervalo de confiança de 95% Risco absoluto CIN2+ Intervalo de confiança de 95% Risco absoluto CIN3+ Intervalo de confiança de 95% Risco absoluto CIN3+ Intervalo de confiança de 95% HPV16 63,9% (99/155) (56,1%, 71,0%) 64,9% (48/74) (53,5%, 74,8%) 43,9% (68/155) (36,3%, 51,7%) 47,3% (35/74) (36,3%, 58,5%) HPV18 50,0% (24/48) (36,4%, 63,6%) 50,0% (7/14) (26,8%, 73,2%) 43,8% (21/48) (30,7%, 57,7%) 42,9% (6/14) (21,4%, 67,4%) HPV45 46,7% (21/45) (32,9%, 60,9%) 23,5% (4/17) (9,6%, 47,3%) 31,1% (14/45) (19,5%, 45,7%) 17,6% (3/17) (6,2%, 41,0%) HPV33/58 49,4% (42/85) (39,0%, 59,8%) 47,1% (16/34) (31,5%, 63,3%) 31,8% (27/85) (22,8%, 42,3%) 23,5% (8/34) (12,4%, 40,0%) HPV31 64,2% (52/81) (53,3%, 73,8%) 72,7% (16/22) (51,8%, 86,8%) 40,7% (33/81) (30,7%, 51,6%) 50,0% (11/22) (30,7%, 69,3%) HPV56/59/66 25,5% (25/98) (17,9%, 35,0%) 0,0% (0/29) (0,0%, 11,7%) 13,3% (13/98) (7,9%, 21,4%) 0,0% (0/29) (0,0%, 11,7%) HPV51 41,7% (15/36) (27,1%, 57,8%) 25,0% (2/8) (7,1%, 59,1%) 25,0% (9/36) (13,8%, 41,1%) 12,5% (1/8) (2,2%, 47,1%) HPV52 35,1% (20/57) (24,0%, 48,1%) 33,3% (4/12) (13,8%, 60,9%) 19,3% (11/57) (11,1%, 31,3%) 16,7% (2/12) (4,7%, 44,8%) HPV35/39/68 36,0% (27/75) (26,1%, 47,3%) 33,3% (7/21) (17,2%, 54,6%) 17,3% (13/75) (10,4%, 27,4%) 19,0% (4/21) (7,7%, 40,0%) Desempenho Clínico das Amostras PreservCyt

Quadro 8: Desempenho do BD Onclarity HPV Assay com Meio PreservCyt em Comparação com Resultados de Histologia (CIN2+)

Estimativa Intervalo de confiança de 95% Estimativa Intervalo de confiança de 95% Sensibilidade 94,7% (160/169) (90,2%, 97,2%) 97,0% (160/165) (93,1%, 98,7%) Especificidade 50,5% (97/192) (43,5%, 57,5%) 40,8% (75/184) (33,9%, 48,0%) Quadro 9: Desempenho do BD Onclarity HPV Assay com Meio PreservCyt em Comparação com Resultados de Histologia (CIN3+)

Estimativa Intervalo de confiança de 95% Estimativa Intervalo de confiança de 95% Sensibilidade 94,4% (85/90) (87,6%, 97,6%) 97,7% (85/87) (92,0%, 99,4%) Especificidade 37,3% (101/271) (31,7%, 43,2%) 29,8% (78/262) (24,6%, 35,6%)

(10)

Quadro 10: Desempenho do BD Onclarity HPV Assay com Meio PreservCyt em Comparação com o Comparador Compósito

Resultado do comparador compósito

BD Onclarity

HPV Assay Positivo Negativo

Não resolvido* Total Concordância percentual positiva (intervalo de confiança de 95%) Concordância percentual negativa (intervalo de confiança de 95%) Concordância percentual geral (intervalo de confiança de 95%) Positivo 246 5 18 269 96,1% (93,0%, 97,9%) 98,7% (96,9%, 99,4%) 97,6% (96,1%, 98,5%) Negativo 10 366 29 405 Total 256 371 47 674

*Os resultados hc2 e RLA não são concordantes ou os resultados não estiveram disponíveis para ambos os testes. Quadro 11: Risco Absoluto de CIN2+ e CIN3+ para Genótipos BD Onclarity HPV Assay em Meio PreservCyt

Genótipo BD Onclarity HPV

Assay

Infeção devido a um ou mais genótipos

Infeção devido a um único genótipo ou grupo de

genótipos

Infeção devido a um ou mais genótipos

Infeção devido a um único genótipo ou grupo de genótipos Risco absoluto CIN2+ Intervalo de confiança de 95% Risco absoluto CIN2+ Intervalo de confiança de 95% Risco absoluto CIN3+ Intervalo de confiança de 95% Risco absoluto CIN3+ Intervalo de confiança de 95% HPV 16 77,1% (84/109) (68,3%, 84,0%) 81,4% (57/70) (70,8%, 88,8%) 44,0% (48/109) (35,1%, 53,4%) 50,0% (35/70) (38,6%, 61,4%) HPV 18 50,0% (12/24) (31,4%, 68,6%) 45,5% (5/11) (21,3%, 72,0%) 29,2% (7/24) (14,9%, 49,2%) 18,2% (2/11) (5,1%, 47,7%) HPV 45 50,0% (6/12) (25,4%, 74,6%) 25,0% (1/4) (4,6%, 69,9%) 16,7% (2/12) (4,7%, 44,8%) 0,0% (0/4) (0,0%, 49,0%) HPV 33/58 70,0% (28/40) (54,6%, 81,9%) 75,0% (15/20) (53,1%, 88,8%) 35,0% (14/40) (22,1%, 50,5%) 50,0% (10/20) (29,9%, 70,1%) HPV 31 67,7% (42/62) (55,4%, 78,0%) 71,0% (22/31) (53,4%, 83,9%) 30,6% (19/62) (20,6%, 43,0%) 41,9% (13/31) (26,4%, 59,2%) HPV 56/59/66 34,0% (18/53) (22,7%, 47,4%) 11,1% (2/18) (3,1%, 32,8%) 9,4% (5/53) (4,1%, 20,3%) 0,0% (0/18) (0,0%, 17,6%) HPV 51 48,0% (12/25) (30,0%, 66,5%) 27,3% (3/11) (9,7%, 56,6%) 16,0% (4/25) (6,4%, 34,7%) 18,2% (2/11) (5,1%, 47,7%) HPV 52 73,9% (17/23) (53,5%, 87,5%) 85,7% (6/7) (48,7%, 97,4%) 26,1% (6/23) (12,5%, 46,5%) 42,9% (3/7) (15,8%, 75,0%) HPV 35/39/68 38,5% (10/26) (22,4%, 57,5%) 40,0% (2/5) (11,8%, 76,9%) 15,4% (4/26) (6,1%, 33,5%) 20,0% (1/5) (3,6%, 62,4%) Desempenho Clínico das Amostras BD Onclarity HPV Cervical Brush

Quadro 12: Desempenho do BD Onclarity HPV Assay com BD Onclarity HPV Cervical Brush em Comparação com Resultados de Histologia (CIN2+)

Local

Estimativa Intervalo de confiança de 95% Estimativa Intervalo de confiança de 95% A Sensibilidade 97,2% (104/107) (92,1%, 99,0%) 99,1% (106/107) (94,9%, 99,8%) Especificidade 17,9% (25/140) (12,4%, 25,0%) 21,4% (30/140) (15,4%, 28,9%) B Sensibilidade 100,0% (121/121) (96,9%, 100,0%) 97,5% (116/119) (92,8%, 99,1%) Especificidade 37,4% (55/147) (30,0%, 45,5%) 43,0% (61/142) (35,1%, 51,2%) Quadro 13: Desempenho do BD Onclarity HPV Assay com BD Onclarity HPV Cervical Brush em Comparação com Resultados de Histologia (CIN3+)

Local

Estimativa Intervalo de confiança de 95% Estimativa Intervalo de confiança de 95% A Sensibilidade 97,3% (72/74) (90,7%, 99,3%) 98,6% (73/74) (92,7%, 99,8%) Especificidade 15,0% (26/173) (10,5%, 21,1%) 17,3% (30/173) (12,4%, 23,7%) B Sensibilidade 100,0% (60/60) (94,0%, 100,0%) 98,3% (57/58) (90,9%, 99,7%) Especificidade 26,4% (55/208) (20,9%, 32,8%) 31,0% (63/203) (25,1%, 37,7%)

(11)

Estudos analíticos

Sensibilidade Analítica no “Cutoff” Clínico:

O limite de deteção (LdD) no valor de “cutoff” clínico para HPV foi determinado para o BD Onclarity HPV Assay utilizando linhas celulares positivas para HPV: SiHa (HPV 16), HeLa (HPV 18) e MS751 (HPV 45) e ADN de plasmídeo clonado com as sequências dos seguintes genótipos HPV: HPV 31, 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68 em BD SurePath Preservative Fluid, PreservCyt Solution e BD Onclarity HPV Cervical Brush Diluent contendo uma linha celular negativa para HPV (C33A). As linhas celulares HPV foram testadas individualmente, enquanto que os plasmídeos HPV foram testados coletivamente em três grupos: 1) HPV 31, 33, 51, 52 e 59; 2) HPV 56, 58, 68; e 3) HPV 35 e 66. Foram testadas, no mínimo, quarenta e cinco réplicas de cada um de seis níveis alvo para as linhas celulares HPV e vinte réplicas de cada um de seis níveis alvo para os plasmídeos HPV, utilizando uma gama mínima de três lotes de reagentes e um mínimo de três BD Viper LT Systems. O LdD consiste no nível de ADN HPV na amostra diluída que produz resultados positivos acima do valor de “cutoff” clínico em, pelo menos, 95% dos casos. O valor LdD máximo para cada genótipo HPV e meio é indicado no Quadro 14.

Quadro 14: Sensibilidade Analítica

Alvo Meio BD SurePath (intervalo de confiança de 95%) Meio PreservCyt (intervalo de confiança de 95%) BD Onclarity HPV Cervical Brush Diluent (intervalo de confiança de 95%) SiHa (HPV 16) células/mL 1584 (1276 – 1962) 1835 (1426 – 2358) 137 (131 – 144) HeLa (HPV 18) células/mL 915 (739 – 1131) 1786 (1175 – 2715) 51 (46 – 56) MS751 (HPV 45) células/mL 3793 (2944 – 4888) 5425 (4167 – 7066) 305 (284 – 343) HPV 31 cópias/mL 3652 (3159 – 3868) 4118 (3898 – 4228) 692 (650 – 817) HPV 33 cópias/mL 7326 (6578 – 8932) 8272 (7946 – 8743) 1376 (1272 – 1451) HPV 35 cópias/mL 6820 (6477 – 7282) 7282 (6895 – 7674) 1552 (1317 – 1780) HPV 39 cópias/mL 7894 (7115 – 8193) 8272 (7810 – 9398) 1531 (1419 – 1685) HPV 51 cópias/mL 6697 (5796 – 7097) 5909 (5553 – 6824) 1229 (1155 – 1353) HPV 52 cópias/mL 3582 (3414 – 4184) 4184 (3740 – 4761) 833 (744 – 934) HPV 56 cópias/mL 4976 (4140 – 5698) 4774 (4479 – 5997) 836 (737 – 911) HPV 58 cópias/mL 10094 (9403 – 11180) 11488 (8989 – 12360) 2990 (2656 – 7819) HPV 59 cópias/mL 4400 (4145 – 5069) 4374 (4105 – 5482) 772 (722 – 899) HPV 66 cópias/mL 3793 (3621 – 4030) 4462 (4008 – 4844) 701 (646 – 767) HPV 68 cópias/mL 10415 (9799 – 11642) 10481 (9816 – 12082) 2079 (1995 – 2125) Reatividade Cruzada:

Foi utilizado um painel de bactérias, leveduras e vírus de cultura, em conjunto com ADN de plasmídeo clonado com sequências alvo de HPV de alto e baixo risco, para avaliar a especificidade analítica do BD Onclarity HPV Assay no BD Viper LT System. Cada elemento com potencial reatividade cruzada foi testado individualmente em BD SurePath Preservative Fluid e PreservCyt Solution contendo uma linha celular negativa para HPV (C33A). Os microrganismos são descritos nos Quadros 15 e 16. O BD Onclarity HPV Assay não demonstrou reatividade cruzada com qualquer um dos microrganismos testados.

(12)

Quadro 15: Microrganismos Testados Relativamente à Especificidade Analítica

Bactérias* Vírus**

Actinomyces israelii Adenovírus, tipo 5

Atopobium vaginae EBV-1, estirpe B95-8

Bacteroides fragilis HCMV. Estirpe AD169

Bacteroides ureolyticus HIV-1

Bifidobacterium adolescentis HSV1

Bifidobacterium breve HSV2

Bifidobacterium longum ssp. longum HPV de alto risco***

Chlamydia trachomatis HPV 16

Clostridium perfringens HPV 18

Corynebacterium genitalium HPV 31

Enterobacter cloacae ssp. cloacae HPV 33

Enterococcus faecalis HPV 35

Enterococcus faecium HPV 39

Escherichia coli HPV 45

Fusobacterium nucleatum ssp. nucleatum HPV 51

Gardnerella vaginalis HPV 52

Klebsiella pneumonia ssp. ozaenae HPV 56

Lactobacillus acidophilus HPV 58 Mycobacterium smegmatis HPV 59 Mycoplasma genitalium HPV 66 Neisseria gonorrhoeae HPV 68 Peptostreptococcus anaerobius Prevotella bivia Prevotella disiens Proteus mirabilis Proteus vulgaris Providencia stuartii Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus agalactiae Streptococcus pyogenes Ureaplasma urealyticum Leveduras/Protozoários**** Candida albicans Trichomonas vaginalis

*Bactérias testadas a aproximadamente 1,0 x 107_{CFU/mL, com exceção das seguintes: Chlamydia trachomatis (1,0 x 10}7_EB/mL),

Mycobacterium smegmatis (2,5 x 106 CFU/mL) e Ureaplasma urealyticum (8,0 x 106 CFU/mL).

**Vírus testados a 1,0 x 106 VP/mL.

***ADN de plasmídeo com HPV de alto risco testado a 1,0 x 106 cópias/mL.

****Leveduras (Candida albicans) testadas a aproximadamente 1,0 x 107_{CFU/mL; Protozoários (Trichomonas vaginalis) testados a}

aproximadamente 1,4 x 106_CFU/mL.

Quadro 16: Plasmídeos com HPV de Baixo Risco Testados Relativamente à Especificidade Analítica

HPV 6 HPV 69 HPV 11 HPV 70 HPV 26 HPV 73 HPV 30 HPV 82 HPV 34 HPV 97 HPV 53 HPV c85 HPV 67

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Substâncias Interferentes:

O potencial de interferência na execução do BD Onclarity HPV Assay no BD Viper LT System foi determinado relativamente a substâncias exógenas ou endógenas que podem estar presentes em amostras cervicais clínicas. Foram testadas amostras produzidas com estado positivo para HPV e negativo para HPV (co-introdução de células SiHa, HeLa e MS751 a 3 x LdD) na presença ou ausência de cada substância potencialmente interferente. As substâncias utilizadas nestes estudos estão descritas no Quadro 17. As concentrações representam o maior nível de substância que não resultou em qualquer interferência no

BD Onclarity HPV Assay.

Quadro 17: Substâncias Potencialmente Interferentes

BD Onclarity HPV Cervical

Brush Diluent Meio BD SurePath Meio PreservCyt Substância potencialmente

interferente Concentração testada

Concentração

testada Concentração testada

Lubrificante vaginal KY 10% (p/v) 6% (p/v) 10% (p/v)

Película contracetiva vaginal VCF 3% (p/v) 10% (p/v) 10% (p/v)

Espuma contracetiva vaginal VCF 10% (p/v) 10% (p/v) 10% (p/v)

Gel contracetivo Conceptrol 1% (p/v) 10% (p/v) 10% (p/v)

Monistat 3* 2% (p/v) 2% (p/v) 1,8% (p/v)

Clotrimazol 7 10% (p/v) 10% (p/v) 10% (p/v)

Vagistat-1 Tioconazol 2% (p/v) 2% (p/v) 2% (p/v)

Creme vaginal clindamicina 9% (p/v) 10% (p/v) 10% (p/v)

Solução de lavagem vaginal

Summer's Eve 10% (v/v) 10% (v/v) 10% (v/v)

Creme Zovirax (Aciclovir) 10% (p/v) 8% (p/v) 10% (p/v)

Gel Vandazole (gel vaginal

metronidazol, 0,75%) 10% (p/v) 10% (p/v) 10% (p/v)

Desodorizante Summer's Eve 2% (p/v) 3% (p/v) 2% (p/v)

Mucina bovina 10% (v/v) 10% (v/v) 10% (v/v)

Progesterona 20 ng/mL 20 ng/mL 20 ng/mL

Estradiol 1,2 ng/mL 1,2 ng/mL 1,2 ng/mL

Sangue total 3% (v/v) 5% (v/v) 5% (v/v)

Leucócitos 1x106 células/mL 1x106 células/mL 1x106 células/mL

Sémen 10% (v/v) 10% (v/v) 10% (v/v)

Solução de lavagem de ácido

acético** 5% (v/v)

Sangue + Solução de lavagem de ácido acético

Sangue a 5% (v/v), Solução de lavagem de ácido

acético a 2,5% (v/v) *As concentrações acima das indicadas resultaram em falhas do nível de líquido durante a extração no BD Viper LT System. **A solução de lavagem de ácido acético é constituída por 1 parte de ácido acético glacial: 9 partes de solução CytoLyt.

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Interferência de Alvos Concorrentes:

O potencial de inibição da deteção de HPV devido à presença de níveis altos de um alvo e níveis baixos de um outro alvo durante uma infeção mista foi avaliado no BD Onclarity HPV Assay. Foram testadas células SiHa, HeLa e MS751 individualmente ou coletivamente a 3 x LdD na presença ou ausência de alvo(s) HPV concorrente(s) a 1,0 x 106 cópias/mL em BD SurePath Preservative Fluid, PreservCyt Solution e BD Onclarity HPV Cervical Brush Diluent contendo uma linha celular negativa para HPV (C33A) (Quadro 18).

Quadro 18: Interferência de Alvos Concorrentes

Tipo de tubo HPV Assay Alvos celulares HPV individuais a 3 x LdD

Plasmídeos HPV a 1 x 106 cópias/mL

Deteção de alvo celular HPV na presença ou ausência de

genótipos concorrentes (plasmídeos HPV)

Genótipos G1 com alvos co-amplificados G1

SiHa (HPV 16) HPV 18 + HPV 45 Sim

HeLa (HPV 18) HPV 16 + HPV 45 Sim

HPV 45 (MS751) HPV 16 + HPV 18 Sim

Genótipos G1 com alvos

co-amplificados G2 SiHa + HeLa + MS751

HPV 31 + HPV 33 + HPV 56 +

HPV 58 + HPV 59 + HPV 66 Sim Genótipos G1 com alvos

co-amplificados G3 SiHa + HeLa + MS751

HPV 35 + HPV 39 + HPV 51+

HPV 52 + HPV 68 Sim

Capacidade de reprodução:

A capacidade de reprodução do BD Onclarity HPV Assay foi avaliada no aparelho BD Viper LT através de um painel de quatro membros constituído por amostras negativas, negativas altas, positivas baixas e positivas moderadas. Os membros positivos do painel foram constituídos por células SiHa, HeLa e MS751 introduzidas coletivamente em grupos de amostras BD SurePath clinicamente negativas para HPV e em BD Onclarity HPV Cervical Brush Diluent contendo uma linha celular negativa para HPV (C33A). O painel foi testado numa gama igualmente distribuída de três lotes de reagentes e três aparelhos, ao longo de 12 dias. Os dados estão resumidos no Quadro 19.

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Quadro 19: Resumo dos Dados da Capacidade de Reprodução para o BD Onclarity HPV Assay no BD Viper LT System Inter-execução Intra-execução Total Meio Linha celular (genótipo) Nível do painel Concentração células/mL % de Corretos Intervalo de confiança de 95% Ct Média SD %CV SD %CV SD %CV S ur eP at h SiHa (HPV 16) Neg 0 100% (216/216) (98,25% – 100%) NA NA NA NA NA NA NA Neg Alto 342 _(211/216)97,69% (94,7% – _99,01%) 35,28 0,16 0,46 0,54 1,52 0,57 1,62 Pos Baixo 1582 100% (216/216) (100% – 98,25%) 32,31 0,16 0,50 0,22 0,69 0,30 0,92 Pos Mod 4746 100% (216/216) (100% – 98,25%) 31,07 0,22 0,69 0,22 0,71 0,35 1,11 HeLa (HPV 18) Neg 0 100% (216/216) (98,25% – 100%) NA NA NA NA NA NA NA Neg Alto 102 98,61% (213/216) (96% – 99,53%) 35,89 0,24 0,68 0,75 2,09 0,85 2,37 Pos Baixo 914 99,54% (215/216) (97,42% – 99,92%) 32,70 0,16 0,50 0,30 0,92 0,37 1,14 Pos Mod 2742 100% (216/216) (100% – 98,25%) 30,68 0,13 0,43 0,22 0,72 0,30 0,98 MS-751 (HPV 45) Neg 0 100% (216/216) (98,25% – 100%) NA NA NA NA NA NA NA Neg Alto 395 100% (216/216) (98,25% – 100%) 35,77 0,00 0,00 0,52 1,45 0,55 1,53 Pos Baixo 3793 100% (216/216) (100% – 98,25%) 32,71 0,20 0,60 0,26 0,80 0,36 1,10 Pos Mod 11378 99,54% (215/216) (97,42% – 99,92%) 31,33 0,18 0,57 0,35 1,10 0,41 1,31 C er v ic al B ru s h D iluent SiHa (HPV 16) Neg 0 100% (214/214) (98,24% – 100%) NA NA NA NA NA NA NA Neg Alto 32 100% (218/218) (98,27% – 100%) 36,29 0,09 0,25 0,59 1,63 0,62 1,71 Pos Baixo 205 94,91% (205/216) (91,11% – 97,13%) 33,63 0,26 0,78 0,33 0,97 0,43 1,27 Pos Mod 615 100% (216/216) (98,25% – 100%) 31,80 0,16 0,51 0,18 0,56 0,25 0,79 HeLa (HPV 18) Neg 0 100% (214/214) (98,24% – 100%) NA NA NA NA NA NA NA Neg Alto 13 99,07% (214/216) (96,69% – 99,75%) 35,69 0,10 0,29 0,78 2,18 0,80 2,23 Pos Baixo 76 99,08% (216/218) (96,72% – 99,75%) 33,34 0,15 0,44 0,25 0,76 0,30 0,91 Pos Mod 228 99,54% (215/216) (97,42% – 99,92%) 32,07 0,24 0,73 0,25 0,78 0,37 1,16 MS-751 (HPV 45) Neg 0 100% (214/214) (98,24% – 100%) NA NA NA NA NA NA NA Neg Alto 59 _(216/216)100% (98,25% – _100%) 36,54 0,22 0,61 0,62 1,68 0,66 1,81 Pos Baixo 457 99.54% (215/216) (97,42% – 99.92%) 33,22 0,16 0,48 0,25 0,75 0,32 0,95 Pos Mod 1371 100% (218/218) (98,27% – 100%) 31,74 0,14 0,43 0,21 0,67 0,27 0,84

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Contaminação Cruzada:

Foi realizado um estudo para avaliar o risco de produção de um resultado positivo falso, quer na mesma execução (contaminação cruzada intra-ensaio), quer numa execução subsequente (contaminação por transferência inter-ensaio), no BD Viper LT System. Foi efetuada uma execução por dia ao longo de cinco dias em cada um de três aparelhos, abrangendo um total de 675 réplicas de teste. Cada execução consistiu em amostras BD SurePath Preservative Fluid ou PreservCyt Solution contendo uma linha celular negativa para HPV (C33A), com e sem células SiHa introduzidas a 1,0 x 105_{células/mL e dispostas num padrão alternado em} xadrez. A taxa de contaminação geral, tanto no BD SurePath Preservative Fluid como na PreservCyt Solution, foi de 0,00%. Estabilidade de Amostras Não Processadas (no frasco):

Foram realizados estudos analíticos para sustentar as afirmações de conservação relativamente à estabilidade de amostras cervicais não processadas. Foram introduzidas células SiHa a 3 x LdD em amostras BD SurePath Preservative Fluid, PreservCyt Solution e BD Onclarity HPV Cervical Brush Diluent contendo uma linha celular negativa para HPV (C33A) e, em seguida, as amostras foram conservadas a 2 – 8 °C, 30 °C e -20 °C durante vários períodos. No final de cada período definido, as amostras foram removidas de armazenamento e testadas com o BD Onclarity HPV Assay no BD Viper LT System. Foram geradas vinte e quatro réplicas de ensaio para cada condição (tipo de amostra/temperatura/duração). Foi alcançada estabilidade durante 30 dias a 2 – 30 °C e -20 °C.

Estabilidade de Amostras Diluídas:

Foram realizados estudos analíticos para sustentar as afirmações de conservação relativamente à estabilidade de amostras cervicais diluídas. Foram introduzidas células SiHa a 3 x LdD em amostras BD SurePath Preservative Fluid e PreservCyt Solution contendo uma linha celular negativa para HPV (C33A), sendo as amostras diluídas em BD HPV LBC Diluent e, em seguida, conservadas a 2 – 8 °C, 30 °C e -20 °C durante vários períodos. No final de cada período definido, as amostras foram removidas de armazenamento e testadas com o BD Onclarity HPV Assay no BD Viper LT System. Foram geradas vinte e quatro réplicas de ensaio para cada condição (tipo de amostra/temperatura/duração). Foi alcançada estabilidade durante 15 dias a 2 – 30 °C e durante 30 dias a -20 °C.

Estabilidade de Amostras Após Pré-aquecimento:

Foram realizados estudos analíticos para sustentar as afirmações de conservação relativamente à estabilidade de amostras cervicais após o pré-aquecimento. Foram introduzidas células SiHa a 3 x LdD em amostras BD SurePath Preservative Fluid, PreservCyt Solution e BD Onclarity HPV Cervical Brush Diluent contendo uma linha celular negativa para HPV (C33A), sendo as amostras diluídas em BD Onclarity HPV LBC Diluent e, em seguida, pré-aquecidas com o BD Viper LT Pre-warm Heater. As amostras processadas foram conservadas a 2 – 8 °C, 30 °C e -20 °C durante vários períodos. No final de cada período definido, as amostras foram removidas de armazenamento e testadas com o BD Onclarity HPV Assay no BD Viper LT System. Foram geradas vinte e quatro réplicas de ensaio para cada condição (tipo de amostra/temperatura/duração). Foi alcançada estabilidade durante 7 dias a 2 – 30 °C e durante 30 dias a -20 °C.

INTERPRETAÇÃO DOS QUADROS Símbolos e Abreviaturas Símbolos (+) positivo (-) negativo # número % percentagem Abreviaturas

ASCUS Células escamosas atípicas de relevância não determinada cfu Unidades formadoras de colónias

CIN Neoplasia intraepitelial cervical CQ Controlo de qualidade CV Coeficiente de variação HPV Vírus do papiloma humano

HR Alto risco

IC Intervalo de confiança LBC Citologia em base líquida n Número

NA Não aplicável NEG Negativo

NPA Concordância percentual negativa PBS Soro fisiológico tamponado com fosfato PCR Reação em cadeia da polimerase POS Positivo

PPA Concordância percentual positiva SD Desvio padrão

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APRESENTAÇÃO

Estão também disponíveis os seguintes produtos BD Onclarity e BD Viper para utilização no BD Viper LT. Nº. de cat. Descrição

442946 BD Onclarity HPV Assay Reagent Pack (embalagem de reagentes de ensaio), 192 testes

441993 Control Set for the BD Onclarity HPV Assay (conjunto de controlo para o ensaio), 24 tubos positivos e 24 negativos 442841 BD Viper PCR Extraction Reagent Trough with Piercing Tool (canal de reagentes de extração com ferramenta de

perfuração), 12 canais de reagentes de extração

441992 BD FOX PCR Extraction Tubes (tubos de extração), 384 tubos

441354 BD Viper System Neutralization Pouch (bolsa de neutralização), 12 bolsas

442840 BD Onclarity HPV Liquid Based Cytology Specimen (LBC) Diluent Tubes (tubos de diluente para amostras para citologia de base líquida), 400

441991 BD Onclarity HPV Assay Cervical Brush Collection Kit (kit de colheita de escova cervical), 100

442957 BD Viper LT System PCR Tube/Tray Kit (kit de tabuleiro/tubos de PCR)

443430 Key Card for the BD Viper LT System (cartão chave para o sistema)

440476 BD ProbeTec Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/GC) Amplified DNA Assay Endocervical Specimen Collection and DRY TRANSPORT Kit (kit de colheita de amostras endocervicais e de TRANSPORTE A SECO para ensaio de ADN amplificado)

441996 BD Viper LT Pipette Tips (pontas de pipeta), 3840

441995 BD Viper LT Solid Waste Liners (recipientes para resíduos sólidos), 80

442950 BD Pre-warm Heater (aquecedor de pré-aquecimento)

442967 BD Viper LT System PCR Accessory kit (kit de acessórios para PCR)

442839 BD Viper LT System

BIBLIOGRAFIA

1. http://www.cdc.gov/std/HPV/STDFact-HPV.htm

2. http://www.emcdda.europa.eu/html.cfm/index33767EN.html

3. Cervical cancer, human papillomavirus (hpv), and hpv vaccines – key points for policy-makers and health professionals http://whqlibdoc.who.int/hq/2008/who_rhr_08.14_eng.pdf

4. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2005. Approved Guideline M29-A3. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 3rd ed., CLSI, Wayne, PA.

5. Garner, J.S. 1996. Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 17:53-80.

6. U.S. Department of Health and Human Services. 2007. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories,HHS Publication (CDC), 5th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.

7. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p. 0021-0045.

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

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