Solubilidade das Proteínas

(1)

Solubilidade das Proteínas

TÉCNICAS LABORATORIAIS EM

QUÍMICA E BIOQUÍMICA

Miguel Mourato

(Coordenador)

Joana Sales

Mestrado em Engenharia

Zootécnica

ISA, 2018/2019

(2)

Proteínas – macromoléculas constituídas por uma ou mais cadeias de

aminoácidos (por ligações peptídicas)

Ex. de aminoácidos:

(3)

Solubilidade, Capacidade de absorção e

Retenção de água

Percentagem de proteína que se mantém em “solução” ou dispersão coloidal sob condições específicas e que não sedimenta com forças centrífugas moderadas

Definição de solubilidade de proteínas:

Proteína

solúvel: Proteína com capacidade de interagir com o solvente (pontes_{de hidrogénio, ligações dipolo-dipolo e cargas iónicas) e que} estabelece um equilíbrio entre as interacções proteína-proteína e proteína-solvente

Vantagem das soluções de proteína:

- A elevada solubilidade permite dispersão rápida e completa das moléculas proteicas

- Conduz a um sistema coloidal disperso com estrutura homogénea

- Essencial para a elaboração de molhos, bebidas, purés e sopas desidratadas

Proteínas insolúveis têm pouca aplicação

(4)

Escleroproteínas:

Classificação das proteínas em função da solubilidade

4

Albuminas: solúveis em água a pH 6,6, coagulam pelo calor. Proteínas ricas em enxofre, solúveis em água, precipitam pelo (NH₄)₂SO₄ a 70-100 %.

Ex: ovalbumina, lactalbumina, enzimas

Globulinas: pouco solúveis em água, solúveis em soluções salinas diluídas a pH 7,0, coagulam pelo calor. Proteínas que precipitam pelo (NH₄)₂SO₄ a 50 %.

Ex: miosina, ovoglobulina, lactoglobulina

Prolaminas: insolúveis em água e em soluções salinas, solúveis em soluções de etanol a 70 %. proteínas ricas em prolina e ácido glutâmico, são solúveis em etanol a 70 %.

Ex: gliadina (nos cereais, trigo e centeio)

Glutelinas: insolúveis em água, soluções salinas e etanol. Solúveis apenas em soluções ácidas e alcalinas diluidas. Proteínas ricas em lisina, somente encontradas em vegetais.

Ex: glutenina (no trigo)

proteínas fibrosas, insolúveis.

(5)

As proteínas são macromoléculas com capacidade de interacção com a água, lipidos e outros componentes

-Factores intrínsecos:

Propriedades fisico-quimicas das moléculas -composição em aminoácidos -conformação 3D -Factores extrínsecos: Características do meio -concentração de proteína -pH -Temperatura -Força iónica

-Tamanho, composição e sequência de aminoácidos (estrutura primária) -Conformação tridimensional

(estruturas secundária, terciária, quaternária) -Posição e tipo de grupos R na estrutura 3D -Interacções entre os grupos R na cadeia

-Carga global, ponto isoeléctrico influenciam a solubilidade, a capacidade de retenção de água e interacção com outros componentes

-AA polares aumentam a capacidade de hidratação

Em água? Em lípidos?

(6)

Variações de pH, temperatura, presença de solventes e agentes desnaturantes, alteram as ligações estabelecidas na proteína, e consequentemente a sua conformação alterando as propriedades de hidratação.

Curvas de solubilidade de globulinas: Salting-in e o pH Solubilidade (mg/mL) pH pI Aumenta [NaCl] Na+ Cl -Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Cl -Cl -Cl -Cl -Cl -H₂O H2O H₂O H₂O Cl -Na+ Na+ Cl -H₂O H₂O H₂O H₂O H₂O _H 2O

Fatores intrínsecos e extrínsecos atuam

conjuntamente

(7)

Predominam forças de atração Predominam forças de repulsão Predominam forças de repulsão

Solubilidade em função do pH

(8)

Força iónica: =1/2.CiZi2

(C concentração e Z carga do ião)

-Meio de força iónica baixa favorece a solubilidade:

-Meio de força iónica alta

favorece a precipitação:

Há ligação dos iões à estrutura das proteínas; diminui

as interacções iónicas proteína-proteína, há

“abertura da rede proteica”, que retém mais água

Há concorrência entre as proteínas e os sais para a captação de água, diminuem as interacções

água-proteína; os sais retêm mais água e não há água suficiente para envolver as proteínas que se agregam Iões de sais neutros podem aumentar a solubilidade para uma gama de 0,5-1,0 mol/L

Salting-in

Salting-out

Solubilidade em função da força iónica

(9)

(10)

-Perda da estrutura nativa da proteína

-Pode conduzir a alterações da solubilidade e das propriedades

funcionais

▪Precipitação

ex. clara de ovo

▪Formação de espumas

ex. clara de ovo

▪Formação de géis

ex. colagénio

Alterações da solubilidade - Desnaturação

(11)

Objectivo do trabalho:

- Verificar a solubilidade das proteínas em função do pH, da força

iónica e da temperatura

- Verificar a influência da conformação e composição de diferentes

proteínas no comportamento em solução

- Determinação da proteína nas amostras iniciais e nos filtrados após

precipitação

- Precipitação da proteína do leite e soja por acção do ácido

- Precipitação da proteína da clara de ovo pelo calor

- Quantificar a proteína nas amostras iniciais e nos filtrados após

precipitação

(12)

-cerca de 80 % de caseína e 20 % de proteína de soro

-4 principais tipos de caseína: αs1, αs2, β e k -organização em micelas permite a

co-existência de 2 zonas com diferente afinidade para a água, hidrofóbica (α e β caseínas) e hidrofilica (k caseína) e estão ligadas ao fosfato de cálcio constituindo micelas

-a destabilização da micela pode ser causada por factores, como pH, temperatura,

hidrólise enzimática. zona hidrofóbica Camada externa de k-caseina Micela de caseina:

(A: submicela de α- e β-caseinas, B: cadeias proteicas da k-caseina, C: fosfato de cálcio, D: kappa casein, E: grupos fosfato).

Fontes: www.food-info.net/images/caseinmicelle.jpg

http://openwetware.org/wiki/User:Andy_Maloney/Kinesin_%26_Micro tubule_Page

A - Precipitação das proteínas do leite pelo ácido

Proteína do leite:

(13)

Produção de iogurte resulta da

coagulação da proteína do leite

por acção do ácido láctico

produzido pelas bacterias lácticas:

-Lactobacillus bulgaricus

-Streptococcus thermophilus

http://www.sciencephoto.com/media/79526/e nlarge

IOGURTE: leite coagulado pelo ácido

Lactobacillus bulgaricus

Streptococcus thermophilus

(14)

-a soja tem cerca de 36,49 % de proteína

-globulinas (90 %): a conglicinina (glicoproteína) e a glicinina.

-pI da proteína de soja varia entre pH 4,5 e 6

-por acção dos sais, sulfato de magnésio, ocorre a precipitação (coagulação) da proteína da suspensão de soja

Há formação de ligações entre os iões Mg2+ _e

as cargas negativas das proteínas, causando a coagulação.

B - Precipitação das proteínas de soja pelos sais

Processo usado na preparação de tofu

Proteína de soja (Glycine Max):

(15)

A proteína do ovo encontra-se quase na sua totalidade na

clara de ovo, que contém cerca de 10 % de proteína

dissolvida em água.

Proteínas muito diversas, em termos quantitativos e qualitativos, de que resultam as suas propriedades únicas

C - Precipitação das proteínas de ovo pelo calor

54% Ovalbumin 12% Ovotransferrin 11% Ovomucoid 4% Ovoglobulin G2 4% Ovoglobulin G3 3.5% Ovomucin 3.4% Lysozyme 1.5% Ovoinhibitor 1% Ovoglycoprotein 0.8% Flavoprotein 0.5% Ovomacroglobulin 0.05%Avidin 0.05% Cystatin (Total listed 95.8%)

Proteína do ovo:

(16)

Método colorimétrico, que se baseia na formação de um composto corado que absorve radiações electromagnéticas a 540 nm

I

A

=

log

o

onde I_o é a intensidade do feixe de radiação incidente e I é a intensidade do feixe de radiação transmitida.

A relação entre a absorvância e a concentração foi estabelecida em 1852 por Beer, e tem a seguinte forma:

c

l

A

=



.

- é a absortividade molar (constante característica

do sistema soluto-solvente, para um determinado comprimento de onda)

-L é a espessura da solução atravessada pela radiação -C é a concentração da espécie que se pretende

determinar.

O espectrofotómetro mede a absorvância, A, que se define como:

Determinação da proteína solúvel pelo método do

Biureto

(17)

Recta padrão ou recta de

calibração

-feita com proteínas de concentração conhecida

-permite calcular a concentração de proteína de uma amostra pela medição da sua absorvância

Método do Biureto: É um método específico para proteínas solúveis, mas não é muito sensível, detecta quantidades entre 1-20 mg de proteína. Cu2+ C R O NH CH C O NH R CH C O HN C O HN R HC R HC Composto formado entre as cadeias polipeptídicas e o

A relação entre a absorvância e a concentração é expressa

pela lei de Lambert-Beer é linear dando origem a uma reta de

(18)

18 1ª PARTE: Efeito do pH, temperatura e da concentração de sais na solubilidade de proteínas

A - Precipitação das proteínas do leite pelo ácido:

100 mL de leite Aquecer ligeiramente cerca de 30 ºC Adicionar 10 mL de sumo de limão ou vinagre Agitar durante 2 minutos e deixar repousar durante 5 minutos Verificar a precipitação e filtrar em papel de filtro e recolher a coalhada Ocorreu coagulação? Quais foram as alterações observadas? Trabalho Prático: Solubilidade das Proteínas

(19)

Ocorreu coagulação? Quais foram as alterações observadas?

B - Precipitação das proteínas de soja pelos sais e pelo calor:

Adicionar 1,5 g de MgSO₄.7H₂O

Agitar para dissolver

Verificar a precipitação e filtrar em papel de filtro e

recolher o precipitado 100 mL de Bebida de soja Qual é o efeito da temperatura? Aquecer até fervura (não deixar entornar)

1ª PARTE: Efeito do pH, temperatura e da concentração de sais na solubilidade de proteínas

(20)

C - Precipitação das proteínas da clara de ovo pelo calor: Clara de ovo diluída Fazer uma diluição de 1:2 de clara de ovo em água Aquecer até fervura Verificar a precipitação

Ocorreu coagulação? Quais foram as alterações

observadas?

1ª PARTE: Efeito do pH, temperatura e da concentração de sais na solubilidade de proteínas

20

(21)

Tubos [Proteína solúvel] (mg mL-1₎ BSA 1% (mL) Tampão (mL) Volume total (mL) Absorvância 1 0 mg mL-1 ₀ ₂ ₂ _? 2 1,0 mg mL-1 _? _? ₂ _? 3 2,5 mg mL-1 _? _? ₂ _? 4 3,75 mg mL-1 _? _? ₂ _? 5 5,0 mg mL-1 _? _? ₂ _? 6 7,5 mg mL-1 _? _? ₂ _?

2ª PARTE: Elaboração da reta de calibração

(22)

22

BSA 1% Tampão

1º- Adição de BSA e Tampão

1 2 3 4 5 6

4º- Agitação

5º- Deixar desenvolver cor durante 30 minutos. 1 ₂ ₃ ₄ ₅ ₆ 0,0 mg mL-1 1,0 mg mL-1 2,5 mg mL-1 3,75 mg mL-1 5,0 mg mL-1 7,5 mg mL-1

2º- Soluções padrão com concentração conhecida

3º- Adição de reagente de Biureto

8 mL

de reagente do Biureto

(23)

6º- Após 30 minutos, é possível fazer as leituras de absorvância.

7º- Fazer a leitura da absorvância de cada

um dos tubos, utilizando um

espectrofotómetro com um  de 540 nm:

(24)

24

c

l

A

=



.

Através da equação matemática desta reta pode-se calcular a concentração de qualquer solução desconhecida pela medição da sua absorvância.

Após se determinar a absorvância de várias soluções de concentração conhecida é elaborado um gráfico que se designa reta de calibração ou

reta padrão: lei de Lambert-Beer y = 0,0479x R² = 0,9974 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0 2 4 6 8 A b so rv ân ci a [Proteína solúvel] (mg mL-1₎ Recta de calibração

Uma representação gráfica da

absorvância em função da

concentração dará então origem a

uma reta de declive l.

0 mg mL-1 1,0 mg mL-1 2,5 mg mL-1 3,75 mg mL-1 5,0 mg mL-1 7,5 mg mL-1

(25)

2º-Adição de reagente de Biureto 8 mL de reagente do Biureto 3º-Agitação

4º-Deixar desenvolver cor durante 30 minutos. 1º-Preparação das amostras

Fazer a leitura da absorvância de cada um dos tubos, utilizando um espectrofotómetro com um  de 540 nm.

L

FBS Br

F 0 L G Br

2ª PARTE: Determinação da proteína solúvel nas amostras iniciais e no filtrado após precipitação

2 mL Filtrado do leite 2 mL Bebida de soja 2 mL Leite FL BS 2 mL Filtrado de bebida de soja 2 mL Tampão

(26)

26 Discussão e análise dos resultados:

• Comparar o tipo de coagulação/precipitação obtida nos 3 casos.

• Interpretar o processo realizado em cada caso, tendo em conta a proteína utilizada.

• A partir da curva de calibração do método do Biureto efetuada no

trabalho prático anterior, determinar a quantidade de proteína das amostras filtradas.