Marion Schneider Meireles
EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO COM COLECALCIFEROL
SOBRE AS PROTEÍNAS REGULADORAS DO METABOLISMO
DA VITAMINA D EM MONÓCITOS E SOBRE OS MARCADORES
DE INFLAMAÇÃO DE PACIENTES EM DIÁLISE
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Doutor em Ciências.
São Paulo 2015
Marion Schneider Meireles
EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO COM COLECALCIFEROL
SOBRE AS PROTEÍNAS REGULADORAS DO METABOLISMO
DA VITAMINA D EM MONÓCITOS E SOBRE OS MARCADORES
DE INFLAMAÇÃO DE PACIENTES EM DIÁLISE
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Lilian Cuppari Coorientador: Prof. Dr. Maria Ayako Kamimura
São Paulo 2015
Ficha catalográfica
Meireles, Marion Schneider
Efeito da suplementação com colecalciferol sobre as proteínas reguladoras do metabolismo da vitamina D em monócitos e sobre os marcadores de inflamação de pacientes em diálise /
Marion Schneider Meireles – São Paulo, 2015. x, 71f
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Nutrição.
Título em inglês: Effect of the cholecalciferol supplementation on vitamin D-regulatory proteins in monocytes and inflammatory markers of patients on dialysis.
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
Coordenador do curso de pós-graduação: Prof. Dr. Mauro Batista de Morais
iv
MARION SCHNEIDER MEIRELES
EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO COM COLECALCIFEROL SOBRE AS
PROTEÍNAS REGULADORAS DO METABOLISMO DA VITAMINA D
EM MONÓCITOS E SOBRE OS MARCADORES DE INFLAMAÇÃO DE
PACIENTES EM DIÁLISE
Presidente da banca:
Prof. Dr. Lilian Cuppari
Banca examinadora:
Prof. Dr. Aluízio Barbosa de Carvalho Prof. Dr. Marise Lazaretti Castro
Prof. Dr. Miriam Ghedini Garcia Lopes Prof. Dr. Rosa Maria Affonso Moysés
v
“O cientista não é o homem que fornece as verdadeiras
respostas, é quem faz as verdadeiras perguntas”.
(Claude Lévi-Strauss)
vi
Dedico minha tese ao Rodrigo,
vii
Agradecimentos
A minha passagem pelo doutorado não poderia ter sido concretizada sem a ajuda de
pessoas incríveis que tive a honra de conviver. Por essa razão, gostaria de dedicar e
reconhecer a vocês minha imensa gratidão:
À minha família, a qual me proporcionou, além de enorme carinho e amor, os
conhecimentos da integridade, da perseverança e de procurar sempre em Deus à força
maior para o meu desenvolvimento como ser humano. À minha mãe por tantas
palavras de força e ajuda. Espero um dia chegar ao seu nível! Ao meu pai, por seu
incentivo e apoio. Ao meu irmão Maurício, por ter contribuído com tantos
ensinamentos e reflexões, tanto pessoais quanto a respeito da ciência da nutrição. À
minha querida tia Su por sua valiosa contribuição na revisão da língua portuguesa
desta tese. Ao Eliezer, por toda dedicação que sempre teve comigo. Às minhas
cunhadas Andréia e Ana, por serem exemplos de mulheres batalhadoras. Aos meus
sobrinhos Erick e Júlia, por me trazerem a alegria da infância novamente. Aos meus
sogros, por me acolherem de forma tão carinhosa. Aos meus avós (in memoriam) por
contribuírem com a minha educação na fase inicial da minha vida e, de certa forma,
por estarem sempre presentes, até hoje. E, por fim e não menos importante, meu
amado marido Rodrigo, por acreditar em mim mais do que eu mesma acredito!
Lílian, minha querida orientadora, um agradecimento mais do que especial,
por toda a confiança que depositaste em mim quando aceitou me orientar nessa longa
caminhada de pesquisa, ensino e assistência. Seus ensinamentos abriram meu coração
para tentar ser, ao menos um pouco, a profissional completa que tu és: exigente,
amável, inteligente, justa, íntegra e competente para com seus alunos, colegas e
pacientes. De forma mais do que uma educadora, foi uma amiga, me apoiou, me deu
força e coragem em muitos momentos difíceis pelos quais passei nessa jornada. Serei
eternamente admiradora da sua competência!
viii
Maria, minha coorientadora, por seus ensinamentos, partilhando comigo as
suas ideias e experiências. Quero expressar o meu reconhecimento pela profissional
extremamente talentosa que és. Sua entrega à pesquisa e ao ensino motivam a minha
superação pessoal.
Aos queridos amigos da Casinha, foi uma honra e aprendizado conviver com
cada um de vocês. Chris, Laila e Raíssa, grandes amigas que fiz durante este percurso
e que sempre estiveram comigo nos momentos mais difíceis, me enchendo de alegrias,
passeios e conversas. Danilo, Tarcísio, Bruna, Fernanda, Bianka, Ana Paula,
Andreia, Priscila, Mônica, Rebeca, Gizely, Fe, Alex, Flávia, Mariana, Giovana e
Catarina, os quais estiveram comigo durante essa jornada, me mostrando o quanto
pessoas tão diferentes podem ter o mesmo objetivo, convivendo e ajudando-se
mutuamente. Thalita e Thiago, meus orientandos, agradeço por me proporcionar o
prazer de ensinar.
Aos funcionários da Casinha, meus sinceros agradecimentos por toda a ajuda
prestada. Às enfermeiras Sílvia e Camila, bem como toda a equipe de enfermagem,
pela assistência na coleta de dados junto aos pacientes.
Aos médicos Dra. Maria Eugênia, Dr. Sérgio Draibe, Dr. Bevilacqua e Dr.
Aluízio pelas valiosas críticas e sugestões concedidas desde a concepção deste projeto
até as discussões científicas durante as reuniões da uremia.
Cida e Tarcísio, por me ensinarem sobre os experimentos em um laboratório e
me mostrarem o quanto é complexa a pesquisa experimental.
Márcia, minha querida professora de inglês, por toda ajuda nas revisões
gramaticais e no incentivo de que eu conseguiria uma satisfatória comunicação da
minha pesquisa nos congressos internacionais de que participei.
ix
Agradeço aos pacientes que fizeram parte deste estudo, contribuindo com sua
dedicação e boa vontade. Sem eles não haveriam resultados de uma investigação.
Agradeço a todos aqueles que não citei, mas que fizeram o meu sonho tornar-se
realidade, me proporcionando forças para que eu não desistisse de ir atrás do que eu
buscava para minha vida.
Por fim, a Deus, que permitiu que eu conquistasse tudo que sempre sonhei na
minha vida e que me proporcionou conviver com todas essas pessoas maravilhosas,
que tornaram meus dias mais iluminados.
x
Este trabalho recebeu apoio das seguintes instituições:
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Fundação Oswaldo Ramos – Hospital do Rim e Hipertensão
1 Sumário Dedicatória ... vi Agradecimentos ... vii Lista de quadros ... 2 Lista de figuras ... 3 Lista de abreviaturas ... 4 Resumo ... 6 Abstract ... 9 1. INTRODUÇÃO ... 12 2. OBJETIVOS ... 15 2.1 Geral ... 15 2.2 Específicos ... 15 3. REVISÃO DA LITERATURA ... 17 3.1 Vitamina D ... 17 3.1.1 Ação clássica ... 22
3.1.2 Ações não clássicas ... 24
3.2 Avaliação do estado nutricional de vitamina D ... 25
3.3 Hipovitaminose D ... 27
3.4 Vitamina D e doença renal crônica ... 29
3.4.1 Vitamina D e inflamação na doença renal crônica ... 31
4. ARTIGO ... 37
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 58
6. REFERÊNCIAS ... 60
2
Lista de quadros
Quadro 1. Teor de vitamina D das principais fontes alimentares... 17 Quadro 2. Recomendações de ingestão dietética de referência de vitamina D ... 18 Quadro 3. Nomenclatura e estrutura molecular do grupo de moléculas da vitamina D ... 20 Quadro 4. Principais fatores de risco de hipovitaminose D ... 28
3
Lista de figuras
Figura 1. Síntese e metabolismo da vitamina D... 19 Figura 2. Etapas da ativação genômica do receptor de vitamina D ... 22 Figura 3. Ações clássicas do calcitriol ... 23 Figura 4. Representação esquemática dos mecanismos envolvidos nas ações imunomodulatórias da 1,25(OH)2D ... 25 Figura 5. Esquema representando as ações da vitamina D em diversas células e situações clínicas ... 29 Figura 6. Representação esquemática dos fatores envolvidos no distúrbio do metabolismo mineral da doença renal crônica ... 30
4 Lista de abreviaturas 1,25(OH)2D 1,25-dihidroxivitamina D 25(OH)D 25-hidroxivitamina D Ca Cálcio CYP24A1 24-hidroxilase CYP27B1 1-α hidroxilase
DBP Vitamin D binding protein
DP Diálise peritoneal
DRC Doença renal crônica
FA Fosfatase alcalina
FAO Fosfatase alcalina óssea FGF-23 Fibroblast growth factor-23
HD Hemodiálise IL-6 Interleucina-6 P Fósforo PCR Proteína C-reativa PTH Hormônio da paratireoide TLR Toll-like receptor
TNF-α Tumor necrosis factor-α
VDR Vitamin D receptor
Vitamina D2 Ergocalciferol
RESUMO ______________________________________________________________
6
Resumo
Introdução: A hipovitaminose D, bem como o estado inflamatório crônico são condições clínicas altamente prevalentes entre os pacientes em diálise. Estudos sugerem que a vitamina D apresenta um papel imunomodulador, inibindo a produção de citocinas pró-inflamatórias. Entretanto, o impacto do tratamento da hipovitaminose D sobre a modulação da resposta inflamatória tem sido pouco investigado nesses pacientes.Objetivos: Investigar os efeitos da restauração do estado nutricional de vitamina D sobre a expressão intracelular das proteínas reguladoras do metabolismo da vitamina D nos monócitos e sobre os marcadores circulantes de inflamação em pacientes em diálise.
Métodos: Trata-se de um ensaio clínico randomizado, duplo-cego e controlado por placebo, com duração de 12 semanas. Pacientes submetidos à hemodiálise ou à diálise peritoneal e com hipovitaminose D (25(OH)D<20ng/mL) foram aleatoriamente alocados para o grupo colecalciferol ou para o grupo controle. Os pacientes do grupo colecalciferol (n=20) receberam 50.000 UI de colecalciferol 2x/semana (1.000 UI/gota) e os pacientes do grupo controle (n=18) receberam uma solução placebo (50 gotas 2x/semana). A expressão intracelular das enzimas 1-α hidroxilase e 24-hidroxilase, do receptor da vitamina D (VDR) e da interleucina-6 (IL-6) nos monócitos foram determinadas por citometria de fluxo. As concentrações séricas de 25(OH)D, IL-6, fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e proteína C-reativa (PCR) foram mensuradas. Os dados foram expressos em média ± desvio padrão ou mediana e intervalo interquartil, de acordo com a distribuição das variáveis.
Resultados: A coorte era composta por 53% de homens, 42% dos pacientes eram portadores de diabetes mellitus e 90% de hipertensão arterial sistêmica. O tempo mediano em programa de diálise era de 30,5 meses (12,5-54,5), a média de idade era 56±13 anos e o IMC=25,4±5,6 kg/m2e 21% dos pacientes apresentavam algum grau de desnutrição. Os grupos não diferiram quanto às variáveis demográficas, clínicas, nutricionais e laboratoriais no início do estudo. A concentração sérica de 25(OH)D do grupo colecalciferol aumentou significantemente após o tratamento (14,3±4,7 ng/mL para 43,1±11,0 ng/mL; p<0,001), já no grupo controle não houve mudança (13,9±4,2 ng/mL para 13,5±4,3 ng/mL; p=0,562). Nos monócitos, houve um aumento significante na expressão da enzima 1-α hidroxilase e na expressão do VDR no grupo colecalciferol, enquanto a expressão do VDR do grupo controle
7
Resumo
diminuiu após a intervenção. Em ambos os grupos não foram observadas modificações na expressão da enzima 24-hidroxilase e na expressão da IL-6. A concentração sérica de PCR e de IL-6 diminuiu significantemente apenas no grupo colecalciferol (de 8,1±6,6 pg/mL para 4,6±4,1 pg/mL, p=0,012 e de 0,50 (0,10-1,27) mg/dL para 0,28 (0,09-0,62) mg/dL, p=0,010, respectivamente), sendo que o efeito da interação entre o grupo e o tempo foi p=0,003 para IL-6 e p=0,097 para PCR. TNF-α não sofreu modificação em ambos os grupos. A concentração do hormônio da paratireoide diminuiu apenas no grupo colecalciferol. Não houve mudança na concentração sérica de cálcio, fósforo, fosfatase alcalina e fator de crescimento de fibroblastos-23 em nenhum dos grupos. Nenhum paciente desenvolveu hipercalcemia ou hiperfosfatemia durante o período do estudo.
Conclusão: O tratamento da hipovitaminose D promoveu um aumento da expressão da enzima 1-α hidroxilase e do VDR nos monócitos e uma redução nos marcadores inflamatórios circulantes de pacientes em diálise.
ABSTRACT ______________________________________________________________
9
Abstract
Introduction: Hypovitaminosis D and a chronic inflammatory state are highly prevalent clinical conditions among patients undergoing dialysis. Studies have suggested that vitamin D has an immunodulatory role, inhibiting the production of proinflammatory cytokines. However, the impact of the treatment of hypovitaminosis D on modulation of the inflammatory response has been scarcely investigated in these patients.Objective: To investigate the effect of the restoration of the vitamin D status on the expression of intracellular vitamin D-regulatory proteins in monocytes and circulating inflammatory markers in dialysis patients.
Methods: This is a randomized double-blind placebo-controlled 12-week clinical trial. Patients undergoing hemodialysis and peritoneal dialysis with hypovitaminosis D (25(OH)D<20 ng/mL) were randomly allocated to cholecalciferol group or to control group. The patients of the cholecalciferol group (n=20) received 50,000 IU of cholecalciferol twice weekly (1,000 IU/drop) and the patients of the control group (n=18) received a placebo solution (50 drops twice weekly). The intracellular expression of the 1-α hydroxylase and 24-hydroxylase enzymes, vitamin D receptor (VDR) and interleukin-6(IL-6) in monocytes were determined by flow cytometry. Serum concentrations of 25(OH)D, IL-6, tumor necrosis factor-α (TNF-α) and C-reactive protein (CRP) were measured. Data were expressed as mean ± standard deviation or median and interquartile range according distribution of the variable. Results: The cohort was composed of 53% men, 42% had diabetes mellitus and 90% had systemic arterial hypertension. The median dialysis vintage was 30.5 months (12.5-54.5), the mean age was 56±13 years, BMI=25.4±5.6 kg/m2, and 21% of the patients had some degree of malnutrition. At baseline the groups were not different in regards to demographic, clinical, nutritional and laboratory variables. After 12 weeks the serum concentration of 25(OH)D increased significantly in the cholecalciferol group (14.3±4.7 ng/mL to 43.1±11.0 ng/mL, p<0.001), while in the control group did not change (13.9±4.2 ng/mL to 13.5±4.3 ng/mL; p=0.562). In monocytes, there was a significant increase in the 1-α hydroxylase enzyme expression and VDR expression in the cholecalciferol group, while VDR expression decreased in the control group. In both groups there were no change in the expression 24-hydroxylase and IL-6. Serum concentration of CRP and IL-6 decreased significantly only in the cholecalciferol group (from 0.50 (0.10-1.27) mg/dL
10
Abstract
to 0.28 (0.09-0.62) mg/dL, p=0.010 and from 8.1±6.6 pg/mL to 4.6±4.1 pg/mL, p=0.012, respectively). The interaction effect between group and time was p=0,003 for IL-6 and p=0,097 for PCR. TNF-α did not change in both groups. Serum parathyroid hormone decreased only in the cholecalciferol group. Serum concentration of calcium, phosphorus, alkaline phosphatase and fibroblast growth factor-23 did not change in both groups. No patient developed hypercalcemia or hyperphosphatemia in the study period.
Conclusion: Treatment of hypovitaminosis D promoted an upregulation in the expression of 1-α hydroxylase and VDR in monocytes and a decrease in circulating inflammatory markers in patients undergoing dialysis.
1. INTRODUÇÃO ______________________________________________________________
12
Introdução
O termo vitamina D é frequentemente empregado para descrever um grupo de moléculas secosteroides interligadas por reações fotolíticas e enzimáticas.1
A vitamina D pode ser obtida por fonte alimentar (D2 – ergocalciferol ou D3 –
colecalciferol) ou por produção endógena (D3). Ao passo que apenas 10 a 20% das
necessidades diárias de vitamina D são alcançadas pela alimentação (alimentos in
natura ou fortificados), a produção endógena é considerada a principal fonte de
vitamina D, sendo capaz de suprir 90 a 95% das necessidades diárias nos seres humanos.1,2
A síntese de vitamina D inicia-se na pele em consequência da exposição à luz solar. Os fótons ultravioleta (UVB) provocam a fotólise do 7-dehidrocolesterol presente na pele, formando o pré-colecalciferol, o qual pode ser termicamente isomerizado a colecalciferol que, via proteína ligadora de vitamina D, entra na circulação. No fígado, a vitamina D3 sofre o primeiro processo de hidroxilação pela
ação da enzima 25-hidroxilase presente na mitocôndria dos hepatócitos, formando a 25-hidroxivitamina D [25(OH)D] ou calcidiol, que é a forma mais abundante no organismo e marcador do estado nutricional de vitamina D. Para que a vitamina se torne biologicamente ativa, no entanto, é necessária uma segunda hidroxilação que ocorre no rim, pela ação da enzima 1-α hidroxilase presente na mitocôndria das células do túbulo renal proximal, resultando, finalmente, na formação da 1,25 dihidroxivitamina D [1,25(OH)2D] ou calcitriol.1,3,4
Distúrbios relacionados ao metabolismo da vitamina D são característicos da doença renal crônica (DRC). Com a progressão da doença e diminuição da massa renal funcionante, há um declínio da expressão da enzima 1-α hidroxilase, resultando em redução na síntese de 1,25(OH)D2.5,6 Por essa razão acreditava-se
que a manutenção de níveis adequados do substrato [25(OH)D] não teria impacto na saúde desses pacientes. No entanto, com a descoberta de que locais extrarrenais, entre eles as células do sistema imune, apresentam o aparato necessário para produzir localmente 1,25(OH)2D,7revitalizou-se o interesse em investigar o papel da
hipovitaminose D nos vários desfechos clínicos que acometem esses pacientes, entre eles os associados à inflamação crônica.
Estudos têm demonstrado uma elevada prevalência de hipovitaminose D (25(OH)D<30 ng/mL) nessa população e uma associação dessa condição com
13
Introdução
níveis elevados de marcadores inflamatórios, especialmente em pacientes submetidos à terapia dialítica.8,9
Sabe-se que a suplementação com vitamina D é eficaz em restabelecer as concentrações séricas adequadas de 25(OH)D na maioria dos portadores de DRC, no entanto, há uma escassez de estudos que avaliam o impacto do seu tratamento sobre os aspectos imunológicos nessa população.
Em um ensaio clínico, Stubbs et al. (2010) avaliaram o efeito da suplementação com colecalciferol sobre a modulação da resposta inflamatória em sete pacientes em hemodiálise que apresentavam níveis séricos de 25(OH)D < 25 ng/mL. A terapia com colecalciferol resultou em elevação dos níveis de 25(OH)D, aumento da expressão do receptor de vitamina D nos monócitos, além de reduzir os níveis circulantes de interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8) e fator de necrose tumoral-α (TNF-α).10
Bucharles et al. (2012) investigaram o efeito da suplementação com colecalciferol em 30 pacientes em hemodiálise. Foi verificado um aumento da 25(OH)D sérica após três meses de suplementação, com concomitante redução da proteína C-reativa e IL-6, sugerindo que a correção da hipovitaminose D apresenta um efeito anti-inflamatório.11 No entanto, poucos ensaios clínicos controlados investigaram se a restauração do estado nutricional da vitamina D poderia reduzir a resposta inflamatória de pacientes em diálise. Marckmann et al. (2012) e Seibert et
al. (2013) não conseguiram demonstrar o efeito benéfico da suplementação com
colecalciferol sobre marcadores de inflamação em pacientes em diálise.12,13 Portanto, ainda existem incertezas quanto ao efeito da reposição da vitamina D sobre a resposta inflamatória de pacientes com DRC.
Diante da elevada prevalência de hipovitaminose D na doença renal crônica e das potenciais ações pleiotrópicas da vitamina D é possível supor que a restauração do estado nutricional dessa vitamina poderia promover efeitos imunomoduladores em pacientes submetidos à terapia dialítica.
2. OBJETIVOS ______________________________________________________________
15
Objetivos
2.1 Objetivo geral:Investigar os efeitos da restauração do estado nutricional de vitamina D sobre a expressão intracelular das proteínas reguladoras do metabolismo da vitamina D nos monócitos e sobre os marcadores circulantes de inflamação em pacientes em diálise.
2.2 Objetivos específicos:
Investigar o impacto da suplementação com colecalciferol sobre: 1) A concentração sérica de 25-hidroxivitamina D;
2) A expressão intracelular do receptor da vitamina D, das enzimas 1-α hidroxilase e 24-hidroxilase e da interleucina-6 em monócitos;
3) Os níveis circulantes de interleucina-6, fator de necrose tumoral-α e proteína C-reativa;
3. REVISÃO DA LITERATURA ______________________________________________________________
17
Revisão da literatura
3.1 Vitamina D
A vitamina D é considerada um nutriente essencial que pode ser obtido por meio da alimentação (D2 – ergocalciferol ou D3 – colecalciferol) ou por produção
endógena (D3). As diferenças entre as duas formas da vitamina D estão apenas na
origem e na estrutura molecular, enquanto, do ponto de vista fisiológico, as duas formas de vitamina D parecem exercer os mesmos efeitos.14
Poucos alimentos contêm naturalmente vitamina D (Quadro 1). Enquanto a vitamina D2 é sintetizada a partir da radiação ultravioleta (UVB) sobre o ergosterol de
plantas e cogumelos, a vitamina D3 está presente, principalmente, no óleo de fígado
de bacalhau e peixes gordurosos.3
Quadro 1. Teor de vitamina D das principais fontes alimentares. Alimento Porção Vitamina D (UI)
D2
Cogumelos frescos 100 g ~ 100
Cogumelos secos ao sol 100 g ~ 1600 D3
Salmão selvagem 100 g ~ 600 a 1000
Salmão de criação 100 g ~ 100 a 250
Sardinha em conserva 100 g ~ 300
Atum em conserva 100 g ~ 230
Óleo de fígado de bacalhau 5 mL ~ 400 a 1000
Gema de ovo 1 unidade ~ 20
Fonte: Maeda et al., 2014.3
As recomendações de ingestão dietética de referência (Dietary Reference
Intakes - DRI) de vitamina D foram estabelecidas pelo comitê do Instituo de Medicina
dos Estados Unidos (Institute of Medicine – IOM) para manter a saúde óssea, assumindo que um indivíduo tenha exposição solar mínima. Foi determinado que uma ingestão de 600 UI/dia de vitamina D é suficiente para atender às necessidades nutricionais da maioria das crianças e adultos e 800 UI/dia para indivíduos com idade superior a 70 anos (Quadro 2).15
18
Revisão da literatura
Quadro 2. Recomendações de ingestão dietética de referência de vitamina D. Faixa etária EAR (UI/dia) RDA (UI/dia) UL (UI/dia)
0 a 6 meses * - - 1000 6 a 12 meses * - - 1500 1 a 3 anos 400 600 2500 4 a 8 anos 400 600 3000 9 a 13 anos 400 600 4000 14 a 18 anos 400 600 4000 19 a 50 anos 400 600 4000 51 a 70 anos 400 600 4000 > 70 anos 400 800 4000 Gestantes/lactantes 400 600 4000
EAR: Necessidade média estimada (valor de ingestão de vitamina D para cobrir as necessidades de 50% dos indivíduos saudáveis); RDA: Ingestão dietética recomendada (nível de ingestão dietética suficiente para cobrir as necessidades de 97 a 98% dos indivíduos saudáveis); UL: nível máximo de ingestão tolerável. *Ingestão adequada = 400UI/dia.
A absorção da vitamina D proveniente da alimentação ocorre no intestino delgado, em meio lipídico e emulsificada pela bile. Após absorção, a vitamina D é incorporada aos quilomícrons e transportada por meio do sistema linfático para a circulação sanguínea.16
À medida que apenas 10 a 20% das necessidades diárias de vitamina D são alcançadas pela alimentação (alimentos in natura ou fortificados), a produção endógena é considerada a principal fonte de vitamina D, sendo capaz de suprir 90 a 95% das necessidades diárias nos seres humanos.1,2
A síntese de vitamina D inicia-se na pele em consequência da exposição à luz solar. Os fótons ultravioleta B, em um comprimento de onda entre 290 e 315 nm, provocam a fotólise do 7-dehidrocolesterol (pró-vitamina D3) presente na camada
bilipídica das membranas celulares da epiderme, formando a pré-vitamina D3. Uma
vez foto-sintetizada, a pré-vitamina D3 pode ser termicamente isomerizada a vitamina
D3 ou formar isômeros biologicamente inertes (lumisterol e taquisterol).17,18 A
conformação tridimensional da molécula de vitamina D3 possibilita sua secreção
para o espaço extracelular.1
Uma vez que a vitamina D, proveniente da alimentação (vitamina D2/D3) ou da
síntese cutânea (vitamina D3), atinge a circulação sanguínea, inicia-se o processo de
19
Revisão da literatura
carbono 25 pela ação da enzima 25-hidroxilase (CYP2R1; CYP27A1), formando a 25-hidroxivitamina D [25(OH)D] ou calcidiol.3
O segundo processo de bioativação ocorre nos rins. Nas mitocôndrias das células dos túbulos renais proximais, a enzima 1-α hidroxilase promove hidroxilação no carbono 1 da 25(OH)D, formando 1,25 dihidroxivitamina D [1,25(OH)2D] ou
calcitriol, a forma biologicamente ativa da vitamina D (Figura 1).17 A enzima 1-α hidroxilase (CYP27B1) é uma proteína mitocondrial da família CYP450. Nos rins, a expressão do gene CYP27B1 é estimulada pelo hormônio da paratireoide (PTH) e suprimida pelo fósforo, cálcio, fator de crescimento de fibroblastos (fibroblast growth
factor – FGF-23) e pela própria 1,25(OH)2D.1,3,4
Fonte: adaptado de Holick. 2007.19
Figura 1. Síntese e metabolismo da vitamina D.
É importante ressaltar que o termo vitamina D é frequentemente empregado para descrever um grupo de moléculas secosteroides interligadas por reações fotolíticas e enzimáticas descritas anteriormente, entretanto somente o colecalciferol e o ergocalciferol são classificados como vitaminas, enquanto o calcidiol é um pré-hormônio e o calcitriol é um pré-hormônio. A complexa nomenclatura e estrutura molecular desse grupo de moléculas está representada no Quadro 3.1
20
Revisão da literatura
Quadro 3. Nomenclatura e estrutura molecular do grupo de moléculas da vitamina D.Abreviatura Nomenclatura Estruturas moleculares
Pró-vitamina 7-DHC 7-deidrocolesterol Pró-D2 Ergosterol Pré-vitamina Pré-D3 Pré-colecalciferol Vitamina D3 Colecalciferol D2 Ergocalciferol Pré-hormônio 25(OH)D3 25-hidroxivitamina D3 Calcidiol 25(OH)D2 25-hidroxivitamina D2 Ercalcidiol Hormônio 1,25(OH)2D3 1,25 dihidroxivitamina D3 Calcitriol 1,25(OH)2D2 1,25 dihidroxivitamina D2 Ercalcitriol
Fonte: adaptada de KDIGO, 200920; Dusso et al., 200517; Jones, 201321.
Como todos os compostos da vitamina D são moléculas lipofílicas, eles são transportados na circulação sanguínea ligados a proteínas. O principal transportador de colecalciferol, ergocalciferol, 25(OH)D e 1,25(OH)2D é a proteína ligadora de
21
Revisão da literatura
também podem contribuir para o transporte destes compostos. O complexo DBP-25(OH)D é continuamente filtrado pelos glomérulos e reabsorvido por meio de
componentes endocíticos. A reabsorção deste complexo ocorre nas células do
túbulo proximal e se dá por endocitose mediada por receptores presentes na superfície luminal da membrana celular, denominados megalina e cubilina. No citoplasma, a DBP é degradada pelos lisossomos, liberando a 25(OH)D, a qual pode ser convertida na sua forma ativa pela ação da enzima 1-α hidroxilase ou inativada pela enzima 24-hidroxilase (CYP24A1). A enzima 24-hidroxilase é responsável pela degradação da 25(OH)D e da 1,25(OH)2D a compostos biologicamente inativos,
como 24,25(OH)2D e 1,24,25(OH)3D, respectivamente.21 Enquanto a própria
concentração sérica de 1,25(OH)2D e o FGF-23 induzem a expressão dessa enzima
catabólica, o PTH inibe-a.22
Uma vez sintetizado, o calcitriol [1,25(OH)2D] exerce suas ações genômicas,
a partir da ligação com seu receptor. Da mesma forma, a 25(OH)D também pode exercer certa atividade biológica ao ligar-se ao receptor, porém tal atividade é, ao menos, 100 vezes menor que a da 1,25(OH)2D.23
O receptor da vitamina D (vitamin D receptor - VDR) é um fator de transcrição que pertence à família dos receptores nucleares para hormônios esteroides. Em sua estrutura há um domínio específico para acoplamento da 1,25(OH)2D,
heterodimerização com o receptor do retinoide X (RXR), ligação ao DNA e ativação da transcrição. A 1,25(OH)2D liga-se a porção hidrofóbica do VDR, induzindo uma
mudança conformacional e formação do complexo transcricional hormônio-receptor. Esse complexo é heterodimerizado com o RXR, formando um complexo 1,25(OH)2D-VDR-RXR, o qual se liga a sequências específicas de DNA nos seus
genes-alvos, denominados elementos responsivos à vitamina D (vitamin D response
element – VDRE). Para promover a ativação ou repressão gênica, proteínas
corregulatórias são recrutadas, desencadeando, assim, uma resposta biológica (Figura 2) 1
22
Revisão da literatura
Fonte: adaptado de Dusso, 2011.24
Figura 2. Etapas da ativação genômica do receptor de vitamina D.
À medida que as ações genômicas ocorrem quando a 1,25(OH)2D liga-se a
seu receptor nuclear mediando efeitos pós-transcricionais, as ações não-genômicas ocorrem quando o VDR, situado na membrana celular ou no citoplasma, induz a uma rápida sinalização intracelular, por meio da indução de canais voltagem-dependente de transporte de íons transmembrana (Ca+2, Cl-), do controle do influxo e da quantidade de Ca+2 no citoplasma e da ativação de segundos mensageiros, como AMP cíclico, proteína quinase A e fosfolipase C.1,25
3.1.1 Ação clássica
A ação clássica da 1,25(OH)2D é a regulação do metabolismo mineral,
principalmente sobre a homeostase de cálcio, onde órgãos como intestino, rins, ossos e paratireoides estão interligados para manter a homeostase (Figura 3). No intestino, o calcitriol participa de mecanismos de absorção ativa de cálcio (duodeno) e passiva (jejuno). Na absorção ativa, o calcitriol estimula a expressão de TRPV5 e TRPV6 (proteínas envolvidas na captação de cálcio pelo enterócito), de calbindina (proteína envolvida no transporte intracelular de cálcio) e dos canais de membrana ATP-dependentes para extrusão do cálcio para o fluido extracelular. No jejuno, o calcitriol estimula a expressão de paracelinas, proteínas intercelulares que formam
23
Revisão da literatura
canais por onde o cálcio é transferido passivamente para o interior do enterócito. A absorção intestinal de fósforo ocorre por meio de uma proteína transportadora – NaPi2b, a qual tem sua expressão estimulada pelo calcitriol e inibida pelo FGF-23. Nos rins, mais precisamente, nas células do túbulo renal distal, o calcitriol promove reabsorção do cálcio filtrado, por meio do estímulo à expressão de proteínas transportadoras de cálcio – TRPV5 e calbindina.26
Nos ossos, o calcitriol está envolvido no aumento da expressão do fator de ativação nuclear (RANKL) produzidos pelos osteoblastos, que se ligam aos seus receptores (RANK) presentes em pré-osteoclastos, induzindo a sua diferenciação em osteoclasto maduro. O osteoclasto maduro, por sua vez, promove reabsorção óssea, removendo cálcio e fósforo dos ossos, contribuindo com a manutenção da concentração sérica de cálcio e fósforo dentro de valores normais.19 Nas paratireoides, a ligação do calcitriol ao VDR contribui para a regulação dos níveis de PTH.27
Fonte: adaptado de Holick, 2007.19
24
Revisão da literatura
3.1.2 Ações não clássicas
A partir da identificação da expressão da enzima 1-α hidroxilase e do VDR em diversas células de tecidos extrarrenais7, investigações para determinar os efeitos não clássicos da 1,25(OH)2D vem ganhando atenção da comunidade científica. Ao
passo que as células renais são as principais responsáveis pela concentração sérica de 1,25(OH)2D, a qual age de forma endócrina sobre a homeostase calcêmica,
outras células como as da próstata, mama, cólon, células imunes, células β-pancreáticas e da pele são capazes de produzir 1,25(OH)2D intracelularmente para
promover ações autócrinas e parácrinas.17,19 A regulação da síntese e da degradação de 1,25(OH)2D está sob o controle de diversos fatores locais, tais como
citocinas e fatores de crescimento, os quais podem otimizar o nível intracelular de 1,25(OH)2D para promover ações celulares específicas.28
Cerca de 900 genes são regulados pela 1,25(OH)2D.29 Entre eles,
destacam-se os genes envolvidos no controle do ciclo celular, como a indução da proliferação, diferenciação e apoptose, bem como da inibição da angiogênese, além da inibição do sistema renina-angiotensina, do controle da síntese e liberação de insulina e da regulação do sistema imunológico, induzindo a expressão de peptídeos antimicrobianos e a inibindo a síntese de citocinas pró-inflamatórias.1,30,31
A importância fisiológica da 1,25(OH)2D no sistema imune tem sido
demonstrada em alguns estudos. A maioria das células imunes expressa o aparato metabólico para sintetizar (enzima 1-α hidroxilase), degradar (enzima 24-hidroxilase) e promover uma ação imunomodulatória quando a 1,25(OH)2D liga-se à seu receptor
(VDR).7 A expressão gênica nessas células, mediada pela ligação 1,25(OH)2D-VDR
induz à produção de peptídeos antimicrobianos (catelicidina e beta-defensina 2), à regulação da produção de citocinas e à inibição da proliferação de células que participam do processo infamatório.31-33
O complexo 1,25(OH)2D-VDR regula a inflamação estimulando o supressor de
sinalização de citocinas 1 (SOCS-1) e inibindo a proteína quinase ativada pelo mitógeno p38 (MAPK p38), os quais fazem parte da via do receptor Toll-like (TLR). Dessa forma, ocorre supressão da via de sinalização do fator nuclear kappa B (NF-κB), promovendo, assim redução da síntese de citocinas pró-inflamatórias, tais como
25
Revisão da literatura
fator de necrose tumoral-α (Tumor necrosis factor-α – TNF-α), interleucina-6 (IL-6) e proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1) (Figura 4).31,32
Fonte: adaptado de Yin & Agrawal, 2014.32
Figura 4. Representação esquemática dos mecanismos envolvidos nas ações imunomodulatórias da 1,25(OH)2D.
LPS: lipopolissacarídeo; TLR: receptor Toll-like; SOCS1: supressor de sinalização de citocinas 1; MAPK: proteína quinase ativada pelo mitógeno; TNF-α: fator de necrose tumoral-α; IL-6: interleucina-6; MCP-1: proteína quimiotática de monócitos-1; NF-κB: fator nuclear kappa B; VDRE: elemento responsivo à vitamina D; CYP27B1: enzima 1α-hidroxilase; VDR: receptor da vitamina D; MTB:
Mycobacterium tuberculosis; IκB-α: inibidor do fator de transcrição nuclear kappa B-α.
3.2 Avaliação do estado nutricional de vitamina D
Dentre todos os compostos da vitamina D, a 25(OH)D é a que apresenta as características que definem um bom marcador nutricional: é a forma mais abundante circulante da vitamina D, tem meia-vida relativamente longa (25 a 30 dias), sofre pouca regulação e depende da disponibilidade de substrato.34 Já a 1,25(OH)2D
apresenta meia-vida curta (4 a 6 horas) e é rigidamente mantida em concentrações normais por diversos mecanismos regulatórios.1,35 Da mesma forma, a vitamina D2 e
26
Revisão da literatura
concentração sérica pode variar de 0 a 100 ng/mL, dependendo da ingestão recente de alimentos fontes em vitamina D ou da exposição solar.36
Os critérios atualmente definidos para classificação do estado nutricional de vitamina D se baseiam nas ações clássicas dessa vitamina, ou seja, na manutenção da concentração sérica de PTH, dentro de valores normais, e na saúde óssea. O Instituo de Medicina dos Estados Unidos (Institute of Medicine – IOM) considera que níveis de 25(OH)D > 20 ng/mL são adequados para manter uma boa saúde óssea. Valores abaixo deste nível indicam deficiência de vitamina D, enquanto níveis entre 20 e 50 ng/mL são considerados adequados e acima de 200 ng/mL são indicativos de toxicidade.15 Já para a Sociedade Americana de Endocrinologia, níveis de 25(OH)D < 20 ng/mL são indicativos de deficiência, entre 20 e 29 ng/mL, de insuficiência, entre 30 e 100 ng/mL, de suficiência e > 150 ng/mL, de intoxicação.37 E para a Sociedade Brasileira de Endocrinologia, níveis de 25(OH)D > 30 ng/mL são desejáveis para a redução do risco de doenças osteometabólicas.3 Portanto, o diagnóstico de hipovitaminose D ainda não é consenso entre a comunidade científica. No entanto, discussões acerca do nível ótimo de 25(OH)D vem ocorrendo, uma vez que a 25(OH)D também é fundamental para promover ações pleiotrópicas. Tem sido sugerido que apenas 5% da 25(OH)D circulante seja utilizada como substrato para produção renal de 1,25(OH)2D, à medida que aproximadamente 85%
é utilizada por células extrarrenais.38
Nos últimos anos, com o crescimento do interesse a respeito da vitamina D diversos métodos estão disponíveis para a dosagem da concentração sérica de 25(OH)D, dentre eles destacam-se àqueles baseados em cromatografia e imunoensaios.
As técnicas baseadas em cromatografia são consideradas padrão-ouro. A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS) permitem distinguir entre 25(OH)D2 e
25(OH)D3, porém são altamente sofisticadas e apresentam um custo elevado.39 Na
prática clínica e em pesquisas métodos como o radioimunoensaio, quimioluminescência ou ensaios imunoenzimáticos são empregados, por serem mais simples e apresentarem custo menor.
27
Revisão da literatura
3.3 Hipovitaminose D
Há evidências que a hipovitaminose D, definida como 25(OH)D < 20 ou < 30 ng/mL é altamente prevalente entre a população mundial e, por isso, tem sido considerada como um problema de saúde pública. Em uma revisão sistemática composta por 168.000 participantes de 44 países, cerca de um terço dos estudos relataram concentração média de 25(OH)D < 20 ng/mL.9 No Brasil, não existem estudos populacionais que tenham avaliado o estado nutricional da vitamina D, entretanto a prevalência de hipovitaminose D em grupos específicos da população tem sido identificada. Em um estudo com idosos ambulatoriais e institucionalizados, 43,8% e 71,2%, respectivamente, apresentaram concentração sérica < 20 ng/mL.40 Em uma coorte de adultos saudáveis, 77,4% apresentaram concentração sérica de 25(OH)D < 20 ng/mL após o inverno, ao passo que esse percentual reduziu para 37,3% após o verão.41 Em uma coorte de adolescentes, 60% apresentaram concentração sérica de 25(OH)D abaixo de 30 ng/mL.42
Conforme apresentado no Quadro 4, diversas causas estão relacionadas a baixos níveis de 25(OH)D.19,43 A localização da região, bem como a estação do ano afetam a síntese cutânea de vitamina D3. Assim, em regiões de alta latitude e no
inverno, onde a incidência dos raios solares é menor, a produção de vitamina D3
diminui.44,45 O uso de protetor solar pode reduzir a síntese cutânea de vitamina D3
em mais de 95%.46 A elevada concentração de melanina presente na pele escura, compete com o 7-dehidrocolesterol pelos fótons UVB.47 Nos idosos, devido ao afinamento da epiderme e derme, ocorre redução da reserva de 7-dehidrocolesterol.48 Em indivíduos obesos, a disponibilidade de vitamina D está reduzida, provavelmente devido ao sequestro e armazenagem deste componente lipossolúvel pelas células do tecido adiposo.19 Além disso, portadores de algumas doenças, como a doença renal crônica, podem apresentar síntese reduzida de vitamina D, devido a hiperpigmentação da pele, catabolismo elevado de 25(OH)D, devido a expressão aumentada da enzima que degrada este componente e perdas urinárias de proteínas, o que promove elevada perda de DBP ligada a 25(OH)D.49,50 Outras causas da hipovitaminose D ainda podem ser citadas, como alguns medicamentos que aumentam o catabolismo da 25(OH)D e algumas doenças que reduzem a absorção intestinal de vitamina D, como doença de Crohn, fibrose cística
28
Revisão da literatura
ou doença celíaca, que provocam perdas urinárias de 25(OH)D, como síndrome nefrótica e que reduzem a 25-hidroxilação, como a doença hepática grave.19
Quadro 4. Principais fatores de risco para hipovitaminose D. Síntese cutânea reduzida de vitamina D3
Uso de protetor solar Uso excessivo de roupas
Confinamento em locais fechados Elevada concentração de melanina Envelhecimento
Elevada latitude Inverno
Hora do dia
Doença renal crônica
Disponibilidade reduzida de vitamina D
Má-absorção intestinal Obesidade
Catabolismo elevado de 25(OH)D
Medicamentos (anticonvulsivante, glicocorticoides) Doença renal crônica
Síntese reduzida de 25(OH)D
Doença hepática grave
Perdas urinárias elevadas de 25(OH)D
Síndrome nefrótica Doença renal crônica
Fonte: adaptado de Premaor & Furlanetto, 200643; Holick, 200719.
Com a gravidade e/ou duração da hipovitaminose D, a síntese de 1,25(OH)2D
diminui, promovendo redução da absorção intestinal de cálcio e, consequentemente, hipocalcemia e elevação de PTH, condição esta que, se mantida prolongadamente, pode levar a alterações no metabolismo mineral e estrutura óssea.43
Considerando o importante papel da vitamina D em vários órgãos e sistemas, estudos têm demonstrado uma associação entre hipovitaminose D e o risco de desenvolver várias enfermidades, conforme descrito na Figura 5. Entre elas destacam-se os eventos cardiovasculares, diabetes mellitus, neoplasias, doenças autoimunes, como esclerose múltipla, artrite reumatoide, encefalite autoimune, lúpus eritematoso sistêmico e tireoidite autoimune, doenças inflamatórias, como infecções
29
Revisão da literatura
agudas, tuberculose, doença inflamatória intestinal e asma, bem como o aumento do risco de mortalidade na população geral.51-56 No entanto, é preciso considerar que os resultados desses estudos observacionais não permitem indicar uma relação causal.
Fonte: adaptado de Norman, 2013.57
Figura 5. Esquema representando as ações da vitamina D em diversas células e situações clínicas.
3.4 Vitamina D e doença renal crônica
A deficiência de vitamina D é um dos fatores que contribui para o desenvolvimento do distúrbio do metabolismo mineral e ósseo (DMO), o qual é altamente prevalente na doença renal crônica (DRC). A Figura 6 demonstra esquematicamente os componentes envolvidos com o DMO-DRC. Com o declínio da função renal, há redução da excreção renal de fósforo, com consequente aumento de hormônios fosfatúricos – hormônio da paratireoide (PTH) e fator de crescimento de fibroblastos-23 (FGF-23). Entretanto, o mecanismo fosfatúrico torna-se
30
Revisão da literatura
insuficiente a medida que a doença progride, levando à hiperfosfatemia. Além disso, o aumento do FGF-23 e a redução da massa renal funcionante provocam diminuição da expressão da enzima 1-α hidroxilase, reduzindo, assim, a síntese renal de 1,25(OH)2D. O FGF-23 também age sobre a enzima 24-hidroxilase, estimulando sua
expressão e, consequentemente, aumentando a degradação da 1,25(OH)2D.21 A
deficiência de 1,25(OH)2D promove redução da absorção intestinal de cálcio,
levando a hipocalcemia, em consequência disto, ocorre aumento da síntese de PTH, a qual também é estimulada pela redução da expressão de VDR e dos receptores de cálcio (CaR) nas paratireoides.20,58,59
Fonte: adaptado de Kim & Kim, 2014.60
Figura 6. Representação esquemática dos fatores envolvidos no distúrbio do metabolismo mineral da doença renal crônica.
Mais recentemente tem sido observado que portadores de DRC também apresentam reduzida concentração sérica do substrato (25(OH)D) para produção renal de 1,25(OH)2D. Estima-se que 78% a 97% dos pacientes apresentam
hipovitaminose D (25(OH)D < 30 ng/mL).61,62 Diversas causas estão relacionadas com o desenvolvimento da hipovitaminose D nesta população, entre elas destacam-se as tradicionais, tais como a pouca exposição solar, baixa ingestão de alimentos fontes em vitamina D e uso de medicamentos, além disso, causas relacionadas com a própria doença, como alterações na pigmentação da pele, além das perdas
31
Revisão da literatura
urinárias e para a solução de diálise da proteína ligadora de vitamina D.49,50 A elevada proporção de pacientes obesos e diabéticos também contribui para a hipovitaminose D nesta população.63
Há evidências que a hipovitaminose D tem um importante impacto sobre a morbi-mortalidade de portadores de DRC. Estudos observacionais mostram que reduzidos níveis séricos de 25(OH)D estão associados com elevado risco de eventos cardiovasculares, inflamação, mortalidade cardiovascular e por todas as causas.8,61,64-66 Dessa forma, é possível supor que a restauração do estado nutricional de vitamina D poderia trazer efeitos benéficos para essa população. No entanto, ainda são poucos os estudos clínicos que avaliaram os efeitos do tratamento da hipovitaminose D nos portadores de DRC. Conforme pode ser observado na Tabela 1, a maioria dos estudos teve como foco principal o efeito da suplementação sobre marcadores do metabolismo mineral e, em apenas alguns, o objetivo foi avaliar as ações pleiotrópicas. Apesar de resultados inconsistentes, provavelmente por diferenças nos protocolos de suplementação, há indícios de que a intervenção com calciferol (ergocalciferol ou colecalciferol) tenha efeitos modulatórios sobre o metabolismo mineral, a inflamação, a hipertensão e intolerância à glicose.
3.4.1 Vitamina D e inflamação na doença renal crônica
Desordens imunológicas, tanto do sistema imune inato, quanto adaptativo são comuns entre portadores de DRC. Dentre as alterações do sistema imune inato destaca-se a hipercitocinemia, provocada pelo acúmulo de citocinas pró-inflamatórias, como consequência da reduzida excreção renal e/ou aumento da produção, induzida por toxinas urêmicas, estresse oxidativo, sobrecarga de volume, comorbidades, entre outros fatores. Ao passo que, alterações do sistema imune adaptativo é caracterizado por aumento das taxas de infecções e prejuízo da resposta à vacinação.67,68
A combinação da resposta imune alterada, aliada a persistentes estímulos, caracterizam a inflamação sistêmica de baixo grau presente nos portadores de DRC, principalmente na fase dialítica.69 O processo inflamatório inicial, desencadeado pelo dano tecidual, é essencial para eliminar agressores, porém à medida que se
32
Revisão da literatura
perpetua, traz consequências nocivas.70 Estudos têm demonstrado que pacientes em diálise apresentam elevada prevalência de inflamação e que ela está associada a estresse oxidativo, disfunção endotelial, calcificação vascular e desnutrição.69
Diversas causas desencadeiam a inflamação nesta população de pacientes e estão relacionadas, principalmente, à uremia e ao procedimento dialítico. Entre elas destacam-se o acúmulo de toxinas urêmicas, endotoxinas presentes na água da hemodiálise, interações entre o sangue e o hemodialisador, infecções no acesso vascular (cateter venoso central ou fístula arteriovenosa) e peritoneal (cateter peritoneal) e soluções de diálise peritoneal bioincompatíveis (alta concentração de glicose, baixo pH e com a presença de produtos de degradação de glicose).70
A resposta inflamatória gerada por contínuo estímulo na DRC promove ativação de células mononucleares e do sistema complemento, os quais induzem a liberação de mediadores inflamatórios para o ambiente extracelular, incluindo citocinas, espécies reativas de oxigênio e óxido nítrico.71
As citocinas são polipeptídeos produzidos em resposta a um antígeno ou outro sinal e função, como mensageiros químicos, que atuam de forma autócrina, parácrina ou endócrina e regulam várias reações imunológicas.72 Uma das citocinas mais relevantes no ambiente urêmico e que está associada à complicações da DRC é a interleucina-6 (IL-6), uma proteína de 20 kD, secretada por diversas células, como monócitos, fibroblastos, adipócitos e células endoteliais,73 em resposta à ação da interleucina-1 (IL-1) e/ou à ação do fator de necrose tumor-α (TNF-α – Tumor
necrosis factor-α). Dessa forma, a IL-1 e o TNF-α, produzidos pela ativação de
receptores Toll-like (TLR), são iniciadores do processo inflamatório, os quais ativam uma cascata complexa envolvendo diversas citocinas e os sistemas de coagulação e do complemento.72
Enquanto a maioria das citocinas apresenta mecanismos de ação autócrinos e parácrinos, os maiores efeitos da IL-6 são uma consequência da sua concentração na circulação e podem acontecer em locais distintos e longe da sua origem.73 De fato, a IL-6 estimula a síntese hepática de proteínas de fase aguda positivas, como a α-1 glicoproteína, a amiloide sérica A e a proteína C-reativa (PCR), e inibe a síntese hepática de proteínas de fase aguda negativas, como a transferrina e a albumina.
Diante do exposto, portadores de DRC apresentam imunoativação, resultando em inflamação, a qual pode colaborar para o desenvolvimento de doença
33
Revisão da literatura
cardiovascular, bem como imunodepressão, o que pode contribuir para a alta prevalência de infecções. Visto que estas duas complicações – doença cardiovascular e infecções – são as principais causas de mortalidade nessa população, atenuar os efeitos das anormalidades do sistema imune é uma estratégia importante.68
Abordagens terapêuticas para atenuar as causas inflamatórias relacionadas às comorbidades e ao procedimento dialítico, além de estratégias terapêuticas anti-inflamatórias alternativas, como intervenções nutricionais, no estilo de vida e farmacológicas inespecíficas.74
Abordagens farmacológicas inespecíficas para tratar a inflamação crônica de pacientes em diálise estão sendo investigadas, incluindo a vitamina D. Estudos sugerem que a 1,25(OH)2D sintetizada em locais extrarrenais, a partir da 25(OH)D,
pode ter um papel biológico importante, além daqueles tradicionalmente descritos. Dessa forma, a manutenção de uma concentração adequada de 25(OH)D é particularmente importante para a produção local da forma ativa de vitamina D, a qual pode constituir uma abordagem terapêutica da inflamação crônica nesta população. O guia que estabelece condutas terapêuticas para pacientes com DRC recomenda, como estratégia para correção da hipovitaminose D de pacientes em diálise, a mesma suplementação de vitamina D indicada para a população saudável ou seja, 50.000 UI/semana ou o equivalente a 6.000 UI/dia de colecalciferol ou ergocalciferol durante 8 semanas.20
Assim, o interesse em investigar efeitos autócrinos e parácrinos da suplementação com calciferol vem ganhando interesse da comunidade científica, porém, como pode ser observado na Tabela 1, ainda há uma escassez de estudos intervencionais.75 Os estudos apresentados tiveram como objetivo avaliar os efeitos pleiotrópicos da restauração do estado nutricional da vitamina D de pacientes em diálise. Enquanto algumas investigações demonstraram redução de marcadores inflamatórios após a suplementação com colecalciferol10,11,76, outras não foram capazes de verificar tal efeito.12,13,77
Dessa forma, devido à escassez de estudos e achados inconsistentes do efeito da vitamina D sobre o sistema imunológico, ensaios clínicos controlados são necessários para fornecer resultados mais concretos sobre a modulação da resposta inflamatória em pacientes com doença renal crônica.
34
Revisão da literatura
Tabela 1. Estudos de suplementação com vitamina D sobre parâmetros do metabolismo mineral e efeitos pleiotrópicos em pacientes em diálise.Estudo Delineamento
do estudo Amostra Intervenção
Principais resultados 25(OH)D 25(OH)D >30 ng/mL 1,25(OH)2D Marcadores ósseos Efeitos pleiotrópicos
Del Vale et al., Hemod Int,
201578
Ensaio clínico
não controlado 79 pacientes HD
Ergocalciferol:
72.000 UI/sem por 12 s, seguido por 24.000 UI/sem por 36 sem
↑ 84% ↑ PTH, FA, P ↔ FAO ↓ Ca ↑ NA Massart et al., AJKD, 2014789 Ensaio clínico randomizado, controlado por placebo e duplo-cego 55 pacientes HD (26 grupo suplementado e 29 grupo placebo) Colecalciferol:
25.000 UI/sem por 13 sem + 26 sem de prescrição individualizada ↑ 62% ↑ PTH, P, Ca ↔ NA Seibert et al., Nephron Clin Pract, 201313 Ensaio clínico randomizado, controlado por placebo e duplo cego 33 pacientes HD (15 grupo suplementado e 18 grupo placebo) Colecalciferol:
20.000 a 40.000 UI por semana ou por mês, dependendo da concentração sérica
de 25(OH)D, durante 12 semanas
↑ NA ↑ PTH, FA, P, Ca, FGF-23 ↔ PCR ↔ TNF-α, Porter et al., Am J Nephrology, 201380 Coorte retrospectiva 96 pacientes HD Ergocalciferol:
25(OH)D<5ng/mL= 50.000 UI/sem por 12 sem + 50.000 UI/mês por 3 meses; 25(OH)D 5-15 ng/mL= 50.000 UI/sem por
4 sem + 50.000 UI/mês por 5 meses; 25(OH)D 16-30 ng/mL= 50.000 UI/mês por 6 meses ↑ 41% NA PTH, Ca ↔ P ↓ NA Ulutas et al., Int Urol Nephrol, 201381 Ensaio clínico
não controlado 19 pacientes DP Colecalciferol: 50.000 UI/sem por 4-8 sem ↑
NA NA Ca, P ↔ PTH ↓ HOMA-IR, leptina ↓
Marckmann et al., NDT, 201212 Ensaio clínico randomizado, controlado por placebo e duplo-cego 27 pacientes HD (13 grupo suplementado e 14 grupo placebo)
Colecalciferol: 40.000 UI/semana por 8 semanas ↑ 100% ↑ PTH, P, Ca, FGF-23 ↔ PCR, IL-6, PAS, PAD ↔
35
Revisão da literatura
HD: hemodiálise; DP: diálise peritoneal; sem: semana; 25(OH)D: 25-hidroxivitamina D, 1,25(OH)2D: 1,25-dihidroxivitamina D; PTH: hormônio da paratireoide; FA: fosfatase alcalina total; FAO: fosfatase alcalina óssea; Ca: cálcio; P: fósforo; FGF-23: fator de crescimento de fibroblastos-23; IL-6: interleucina-6; TNF-α: fator de necrose tumoral-α; PCR: proteína C-reativa; TRAcP-5b: fosfatase ácida resistente ao tartarato 5b; PAS: pressão arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica; HOMA-IR: Modelo homeostático de avaliação da resistência à insulina; BNP: peptídeo natriurético cerebral; LVMI: índice de massa ventricular esquerda; Hb: hemoglobina; NA: não avaliado; ↑: aumentou; ↓: diminuiu; ↔: não mudou.
Estudo Delineamento
do estudo Amostra Intervenção
Principais resultados 25(OH)D 25(OH)D >30 ng/mL 1,25(OH)2D Marcadores ósseos Efeitos pleiotrópicos Bucharles et al., J Ren Nutr,
201211
Ensaio clínico
não controlado 30 pacientes HD
Colecalciferol:
50.000 UI/sem por 12 sem + 20.000 UI/sem por 12 sem
↑ NA NA PTH, FA, P ↔ Ca ↑ PCR, IL-6, LVMI ↓ Albumina ↔ Wasse et al., Am J clin Nutr, 201282 Estudo piloto, randomizado, controlado por placebo e duplo-cego 52 pacientes HD (25 grupo suplementado e 27 grupo placebo)
Colecalciferol: 200.000 UI/sem por 3 sem ↑ 90,5% ↑
PTH, FA, P, Ca ↔ NA Armas et al., CJASN, 201283 Ensaio clínico randomizado, controlado por placebo e duplo-cego 42 pacientes HD (20 grupo suplementado e 22 grupo placebo)
Colecalciferol: 10.333 UI/sem por 15 sem ↑ NA ↑ PTH, P, Ca ↔ NA
Stubbs et al., JASN, 201010
Ensaio clínico
não controlado 7 pacientes HD
Colecalciferol: 50.000 UI 2x/sem por 3 sem + 50.000 UI por semana ou por mês,
dependendo da concentração sérica de 25(OH)D, durante mais 5 semanas
↑ NA ↑ PTH, P, Ca, FGF-23 ↔ IL-6, TNF-α ↓ Matias et al., CJASN, 201076 Ensaio clínico não controlado 158 pacientes HD Colecalciferol: 25(OH)D<15ng/mL= 50.000 UI/sem 25(OH)D 16-30 ng/mL= 10.000 UI/sem 25(OH)D >30 ng/mL= 2.700 UI 3x/sem Duração: 6 meses ↑ 86% ↑ PTH, P, Ca ↓ FAO ↔ Albumina ↑ PCR, BNP, LVMI ↓ PAS, PAD, Hb ↔ Jean et al., NDT,200977 Ensaio clínico não controlado 107 pacientes HD
Colecalciferol: 100.000 UI/mês por 15 meses ↑ 91% ↑ FAO, PTH ↓ P, Ca ↔ PAS, PAD, Hb, albumina, PCR ↔ Tokmak et al., NDT, 200884 Ensaio clínico
não controlado 64 pacientes HD
Colecalciferol: 20.000 UI/sem por 9 meses
↑
36
4. ARTIGO ______________________________________________________________
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Artigo
O manuscrito abaixo foi submetido para apreciação no periódico Clinical
Journal of the American Society of Nephrology.
Effect of cholecalciferol on vitamin D-regulatory proteins in monocytes and on inflammation in dialysis patients: a randomized clinical trial
Marion Schneider Meireles1, MSc; Maria Ayako Kamimura1, PhD; Maria Aparecida Dalboni2, PhD; José Tarcísio Giffoni de Carvalho2, MSc; Lilian Cuppari1,2, PhD
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The Nutrition Graduation Program, Federal University of São Paulo
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Department of Medicine – Division of Nephrology, Federal University of São Paulo
Correspondence: L Cuppari, Oswaldo Ramos Foundation, Rua Pedro de Toledo, 282, Vila Clementino, São Paulo, SP, Brazil, 04039-000, phone: 551159048499, fax: 551155721862, e-mail: lcuppari@uol.com.br
Short running head:Immunomodulatory effect of the vitamin D
Key words: Vitamin D, chronic kidney disease, dialysis, inflammation.
Word count for the abstract: 309 Word count for the text: 2947
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Artigo
AbstractBackground and objectives: Hypovitaminosis D and inflammation are highly prevalent conditions among patients undergoing dialysis, and the association of these with worse survival has been well recognized. Although a potential role for vitamin D in the immune system has been suggested, the effect of the treatment of hypovitaminosis D on the modulation of the inflammatory response remains unclear. The aim of this study was to investigate the effect of the restoration of the vitamin D status on the expression of vitamin D-regulatory proteins in monocytes and circulating inflammatory markers in dialysis patients. Design, setting, participants, & measurements: In this randomized double-blind placebo-controlled 12-week trial, 38 patients on dialysis with 25-hydroxyvitamin D [25(OH)D] < 20 ng/mL were randomized either to the cholecalciferol group (n=20; 50.000 IU of cholecalciferol twice weekly) or the control group (n=18; 50 drops of a placebo solution twice weekly). The expression of interleukin-6 (IL-6), vitamin D receptor (VDR), 1-α hydroxylase and 24-hydroxylase enzymes in monocytes was determined by flow cytometry. Serum concentrations of 25(OH)D, IL-6, tumor necrosis factor-α (TNF-α) and C-reactive protein (CRP) were measured.
Results: After 12 weeks, the serum 25(OH)D increased from 14.3±4.7 ng/mL to 43.1±11.0 ng/mL (p<0.001) in the cholecalciferol group and did not change in the control group (13.9±4.2 ng/mL to 13.5±4.3 ng/mL; p=0.562). In monocytes, while 1-α hydroxylase expression and VDR expression increased in the cholecalciferol group (p=0.019), in the control group, 1-α hydroxylase expression did not change, and VDR expression decreased (p=0.019). There were no changes in IL-6 and 24-hydroxylase expression in both groups. In the cholecalciferol group, the serum concentration of IL-6 and CRP significantly decreased from 8.1±6.6 pg/mL to 4.6±4.1 pg/mL (p=0.012) and 0.50 (0.10-1.27) mg/dL to 0.28 (0.09-0.62) mg/dL (p=0.010), respectively.
Conclusions: The treatment of hypovitaminosis D promoted the upregulation of 1-α hydroxylase and VDR expression in monocytes and decreased circulating inflammatory markers in patients undergoing dialysis.
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Artigo
IntroductionHypovitaminosis D and disorders of vitamin D metabolism are common among patients with chronic kidney disease (CKD).(1, 2) The impaired conversion of 25-hydroxyvitamin D [25(OH)D] to 1,25-dihydroxyvitamin D [1,25(OH)2D], the active form of vitamin D, reflecting decreased renal 1-α
hydroxylase (CYP27B1) enzyme activity, contributes to the development of bone and mineral disorders highly prevalent in this population of patients.(3) More recently, it has been demonstrated that in addition to tubular renal cells, 1-α hydroxylase is present in numerous extrarenal sites, allowing the local production of 1,25(OH)2D, which binds to its receptor (VDR) triggering autocrine
and paracrine responses.(4) It has been estimated that approximately 85% of serum 25(OH)D is used as a substrate for the extrarenal synthesis of 1,25(OH)2D.(5) Therefore, the availability of sufficient 25(OH)D is of paramount
importance to produce effective responses. The pleiotropic effects of vitamin D have been demonstrated in numerous organs and cells, including prostate, mammary, colon, pancreatic β-cells, keratinocytes and immune cells.(6) Particularly in the immune system, the 1,25(OH)2D synthesized in monocytes
has been proposed to have immunomodulatory properties through the inhibition of the proinflammatory cytokine production.(7)
A chronic inflammatory state and a low 25(OH)D serum concentration are highly prevalent among patients with CKD, and both conditions are associated with poor outcomes especially due to cardiovascular events.(8, 9) Although multiple causes involve an elevated inflammatory response in these patients, hypovitaminosis D has been demonstrated as an important factor in the generation of chronic inflammation.(10) Therefore, the repletion of nutritional vitamin D might represent a safe and low-cost therapeutic approach to minimize inflammation in patients with CKD. Currently, randomized clinical trials investigating the impact of the correction of hypovitaminosis D on inflammation in dialysis patients are scarce.
Therefore, the present study is a clinical trial investigating the effect of the restoration of vitamin D status on the expression of vitamin D regulatory proteins in monocytes and on circulating inflammatory markers in dialysis patients.
