Glicose  RICA EM ENERGIA

ENZIMAS Objetivos

1. Definir, caracterizar e classificar as enzimas de acordo com:

 Meio de ação

 Composição química

 Reações por elas catalisadas

2. Como agem as enzimas?

3. Diferencie :

 Holoenzimas de apoenzimas

 Enzimas de Coenzimas

 Coenzimas de cofatores

4. Fale sobre a conformação enzimática e suas conseqüências 5. Fale sobre :

 sítio ativo

 Especificidade, tipos e exemplos

 Fatores que influem na atividade enzimática

 Inibição enzimática

reversível,

competitiva

feed back

irreversível

 Alosteria e a influência dos efetores. Faça uso de gráficos

5. Obtenha a equação de Michaelis-Mentem e a de Lineweaver-Burk. Plote a 2ª equação em um gráfico em presença e em ausência de inibidores

competitivos e não competitivos. Localize os parâmetros KM e VMAX e explique

o seu significado

6. Dê 10 exemplos de enzimas comercializadas, sua função e origem

7. Uma enzima tem afinidade pelos substratos A, B e C, apresentando,

respectivamente, os seguintes valores de KM : 3 X 10-6 M, 4 X 10-7M e 3x10-4

M. Por qual dos substratos a enzima apresenta maior afinidade? Explique. 8. Fale sobre :

 “turnover number”

 enzimas imobilizadas

1.

Enzimas e Biocatálise

Observe a reação no interior da célula:

C6H12O6 + 6O2



Glicose





 DEGRADAÇÃO SOB BAIXAS TEMPERATURAS,

 NO INTERIOR DA CÉLULA

 VELOCIDADE DE REAÇÃO EXTRAORDINARIAMENTE RÁPIDA

 O INTERIOR DA CÉLULA APRESENTA CAPACIDADE DE

CONTROLE CINÉTICO SOBRE O POTENCIAL TERMODINÂMICO DO AÇÚCAR



SISTEMA CELULAR UTILIZA

ENZIMAS

PARA

ACELERAR

E

CONTROLAR

AS

REAÇÕES

IMPORTANTES PARA A VIABILIDADE CELULAR





ENZIMAS

São catalisadores biológicos.



NÃO SÃO CONSUMIDOS DURANTE A REAÇÃO.



São proteínas especializadas em catálise de reações

metabólicas.



As

substâncias

(substrato)

transformadas,

freqüentemente, apresentam pouca tendência à reação

fora da célula.

Ea

Ea com enzima

Glicose + 6 O2

---(substrato)

6CO2 + 6H2O (produtos)

CARACTERÍSTICAS

 Poder catalítico:

 acelera as velocidades de reação - em torno de 1016 X superior que a reação não catalisada

NH2

C=O + 2H2O + H+ 2NH4+ + HCO3

T=20ºC para a Urease

v =3x 104 reações / segundo  reação catalisada

v = 3x 10 -10 reações por segundo  reação não catalisada

Taxa de catalise: 1014 entre a reação catalisada e a não catalisada

CARACTERÍSTICAS:

 Especificidade: Absoluta ou de grupo

As enzimas são seletivas com relação aos substratos  a interação íntima entre a enzima e o seu substrato ocorre através de reconhecimento molecular e estrutural entre ambos

NH2

C = O



NH2

C = S



Especificidade:

Absoluta: urease, glicoseoxidase, hexoquinase.

Grupo: amilase, protease, lipase.

Atenção:

 Regulação

Algumas enzimas apresentam atividade regulatória e são fundamentais a manutenção do equilíbrio metabólico

 zimogênios  Alosteria

Zimogênio: são precursores inativos de enzimas. A maioria das enzimas digestivas e algumas que atuam na coagulação do sangue encontram-se na forma ZIMOGÊNIO

 Enzimas digestivas na forma zimogênica: impedem que

haja uma autodigestão dos tecidos evolvidos, gástricos e pancreáticos, ou impedem a coagulação indesejada. EX:

Alosteria:



 A atividade catalítica da enzima pode ser diretamente regulada por meio de alterações conformacionais ou estrutural

 Enzimas alostéricas são geralmente oligoméricas, constituídas de múltiplas subunidades.

 Influenciam a velocidade de uma via metabólica, direcionando o substrato para vias alternativa.

Ex:

PEPSINOGÊNIO TRIPSINOGÊNIO PROTOMBINA

PEPSINA TRIPSINA

TROMBINA

A B C D ATUA AÇÃO ENZIMÁTICA

INIBE A AÇÃO ENZIMÁTICA

Há ainda as Enzimas constitutivas e as enzimas Indutivas

 Enzimas constitutivas (geralmente endoenzima)- fazem parte da célula em qualquer condição. Ex: hexoquinase.

 Enzimas Indutivas (geralmente exoenzimas)- são

“fabricadas” a partir da necessidade da célula. Ex: amilases

Coenzimas e cofatores

 Algumas enzimas ATUAM COMO CATALISADORES e não

requerem nenhum outro grupo químico além de seus resíduos de aminoácidos.

 Algumas requerem componentes químicos adicionais chamados

coenzimas e/ou cofatores.

 O cofator pode ser um íon inorgânico (Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+) ou uma molécula orgânica complexa, denominada por alguns autores como coenzima.

 Algumas enzimas requerem tanto o cofator quanto a coenzima para apresentarem atividade catalítica. Quando a coenzima ou o íon metálico está covalentemente ligado à parte protéica da enzima, este complexo é denominado grupo prostético

Coenzimas:

 Transporte de Hidrogênio: NAD, FAD, NADP, FMN  Transporte de radicais: CoA, TPP, biotina

Cofatores:

 macroelementos(g/dia): Ca++, Mg++, Na+, Fe++/ Fe+++

Características:

 Funcionam como cosubstratos  São alterados durante a reação

 Geralmente são regenerados na própria via

ATENÇÃO:

Exemplos:

Coenzima Tipo de reação

NAD+ / NADH remoção ou adição de hidrogênio

NADP+ / NADPH remoção ou adição de hidrogênio

ATPb fosforilação

SAM alquilação-C1

Acetil-CoA alquilação-C2

Flavinasc oxigenação ou oxidação

Pirodoxal-fosfato transaminação

Biotina carboxilação

Complexos

metal-porfirinaC

peroxidação, oxigenação PROTEÍNA---COFATOR

HOLOENZIMA

LIGAÇÃO IÕNICA

GRUPO PROSTÉTICO

NOMENCLATURA

 Usual ou consagrados pelo uso: Mais curta e utilizada.

Geralmente apresenta o sufixo "ase" para caracterizar a enzima. Ex:

Usual: Urease, lipase, hexoquinase, amilase, Peptidase.

Consagrados pelo uso: Tripsina, Pepsina, Ptialina.

 Sistemático: informa sobre a função metabólica da enzima (E.C.)

E.C.- Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology – IUBMB)

 Este sistema de classificação divide as enzimas em seis Classes

principais, nas quais estão inclusas subclasses de acordo com o tipo de reação catalisada.

 Nesta sistemática, cada enzima é designada:

 Por um Nome Recomendado, usualmente pequeno e

apropriado para o uso diário,

 Um Nome Sistemático, o qual identifica a reação

catalisada

 Um Número de Classificação, o qual é usado quando

uma identificação precisa é necessária.

Exemplo deste sistema de classificação na reação a seguir:

ATP + creatina creatininaquinase _{ADP + fosfocreatina}

Usual: creatininaquinase

Nome Sistemático: ATP:creatina fosfotransferase

Número de classificação: EC 2.7.3.2,

 O Nome Recomendado para esta enzima, que é o normalmente usado,

é creatininaquinase e o Nome Sistemático, baseado na reação catalisada, é ATP:creatina fosfotransferase. Seu número de classificação é EC 2.7.3.2

 Onde: o primeiro dígito, 2, a Classe (transferase), o segundo dígito, 7, a Subclasse

(fosfotransferase), o terceiro dígito, 3, a Sub-subclasse em que a fosfotransferase

apresenta um grupo nitrogenado como aceptor, e o quarto dígito, 2, designa uma creatina

O quadro abaixo relaciona os códigos utilizados para a aplicação do número de identificação das enzimas.

Classificação das Enzimas Segundo a Comissão de Enzimas (E.C.)

1. Oxido-redutases (reações de oxidação-redução ou transferência de elétrons

Desidrogenases e Oxidases)

1.1.atuando em CH-OH

1.2.atuando em C=O

1.3.atuando em C=O-

1.4.atuando em CH-NH2

1.5.atuando em CH-NH-

1.6.atuando em NADH, NADPH

2.Transferases (transferem grupos funcionais como amina, fosfato, acil, carboxil – Quinases e Transaminases)

2.1.grupos com um carbono

2.2.grupos aldeído ou cetona

2.3.grupos acil

2.4.grupos glicosil

2.7.grupos fosfatos

2.8.grupos contendo enxofre

Ex: Glicose + ATP HEXOQUINASE Glicose – 6- fosfato + ADP

H O H C + NADH + H+ ALCOOL DESIDROGENASE H-C-OH NAD+

3.Hidrolases (reações de hidrólise de ligação covalente - Peptidases)

3.1.ésteres

3.2.ligações glicosídicas

3.4.ligações peptídicas

3.5.outras ligações C-N

3.6.anidridos ácidos

4.Liases (catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de moléculas de água, amônia e gás carbônico – Dehidratases e Descarboxilases)

4.1. =C=C=

4.2. =C=O

4.3. =C=N-

5.Isomerases (reações de interconversão entre isômeros óticos ou geométricos - Epimerases)

5.1.racemases

6.Ligases (catalisam reações de formação de novas moléculas a partir da ligação entre duas pré-existentes, sempre às custas de energia - Sintetases)

6.1. C-O

6.2. C-S

6.3. C-N

6.4. C-C

NH2

C=O + 2H2O + H+ 2NH4+ + HCO3

NH2

COO- _{H O}

Piruvato descarboxilase

C=O O=C=O + C CH3 CH3

COO- COO

-C=O + CO2 + ATP C=O + ADP + PI

CH3 CH2

PIRUVATO COO

Fatores que afetam atividade enzimática

 Temperatura

 Concentração enzimática  Concentração do substrato  Presença de Inibidores

EFEITO DO pH NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

A estabilidade enzimática frente a esses dois parâmetros varia em função da origem da enzima.

Enzimas oriundas de bactérias termofílicas são estáveis ao ponto de ebulição da água

pH ótimo das Enzimas é função de sua origem. Ex.: Tripsina (intestino)...pH 8

Pepsina (estômago)...pH 2

EFEITO DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

 Existe uma zona de temperatura ótima para a qual a atividade enzimática é máxima. A lei de Arrhenius relaciona a constante de velocidade de uma reação química, K, à energia de ativação, Ea

K = A.e

A: fator de Arrhenius

R: cte. dos gases perfeitos log K

T: temperatura (°K)

-(Ea/ 2,3R)

Concentração enzimática - A velocidade de reação aumenta diretamente proporcional a concentração do catalisador, sugerindo que a interação enzima-substrato obedece à lei da ação das massas Ex.: para concentração de substrato fixa determina-se a concentração de enzima em uma amostra biológica

Concentração do substrato - Para uma concentração fixa da enzima, a velocidade da reação aumenta com a concentração do substrato, tendo a velocidade máxima sido atingida, a velocidade independerá do acréscimo de mais substrato (característica de todas as enzimas não alostéricas) Ver Equação de Michaelis- Menten

Capacidade Catalítica  Quantificação da Atividade Enzimática:

Cinética Enzimática (Enzima Michaeliana)

K+1 K+2

E + S E-S E + P

K -1 K -2

ET = EL+ E-S



E-S é infinitamente pequeno quando comparado a de S

1-Velocidade de formação de E-S:

V1= K+1  EL  S + K- 2 E  P



V1= K+1  ET - E-S   S (1)

2-Velocidade de quebra de E-S:

V2= K-1 E-S  + K +2  E-S 

3. No regime estacionário : V1= V2

K+1  ET - E-S   S = K-1  E-S  + K+2  E-S 

Rearrumando:

 E-S  = K+1  ET S  K+1 S + K-1 + K +2

Mas V= K+2 E-S  ; definindo KM= ( K +2 + K -1) / K+1

VMAX = K+2ET

Cinética da Inibição Inibidores

S + E + I E-I + S

S + E + I E-I-S

E-I e/ou E-I-S São formados

INIBIÇÕES IRREVERSÍVEIS





Quando podem ser

decompostos CN

-_{; H}

2SO4;

ac. tricloroacético; Hg++; Ag+; Pb+; agitação; raioX



INIBIÇÕES

REVERSÍVEIS Competitiva: atração pelo

sítio ativo





Não competitiva: inibidor liga-se à enzima em local diferente do sítio ativo

Uréia(S) e Tiouréia (I)

INIBIÇÃO REVERSÍVEL COMPETITIVA

S e I têm afinidade pelo sítio ativo da enzima

K+1 K+3

E + S E-S E + P (1) K 2 K -3

Ki

E + I EI (2)

K1,K2 e K3 são constantes de velocidade KI Constante de dissociação

K _–3 desprezível

Considerar na eq.1 [E-S] no estado estacionário e para eq. 2 o estado de equilíbrio.

V1 = K’ [E].[I] = V2 = K’’[E-I ]  Ki = K’/K’’

Ki = [E].[I] (3)

[E-I]

dES / dt = K1[E][S] - [k2 + K3][ES] =0 (4)

v=K3 [ES] (5)  VMAX = K3 [ET]

ET =[ES] + [EL] + [E-I]

EL = [ES] [K2 + K3] / [S] K1

ET =[ES] + [EL] + ([E] [I] / Ki ) (6)



VMAX / K3 = v/ K3 + [E-S] . KM / [S] + ([E] [I] / Ki )

VMAX / K3 = v/ K3 + v/K3 (KM / [S]) + (v/K3). [I] / Ki (6)

VMAX = v + v. (KM / [S]) + v. [I] / Ki

VMAX = v / S . (1+ I/ Ki) KM + S

INIBIÇÃO REVERSÍVEL NÃO COMPETITIVA

K₁ K₃

E + S E-S E + P + K2 +

I I

Ki Ki

E-I E-S-I

Neste tipo de inibição o substrato não tem efeito sobre a fixação do inibidor

Considerar [E-S] no estado estacionário e para equações de inibição o estado de equilíbrio.

Ki = [E] [I] / [E-I]  [E-I] = [E] [I] / Ki

Ki = [E-S ].[I]

[E-S-I]

d[E-S] / dt = K1[E][S] - [k2 + K3][ES] =0

v=K3 [ES]  VMAX = K3 [ET]

EL = [ES] [K2 + K3] / [S] K1 =E

KM = (K2 + K3) / K1

VMAX / K3 = [E-S] . KM / [S] + [E-S] + [E-I] +[E-S-I]

VMAX / K3 = [E-S] .{ 1+ KM / [S] } + [E] [I]/ Ki + [E-S ][I] /Ki

VMAX / K3 = v/K3.{ 1+ KM / [S] } + [I]/ Ki {[E] + [E-S ]}

KM [E-S] = [E] [S]

VMAX / K3 = v/K3.{ 1+ KM / [S] } + [I]/ Ki { KM[E-S]/ [S] + [E-S ]}

VMAX / K3 = v/K3.{ 1+ KM / [S] } + {[I] [E-S]/ Ki}.{ KM/ [S] +1}

VMAX / K3 = v/K3.{ (S+ KM)/ [S] } + {v.[I] / K3 .Ki }.{ KM/ [S] +1}

VMAX = v{ (S+ KM)/ [S] } + v.{[I] /Ki} { KM/ [S] +1}

VMAX = v{ (S+ KM)/ [S] + ([I] /Ki ).(KM + [S] )/[S]}

VMAX = v. (S+ KM)/ [S] { 1+ ([I] /Ki )}

VMAX. [S] = v / { 1+ ([I] /Ki )} (S+ KM)

v ₌ VMAX. [S] . 1

Enzimas Alostéricas

 V x S é uma curva sigmóide  neste caso o único efetor

presente deve ser o substrato

 Não obedece à cinética michaeliana

 Estas enzimas são insensíveis a concentrações do substrato

para valores muito baixos ou muito altos

 São geralmente compostas por subunidades

 Há além dos sítios catalíticos, os reguladores onde agem os

moduladores ou efetores

Os sítios de controle ou reguladores e os catalíticos estão separados quimicamente e espacialmente

Moduladores ou

Efetores Positivos





Negativos Favorecem a reação



Inibem a reação

Exemplo:

Frutose - 6 - fosfato + ATP Frutose - 1, 6 – difosfato + ADP

Fosfofrutoquinase

Modulação Alostérica

Ocorre nas enzimas que possuem um sítio de modulação, ou alostérico, onde se liga de forma não-covalente a um modulador alostérico que pode ser positivo (ativa a enzima)

ou negativo (inibe a enzima).

A ligação do modulador induz a modificações

conformacionais na estrutura espacial da enzima,

modificando a afinidade desta para com os seus substratos;

Um modelo muito comum de regulação alostérica é a inibição por "feed-back", onde o próprio produto da reação atua como modulador da enzima que a catalisa.

Outro exemplo:

Aspartato transcarbamoilase (ATCase)

 Ligação cooperativa homotrópica positiva para ambos os substratos

 Heterotropicamente inibida pela cistidina trifosfato (CTP)

 Heterotropicamente ativado pela adenosina trifosfato (ATP)

H2N – CO – OPO3-2 ₊ OCO – CH₂ – CH – COO-

NH3+

-OCO – CH₂ – CH – COO- ₊ H 2PO4

NH- CO- N H2

carbamoil fosfato aspartato

Enzimas Imobilizadas

 Características comuns:

Grande especificidade em condições muito brandas nas quais funcionam, conferem-lhe vantagens sobre catalisadores comuns: Ex.:

GLICOSE  SORBITOL Catalisador : Rubídio

T = 135ºC por 12ATM Tempo: 60 a 120h

Catalisador : Glicose-frutose oxi - redutase T = 30ºC por 1 ATM

Tempo: 48 a 72h

Problemas : baixo rendimento

Ambos processos catalíticos, neste caso, são ainda caríssimos

Os processos enzimáticos industriais são geralmente em batelada com enzima solúvel

 Custo elevado de extração e purificação da enzima solúvel  Perda do biocatalisador ao fim de cada processo

Solução: IMOBILIZAÇÃO da enzima em suportes insolúveis Vantagens:

Produção Enzimática

(Via Microbiana)



Seleção do microrganismo



Preparo do inóculo



Processo fermentativo



Recuperação do produto

(filtração, centrifugação, decantação, flotação, precipitação) 

Purificação da Enzima (redissolução, evaporação , secagem) 

Produção Industrial de Enzimas

Deve-se levar em conta: 1-pH

2-Temperatura ótima de produção 3- viabilidade comercial da enzima

4- Seleção da linhagem microbiana produtora:

Desenvolver-se em meio simples e barato;

Produzir o mínimo de metabólitos secundários; Preferencialmente a enzima deve ser excretada; Não ser patogênica

5- Meio de cultura :

Deve atender as necessidades nutricionais do microrganismo; Deve ser barato e de fácil obtençao e manuseio

6- Processos industriais:

Culturas superficiais (em desuso) Culturas submersas (Mais usadas)

 Condições de assepsia controlada

Bibliografia para a disciplina de Bioquímica Cursos: Engenharia Química e Química Industrial

1. Princípios de Bioquímica - Albert Lester Lehninger. Editora Sarvier

(texto).R$

2. Bioquímica - Lubert Stryer. Editora Gunabara Koogan S.A. 1995

3. Bioquímica - Klaus Dose. EPU - Springer - EDUSP

Universidade Federal de Pernambuco

Centro de Tecnologia e Geociências

Depto de Engenharia Química

Enzimas

Maria de los Angeles Perez F. Palha