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MESTRADO EM CONTROLO DE QUALIDADE

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Academic year: 2019

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MESTRADO EM CONTROLO DE QUALIDADE

ANÁLISE AUTOMÁTICA DE GENTAMICINA

POR QUIMILUMINESCÊNCIA

Universidade do Porto Faculdade de Farmácia

(2)

Licenciada em Ciências Farmacêuticas pela Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto

MESTRADO EM CONTROLO DE QUALIDADE

ANÁLISE AUTOMÁTICA DE GENTAMICINA

POR QUIMILUMINESCÊNCIA

Trabalho de Dissertação apresentado à Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto para a obtenção do Grau de Mestre em Controlo de Qualidade

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Trabalho realizado no serviço de Química-Física

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AGRADECIMENTOS

À Professora Doutora Conceição Montenegro e ao Doutor Adriano Fachini pela sua supervisão, orientação e apoio durante a realização deste trabalho.

Ao Professor Doutor Alberto Araújo pelo apoio e disponibilidade no acompanhamento do trabalho laboratorial.

Ao Professor Doutor Boaventura Reis, do CENA (Universidade Federal de São Paulo), pela ajuda prestada no desenvolvimento do sistema de fluxo multicomutado e respectivo programa informático utilizado neste trabalho.

À Fundação AstraZeneca pela bolsa de Mestrado concedida.

À Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, e em especial ao serviço de Química-Física, por me ter proporcionado as condições necessárias à realização desta dissertação.

A todos os meus colegas de laboratório: André, David, Diana, Joana Ribeiro, Marieta, Célia, Karine, Cláudia, Eunice, Mafalda, Rita, Rodrigo, Hugo, Cristina, Sofia, Marisa, Ana, Joana Carvalhido; a todos agradeço a simpatia, amizade e ajuda prestada durante esta etapa da minha vida.

À D. Belmira e à D. Manuela agradeço o apoio, simpatia e amizade demonstrada durante os meses que passei no Serviço de Química-Física da FFUP.

Aos meus pais que sempre me incentivaram e apoiaram.

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RESUMO

No âmbito desta dissertação foi desenvolvido um método analítico para a determinação de gentamicina, associando-se uma técnica de fluxo não segmentado (a multicomutação) com a detecção por quimiluminescência. A metodologia desenvolvida foi aplicada à análise de produtos farmacêuticos, disponíveis no mercado português.

A determinação da gentamicina baseou-se no seu efeito inibidor sobre a emissão de radiação obtida pela reacção de quimiluminescência entre o luminol e o hipoclorito de sódio, em meio alcalino. O luminol era oxidado pelo hipoclorito, emitindo radiação na zona do visível (425 nm). Na presença da gentamicina, este antibiótico reagia com o hipoclorito, diminuindo a quantidade de oxidante disponível para reagir com o luminol, o que originava a diminuição da intensidade da radiação emitida.

A utilização de um sistema de fluxo multicomutado permitiu recorrer à amostragem binária, assegurando-se uma rápida homogeneização da zona de reacção e um controlo flexível da dispersão, porque a inserção da amostra e reagentes era baseada no tempo e, por isso, facilmente controlável.

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ABSTRACT

In this work, an analytical method was developed for the determination of gentamicin, using a non segmented flow system (multicommutation) with chemiluminescence detection. The developed methodology was applied to the analysis of pharmaceutical products, available in the portuguese market.

The gentamicin determination was based on its ability to inhibit the emission of light by the chemiluminescence reaction of luminol with sodium hypochlorite, in alkaline medium. The oxidation of luminol by hypochlorite causes the emission of radiation belonging to the visible spectrum (425 nm). In the presence of gentamicin, this will react with hypochlorite, reducing the quantity of oxidant available to react with luminol, producing a decrease in the emission of light.

The use of a multicommutated flow system allowed employing the binary sampling, ensuring a quick homogeneization of the reaction zone and a flexible control of dispersion, since the insertion of sample and reagents was based in time, which was easily controled.

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Lista de Siglas e Abreviaturas

AAC – Enzima N-acetiltransferase AAD – Enzima O-adeniltransferase ADN – Ácido desoxirribonucleico APH – Enzima O-fosfotransferase ARN – Ácido ribonucleico

CE – Electroforese capilar

EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético

ELSD – Detector evaporativo por dispersão de luz FIA – Análise por injecção em fluxo

GC – Cromatografia gasosa

GC-MS – Cromatografia gasosa com detecção por espectrometria de massa HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência

HPLC-MS – Cromatografia líquida com detecção por espectrometria de massa IUPAC – International Union of Pure and Applied Chemistry

LC – Cromatografia líquida

MCFIA – Análise por injecção em fluxo por multicomutação MPFS – Sistema de fluxo por multi-impulsão

MSFIA – Análise por injecção em fluxo por multi-seringa OPA – o-ftaldeído

PVP – Polivinilpirrolidona

SIA – Análise por injecção sequencial UV – Ultra-violeta

(8)

ORGANIZAÇÃO DA DISSERTAÇÃO

Embora a presente dissertação esteja enquadrada no âmbito da química analítica, sendo eu farmacêutica optei por dar, especialmente no capítulo relativo à introdução, uma visão mais alargada focando alguns aspectos que se relacionam não só com o medicamento, nomeadamente aspectos bacteriológicos e farmacológicos, mas também com a sua utilização. Assim, a tese está organizada do seguinte modo:

– No Capítulo 1 fazem-se algumas referências ao medicamento para o qual foi desenvolvido o método analítico, detalhando aspectos relacionados não só com as suas propriedades químicas, mas também farmacológicas, bacteriológicas, toxicológicas e utilidade terapêutica deste antibiótico. Paralelamente abordam-se os métodos automáticos de análise, onde se enquadra o método analítico proposto, dando-se particular destaque à análise por injecção em fluxo por multicomutação e também à aplicação da quimiluminescência como método de detecção.

– No Capítulo 2 descrevem-se os procedimentos experimentais para a execução do trabalho laboratorial.

– No Capítulo 3 apresentam-se os resultados obtidos e realiza-se a sua análise crítica.

(9)

ÍNDICE

1. INTRODUÇÃO

... 1

1.1 – Breve resumo histórico ... 2

1.2 – Antibióticos ... 5

1.2.1 – Generalidades ... 5

1.2.2 – Mecanismos de resistência aos antibióticos ……….. 6

1.3 – Aminoglicosídeos ………... 8

1.3.1 – Origem ………... 8

1.3.2 – Estrutura química e características ……… 9

1.3.3 – Mecanismo de acção ……….. 10

1.3.4 – Espectro de acção ……….. 11

1.3.5 – Mecanismos de resistência bacteriana ………... 11

1.3.6 – Toxicidade ………. 13

1.3.7 – Utilização terapêutica ……… 14

1.3.7.1 – Utilização em medicina humana ……… 14

1.3.7.2 – Utilização em medicina veterinária ………... 15

1.4 – Gentamicina ……… 16

1.5 – Métodos de quantificação da gentamicina em formulações farmacêuticas 18 1.6 – Métodos automáticos de análise ………. 22

1.6.1 – Métodos de fluxo não segmentados ………... 22

1.7 – Análise por Injecção em Fluxo por Multicomutação (MCFIA) …………. 29

1.8 – Quimiluminescência ………... 33

1.8.1 – Aspectos gerais ……….. 33

1.8.2 – Luminol ……….. 37

1.9 – Métodos de fluxo com detecção quimiluminométrica para a análise de gentamicina ………. 38

2. PARTE EXPERIMENTAL

………... 40

2.1 – Reagentes e soluções ……….. 41

2.1.1 – Preparação das amostras ……… 42

2.1.2 – Preparação das soluções para o estudo dos interferentes ………….. 43

(10)

2.3 – Procedimento em fluxo ………... 48

2.4 – Optimização da montagem de fluxo e validação do método analítico desenvolvido ………... 51

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

………... 53

3.1 – Introdução ………... 54

3.1.1 – Optimização dos parâmetros físico-químicos ……… 54

3.1.2 – Avaliação dos interferentes ……… 61

3.1.3 – Análise de formulações farmacêuticas ……….. 63

4. CONSIDERAÇÕES GERAIS

………... 68

(11)

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.1 – Estrutura dos aminociclitóis presentes nos aminoglicosídeos ……….. 9

Figura 1.2 – Locais de inactivação enzimática em vários aminoglicosídeos ……… 13

Figura 1.3 – Estrutura química dos principais componentes da gentamicina ……... 16

Figura 1.4 – Esquema representativo de um sistema FIA ……… 24

Figura 1.5 – Esquema representativo de um sistema SIA ……… 25

Figura 1.6 – Esquema representativo de um sistema de MSFIA ……….. 27

Figura 1.7 – Esquema representativo de um sistema de MPFS ……… 28

Figura 1.8 – Esquema representativo de um sistema de MCFIA ………. 29

Figura 1.9 – Representação esquemática da amostragem binária ………. 30

Figura 1.10 – Esquema representativo dos tipos de reacções quimiluminométricas 34 Figura 1.11 – Estrutura química do luminol ………. 37

Figura 2.1 – Bomba peristáltica Gilson Minipuls 3 ……….. 45

Figura 2.2 – Válvula solenóide de três vias da NResearch Inc. ……… 45

Figura 2.3 – Representação esquemática do luminómetro mostrando os pontos de mistura das soluções ………... 46

Figura 2.4 – Esquema da montagem de fluxo multicomutado utilizada na determinação de gentamicina em formulações farmacêuticas ………... 48

Figura 2.5 – Representação esquemática da posição das válvulas solenóides durante o ciclo analítico ………. 50

Figura 3.1 – Influência do número de ciclos de intercalação de amostra e solução de hipoclorito no sinal analítico ………. 56

Figura 3.2 – Influência do caudal no sinal analítico referente ao branco …………. 57

Figura 3.3 – Influência da concentração da solução de hipoclorito de sódio no sinal analítico ………. 58

Figura 3.4 – Influência do pH da solução de hipoclorito de sódio no sinal analítico 58 Figura 3.5 – Influência da concentração da solução de luminol no sinal analítico ... 59

Figura 3.6 – Influência do pH da solução de luminol no sinal analítico …………... 60

(12)

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1.1 – Aminoglicosídeos com maior utilidade na terapêutica, período em que foram descobertos e tipo de origem ……… 8 Tabela 1.2 – Métodos de fluxo não segmentados mais utilizados e seu

enquadramento histórico ……… 23

Tabela 2.1 – Protocolo de operações do sistema de fluxo para a determinação de gentamicina em formulações farmacêuticas ……….. 50 Tabela 3.1 – Valores optimizados dos parâmetros analíticos ………... 60 Tabela 3.2 – Síntese dos resultados obtidos na avaliação dos interferentes ………. 62 Tabela 3.3 – Resultados da análise de colírios contendo gentamicina e dos ensaios

de recuperação ……… 64

Tabela 3.4 – Resultados da análise de soluções injectáveis contendo gentamicina e

dos ensaios de recuperação ……… 65

Tabela 3.5 – Resultados da análise de pomadas oftálmicas contendo gentamicina e

(13)
(14)

1.1- Breve resumo histórico

A primeira referência histórica à existência de microrganismos causadores de doenças infecciosas, sobretudo epidémicas, remonta ao século IV a.C., quando Hipócrates, o célebre físico e médico grego, falou pela primeira vez de “miasmas”, que descreveu como sendo partículas químicas que provinham dos pântanos e dos corpos em decomposição e que, eram espalhadas pelo ar, causando as epidemias. No século XV, quando uma vasta epidemia de peste bubónica devastou a Europa, esta teoria ainda subsistia, o que levou à utilização de numerosos “antimiasmáticos” tão fantasiosos como ineficazes. Mais tarde no século XVII, o conceito dos “miasmas” ainda se mantinha inalterado, tendo sido criados os mais engenhosos meios para os remover do ar contaminado ou para se protegerem contra eles. Assim, foram utilizados sinos e campainhas a soar no exterior das casas; pássaros que voavam no interior dos quartos para agitarem o ar; perfumes nos lenços, roupas, móveis e paredes; aranhas em recipientes abertos nos quartos para que estes animais absorvessem os “miasmas”; amuletos com palavras mágicas; entre outros [1].

Contudo, se durante séculos a teoria hipocrática dos “miasmas” prevaleceu, ignorando-se a verdade que nela estava contida, houve quem a procurasse aprofundar ou encontrar compostos naturais e produtos químicos eficazes no combate às epidemias. Neste contexto salienta-se o caso de Fracastro, que em Verona, no ano de 1546, admitiu que os “miasmas” eram partículas de matéria viva com capacidade de se multiplicarem e disseminarem na atmosfera, aproximando-se, assim, da actual noção de bactéria e microrganismos afins [1]. Neste mesmo século, o médico Aureolus Paracelsus usou compostos de antimónio no tratamento geral das infecções e derivados de mercúrio no tratamento específico da sífilis [2].

(15)

No entanto, foi só em 1861, quando Pasteur demonstrou a impossibilidade de se observar a fermentação da urina e de soluções de sacarose se estas fossem previamente fervidas e protegidas do ar contaminante, que a teoria dos “miasmas” de Hipócrates foi definitivamente abandonada, surgindo assim a noção de esterilização. Este conceito teve um enorme impacto na terapêutica logo nos anos imediatos, com o cirurgião Joseph Lister, de Glasgow, que estudou o efeito inibitório de substâncias químicas sobre as bactérias, aplicando os seus conhecimentos directamente na medicina, ao utilizar o fenol para esterilizar os instrumentos cirúrgicos, diminuindo, assim, a taxa de mortalidade e morbilidade associada às cirurgias. A ideia de que as infecções eram causadas por microrganismos estava instaurada e sabia-se, agora, que havia meios físicos e químicos para os combater [1-3].

Em 1876, na Alemanha, Koch dedicava-se ao estudo de infecções de animais e homens, quando identificou a primeira bactéria a ser conhecida – o bacilo do carbúnculo (Bacillus anthracis). Seis anos mais tarde, o mesmo cientista viria a identificar também

o bacilo da tuberculose e, no ano seguinte, o vibrião colérico. Com estas descobertas iniciava-se a era da bacteriologia, abrindo-se novos horizontes, até então desconhecidos, para o conhecimento da fisiopatologia e da terapêutica das doenças infecciosas [1,2].

Em 1909, também na Alemanha, Paul Ehrlich e seus colaboradores descobriram o salvarsan, sendo utilizado no tratamento do triponossoma e outros protozoários. Em 1910, o mesmo cientista demonstrou a possibilidade de se utilizarem, com êxito, compostos orgânicos de arsénio contra a infecção do homem pelo treponema pálido (agente causador da sífilis), sendo esta terapia utilizada até 1940, altura em que foi substituída pela penicilina [2,3].

No entanto, só em 1935 é que nasce a quimioterapia antibacteriana sistémica, com a síntese do Prontosil, uma sulfonamida cujos efeitos e resultados foram estudados por Gerhard Domagk, o que lhe valeu o Prémio Nobel da Medicina em 1938. Contudo, foram precisos mais cinco anos, para Alexander Fleming descobrir a penicilina e dar-se, assim, início à era da antibioticoterapia. Seguiu-se a descoberta da estreptomicina, a partir de culturas de Streptomyces griseus, em 1944, por Selman Waksman juntamente

(16)

Também é a Waksman que se deve a introdução do termo “antibiótico”, que veio substituir o antigo termo “antibiose”, que havia sido proposto por Vuillmein, em 1868, e que se referia ao antagonismo dos seres vivos em geral. O termo “antibiótico” foi redefinido, por Waksman, como uma substância produzida por microrganismos que antagoniza o desenvolvimento ou a vida de outros microrganismos, quando presente em altas diluições no meio bioquímico do corpo humano [3].

(17)

1.2- Antibióticos

1.2.1- Generalidades

Os antibióticos são fármacos cuja finalidade é matar ou impedir a multiplicação de microrganismos patogénicos, que infectam organismos superiores, causando-lhes doença. Os antibióticos podem ter diferentes origens: serem produzidos por microrganismos, a maior parte das vezes fungos; serem obtidos através da modificação química da molécula de um antibiótico produzido por um microrganismo; por semi-síntese a partir de um núcleo fundamental de origem natural; ou por semi-síntese completa.

Os antibióticos podem exercer a sua acção por dois modos de acção distintos, sendo eles: através da inibição da multiplicação bacteriana (acção bacteriostática); ou provocando a morte das bactérias (acção bactericida).

O mecanismo de acção dos antibióticos nem sempre está suficientemente esclarecido e, frequentemente, determinado antibiótico actua por diferentes mecanismos em diferentes fases do ciclo de vida das bactérias, dependendo da sua concentração. Os mecanismos de acção dos antibióticos podem-se enquadrar nos seguintes grupos [1]:

1) Inibição da síntese da parede bacteriana

Todos os compostos pertencentes a este grupo são bactericidas, e a sua acção só é exercida sobre o crescimento das bactérias. São exemplo de antibióticos pertencentes a este grupo as penicilinas e as cefalosporinas.

2) Modificação da permeabilidade da membrana citoplasmática

(18)

3) Alteração da síntese dos ácidos nucleicos

Os antibióticos que inibem a síntese dos ácidos nucleicos podem actuar em diferentes fases da sua síntese. São exemplos de antibióticos pertencentes a este grupo: as quinolonas, que impedem a acção da girase do ADN; o metronidazol, que actua sobre o ADN, desintegrando-o, o que inibe a síntese de novas cadeias de ADN; a rifampicina, que inibe a polimerase da ARN dependente do ADN.

4) Inibição da síntese proteica por acção sobre os ribossomas

Os antibióticos pertencentes a este grupo inibem a síntese proteica por acção directa sobre os ribossomas, ligando-se às subunidades que os constituem. São exemplo de antibióticos pertencentes a este grupo: os aminoglicosídeos, as tetraciclinas e o cloranfenicol. No que se refere aos aminoglicosídeos, mais adiante descrever-se-à com detalhe o seu mecanismo de acção.

5) Inibição de diversas enzimas do metabolismo citoplasmático

Contrariamente ao que se passa nas células eucarióticas (hospedeiro), as células procarióticas (bactérias) não podem utilizar folatos pré-formados, tendo que os sintetizar. Sendo assim, há antibióticos, como as sulfonamidas e o trimetropim, que actuam no processo de síntese dos folatos realizado pelas bactérias, impedindo-o.

1.2.2- Mecanismos de resistência aos antibióticos

Os microrganismos patogénicos podem ter diferentes mecanismos bioquímicos que os tornam resistentes aos antibióticos, tais como:

• Enzimas microbianas inactivadoras dos antibióticos;

• Receptores microbianos com baixa afinidade para os antibióticos;

• Baixas concentrações intra-microbianas dos antibióticos, devido a uma permeabilidade reduzida da membrana citoplasmática e por transporte activo de saída;

(19)

• Falta de biotransformação do antibiótico num metabolito activo pelo microrganismo.

As bactérias podem ser naturalmente resistentes a um determinado grupo de antibióticos, ou podem adquirir a informação dos mecanismos bioquímicos de resistência, quer por modificação dos ácidos nucleicos do seu cromossoma, quer por aquisição de material genético proveniente do exterior. O primeiro mecanismo é conhecido por mutação, e ocorre permanentemente, independentemente da bactéria estar na presença de um antibiótico, com um ritmo baixo de 1 para 10 milhões de divisões celulares. A resistência conferida por mutação é geralmente isolada, e refere-se a um só composto ou grupo de compostos semelhantes, sendo baixa a probabilidade de desenvolvimento de resistência a vários antibióticos [1,2,4].

Mas se a eficácia na produção e disseminação de estirpes bacterianas resistentes a diferentes antibióticos através da mutação é modesta, o mesmo não se passa com o outro mecanismo genético, que é capaz de conferir um bloco de múltiplas resistências e de as transmitir de uma bactéria para outra da mesma ou de diferente espécie, género e família. Muitas bactérias (patogénicas ou não) contém plasmídeos, que são pequenas moléculas circulares de ADN extra-cromossómicas capazes de se autocopiarem independentemente do cromossoma, e que, por vezes, possuem informação genética capaz de tornar a bactéria resistente a um ou mais antibióticos (plasmídeos de resistência ou R) [2,4].

Esta capacidade dos plasmídeos difundirem resistência aos antibióticos é ainda alargada por um outro fenómeno. Alguns segmentos de ADN podem sofrer translocação ou transposição de um local da cadeia de ADN para outro, constituindo verdadeiros “genes saltitantes” designados por transposões. Quando estes genes possuem informação de mecanismos de resistência, os plasmídeos R que os recebem vão aumentar o número de resistências que transportam, tornando-se mais infecciosos.

(20)

1.3- Aminoglicosídeos

Em 1944, Waksman e seus colaboradores isolaram a estreptomicina a partir de um actinomicete (Streptomyces griseus), iniciando-se assim a era dos antibióticos

designados por aminoglicosídeos. Posteriormente, foram descobertos outros compostos quimicamente aparentados (ver a Tabela 1.1), constituindo-se um novo grupo de antibióticos, com características bastante homogéneas.

Tabela 1.1 – Aminoglicosídeos com maior utilidade na terapêutica, período em que foram descobertos e tipo de origem [5].

Aminoglicosídeo Data Origem

Estreptomicina 1944 Natural

Neomicina 1949 Natural

Canamicina 1957 Natural

Gentamicina 1963 Natural

Tobramicina 1967 Natural

Amicacina 1972 Semi-sintético

Netilmicina 1975 Semi-sintético

1.3.1-

Origem

A maior parte dos aminoglicosídeos é de origem natural, sendo produzidos por vários microrganismos pertencentes à família das Actinobacteria (actinomicetes), nomeadamente membros dos géneros Streptomyces e Micromonospora. Estes

(21)

1.3.2-

Estrutura química e características

Os aminoglicosídeos são um grupo de antibióticos formados por dois ou mais açúcares aminados unidos por uma ligação glicosídica a uma hexose aminada (núcleo aminociclitol). Este aminociclitol é a 2-deoxiestreptamina em todos os aminoglicosídeos com interesse clínico, com a excepção da estreptomicina, cuja hexose é a estreptidina (Figura 1.1) [5].

Figura 1.1 – Estrutura dos aminociclitóis presentes nos aminoglicosídeos (adaptado de [6]).

Estruturalmente, os aminoglicosídeos possuem um grande número de radicais amina (-NH) e hidroxilo (-OH), pelo que são policatiões com características básicas e uma elevada polaridade. Estes antibióticos têm uma elevada solubilidade em água, são relativamente insolúveis em lípidos, e a sua actividade anti-microbiana é potenciada em meios alcalinos [7].

As características polares dos aminoglicosídeos fazem com que a sua absorção oral seja muito baixa (inferior a 1% da dose administrada), por isso após a sua administração, vão aparecer na sua quase totalidade nas fezes, na forma intacta, o que incapacita a obtenção de níveis sistémicos eficazes. Por outro lado, a via intramuscular permite obter rapidamente níveis sanguíneos terapêuticos [5].

A natureza catiónica dos aminoglicosídeos contribui para a sua actividade anti-microbiana. Devido às suas cargas positivas, estes antibióticos são capazes de se ligar aos lipopolissacarídeos da parede celular da bactéria, pois estes encontram-se carregados negativamente, bem como a uma grande variedade de moléculas aniónicas, como o ADN e os fosfolípidos, que se encontram na membrana celular ou no interior da bactéria. Infelizmente, o facto de os aminoglicosídeos se encontrarem carregados positivamente, a pH fisiológico, também contribui para a sua toxicidade, nomeadamente nefrotoxicidade, ototoxicidade e bloqueio da transmissão neuromuscular [7].

(22)

Os aminoglicosídeos são compostos metabolicamente estáveis, que são excretados na urina, na forma inalterada. Estes fármacos têm uma margem terapêutica estreita, pelo que é necessário realizar a monitorização da concentração destes antibióticos, principalmente em doentes com disfunção renal ou sujeitos a tratamentos prolongados (superior a 3 dias) [7].

1.3.3- Mecanismo de acção

(23)

1.3.4-

Espectro de acção

O espectro de acção dos aminoglicosídeos é bastante extenso, abrangendo tanto bactérias Gram-negativas como bactérias Gram-positivas.

O grande interesse terapêutico deste grupo de antibióticos resulta da sua actividade contra os bacilos Gram-negativos aeróbios, nomeadamente E. coli, Proteus, Klebsiella, Enterobacter, Salmonella, Shigella e P. aeruginosa [5].

No que se refere às bactérias Gram-positivas, geralmente os aminoglicosídeos são menos activos. Quando usados em monoterapia, a sua actividade é inadequada contra Streptococcus spp., Enterococcus spp., Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis, pelo que a sua utilidade clínica no tratamento de infecções por bactérias

Gram-positivas é limitada à combinação sinérgica entre os aminoglicosídeos e outros agentes anti-microbianos, como os antibióticos -lactâmicos [7].

Em condições de anaerobiose, estes compostos são inactivos, tanto em relação aos anaeróbios obrigatórios como aos facultativos, possivelmente porque, nestas condições, o seu transporte através da membrana citoplasmática é bloqueado [5,6].

1.3.5-

Mecanismos de resistência bacteriana

A resistência das bactérias aos aminoglicosídeos pode ser natural ou adquirida, estando esta relacionada com o facto de, por não possuírem cadeia respiratória, não existir energia suficiente para os transportar através da membrana citoplasmática das células bacterianas. As bactérias anaeróbias facultativas apresentam uma maior resistência aos aminoglicosídeos quando crescem em anaerobiose do que quando crescem na presença de oxigénio. Outros microrganismos, como os Streptococcus spp. e

os Enterococcus spp., têm parede celular que funciona como uma barreira de

permeabilidade, sendo também naturalmente resistentes aos aminoglicosídeos. Nestes casos, a utilização conjunta de um antibiótico que iniba a síntese da parede celular, como é o caso dos -lactâmicos e a vancomicina, facilita a entrada do aminoglicosídeo na célula bacteriana [7].

(24)

inactivação enzimática e falta de afinidade para o local de acção do antibiótico, o ribossoma.

A alteração da permeabilidade da membrana dos bacilos Gram-negativos confere resistência cruzada a todos os aminoglicosídeos e, muitas vezes, a outros grupos de antibióticos. Os microrganismos resistentes apresentam alterações no seu potencial transmembranar e/ou na cadeia respiratória. Bactérias Gram-negativas, como a P. aeruginosa, são resistentes aos aminoglicosídeos, devido a alterações na estrutura das

porinas presentes na sua membrana citoplasmática, o que contribuiu para uma diminuição da permeabilidade da mesma [2,7].

(25)

Figura 1.2 – Locais de inactivação enzimática em vários aminoglicosídeos (adaptado de [2]).

Por fim pode ocorrer a alteração do ribossoma, devido a uma mutação na subunidade 30S do mesmo. No entanto, este mecanismo de resistência só é relevante para a estreptomicina, pois os outros aminoglicosídeos podem ligar-se às duas subunidades do ribossoma (30S e 50S), não sendo afectados por este mecanismo de resistência [5,7].

1.3.6-

Toxicidade

O interesse clínico dos aminoglicosídeos encontra-se limitado devido aos seus efeitos tóxicos, dos quais os mais graves são a nefrotoxicidade, a ototoxicidade e a neurotoxicidade.

A nefrotoxicidade resulta da acumulação de aminoglicosídeos no tubo proximal e deve-se a necrose tubular aguda, em especial do tubo proximal, com redução da capacidade de concentração da urina, seguida de redução da filtração glomerular. A toxicidade renal é dependente da dose de antibiótico e geralmente reversível se a terapêutica for suspensa precocemente. Dos aminoglicosídeos usados por via sistémica, o menos nefrotóxico é a estreptomicina, tendo os restantes antibióticos deste grupo uma

Canamicina A

Tobramicina

Amicacina

Gentamicina C1a

Sisomicina

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nefrotoxicidade muito semelhante. No entanto, a gentamicina é mais nefrotóxica do que a amicacina, canamicina ou netilmicina. É de realçar que os efeitos nefrotóxicos se encontram potenciados por determinados factores, como: idade, disfunção renal, tratamentos prolongados, dose terapêutica, distância temporal entre dois regimes terapêuticos e administração concomitante com outros fármacos nefrotóxicos [2,5].

Os aminoglicosídeos tendem a acumular-se nos fluidos do ouvido interno revelando efeitos ototóxicos. Normalmente, a ototoxicidade é irreversível e pode-se manifestar como lesão vestibular e/ou coclear. Da lesão coclear resulta, inicialmente, um zumbido de frequência elevada, seguido de surdez progressiva, quase sempre irreversível. Já a lesão vestibular leva ao aparecimento de naúseas, vómitos, tonturas, vertigens e perturbações do equilíbrio, sintomatologia que de início se encontra sempre presente, mas que mais tarde, com a regressão da lesão ou a passagem à fase crónica, poderá desaparecer completamente ou ficar limitada a ataxia que apenas surge ao fechar os olhos. A ototoxicidade está relacionada com a dose total de antibiótico que é administrada. Quando os aminoglicosídeos são utilizados por via sistémica, a lesão predominante é a vestibular no caso da estreptomicina e da gentamicina e é a coclear para a canamicina, netilmicina e amicacina [5].

Quando administrados em doses elevadas, por via muscular ou intra-venosa, os aminoglicosídeos podem causar bloqueios neuromusculares do tipo não despolarizante, levando a paragens respiratórias. Constituem grupos de alto risco os doentes com medicação relaxante muscular ou com miastenia grave. São também exemplo de outras manifestações de neurotoxicidade mais raras, a nevrite óptica, parestesias, cefaleias e irritabilidade [2].

1.3.7-

Utilização terapêutica

1.3.7.1 - Utilização em medicina humana

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particularmente as Enterobacteriaceae e a P. aeruginosa. Geralmente são utilizados em

associação com antibióticos -lactâmicos no tratamento de infecções graves [5].

Os aminoglicosídeos deverão ser utilizados preferencialmente no tratamento de doenças graves, tais como: infecções do tracto respiratório, preferencialmente associados a um -lactâmico; infecções intra-abdominais e infecções pélvicas, associados à clindamicina ou ao metronidazol; infecções urinárias complicadas; quadros de septicemia, associados à piperacilina, ceftazidima, imipenemo ou monobactâmicos; endocardites por enterococos; infecções da pele, tecidos moles e ósseas; e meningites (administração intra-tecal), embora, neste caso, seja preferível recorrer a outros grupos de antibióticos.

Em doentes hospitalizados com respiração assistida e em doentes algaliados, os aminoglicosídeos têm sido usados profilacticamente para diminuir os riscos de infecção respiratória e urinária, respectivamente.

A administração de aminoglicosídeos por via oral, isoladamente ou em associação a outros antibióticos (vancomicina e outros, ou anti-fúngicos), tem sido utilizada na descontaminação gastrointestinal para a prevenção de infecções em doentes neutropénicos.

Por fim, os aminoglicosídeos também podem ser utilizados topicamente no tratamento de doentes queimados, conseguindo-se boas absorções e excelentes níveis séricos [2].

1.3.7.2- Utilização em medicina veterinária

(28)

1.4- Gentamicina

Em 1963,Weinstein e seus colaboradores isolaram um novo antibiótico de largo espectro – a gentamicina – a partir de duas espécies de bactérias pertencentes ao género

Micromonospora [10].

A gentamicina C é uma mistura de várias substâncias, apresentando três componentes principais estruturalmente relacionados, designados de gentamicina C1,

C1a e C2, e dois componentes menores, a gentamicina C2a e C2b (Figura 1.3).

Figura 1.3 – Estrutura química dos principais componentes da gentamicina.

Este antibiótico é produzido por fermentação da Micromonospora purpurea ou

da M. echinospora. Os componentes da gentamicina C são pseudo-trissacarídeos,

contendo garosamina e purpurosamina ligadas glicosidicamente à 2-deoxiestreptamina. Quanto à posição desta ligação, a gentamicina apresenta uma estrutura de 2-deoxiestreptmina 4,6-dissubstituída [11-13].

A gentamicina existe na forma de sais de sulfato, apresentando-se como um pó branco ou quase branco, higroscópico. É facilmente solúvel em água, moderadamente solúvel em metanol, etanol e acetona, e praticamente insolúvel em benzeno e hidrocarbonetos halogenados [14].

Quanto à sua actividade, a gentamicina é um antibiótico de largo espectro, activo contra S. aureus e bacilos Gram-negativos, incluindo a P. aeruginosa. Tem moderada

actividade contra Streptococcus spp. e em associação com a penicilina, tem uma acção

sinérgica contra E. faecalis e E. faecium. Não se verificam diferenças detectáveis no

espectro de acção dos diferentes componentes principais da gentamicina [2,15]. Relativamente ao mecanismo de acção, este é igual para os três componentes principais da gentamicina C, ligando-se à subunidade 30S do ribossoma no mesmo local, mas com

R1 R2 R3

Gentamicina C1 CH3 H CH3

Gentamicina C2 H H CH3

Gentamicina C1a H H H

Gentamicina C2a H CH3 H

(29)

o ribossoma [16]. Tal como todos os outros aminoglicosídeos, não é absorvida por via oral, pelo que, terapeuticamente, é administrada por via muscular ou via intra-venosa. A sua eliminação faz-se por via renal, por filtração glomerular, atingindo elevadas concentrações urinárias, sem sofrer alterações metabólicas [2].

Actualmente, devido a ser um antibiótico de largo espectro, a gentamicina é usada em várias situações de doença, nomeadamente no tratamento de infecções sistémicas graves, provocadas por bacilos Gram-negativos, podendo ser usada isoladamente no tratamento de infecções urinárias ou tularémia, ou em associação a outros antibióticos, como por exemplo a ampicilina e a penicilina, as isoxazolil-penicilinas, a doxiciclina e a ceftriaxona, estendendo-se assim a sua acção terapêutica ao tratamento de endocardites por enterococos, ao tratamento de infecções provocadas por

S. aureus e S. epidermidis, ao tratamento da brucelose humana e ao tratamento de

endocardites causada por estirpes de Streptococcus spp. susceptíveis à penicilina,

respectivamente [2,6,17]. Topicamente, a gentamicina também tem sido utilizada no tratamento de infecções de pele e de queratoconjuntivites, quando provocadas por bacilos Gram-negativos [2]. Por ter um espectro de acção alargado é geralmente um antibiótico de primeira escolha no combate a infecções nosocomiais graves causadas por Enterobacteriaceae e P. aeruginosa em hospitais com baixa resistência a este grupo

de antibióticos [17].

Devido à sua larga utilização na terapêutica, tem-se assistido a um aumento no número de estirpes bacterianas resistentes à gentamicina, principalmente no que se refere a infecções nosocomiais [2].

(30)

1.5- Métodos de quantificação da gentamicina em

formulações farmacêuticas

A determinação da gentamicina tem sido efectuada nas mais variadas matrizes, principalmente em amostras biológicas [19-23], formulações farmacêuticas [24-39], alimentos [40-44] e amostras ambientais [45,46]. No caso particular dos produtos farmacêuticos, este composto aparece sob a forma de sal, nomeadamente sulfato de gentamicina. No entanto, tal como foi referido anteriormente, este antibiótico é constituído por uma mistura de vários componentes que não possuem grupos cromóforos nem fluoróforos, o que dificulta a sua determinação directa através de métodos colorimétricos, habitualmente utilizados na maioria das monografias oficiais para controlo de compostos farmacêuticos.

Estão descritas diferentes metodologias para a análise do sulfato de gentamicina nas mais variadas formulações farmacêuticas, permitindo a realização de estudos de estabilidade, controlo de qualidade das mesmas [24,35] e atestar a autenticidade de um determinado produto farmacêutico [26,27,30]. Na maior parte dos casos, o analito em estudo encontra-se em concentrações razoavelmente elevadas, numa matriz que embora complexa, não exige na maioria das situações o recurso a processos de extracção da amostra [6].

Sendo a gentamicina uma mistura de vários componentes, a indústria farmacêutica adoptou como análise de rotina a determinação das percentagens relativas dos seus componentes principais. A Farmacopeia Portuguesa [47] (bem como a Farmacopeia Europeia [48]) descreve para o efeito uma metodologia de cromatografia líquida de fase reversa com detecção amperométrica, recorrendo a um eléctrodo de ouro, para a análise da matéria-prima. Já a Farmacopeia Americana [49], descreve um método de cromatografia líquida de fase reversa com detecção por ultra-violeta, após derivatização pré-coluna da gentamicina com o-ftaldeído (OPA).

(31)

se o diâmetro da zona de inibição do crescimento da mesma, em torno do disco de papel. Já o ensaio turbidimétrico utiliza um meio de cultura líquido inoculado com uma determinada bactéria, onde se vai colocar a solução diluída do antibiótico em estudo. Após incubação, mede-se a absorvância da “mistura” presente no tubo para avaliar o crescimento da bactéria. No entanto, este tipo de ensaios apresenta várias limitações, sendo de salientar a sua baixa sensibilidade, falta de precisão e de especificidade, além de que são metodologias morosas e com elevada variabilidade [6,24].

Para além do que está fixado nas monografias oficiais, no que concerne à determinação de gentamicina em formulações farmacêuticas têm sido propostos outros procedimentos baseados em técnicas cromatográficas com diferentes métodos de detecção acoplados. Neste âmbito destacam-se a cromatografia de troca iónica com detecção por espectrofotometria na região do ultra-violeta, após derivatização pré-coluna com OPA [25], cromatografia líquida (LC) com detecção electroquímica pulsada, com um eléctrodo de ouro [26] e LC com detecção por detector evaporativo por dispersão de luz (ELSD) [24]. Também a electroforese capilar (CE) com detecção por espectrofotometria na região do ultra-violeta [27,28] tem sido utilizada na análise deste antibiótico em medicamentos, usando detecção espectrofotométrica na região do UV após derivatização pré-capilar da gentamicina com o OPA e o ácido mercaptoacético [29], ou detecção por gradiente de potencial [30] ou detecção electroquímica com eléctrodos de cobre [31]. Todos os procedimentos referidos envolvem equipamento de elevado custo e na maioria das situações os reagentes utilizados, sobretudo os de derivatização (OPA, ácido mercaptoacético), são altamente tóxicos.

Para além das técnicas separativas referidas, foram igualmente propostos procedimentos electroanalíticos envolvendo a potenciometria com eléctrodos selectivos de iões [32], e amperometria usando um biosensor que incorpora simultaneamente a enzima colinesterase e anticorpos anti-gentamicina [33]. Embora estas técnicas sejam mais económicas do que as descritas anteriormente, são por vezes sujeitas a interferências provocadas por compostos quimicamente aparentados ou por produtos de degradação do composto original.

(32)

após radiação de excitação a 465 nm e emissão aos 530 nm. Foi igualmente referida outra metodologia baseada na detecção do produto resultante da reacção entre os iões európio e a gentamicina que potenciava a intensidade da radiação fluorescente emitida a 616 nm pelos iões európio [35].

A gentamicina foi igualmente quantificada recorrendo-se a métodos espectrofotométricos. Wang et al. [36] desenvolveram um método em que após reacção

do analito com o p-dimetilaminobenzaldeído, numa solução de ácido acético/tampão

acetato, o complexo formado, de cor amarela, possuía um máximo de absorção a 405 nm. El-Didamony et al. [37] determinaram este composto por espectrofotometria

indirecta. O método era baseado na oxidação do antibiótico por permanganato de potássio, em meio ácido, determinando-se seguidamente o excesso de oxidante que não participava na reacção e correlacionando-o com a concentração de gentamicina.

Relativamente a metodologias de análise em fluxo, estão descritos métodos de análise por injecção em fluxo (FIA) para a determinação de gentamicina em formulações farmacêuticas, utilizando a quimiluminescência como método de detecção. Li et al. [38] utilizaram a reacção de quimiluminescência directa entre a gentamicina e o

cobalto (III), na presença de ácido sulfúrico, sendo o cobalto (III) electrogerado em linha. Utilizando uma metodologia semelhante, onde o peroxioxalato actuava como espécie emissora de quimiluminescência na presença do imidazol como catalisador da reacção [39], Ramos-Fernández et al. analisaram a gentamicina em soluções injectáveis,

colírios e pomadas oftálmicas. No entanto, a necessidade de se efectuar uma pré-derivatização com o-ftaldeído da espécie a medir, limita a sua aplicação, sobretudo sob

o ponto de vista ambiental.

(33)

legislação de cada país, no que se refere à utilização de fármacos na produção animal [6,51].

Os ensaios microbiológicos, também referidos na literatura, são utilizados preferencialmente como testes de “screening” para a análise de resíduos de antibióticos, podendo detectar a presença de diferentes classes de antibióticos [52-55]. Estes ensaios embora sejam baratos e simples de realizar, necessitam de uma confirmação dos resultados positivos obtidos através de metodologias mais sofisticadas, como é o caso da cromatografia gasosa com detecção por espectrometria de massa (GC-MS), ou mais comummente, a cromatografia líquida com detecção por espectrometria de massa (HPLC-MS).

(34)

1.6- Métodos automáticos de análise

Nas últimas décadas tem-se assistido a um crescente interesse por parte dos laboratórios analíticos, no desenvolvimento de métodos automáticos de análise com o intuito de simplificarem os procedimentos analíticos, de forma a realizarem um número cada vez maior de determinações analíticas, mantendo os custos em valores aceitáveis. A implementação de metodologias automáticas traz algumas vantagens, pois permite reduzir os custos analíticos por via da diminuição do número de operadores envolvido e também pela redução do consumo de reagentes e amostra. Este último aspecto tem impacto sob o ponto de vista ambiental, já que é possível reduzir a produção de resíduos perigosos e diminuir a exposição dos operadores do laboratório a produtos químicos tóxicos [56].

A automação laboratorial teve início na segunda metade do século XX, mesmo antes de se recorrer à utilização do computador. Nesta época foi introduzido o conceito de análise em fluxo, surgindo os sistemas de fluxo contínuo, que provaram ser excelentes instrumentos para a gestão de soluções, permitindo a implementação de procedimentos automáticos em várias etapas do processamento da amostra (por exemplo: controlo de diluições, separação e concentração em linha, adição de reagentes, mistura, e controlo do tempo da amostragem). Os sistemas de fluxo mostravam ser uma metodologia vantajosa, pois conseguiam evitar a contaminação da amostra pelo ambiente (e vice-versa); reduziam o consumo de reagentes e de amostra, bem como a produção de resíduos; aumentavam o ritmo de amostragem; melhoravam a precisão das medidas analíticas; e o sinal analítico era monitorizado continuamente ao longo do tempo. Nestes sistemas, cada amostra ou produto da reacção originava um sinal transiente, cuja altura máxima ou área era relacionada com o parâmetro que se pretendia avaliar [57,58].

1.6.1- Métodos de fluxo não segmentados

(35)

comunidade científica. Tal facto deve-se a estas metodologias exibirem uma elevada versatilidade e simplicidade, sendo o custo das montagens muito acessível.

O conceito de análise em fluxo não segmentado surgiu em 1975, para definir metodologias em que pequenos volumes de amostra, rigorosamente medidos, eram introduzidos de forma intermitente num fluído transportador, o qual procedia ao seu encaminhamento até ao detector, sem que houvesse recurso à intercalação de bolhas de ar. Na altura da detecção não era necessário atingir-se um equilíbrio físico e químico, sendo a quantificação possível porque os padrões e as amostras eram sujeitos a níveis de dispersão idênticos e eram processados de maneira semelhante. Este tipo de métodos tinha a vantagem de ser rápido e oferecer uma boa exactidão e precisão de resultados.

Contudo, à parte destes métodos, foram desenvolvidos outros mais recentemente, como é o caso da Análise por Injecção Sequencial (SIA) e da multicomutação, que apresentam a vantagem de não necessitarem de reconfiguração física do sistema, bastando apenas dar instruções via computador para se conseguir alterar as condições hidrodinâmicas e se efectuar uma optimização rápida das variáveis que lhe estão implícitas. Assim, só era necessário proceder ao estudo das variáveis químicas para que com montagens simples se pudesse analisar diferentes amostras num curto espaço de tempo.

A crescente evolução tecnológica levou ao aparecimento de vários métodos de análise em fluxo não segmentado (Tabela 1.2).

Tabela 1.2 – Métodos de fluxo não segmentado mais utilizados e seu enquadramento histórico.

Método de Fluxo Data Proposto por Ref.

Análise por Injecção em Fluxo (FIA) 1975 J. Ruzicka

E.H. Hansen 59

Análise por Injecção Sequencial (SIA) 1990 J. Ruzicka

G. Marshall

60

Análise por Injecção em Fluxo por Multicomutação (MCFIA)

1994 B.F. Reis e

colaboradores 61

Análise por Injecção em Fluxo por Multi-seringa (MSFIA) 1999 V. Cerdà e

colaboradores 62

Sistema de Fluxo por Multi-impulsão (MPFS) 2002 R.A.S. Lapa e

(36)

O primeiro método de fluxo não segmentado a surgir foi a Análise por Injecção em Fluxo (FIA, do inglês “Flow Injection Analysis”) e tinha como principal característica o controlo da dispersão de um segmento de amostra intercalada num fluxo que o transporta até ao detector (Figura 1.4) [59]. A introdução desta técnica veio revolucionar o conceito de automação na análise química, pois permitia realizar determinações analíticas sem ter que se estabelecer um equilíbrio físico (não era necessária a homogeneização da amostra e reagentes/transportador) ou químico (a reacção não tinha que ser completa). O FIA tornou-se bastante popular, uma vez que permitiu a automação de procedimentos laboratoriais de rotina, de um modo simples e acessível, com redução do consumo da amostra e aumento do ritmo de amostragem [64].

Figura 1.4 – Esquema representativo de um sistema FIA. A – Amostra; T – Solução transportadora; R1 e R2 – Reagentes; BP – Bomba peristáltica; TR – Tubo reactor; D –

Detector (adaptado de [62]).

Com o acoplamento dos computadores aos sistemas de fluxo foi possível colmatar as deficiências do FIA em termos de autonomia. Surgia assim a segunda geração da análise em fluxo, sendo designada por Análise por Injecção Sequencial (SIA, do inglês “Sequential Injection Analysis”) [60]. Este método baseia-se no princípio de controlo da dispersão e manipulação reprodutível da amostra, mas no qual o modo de funcionamento é baseado no conceito de fluxo programado [64].

(37)

computador, sendo este componente responsável pela definição do caudal, volume e sentido (directo ou inverso) do fluxo das diferentes soluções (Figura 1.5). No decorrer do ciclo analítico, volumes precisos de amostra e reagente são sequencialmente aspirados através da válvula selectora de multi-posição, invertendo-se posteriormente o sentido do fluxo para transportar as soluções aspiradas para a zona de reacção. É durante este transporte que ocorre a mistura entre amostra e reagente, não só devido à inversão do sentido do fluxo mas também a processos de dispersão axial e radial, que ocorrem no processo de transporte [64].

Figura 1.5 – Esquema representativo de um sistema SIA. T – Solução transportadora; BP – Bomba peristáltica; TA – Tubo de armazenamento; VS – Válvula selectora; R – Reagente; A – Amostra; TR – Tubo reactor; D – Detector; E – Esgoto (adaptado de [64]).

Comparativamente com o FIA, o SIA apresenta as seguintes vantagens: diminuição do consumo de reagentes e amostra; redução significativa da quantidade de resíduos produzida; possibilidade de se controlar o caudal apropriado de uma maneira mais reprodutível através do computador, bem como de todos os tempos utilizados em cada ciclo analítico, o que permite alterar facilmente os parâmetros experimentais. Estas características do SIA, tornam-no numa metodologia versátil, simples, robusta e que requer pouca manutenção.

Contudo, este método de fluxo também apresenta limitações, sendo de salientar a redução do ritmo de amostragem, em cerca de 30-50%, devido ao facto de ser

T

BP

TA

VS

TR D

A R

E T

BP

TA

VS

TR D

A R

(38)

necessário um tempo de análise que corresponde à soma do tempo de aspiração sequencial das diferentes soluções envolvidas na reacção, com o tempo necessário para a ocorrência da mesma e medida do sinal analítico [64]. Assim, o desempenho do método SIA poderá ser afectado por uma ineficiente mistura da amostra e reagente por dispersão, uma vez que estes são colocados topo a topo [58].

Posteriormente, foram descritos outros métodos de fluxo resultantes de aperfeiçoamentos instrumentais, sendo conhecidos, no seu conjunto, como métodos de fluxo multicomutados. Estes caracterizam-se pelo baixo consumo de reagentes e amostra, juntamente com um elevado ritmo de amostragem.

A Análise por Injecção em Fluxo por Multicomutação (MCFIA, do inglês “Multicommutated Flow Injection Analysis”) foi proposta em 1994 [61] e surgiu como uma nova estratégia de manuseamento da amostra e introdução de reagentes num sistema de fluxo contínuo, recorrendo a válvulas solenóides. Este método de fluxo será abordado com maior detalhe na próxima secção já que foi a opção feita para o desenvolvimento do trabalho experimental.

Em contraste com os restantes métodos de fluxo multicomutados, a Análise por

Injecção em Fluxo por Multi-seringa (MSFIA, do inglês “Multi-syringe Flow

(39)

Figura 1.6 – Esquema representativo de um sistema de MSFIA. A – Amostra; E – Esgoto; T – Solução transportadora; R1 e R2 – Reagentes; TR – Tubo reactor; D –

Detector (adaptado de [62]).

A principal vantagem associada ao MSFIA está relacionada com o facto de não necessitar de bombas peristálticas, e por isso poder usar reagentes mais agressivos, como os ácidos e bases fortes ou os solventes orgânicos, contornando-se o problema da incompatibilidade deste tipo de reagentes com os tubos poliméricos de impulsão usados nos sistemas descritos anteriormente, bem como a dificuldade inerente ao desgaste rápido que eles sofrem, devido à constante compressão e descompressão de que são alvo. Outras vantagens do MSFIA são a sua robustez, a elevada frequência de amostragem, evitam um consumo excessivo de reagentes e amostra, pois estes podem retornar ao reservatório quando não são necessários, e o facto de poder dispensar simultaneamente amostra e reagentes, facilitando a sua mistura. Já a principal desvantagem deste método de fluxo é a necessidade de descarregar periodicamente as soluções presentes nas seringas [62,65,66].

Mais recentemente, foi proposta uma nova estratégia para a implementação de procedimentos analíticos em fluxo, explorando o conceito de multi-impulsão – o

Sistema de Fluxo por Multi-impulsão (MPFS, do inglês “Multi-pumping Flow

System”) [63]. Este método baseia-se na utilização de várias micro-bombas solenóides como unidades propulsoras, sendo estas responsáveis pela introdução de amostra e reagentes, bem como mistura e transporte das soluções (Figura 1.7) [65]. A actuação das micro-bombas solenóides produz um fluxo pulsado, que se traduz numa cadeia contínua

A E T R1 R2

TR TR TR

E D

A E T R1 R2

TR TR TR

(40)

de pequenos segmentos correspondentes a um determinado volume de solução resultante de cada pulso das micro-bombas. Cada pulso leva a um aumento do movimento caótico das soluções em todas as direcções, contribuindo para uma rápida e eficaz mistura entre amostra e reagentes [67].

Figura 1.7 – Esquema representativo de um sistema de MPFS. P1 e P2 – Micro-bombas

solenóides; A – Amostra; R – Reagente; C – Interface de controlo; X – Ponto de confluência; TR – Tubo reactor; D – Detector; E – Esgoto (adaptado de [63]).

O MPSF apresenta várias vantagens, sendo de destacar o facto de as micro-bombas solenóides terem sido desenhadas para proporcionar um percurso inerte para as soluções, de modo a poder utilizar tanto reagentes com elevado grau de pureza, como aqueles mais agressivos. Também a simplicidade do equipamento e a sua fácil concepção, operação e controlo são de destacar. A utilização de fluxo pulsado para obter uma rápida e eficaz mistura entre amostra e reagentes, e a utilização de volumes muito pequenos, permitindo assim uma redução do consumo de amostra e reagentes são outras das vantagens que lhe são apontadas [65].

A P1

P2

C x

TR

D E

R

A P1

P2

C x

TR

D E

(41)

1.7 - Análise por Injecção em Fluxo por Multicomutação

(MCFIA)

Tal como foi referido anteriormente, a Análise por Injecção em Fluxo por Multicomutação (MCFIA)foi proposta como uma nova estratégia de manuseamento da amostra e introdução de reagentes num sistema de fluxo contínuo, recorrendo a um conjunto de válvulas solenóides, cada uma actuando como um comutador independente e cujas operações são controladas por computador [61].

Um sistema de multicomutação pode ser considerado como uma rede analítica que envolve a actuação de n dispositivos activos (ou n operações com um único

dispositivo) numa única amostra permitindo o estabelecimento até 2n estados (Figura 1.8).

Figura 1.8 – Esquema representativo de um sistema MCFIA. A – Amostra; R1 a R3 –

Reagentes; T – Solução transportadora; V1 a V5 – Válvulas solenóides de três vias; Y –

Ponto de confluência; TR – Tubo reactor; D – Detector; SP – Sistema de propulsão; E – Esgoto (adaptado de [68]).

Apresenta diversos parâmetros de entrada (inlet) (por exemplo: amostra, reagentes), parâmetros do sistema introduzidos através do teclado do computador, e de

A R2 R1 T R3

V1 V2 V3

V4 V5

Y TR D SP E

A R2 R1 T R3

V1 V2 V3

V4 V5

(42)

saída (outlet) (por exemplo: resultados, reciclagem de soluções, resíduos) que são, muitas vezes, interdependentes. Os passos analíticos requeridos para o processamento da amostra podem ser definidos através do “software” de controlo, podendo ser, caso necessário, modificados em tempo real [57].

A multicomutação recorre à utilização de válvulas solenóides, que são controladas por computador, para a inserção de amostra e reagente, substituindo os volumes de inserção por tempos de inserção. Estes dispositivos de inserção apresentam uma grande rapidez de comutação, o que lhe confere vantagens na forma de inserção das soluções, comparativamente aos outros dispositivos de injecção usados em outras técnicas de fluxo, nomeadamente FIA e SIA. Com base num controlo temporizado que pode ser facilmente alterado e ajustado, pequenas alíquotas de amostra (na ordem dos µL) são intercaladas com pequenas alíquotas de reagente, permitindo uma mais rápida homogeneização da zona de amostra e, consequentemente, um maior desenvolvimento da reacção [69]. Ao processo de intercalação de alíquotas de amostra e de reagente através de um único percurso analítico, onde a reacção química tem lugar, designa-se de amostragem binária (Figura 1.9).

Figura 1.9 – Representação esquemática da amostragem binária. A – Amostra; R – Reagente; T – Solução transportadora. As zonas sombreadas representam as interfaces de mistura entre amostra e reagente. I – intercalação de pequenos segmentos de amostra e reagente; II – transporte das duas soluções; III – homogeneização da zona de amostragem (adaptado de [70]).

Na amostragem binária, a inserção da amostra é efectuada através da comutação da válvula solenóide entre as posições activada e desactivada, responsáveis pela inserção ou da amostra ou do reagente, com tempos de comutação extremamente curtos.

R R

R R

R R R R

A A

A A

A A A A

T

T

T

R R

R R

R R R R

A A

A A

A A A A

T

T

(43)

resultando na rápida obtenção de uma mistura homogénea com baixa dispersão da amostra. A eficiência da mistura é largamente afectada pelo tamanho das alíquotas, sendo tanto maior quanto menor for o seu volume. Assim que as alíquotas de amostra e reagente estejam dentro do sistema analítico, o fluxo destas soluções pára e apenas a solução transportadora circula novamente [70,71]. A inserção de n pares de

amostra/reagente resulta no estabelecimento de 2n-1 interfaces, onde a mistura ocorre

por dispersão axial. Contrariamente à maior parte dos sistemas de fluxo, na multicomutação a interacção entre a amostra e os reagentes começa na zona de amostragem, aumentando o tempo de reacção, sem afectar a frequência de amostragem [57].

A utilização de pequenas redes de fluxo com válvulas solenóides a funcionarem como interruptores, controladas através do “software”, fez com que as potencialidades da análise em fluxo contínuo aumentassem drasticamente. A multicomutação apresenta várias vantagens, sendo de destacar: (i) a miniaturização do sistema de fluxo, devido ao reduzido tamanho das válvulas solenóides e das interfaces electrónicas, o que permitiu o desenvolvimento de equipamentos compactos e portáteis, passíveis de serem utilizados em análises “in situ”; (ii) o consumo reduzido de amostra e reagentes e (iii) boa reprodutibilidade.

Estes sistemas de fluxo são simples, económicos e versáteis; apresentando um elevado grau de automatização, sendo possível alterar todas as variáveis que incidem directamente sobre os perfis de dispersão, sem haver a necessidade da reconfiguração física do sistema [57,69].

Ainda é de salientar que a multicomutação é capaz de um desempenho analítico semelhante ao do SIA, com a vantagem de permitir uma mistura entre amostra e reagente mais rápida e eficiente, uma vez que a velocidade de comutação das válvulas solenóides é superior. Além disso a multicomutação apresenta um ritmo de amostragem mais elevado, graças ao facto da reacção química poder ter início logo na fase de amostragem, para além dos custos da montagem analítica serem inferiores.

(44)
(45)

1.8- Quimiluminescência

1.8.1- Aspectos Gerais

Desde a Antiguidade que o fenómeno da luminescência é conhecido na Natureza. As primeiras observações deste fenómeno foram realizadas em organismos vivos que emitem luz, como pirilampos, bactérias, fungos, peixes ou insectos.

A primeira referência ao fenómeno da quimiluminescência, como sendo a emissão de luz produzida por uma reacção química, remonta a 1877, tendo sido observado por Radziszewski, ao descobrir que a lofina emitia luz verde por reacção com o oxigénio, na presença de uma base forte. Contudo o termo “quimiluminescência” só viria a ser introduzido em 1888, por Wiedemann, que classificou o fenómeno da luminescência em seis tipos diferentes, consoante a forma de excitação [72].

A exploração da quimiluminescência para fins analíticos apenas se iniciou na década de 70 para reacções em fase gasosa e, na década seguinte, para reacções em fase líquida. Desde então, o número de reacções que produzem quimiluminescência descritas na literatura tem vindo a aumentar, com aplicações analíticas nas mais variadas áreas, como biomédica, alimentar, ambiental e toxicológica [72].

A quimiluminescência é definida como a emissão de radiação electromagnética (ultra-violeta, visível ou infra-vermelho) resultante de uma reacção química. O fenómeno pode ser observado quando um dos intermediários ou produtos da reacção é formado num estado electronicamente excitado, que pode emitir radiação ao regressar ao estado fundamental, ou transferir a sua energia para outra molécula, que depois emitirá radiação [73].

De um modo geral, a quimiluminescência pode ser gerada por dois mecanismos distintos [72,73], como se pode observar no esquema da Figura 1.10:

Quimiluminescência directa: em que dois reagentes, normalmente um substrato e um oxidante, na presença de um co-factor, reagem originando um produto, do qual uma fracção será formada num estado electronicamente excitado e que vai regressar ao estado fundamental com emissão de um fotão.

(46)

transferem o seu excesso de energia para um fluoróforo que por sua vez fica num estado electronicamente excitado, regressando ao estado fundamental com emissão de um fotão.

Figura 1.10 – Esquema representativo dos tipos de reacções quimiluminométricas (adaptado de [74]).

Para uma reacção química emitir radiação tem que cumprir certos requisitos. Em primeiro lugar a reacção deve ser exotérmica, de maneira a produzir energia suficiente para formar uma espécie num estado electronicamente excitado, pois a criação deste estado e a geração de quimiluminescência na zona da região do visível requer cerca de 40 a 70 Kcal mol-1. A ocorrência de quimiluminescência está assim limitada a reacções exotérmicas, como as reacções redox que usam oxigénio, peróxido de hidrogénio ou oxidantes com potência similar. Além disso, o meio reaccional tem de ser favorável para canalizar a energia para a formação de um estado electronicamente excitado. E por fim, a emissão de um fotão tem que ser o processo de desactivação do produto excitado

A + B + C

(substrato) (oxidante) (co-factor

)

P*

P + h

Quimiluminescência

directa

F

P + F*

F + h

Quimiluminescência

indirecta

(catalisador)

A + B + C

(substrato) (oxidante) (co-factor

)

P*

P + h

Quimiluminescência

directa

F

P + F*

F + h

Quimiluminescência

indirecta

Imagem

Tabela  1.1  –  Aminoglicosídeos  com  maior  utilidade  na  terapêutica,  período  em  que  foram descobertos e tipo de origem [5]
Figura 1.1 – Estrutura dos aminociclitóis presentes nos aminoglicosídeos (adaptado de  [6])
Figura 1.2 – Locais de inactivação enzimática em vários aminoglicosídeos (adaptado de  [2])
Figura 1.3 – Estrutura química dos principais componentes da gentamicina.
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Referências

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