FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE NOROVÍRUS EM CASOS DE GASTROENTERITE AGUDA OCORRIDOS NA REGIÃO DO MÉDIO
PARAÍBA, ESTADO DO RIO DE JANEIRO, 2005.
Mônica Simões Rocha Ferreira
Niterói 2007
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
Mônica Simões Rocha Ferreira
DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE NOROVÍRUS EM CASOS DE GASTROENTERITE AGUDA OCORRIDOS NA REGIÃO DO MÉDIO PARAÍBA,
ESTADO DO RIO DE JANEIRO, 2005.
Dissertação apresentada à Coordenação do Programa de Pós Graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Médicas - área de concentração: Ciências Médicas.
Orientadores:
Dra. Solange Artimos Oliveira Dra. Marize Pereira Miagostovich
Niterói 2007
Mônica Simões Rocha Ferreira
DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE NOROVÍRUS EM CASOS DE GASTROENTERITE AGUDA OCORRIDOS NA REGIÃO DO MÉDIO PARAÍBA,
ESTADO DO RIO DE JANEIRO, 2005.
Orientadores:
Dra. Solange Artimos Oliveira Dra. Marize Pereira Miagostovich
Aprovada em: 31 de Outubro de 2007. Examinadores:
Prof. Dr. Sérgio Setúbal - Presidente Prof. Dra. Liliana Cruz Spano Prof. Dra. Flavia Barreto dos Santos Membros Suplentes:
Prof. Dra. Caroline Corediro Soares
Prof. Dra. Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia
Niterói 2007
Este trabalho foi realizado no Laboratório de
Virologia Comparada do Departamento de Virologia do
Instituto Oswaldo Cruz – Fundação Oswaldo Cruz e na
Universidade Federal Fluminense sob orientação da
Dr
aSolange Artimos de Oliveira e Dr
aMarize
Pereira Miagostovich.
Às minhas filhas.
Sabor da minha vida, amor incondicional.
“Ninguém ignora tudo. Ninguém sabe tudo. Todos nós sabemos alguma coisa.
Todos nós ignoramos alguma coisa. Por isso aprendemos sempre.”
AGRADECIMENTOS
À Coordenação e aos professores ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas - UFF.
À Coordenação Nacional de Laboratórios e ao Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz
pelo suporte financeiro deste trabalho.
Às Secretarias Municipais de Saúde dos Municípios da Região do Médio Paraíba,
pelo envio das amostras.
Ao “American Fellows Program”, pelo treinamento da Dra. Marize Pereira
Miagostovich no diagnóstico molecular de norovirus realizado no “Centers for Disease Control and Prevention”.
À Dra. Solange Artimos de Oliveira, por aceitar a orientação deste trabalho, sempre
tão delicada, com palavras de incentivo e apoio no decorrer deste projeto.
À Dra. Marize Pereira Miagostovich, pela co-orientação, por me fazer acreditar na
realização deste trabalho com incentivo e motivação, por seu apoio e carinho que foram indispensáveis para que pudesse trilhar esse caminho. E, finalmente, pela orientação com críticas e conselhos fundamentais a realização deste projeto estando sempre disponível e disposta a ajudar, mesmo de longe.
Ao Dr. José Paulo Gagliardi Leite, uma amizade de muitos anos, exemplo de
seriedade e comprometimento com a instituição, obrigada pela contribuição na finalização deste projeto.
À Silvana Augusta Rodrigues Portes minha grande amiga irmã, comadre de ontem, hoje e sempre, com quem sempre pude contar nos piores e melhores momentos da minha vida. E a todos seus familiares que também são como minha família.
Aos Drs. Sérgio Setúbal pela revisão e críticas construtivas, Dra. Flávia Barreto dos Santos, Dra. Liliane Cruz Spano, Dra. Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia e Dra. Caroline Soares Cordeiro por aceitarem participar da banca examinadora desta dissertação. Aos colegas do Laboratório de Virologia Comparada:
A cada um eu dedico um espaço especial, pois a convivência nos traz um aprendizado único, com cada um aprendi um pouco mais da vida.
Alexandre Fialho, a convivência nos proporcionou respeitar as diferenças. Ana Maria Pinto, cara amiga sempre alegre e pronta para ajudar.
Carmen Baur, pessoa especial sempre prestativa, que tive o prazer de orientar. Edson Pereira, amigo de todas as horas e excelente dançarino.
Eduardo Volotão, que a pouco chegou, e já nos conquistou com sua amizade. Fabiana Fioretti, determinada, sabe o que quer.
Flávia Guimarães, sempre um bom papo.
Francisca dos Santos, pessoa iluminada que mora no meu coração. Gilmar Alcântara, para quem está sempre tudo certo.
Irene Araújo, amiga de muitos anos, um carinho especial. Joeler Vargas, um bom amigo que cuida da nossa saúde.
Juliana Bragazzi, obrigada pela leitura do texto das críticas e sugestões. Marcelle Silva, amiga, dedicada e sempre pronta para o trabalho.
Maria da Penha Xavier, minha amiga nessa e em outras empreitadas da vida,
irmã, a quem agradeço especialmente pelo incentivo e apoio em todo processo.
Marilda Almeida, por seu trabalho sempre impecável.
Matías Victória, esse estrangeiro que a todos conquistou amigo sensível e
colaborador, saudades. Agradeço em especial por ter atuado diretamente nesse trabalho.
Tulio Fumian, sempre de bom humor, pessoa de convivência fácil, a quem agradeço
de forma especial pela dedicação e atuação efetiva nesse trabalho.
Aos colegas que recentemente ingressaram no laboratório, Patrícia Estrada, Julia
Fioretti, Ludmila Rocha, Marcos Lima, Fernando López, Mariela Martinez. Que sejam bem vindos ao nosso grupo fraterno.
Aos amigos que não compartilham mais nosso dia a dia, a minha comadre Celi
Moreira, Cristiane Monteiro, Liliane Spano, Alex Pina, Marcos Barreiros, Nieli Costa, Andréa Marques, Vera Rocha, Joana D`arc, Marcos Brian pelos bons momentos compartilhados.
Aos Colegas do Departamento de Virologia - Fiocruz, pela convivência de tantos
anos o meu respeito e carinho.
Ao meu marido Nivaldo, meu irmão, meus primos, tios, afilhados e amigos fora da esfera científica cada um deles com uma parcela de contribuição no decorrer deste
trabalho com uma palavra, uma conversa, um sorriso.
E finalmente a Deus pela vida e aos meus pais, por minha formação profissional e
SUMÁRIO
SUMÁRIO...IX LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ...XI LISTA DE FIGURAS ...XIV LISTA DE QUADROS ... XV LISTA DE TABELAS...XVI LISTA DE FLUXOGRAMA E GRÁFICO...XVI RESUMO ... XVII ABSTRACT ...XVIII
1 INTRODUÇÃO ... 19
1.1HISTÓRICO... 19
1.2CLASSIFICAÇÃO... 21
1.3MORFOLOGIA E GENOMA VIRAL... 23
1.4CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS... 24
1.5PATOGÊNESE E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS... 26
1.6DIAGNÓSTICO LABORATORIAL... 27
1.7EPIDEMIOLOGIA E DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA... 29
1.8PREVENÇÃO E CONTROLE... 32 2 RELEVÂNCIA DO ESTUDO... 33 3 OBJETIVOS ... 35 3.1OBJETIVO GERAL... 35 3.2OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 35 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 36 4.1MATERIAL... 36 4.1.1 Espécimes clínicos ... 36 4.1.2 Amostras controle ... 37 4.1.3 Comitê de ética ... 38 4.1.4 Oligonucleotídeos ... 38 4.2SOLUÇÕES... 40 4.2.1 Tampão TRIS/HCl/Ca++ 0,01M pH 7,2 ... 40 4.2.2 Sílica ... 40 4.2.3 EDTA 0,2M pH 8,0 ... 41 4.2.4 Tris-HCl 0,1M pH 6,4... 41 4.2.5 Tampão L6... 41 4.2.6 Tampão L2... 42
4.2.7 Tampão tris-boro-EDTA 10X pH 8,4 (TBE) ... 42
4.2.8 Gel de agarose a 1,5%... 42
4.2.9 Solução de brometo de etídio ... 43
4.2.10 Etanol 75% ... 43
4.3MÉTODOS... 44
4.3.1 Fluxograma da rotina do laboratório e deste estudo. ... 44
4.3.2 Preparo da suspensão fecal ... 45
4.3.3 Extração do genoma viral... 45
4.3.5 Reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detecção do norovírus (região B)... 47
4.3.6 Determinação dos genótipos de norovírus pela reação em cadeia pela polimerase (PCR - região D) ... 48
4.3.7 Análise do produto da reação em cadeia pela polimerase ... 49
4.3.8 Purificação do amplicon obtido ... 49
4.3.9 Reação de seqüênciamento e purificação da reação... 50
4.3.10 Análise filogenética das seqüências da região D... 50
4.3.11 Reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qPCR) ... 51
5 RESULTADOS... 53
5.1INVESTIGAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA... 53
5.2INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL E IDENTIFICAÇÃO DO AGENTE ETIOLÓGICO... 54
5.3CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS NOROVÍRUS... 56
5.4QUANTIFICAÇÃO DE NOROVÍRUS PELA REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE EM TEMPO REAL (QPCR)... 59
5.5DISTRIBUIÇÃO DOS CASOS DE ACORDO COM A IDADE E AS MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS... 60
6 DISCUSSÃO ... 62
7 CONCLUSÕES ... 68
8 PERSPECTIVAS... 70
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 71
10 ANEXOS ... 86
ANEXO 1- FICHA DE INFORMAÇÕES CLÍNICAS E EPIDEMIOLÓGICAS... 86
ANEXO 2 - EMAIL DE ACEITE DO TRABALHO CIENTÍFICO. ... 87
ANEXO 3 - PDF DO ARTIGO CIENTÍFICO ... 88
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS A – adenina Å – angstron A260 – absorbância a 260 nm aa – aminoácido AdV – adenovírus C – citosina CA – Califórnia
CaCl2 – cloreto de cálcio
CaCV– calicivírus canino
CDC – “Centers for Disease Control and Prevention” cDNA – ácido desoxirribonucléico complementar CEP – Comitê de Ética em Pesquisa
CME – criomicroscopia eletrônica cm3 – centímetro cúbico CsCl – cloreto de césio Ct – ciclo de contenção Da – dalton dATP – desoxiadenina dCTP – desoxicitosina dGTP – desoxiguanina DMSO – dimetil sulfóxido DNA – ácido desoxirribonucléico dTTP – desoxitimina
dXTP – desoxiribonucleotídeos
EDTA – ácido etilenodiamino tetracético EGPA – eletroforese em gel de poliacrilamida
EIARA – ensaio imunoenzimático para detecção de antígenos de rotavírus e adenovírus EIE – ensaio imunoenzimático
EUA – Estados Unidos da América FeCV– calicivírus felino
Fiocruz – Fundação Instituto Oswaldo Cruz G – genogrupo
g – grama G – guanina
GG – grupo genético ou genótipo HAstV – astrovírus humanos HCl – ácido clorídrico
HMSN – Hospital Municipal Salles Neto HuCV – calicivírus humanos
ICTV – Comitê Internacional de Taxonomia Viral Ig – imunoglobulina
IME – imunomicroscopia eletrônica kb – quilo bases
kDa – quilodalton
LVC-LRRR – Laboratório de Virologia Comparada-Laboratório de Referência Regional para Rotaviroses M – Molar ME – microscopia eletrônica mg – miligrama MgCl2 – cloreto de magnésio mL – mililitro mM – milimolar mm3 – milímetros cúbicos N – Normal
NaOH – hidróxido de sódio ng – nanograma
NLV – “norwalk like-vírus” nm – nanômetro
NoV / NoVs – norovírus nt – nucleotídeo
NTPase – proteína nucleosídeo trifosfatase NVCP – proteína do capsídeo de norovírus
ORF – “open reading frame” - fase aberta de leitura PA – pró-análise
pb – pares de bases
pH – concentração de íons hidrogênio livre
qPCR – reação em cadeia pela polimerase (PCR) quantitativo em tempo real q.s.p. – quantidade suficiente para
RJ – Rio de Janeiro RNA – ácido ribonucléico
RNAm – ácido ribonucléico mensageiro RpRd – RNA polimerase RNA dependente RT – reação de transcrição reversa
PCR – reação em cadeia pela polimerase
RT-PCR – reação em cadeia pela polimerase precedida de transcrição reversa RV - A – rotavírus humano grupo A
rVLPs – “partículas virus-like recombinante” SLV – “sapporo- like vírus”
SRSV – “small round structured virus“ T – timina
TBE – Tris Borato Edta
Tris – hidroximetil-tris-aminometano U – unidades
UTR – “untranslated region” - região não traduzida VLP – “virus like-particles” - partículas tipo-vírus VPA – vírus pequenos e arredondados
VPg – “virus protein genome” - proteína viral associada ao genoma µL – microlitro
µM – micromolar
oC – graus centígrados
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Árvore filogenética do gênero Norovirus. 22
Figura 2. Morfologia dos norovírus. 23
Figura 3. Organização do genoma dos Norovirus. 24
Figura 4. Vias de transmissão dos norovírus. 29
Figure 5. Mapa da Região do Médio Paraíba, Estado do Rio de Janeiro. 37
Figura 6. Eletroforese em gel de agarose a 1,5% dos produtos amplificados pela PCR da região B para detecção de norovírus. 55
Figura 7. Eletroforese em gel de agarose a 1,5% dos produtos amplificados pela PCR da região D para caraterização de norovírus. 56
Figura 8. Árvore filogenética obtida a partir da análise de 56 aminoácidos da região pertencente ao capsideo dos norovírus. 58
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Características dos iniciadores e sonda utilizados neste estudo para detecção,
seqüenciamento e quantificação dos norovírus. 39
Quadro 2. Reagentes utilizados na reação da transcrição reversa para a obtenção do cDNA a
partir do RNA viral extraído. 46
Quadro 3. Reagentes utilizados na reação em cadeia da polimerase para amplificação da
região B do norovírus. 47
Quadro 4. Reagentes utilizados na reação em cadeia pela polimerase para amplificação da
região D do norovírus. 49
Quadro 5. Reagentes utilizados na reação de seqüenciamento. 50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Distribuição das amostras estudadas para os NoVs pela reação em cadeia pela polimerase (região B) de acordo com os bairros e municípios da região do Médio Paraíba, estado do Rio de Janeiro, 2005. 55
Tabela 2: Matriz identidade (em vermelho aminoácidos e em preto nucleótideos) obtida a partir do alinhamento das seqüências do estudo, juntamente com as amostras do município de Carmo, amostra do Hospital Municipal Sales Neto-RJ (HMSN) e o protótipo GII.4 ("Bristol virus"). 57
Tabela 3: Detecção quantitativa de Norovírus utilizando a técnica de reação em cadeia pela
polimerase em tempo real (qPCR), o número de dias com diarréia dos casos com gastroenterite aguda positivos e o número de cópias por grama de fezes. 59
Tabela 4: Manifestações clínicas apresentadas em 39 casos que relataram outros sintomas
além da diarréia de acordo com o grupo etário e o resultado da RT-PCR para norovírus. 61
LISTA DE FLUXOGRAMA E GRÁFICO
Fluxograma 1. Fluxograma da rotina laboratorial e das etapas do estudo. 44 Gráfico 1. Distribuição dos casos estudados de acordo com o grupo etário. 60
RESUMO
Em março de 2005, o Serviço de Epidemiologia do município de Resende, no estado do Rio de Janeiro, relatou a ocorrência de casos agudos de gastroenterite em crianças pertencentes a uma creche do município. A investigação epidemiológica realizada demonstrou que os familiares das crianças também foram afetados. Entre os meses de maio e junho, outros dois municípios, Piraí e Rio Claro, localizados no vale do Médio Paraíba, notificaram surto ou casos esporádicos de gastroenterite aguda. Um total de 50 amostras fecais foram coletadas entre março a junho de 2005 dos três municípios. As amostras fecais foram submetidas à investigação bacteriana e parasitológica e foram negativas. Iniciamos a investigação dos possíveis vírus envolvidos naqueles surtos e nos casos esporádicos de gastroenterite aguda. Foram utilizados os métodos de eletroforese em gel de poliacrilamida para detecção de rotavírus, ensaio imunoenzimático para detecção de adenovírus e rotavírus e a reação em cadeia pela polimerase precedida de transcrição reversa (RT-PCR) para investigar a presença de norovírus e astrovírus. Foi realizada ainda a reação em cadeia pela polimerase em tempo real -“TaqMan” (qPCR) para detectar, quantificar e comparar os resultados com aqueles obtidos com a RT-PCR convencional. O norovírus foi detectado em 33 das 50 amostras (66%) por ambos os métodos demostrando concordância de 100%. A análise parcial da seqüência do genoma que codifica para a proteína do capsídeo viral demonstrou que a amostra circulante pertencia ao genótipo GII.4. Os resultados deste estudo destacam o papel da infecção pelo norovírus em crianças e adultos em surtos bem como em casos esporádicos de gastroenterite aguda.
ABSTRACT
In March 2005, the Epidemiological Surveillance Service of Resende, municipality of the Middle Paraiba Valley, State of Rio de Janeiro, reported a sudden spontaneous occurrence of acute gastroenteritis cases in children in a public day care center. The follow investigation showed that children’s relative were also affected. From May to June, two other municipalities, Piraí and Rio Claro, also localized in the Middle Paraiba Valley, reported gastroenteritis outbreaks or sporadic cases. A total of 50 fecal samples were collected from March to June 2005. Since bacterial and parasitic investigations were negative in those samples, we performed virus investigation in those outbreaks and sporadic cases of acute gastroenteritis. Polyacrylamide gel electrophoresis for rotaviruses, enzyme immunoassay for adenovirus and rotavirus, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) were performed to investigate the presence of noroviruses (NoV) and astroviruses. Also, a quantitative TaqMan real time PCR for NoV was performed to detect, quantified samples and to compare these results with those obtained by conventional RT-PCR. NoV was detected in 33 out of 50 (66%) samples showing an agreement of 100% between both methodologies. Partial nucleotide sequence analysis of the genome sequence for the capsid showed that the circulating strain belonged to genogroup II and genotype 4. The results highlight the role of NoV infection in children and adults in outbreaks as well as in sporadic cases of acute gastroenteritis.
1 INTRODUÇÃO
1.1 Histórico
Os primeiros casos descritos de infecção por norovírus (NoV) datam provavelmente da década de 30, quando a expressão “winter vomiting disease” foi introduzido por Zahorsky (1929), ao descrever uma doença altamente infecciosa cujas características clínicas predominantes eram vômito, dores abdominais e diarréia. Relatos subseqüentes de surtos com as mesmas características foram descritos por diversos pesquisadores (Reimann et al., 1945 a, b; Clark et al., 1972).
Durante as décadas de 40 e 50 os vírus já eram considerados agentes etiológicos da gastroenterite aguda, embora o envolvimento destes nas infecções fosse estabelecido apenas por exclusão (Gordon et al., 1947, 1956; Jordan et al., 1953).
Em 1968, um surto de “winter vomiting disease” ocorreu entre estudantes e professores de uma escola elementar em Norwalk, Ohio, nos Estados Unidos (Adler e Zickl., 1969). No período de dois dias, 50% (116/232) dos estudantes e professores apresentaram um quadro de gastroenterite aguda, seguido por uma taxa de 32% de infecções secundárias em conseqüência dos contatos. As manifestações clínicas mais freqüentes foram vômito/náusea (90%) e diarréia (38%), e o período de incubação de aproximadamente 48 horas. Na ocasião, estudos laboratoriais não evidenciaram o agente etiológico deste surto. Entretanto, na década de 70, estudos com voluntários foram realizados com o objetivo de identificar o agente etiológico desta doença. Amostras de fezes oriundas do surto primário e secundário de Ohio (Dolin et al., 1971, 1972), assim como amostras de três surtos ocorridos em Guildford, no
Reino Unido (Clark et al., 1972) foram utilizadas, sem sucesso, na tentativa de propagar o agente em cultivo celular e em animais de laboratório (Wyatt et al., 1978). Somente o surto de Norwalk induziu a doença em dois dos três voluntários que foram inoculados. No mesmo período, Kapikian et al.(1972) utilizando imuno microscopia eletrônica (IME) identificaram, a partir de filtrado de fezes provenientes do surto de Ohio, agregados de partículas “virus-like”, partículas semelhantes aos picornavírus e parvovírus denominadas de vírus “parvovirus-like” (Kapikian et al., 1973). O desenvolvimento de anticorpos tanto em condições naturais como em condições experimentais, juntamente com outras evidências, identificaram o vírus Norwalk como agente etiológico do surto de Ohio, sendo o primeiro vírus descrito como causador da gastroenterite aguda. Posteriormente, o diagnóstico de quadros de gastroenterite viral aguda pela microscopia eletrônica (ME) resultou na descrição de dois grupos morfológicos: com e sem característica definida, os calicivírus clássicos representados pelo vírus Sapporo e os SRSV, representado pelo vírus Norwalk. Os “Norwalk-like virus” vírus pequeno, não cultiváveis e associados a casos de gastroenterite aguda, antigenicamente distintos, cujo protótipo é o vírus do surto de Norwalk (NLV) foram classificados como pertencentes família Picornaviridade. O termo “small round structured viruses” (SRSV) descrito até então deixou de ser utilizado depois da clonagem e sequenciamento, quando esses vírus foram alocados na família Caliciviridae como gênero “Norwalk-like virus” (CDC, 2001).
Greenberg et al. (1981), observaram a presença de uma proteína estrutural de 59Da (Dalton), e assim propuseram que os Norwalk passassem a constituir a família Caliciviridae, considerando as orientações propostas pelo III Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV), isto é: os vírus pertencentes a esta família teriam como características comuns presença de uma proteína estrutural principal, que dá origem ao capsídeo; simetria icosaédrica
e a apresentação de 90 capsômeros formando 32 depressões que mostram a imagem de cálice (calix, em latim), forma que deu origem ao nome da família (Green et al., 2000).
Madeley e Cosgrove (1976) descreveram pela primeira vez em humanos a presença de calicivírus típicos em amostras de fezes de 10 crianças. Como em algumas crianças a infecção era assintomática, não houve conclusão quanto à patogenia destes vírus. Nesse mesmo ano, Flewett e Davies (1976) identificaram partículas de calicivírus típicos em biópsia de intestino proveniente de um caso de gastroenterite fatal. Entretanto, a detecção simultânea de adenovírus (AdV) no mesmo material não permitiu a determinação do agente causador da doença.
Durante muitos anos, o papel dos calicivírus humanos (HuCV) em casos de gastroenterite aguda teve seu reconhecimento comprometido pela indisponibilidade de métodos diagnósticos capazes de detectar esses agentes. Entretanto, a partir da década de 90, com a utilização de métodos moleculares, estes vírus foram definitivamente associados com surtos de gastroenterites, sendo atualmente considerados, após os rotavírus, como os mais importantes agentes etiológicos de casos de gastroenterite aguda, principalmente em surtos onde o modo de transmissão é resultado da ingestão de água ou alimentos contaminados (Glass et al., 2000).
1.2 Classificação
Em 2005, o gênero NLV foi renomeado como Norovirus pelo ICTV (Comitê Internacional de Taxonomia Viral), tendo como espécie protótipo o vírus Norwalk. Os vírus pertencentes a este gênero são denominados de acordo com o local onde foram inicialmente detectados, tais como: Hawaii, Snow Mountain, Sapporo, Southampton, Tauton, Toronto, Mexico entre outros (Em: ICVTdb: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb Acesso em: 26/05/2005; Green
O gênero Norovirus está dividido em cinco genogrupos (GI-GV), baseado na análise
da seqüência de aminoácidos (aa) da região que codifica o capsídeo viral (Figura 1). Os GI, II e IV são constituídos de vírus de origem humana, com a exceção do GII/11 que é de origem suína (Figura 1). Os genogrupos(G) são constituídos de grupos genéticos ou genótipos (GG), que representam a unidade mínima de classificação dos NoVs. A classificação para os GG consiste em agrupar por similaridade de nucleotídeos (nt) e aa os vírus em um determinado ramo de uma árvore filogenética (Ando et al., 2000; Zheng et al., 2006), sendo que dois vírus serão considerados como pertencentes a diferentes G se a distância entre as amostras, medido pelo método de distância sem correção for ≥ 45%. E quando apresentam distância ≥ 14,3% ≤ 43,8% são agrupadas em diferentes GG (Zheng et al., 2006).
Figura 1: Árvore filogenética do gênero Norovirus.
Fonte: adaptado de Zheng et al., (2006).
Árvore filogenética do gênero norovirus baseada na seqüência completa de aminoácidos do capsídeo viral. A árvore contém os cinco genogrupos (G) e seus respectivos grupos genéticos ou genótipos (GG), indicados nas caixas.
1.3 Morfologia e genoma viral
O vírion de 26 a 37nm de diâmetro, não envelopado, é composto de uma proteína de capsídeo que apresenta 90 capsômeros na superfície dispostas em simetria icosaédrica (Figura 2). A proteína do capsídeo VP1 é composta de 180 moléculas organizadas em 90 dímeros, que formam dois domínios: S e P. O domínio S forma a parte interna do capsídeo que envolve o genoma do RNA (ssRNA) e o domínio P é subdividido em dois domínios: P1 e P2. Estes domínios assumem uma forma semelhante a um cálice quando visualizados pela ME (Prasad et al., 1999; Wilhelmi et al., 2003; Cardoso e Borges et al., 2005).
Figura 2. Morfologia dos norovírus.
B C A D
A: Microscopia Eletrônica de partículas de vírus Norwalk vírus em filtrado de fezes - Barra 100
nanômetro, por C Büchen-Osmond; B: Reconstrução da imagem do Norwalk – Criomicrografia eletrônica, e C: Reconstrução da proteína do capsídeo por Dr. B.V.Venkataram Prasad's; D: Micrografia eletrônica de calicivírus inespecífico - Barra 100 nanômetro, por C Büchen-Osmond.
O genoma do NoV é constituído por um RNA de fita simples, polaridade positiva, 7,7 kb, que contém três fases abertas de leitura (ORFs), uma região não traduzida (UTR), tanto no extremo 3’ quanto no extremo 5’ e uma cauda poli (A) 3' (Figura 3). Apresentam RNA subgenômico de 2,3 kb, UTR no extremo 3’e outra no extremo 5’ (Bertolotti-Ciarlet et al.,
Fonte: Adaptado de Prasad et al. (1999) e Cornelia Buchen-Osmond Em: ICTVdB http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb Acesso em: 25 de março de 2006.
2003). A ORF1 representa 60% do genoma viral e codifica para uma poliproteína precursora (193kDa) de proteínas não estruturais, incluindo a RNA polimerase RNA dependente (RpRd) (Jiang et al., 1993). A ORF2 codifica a proteína VP1 que compõe o capsídeo viral (58kDa) e a ORF3 codifica um polipeptídio VP2 (22kDa) que parece ter função estrutural (Hardy, 2005; Vinjé et al., 2004).
Figura 3. Organização do genoma dos Norovirus.
Fonte: Adaptado de Hardy (2005).
p48: Proteína p48; NTPase: Proteína Nucleosídeo Trifosfatase; p22: Proteína p22; VPg: Proteína de União ao Genoma; 3CLpro: Protease; RdRp: RNA Polimerase RNA dependente; VP1: Proteína Principal do Capsídeo; VP2: Proteína Menor do Capsídeo. Círculo Verde: VPg; (A)n: Cauda Poli (A).
1.4 Características físico-químicas
Os NoVs têm capacidade de flutuação em cloreto de césio de 1,33 a 1,41g/cm3 e são resistentes à inativação com cloro 3,75 a 6,25mg/L (cloro residual livre de 0,5 a 1,0mg/L), que é a concentração usada em sistemas de tratamento e distribuição de águas. Os NoVs são mais resistentes à inativação com o cloro do que o poliovírus tipo1 humano, os rotavírus
ORF1
ORF3 ORF2
humanos (cepa Wa) e símio (cepa SA11) e os bacteriófagos F2 (Keswick et al., 1985), sendo inativados quando o sistema de água é tratado com 10mg/L de cloro (Green et al., 2001; Duizer et al., 2004).
Os calicivírus permanecem infecciosos após aquecimento a uma temperatura de 60°C por 30 minutos, quando em filtrado de fezes com pH 2,7 e mantido em uma temperatura de 22-25°C por três horas, e após tratamento com éter 20% por 18 horas a 4°C (Dolin et al., 1972). Doultree et al.(1999) relataram que os calicivírus felinos (FeCV) mantêm infecciosidade após 20 dias sob superfície de vidro mantido a uma temperatura de 22-25°C. Os calicivírus parecem ter longa persistência, não perdendo sua infecciosidade em diferentes superfícies (Cheesbrough et al., 1997; D´Souza et al., 2006). Segundo D’Souza et al. (2006), o material orgânico presente na suspensão fecal parece proteger contra a inativação do vírus. Os NoVs são considerados resistentes a pH ácido, já que permanecem infecciosos após a passagem pelo estômago, como outros vírus entéricos quando submetidos a pH baixo e a altas concentrações de bílis, como os poliovírus, o vírus da hepatite A e os rotavírus (Dolin et al., 1972; Caul 1996).
A inativação utilizando radiação ultravioleta é dose dependente para os calicivírus canino (CaCV) e FeCV (Duizer et al., 2004; Thruston-Enriquez et al., 2003). Os NoVs se mostraram sensíveis à temperatura de pasteurização regular (de 62ºC por 30 minutos), e à temperatura de pasteurização clássica (70°C por 2 minutos) (Duizer et al., 2004). A grande estabilidade dos NoVs, que permanecem estáveis em água clorada, pH ácido, viáveis após congelamento, aquecimento a 60°C e a pasteurização regular indica a importância da rota de transmissão da infecção envolvendo o preparo de comidas, bebidas e águas recreacionais (Ponka et al., 1999; Hoebe et al., 2004; Koopmans e Duizer, 2004; Widdowson et al., 2005).
1.5 Patogênese e Manifestações clínicas
Os NoVs são estáveis em ambientes ácidos, atravessam o estômago e sua replicação ocorre no intestino delgado, onde ocorre a infecção primária. A mucosa inflama e as células epiteliais absortivas envolvidas apresentam aparência anormal, há expansão dos vilos e encurtamento dos microvilos, provocando lesões na mucosa, resultando na indução da diarréia. Após duas semanas, o intestino delgado retorna à sua aparência histológica normal. As náuseas e os vômitos resultam da transitória gastroparesia que se resolve com o término da infecção viral (Lopman et al., 2002). Indivíduos incapazes de manter uma hidratação (crianças menores de 5 anos e idosos) podem apresentar desidratação grave, resultando em distúrbios eletrolíticos e hospitalização. As infecções são auto limitadas e a maioria dos pacientes se recupera sem seqüelas, entretanto, óbitos podem ocorrer em pacientes com desidratação grave e subnutrição (Wilhelmi et al., 2003; Thornton et al., 2004).
Os NoVs causam gastroenterite aguda de intensidade variável, caracterizada por diarréia, vômitos, náuseas, mal-estar, dores abdominais e musculares, dores de cabeça, anorexia e febre moderada (Thornton et al., 2004; Bull et al., 2006). O período de incubação varia de 10 a 50 horas (média 24 horas) e os vírus podem ser eliminados por até 22 dias. Em surtos, este período varia de 4 a 77 horas após a exposição ao vírus, podendo resultar em altas taxas de transmissão e grandes surtos (Dolin et al., 1971, 1972; Wyatt et al., 1974; Blacklow et al., 1979; Steinhoff et al., 1980; Kaplan et al., 1982; Rockx et al., 2002; Clark e
McKendrick, 2004; Thornton et al., 2004).
Geralmente, a principal característica da doença em adultos é a diarréia, enquanto que em crianças, é o vômito, sendo este sintoma menos freqüente em crianças menores de um ano de idade (Rockx et al., 2002; Lopman et al., 2004).
1.6 Diagnóstico laboratorial
Os NoVs não são propagados em culturas celulares convencionais. Estudos utilizando a técnica de “microcarriers” estão sendo conduzidos demonstrando a infecção e a replicação do RNA viral dos NoVs em células epiteliais de intestino humano em 3D. Até o momento não existe modelo animal que possa reproduzir a doença (Kapikian et al., 1996; Glass et al., 2000; Straub et al., 2007).
A dificuldade em se estabelecer um diagnóstico acessível aos médicos para identificar a etiologia das gastroenterites causadas pelos NoVs, fizeram com que Kaplan et al.(1982) criassem uma série de critérios para distinguir os surtos causados por bactérias dos causados pelos NoVs: vômito em mais de 50% das pessoas afetadas em um surto; período de incubação entre 24 e 48 horas; duração da doença entre 12 e 60 horas e a não identificação de um agente bacteriano (Kaplan et al., 1982). Esses critérios foram reavaliados pelos pesquisadores do “Centers for Disease Control and Prevention”, que concluíram que tais critérios ajudam a discriminar os surtos de origem alimentar causados pelos NoVs. Entretanto, esses critérios não devem ser utilizados individualmente, e sim em conjunto e sempre que possível, as a mostras devem ser enviadas ao laboratório (Turcios et al., 2006).
A ME continua sendo uma ferramenta importante para a investigação dos NoVs. A partir dos primeiros sintomas, já é possível visualizar partículas virais em amostras de fezes
pela ME (Kapikian, 1994), que detecta 106 partículas por mg de fezes, sendo esta a taxa de
excreção destes vírus em pessoas infectadas. A ausência de partículas com a característica peculiar dos HuCV (forma de cálice) pode dificultar sua identificação por este método (Caul e Appelenton, 1982; Doane, 1994; Glass et al., 2000).
A IEM realizada com soros de pacientes convalescentes (Doane, 1994) foi bastante utilizada para determinar a ocorrência de outros HuCV, porém essa ferramenta é limitada
para diagnóstico devido a uma lacuna na definição do anti-soro a ser utilizado (Thornhill et al., 1977; Dolin et al., 1982; Vial et al., 1990).
Os ensaios imunoenzimáticos (EIE) para detecção de NoV tornaram-se possíveis quando Jiang et al.(1992b) estabeleceram um sistema para expressão de proteínas do capsídeo do Norwalk em baculovírus, permitindo tanto a obtenção de antígeno viral como a produção de soro hiperimune em animais (Jiang et al., 1992b; Lopman et al., 2002). Antígenos recombinantes têm sido desenvolvidos para detecção de diferentes vírus do gênero Norovirus, tais como México, Snow Mountain, Hawaii (Atmar e Estes, 2001; Lopman et al., 2002). Embora os EIEs apresentem baixa sensibilidade devido à grande diversidade genética desses vírus, é um método aplicável em surtos como teste de triagem. Um teste mais sensível e específico, como a RT-PCR, deve ser aplicado nas amostras que apresentarem resultado negativo por EIE (Jiang et al., 2000; Richards et al., 2003; Cardoso e Borges, 2005).
A detecção de NoV pela RT-PCR foi primeiramente descrita por Jiang et al.(1992a) e De Leon et al.(1992), sendo uma ferramenta de pesquisa utilizada em todo o mundo.
A clonagem e o seqüenciamento dos vírus Norwalk (Jiang et al., 1990) e Southampton (Lambden et al., 1993) permitiram avanços nos estudos e na determinação da importância epidemiológica dos NoVs. Com o seqüenciamento completo dos HuCVs (Jiang et al., 1993; Lambden et al., 1993; Dingle et al., 1995; Lopman et al., 2002) foi possível o desenvolvimento de diversos iniciadores para serem utilizados nas técnicas de RT-PCR, que é mais sensível que a ME e é capaz de detectar o vírus até duas semanas após a infecção (Yamazaki et al., 1996; Parashar et al., 1998; Lopman et al., 2002). Devido à grande diversidade genética dos NoVs, até o momento não foram descritos iniciadores capazes de detectar todos os genogrupos em uma única reação. Usualmente, é necessária a utilização de uma mistura de iniciadores específicos para os diferentes genogrupos (GI, GII, GIV) (Jiang et al., 2000) ou mesmo de iniciadores que amplifiquem diferentes regiões do genoma como a
RpRd (ORF1), a região da junção da ORF 1-ORF2, que são as mais conservadas do genoma e o capsídeo (ORF2) (De Leon et al., 1992; Ando et al., 1995; Green et al., 1995; Green et al., 2000; Lopman et al., 2002; Vinjé et al., 2004).
A PCR em tempo real (qPCR) é uma técnica que tem menor risco de contaminação e pode estimar a concentração viral, além de ser rápida, bastante sensível e especifica. A detecção é dada por captação de fluorescência permitindo a observação em tempo real do processo de amplificação do produto da reação. Recentemente, o estabelecimento de um protocolo de amplificação genômica quantitativo para detecção direta de NoV GI e GII em espécimes clínicos tem permitido a detecção de NoV em amostras consideradas negativas por ME e mesmo pela RT-PCR convencional (Kageyama et al., 2003; Trujillo et al., 2006; Vainio et al., 2006).
1.7 Epidemiologia e distribuição geográfica
O modo de transmissão dos NoVs é predominantemente por via oral, pela ingestão de água e alimentos contaminados, pelo contato pessoa a pessoa, ou mesmo por aerossóis produzidos durante o vômito (Figura 4) (Marks et al., 2000; Pang et al., 2000; Moreno-Espinosa et al., 2004; Jones et al., 2007).
As infecções por NoV ocorrem, usualmente, em instituições com grandes aglomerados tais como: orfanatos, escolas, creches, asilos, cruzeiros marítimos, hospitais e quartéis militares (Ho et al., 1989; Sharp et al., 1995; Monroe et al., 2000; Gallimore et al., 2004; Goodgame, 2006). Os NoVs infectam indivíduos de todas as idades, o que raramente ocorre com os outros vírus que causam gastroenterite (Glass et al., 2000). O NoV GII tem sido descrito como o genogrupo detectado com maior freqüência em todo o mundo (Fankhauser et al.,1998; Hale et al., 2000; Koopmans, 2001; Lopman et al., 2002).
Figura 4. Principais vias de transmissão dos norovírus.
Fonte: Adaptado de Moreno-Espinosa et al.(2004).
Um estudo internacional demonstrou a soroprevalência de anticorpos para HuCV em todas as idades, encontrando níveis superiores a 70% no Nepal, Bangladesh, Suíça, Equador, Bélgica e Estados Unidos (Greenberg et al., 1979). Em países onde foi detectada baixa soroprevalência, como na Itália (Pelosi et al., 1999) e Noruega (Myrmel et al., 1996), foram encontrados problemas na estratégia dos estudos realizados.
No Brasil foram descritos dois estudos de soroprevalência: Gabbay et al.(1994) detectaram prevalência de anticorpos para Norwalk de 39% a 100% em oito comunidades indígenas da Amazônia. Talal et al.(2000) encontraram 71% de soroprevalência para os NoV em crianças menores de quatro anos de comunidades carentes no estado do Ceará.
Na última década, surtos de NoV foram descritos em diferentes países como Estados Unidos (Fankhauser et al., 2002), Peru (Parashar et al., 2004), Austrália (Wright et al., 1998), Chile (O’Ryan et al., 2000), países da Europa e Canadá (Ponka et al., 1999; Rockx et al., 2002) e em países do continente Asiático (Okitsu-Negishi et al., 2004).
No Brasil, são raros os relatos de casos de gastroenterites associados a NoV. Timenetsky et al.(1993) observaram pela ME a presença de SRSVs em fezes de crianças com e sem diarréia em São Paulo. O primeiro estudo de prevalência dos NoV no Brasil foi descrito por Parks et al.(1999), demonstrando a ocorrência 7% de casos de NoV GI e GII em crianças com e sem diarréia e em crianças hospitalizadas com diarréia persistente.
O primeiro relato brasileiro de surtos de gastroenterite associado ao NoV foi descrito por Gallimore et al.(2004). Os NoVs foram detectados em três dos quatro surtos de gastroenterite ocorridos em uma creche na cidade do Rio de Janeiro. O genogrupo GII foi detectado e sua prevalência variou de 23% a 67% nas amostras estudadas. Castilho et al.(2006), em um estudo de prevalência e diversidade genética dos NoV envolvendo crianças menores de três anos atendidas em ambulatórios de diferentes hospitais do estado de São Paulo, demostraram que os NoVs foram detectados em 36,2% de casos de diarréia aguda, em 26,7% de casos de diarréia persistente e em 36,4% das amostras de fezes de crianças sem diarréia. O genótipo predominante foi o GII.4. Borges et al.(2006), na região centro-oeste do Brasil, detectaram 8,6% de calicivírus em amostras coletadas de crianças menores de cinco anos com diarréia aguda internadas em hospitais públicos. Soares et al.(2007) demonstram 14,5% de NoV em fezes de crianças menores de 10 anos que apresentaram o quadro clínico de gastroenterite e procuraram atendimento médico em hospitais, serviços de emergência e ambulatórios da cidade do Rio de Janeiro, no período de janeiro de 1998 a dezembro de 2005, sendo detectados genogrupos I (48%) e II (52%). Os NoVs GI e GII também foram detectados na população pediátrica internada em hospitais públicos no Rio de Janeiro com gastroenterite aguda, sendo o GII responsável por 96% dos casos de infecção por NoV (Victória et al., 2007).
1.8 Prevenção e controle
Atualmente, os NoVs são considerados vírus emergentes pelo "National Institute of Health" (Monroe et al., 2000), sendo a principal causa de surtos de gastroenterite aguda não bacteriana transmitidos por água e alimentos contaminados, ocorrendo em diversos países desenvolvidos ou não, e atingindo todos os grupos etários (Beller et al., 1997, Noel et al., 1999, Ponka et al., 1999, Daniels et al., 2000; Goodgame, 2006). Estes dados sugerem que somente a implantação de medidas de saneamento básico, melhoria de condições sanitárias e de higiene da população não serão suficientes para prevenir esta infecção (Vinjé e Koopmans, 1996; Fankhauser et al., 1998; Wright et al., 1998).
A vacina é um instrumento de prevenção que poderá ser utilizado para reduzir a morbidade e a mortalidade na população. Contudo, até o momento, não foi possível estabelecer essa estratégia na prevenção e controle da gastroenterite por NoV.
Vacinas utilizando partículas de “virus-like” recombinantes (rVLPs) defectivas do capsídeo viral produzidas em baculovírus demostraram ter potencial altamente imunogênico quando administradas por via parenteral em animais (Green et al., 1993), entretanto com resposta homotípica. O emprego de vacinas orais, utilizando plantas transgênicas, representa um novo conceito em vacinas economicamente mais viáveis, está sendo desenvolvido (Tacket et al., 2000; Tacket, 2005). Tacket (2005) utilizou batatas transgênicas expressando proteína do capsídeo dos NoVs (NVCP) para determinar se voluntários humanos alimentados com esse tubérculo seriam capazes de desenvolver anticorpos, produzindo um aumento de IgA secretória e/ou IgG específica. Porém, somente 35% dos voluntários desenvolveram IgG ou IgM.
A prevenção das infecções por NoV tem como obstáculo a sua grande diversidade genômica e antigênica, um grande desafio para o controle das gastroenterites por NoV.
2 RELEVÂNCIA DO ESTUDO
A gastroenterite aguda constitui um problema de impacto mundial em termos de saúde pública, principalmente nos países em desenvolvimento. No mundo estima-se que mais de 700 milhões de casos/ano ocorram em crianças com até cinco anos de idade (Kapikian, 1994). Há uma estimativa de que ocorram 1,5 bilhão de episódios de diarréia a cada ano, sendo considerada uma das maiores causas de morte entre as doenças infecciosas em todo mundo. A taxa anual estimada é de 3,5 a 5 milhões de mortes, principalmente nos países em desenvolvimento (Linhares, 2000; Fruhwirth et al., 2001; Nguyen et al., 2001; Rohayem et al., 2004).
Recentemente, o Fundo das Nações Unidas para a Infância (UNICEF) divulgou que pela primeira vez desde que começaram a ser feitos os primeiros levantamentos sobre mortalidade infantil, na década de 60, o número de mortes entre crianças em 2006 em todo o mundo foi inferior a 10 milhões. A gastroenterite aguda é causada por diferentes agentes etiológicos, entre os quais os vírus, sendo os rotavírus, os adenovírus entéricos, os astrovírus e os norovírus os principais agentes virais responsáveis por esta enfermidade (Lopez et al., 2000; Monroe et al., 2000; De Wit et al., 2001; Koopmans, 2001; Trevino et al., 2001).
Durante muitos anos, as dificuldades de diagnóstico dos NoVs resultaram em uma freqüência subestimada dos casos de gastroenterite por estes vírus. Entretanto, surtos ocorridos em comunidades afetando indivíduos de todos os grupos etários, atingindo pequenos grupos ou resultando em surtos com centenas de pessoas infectadas, demonstram
que os NoVs têm se tornado um crescente problema de saúde pública em todo o mundo (Marks et al., 2000; Froggatt et al., 2004; Widdowson et al., 2004).
No Brasil, existem poucos estudos sobre a ocorrência de casos de gastroenterite aguda por NoV (Parks et al., 1999; Gallimore et al., 2004; Borges et al., 2006; Castilho et al., 2006; Soares et al., 2007; Victória et al., 2007). Essas investigações estão restritas a laboratórios de pesquisas. Portanto, somente uma investigação mais abrangente, incluindo laboratórios clínicos, a exemplo do que ocorre com relação aos RV, é que poderá fornecer a verdadeira dimensão das infecções por NoV. A ausência de métodos de diagnóstico rápido e de baixo custo tem resultado no não esclarecimento de surtos e casos esporádicos desta infecção. Desta forma, a investigação de NoV em espécimes clínicos obtidos a partir de casos de gastroenterite aguda ocorridos na Região do Médio Paraíba contribuirá com dados laboratoriais e epidemiológicos sobre as infecções por esses vírus no estado do Rio de Janeiro. A caracterização molecular determinará os genótipos circulantes, permitindo a realização de estudos de epidemiologia molecular desses vírus. Além disso, poderá ainda contribuir para o estabelecimento de medidas preventivas a serem tomadas e fornecer conhecimento para o desenvolvimento de uma vacina eficaz para o controle da gastroenterite aguda pelos NoVs.
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Investigar a presença de NoV em espécimes clínicos obtidos de casos de gastroenterite aguda ocorridos na Região do Médio Paraíba, Estado do Rio de Janeiro.
3.2 Objetivos específicos
- Detectar NoV pela RT-PCR em amostras de fezes provenientes de casos de gastroenterite aguda;
- Detectar e quantificar o NoV pela qPCR e comparar com a PCR qualitativa convencional;
- Realizar o seqüenciamento parcial do gene que codifica para a proteína do capsídeo viral para determinação do genótipo dos NoVs detectados;
- Realizar estudo de epidemiologia molecular dos NoVs pela caracterização molecular das seqüências obtidas.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
4.1.1 Espécimes clínicos
Foram estudadas 50 amostras fecais obtidas de 50 casos de gastroenterite aguda, cujos espécimes clínicos foram enviados ao Laboratório de Virologia Comparada-Laboratório de Referência Regional para Rotaviroses (LVC-LRRR), Instituto Oswaldo Cruz – Fiocruz, no período de março a junho de 2005. O estudo corresponde a casos atendidos nas Secretarias Municipais de Saúde das cidades de Resende, Rio Claro e Piraí, localizadas na região do Médio Paraíba do Estado do Rio de Janeiro (Figura 5).
As amostras fecais foram enviadas ao laboratório acompanhadas com Ficha de Informações Clínicas e Epidemiológicas (Anexo 1) e mantidas sob refrigeração (2 - 8 °C) até o momento da análise. Todas as amostras foram previamente testadas pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA), pelo ensaio imunoenzimático para detecção de rotavírus e adenovírus (EIARA) e pela reação de RT-PCR para detecção de astrovírus, conforme protocolo descrito previamente (Pereira et al., 1983; 1985; Noel et al., 1995). Em seguida todas as amostras do estudo foram testadas pela PCR para umfragmento da região B, codificadora da região RNA polimerase RNA dependentete (RdRp). As amostras positivas de NoVs para esta região foram também testados para região D extremidade 3’da ORF2, codificadora da região do capsídeo viral, que caracterizou o genogrupo dessas amostras
(Beuret et al, 2002; Vinjé et al 2004). Destas amostras caracterizadas pela região D, quatro amostras representando os municípios do estudo foram seqüenciadas. Foi construída uma
árvore filogenética, a partir do alinhamento das amostras do estudo com os protótipos de NoV, e as seqüências do estudo foram depositadas no “GenBank”. Todas as 50 amostras dos 50 casos do estudo foram submetidas à reação qPCR (Fluxograma 1).
Figura 5: Mapa da Região do Médio Paraíba, Estado do Rio de Janeiro.
4.1.2 Amostras controle
Controles positivos e negativos foram introduzidos durante todos os procedimentos deste estudo. Todos os cuidados e precauções para o trabalho com métodos de amplificação genômica foram estritamente seguidos, sendo cada etapa realizada em áreas distintas. Para
todos os métodos, o controle negativo foi utilizado H2O livre de Dnase/Rnase.
Fonte: http://www.codin.rj.gov.br/Images/mapas/Municipios/MP_MUNICIPIOS.pdf Acesso em 25 de Março de 2006.
Mapa parcial do Estado do Rio de Janeiro mostrando a região do Médio Paraíba, destacada na cor bege.
Amostras padrões de NoV GI e GII, gentilmente cedidas pelo Dr. Chris Gallimore pesquisador do “Enteric, Respiratory and Neurological Virus Laboratory - Health Public Agency”, Colindale - Reino Unido, foram utilizadas para padronização e estabelecimento dos protocolos de RT-PCR qualitativo e quantitativo. Posteriormente, uma amostra analisada e caracterizada geneticamente como NoV no LVC-LRRR foi utilizada como controle positivo nas reações.
Para aferição das reações de PCR em tempo real quantitativo (qPCR) foram utilizadas alíquotas de plasmídeos recombinantes contendo a região alvo de NoV GII. Os plasmídeos recombinantes, foram preparados previamente de acordo com o protocolo de Kageyama et al. (2003).
4.1.3 Comitê de ética
Este estudo faz parte de um estudo global que abrange diagnóstico, vigilância e epidemiologia molecular dos vírus envolvido na etiologia da gastroenterite aguda no Rio de Janeiro, sendo submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Fiocruz - CEP 311/06.
4.1.4 Oligonucleotídeos
Para síntese do DNA complementar (cDNA) foi utilizado o oligonucleotideo
randômico pd(N)6 (Amersham Biosciences, USA).
As seqüências dos oligonucleotídeos e da sonda, a localização no genoma dos oligonucleotídeos que foram utilizados neste estudo para detecção e caracterização molecular dos NoVs estão listados no Quadro 1.
Quadro 1: Características dos iniciadores e da sonda utilizados neste estudo para detecção e
seqüenciamento e quantificação dos nororovírus.
*Genogrupo I, **Genogrupo II
I: inosina, R: purina (A/G), Y: pirimidina (C/T), S: forte (C/G), W= (A/T).
A Posição dos iniciadores é baseada Norwalk (M87661) para GI e para GII Lordslade(X86557).
Iniciadores/ sonda
(Polaridade) Seqüência 5´ 3´ Posição no
genoma Concentração
Produto (pb)
PCR NoV Região B
Mon 432* (+) Tgg ACI CgY ggI CCY AAY CA 5093-5114
Mon 434 * (-) gAA SCG CAT CCA RCG gAA CAT 5285-5305 Mon 431** (+) Tgg ACI AGR ggI CCY AAY CA 5093-5114
Mon 433** (-) ggA YCT CAT CCA YCT GAA CAT 5285-5305
100 mM 213bp
PCR NoV GII Região D
Cap C (-) CCT TYC CAK WTC CCA Ygg 6667-6684
Cap D1 (+) TgT CTR STC CCC CAg GAA Tg 6432-6451
Cap D3 (+) TgY CTY ITI CCH CAR gAA Tgg 6432-6452
50 mM 253bp
Taq Man NoV GII
COG2F (+) CAR gAR BCN ATg TTY AgR Tgg ATg Ag 5003 600nM
COG2R (-) TCg ACG CCA TCT TCA TTC ACA 5100 600nM
Sonda RING2 -TP (+)
FAM – Tgg gAg ggC gAT CgC AAT
CT-TAMRA 5048 250nM
4.2 SOLUÇÕES
4.2.1 Tampão TRIS/HCl/Ca++ 0,01M pH 7,2
Tris - hidroximetil-tris-aminometano (SIGMA®) 1,21g
Cloreto de Cálcio -CaCl2- 0,0015M (Vetec®) 0,02g
Água destilada q.s.p. 1000mL
Em um bécher de 2000mL foram adicionados os reagentes, homogeneizados com
agitador magnético e ajustado o pH (7,2) com ácido clorídrico PA (Merck®) antes de
completar o volume final em balão volumétrico de 1000mL. A solução foi transferida um para frasco com vedação e autoclavada a 121°C por 20 minutos. Foi conservada entre 2 - 4ºC.
4.2.2 Sílica
Dióxido de silício (SIGMA®) 60g
Água destilada q.s.p. 500mL
Em uma proveta de 500mL foram adicionadas água e 60g de sílica, a solução foi homogeneizada vertendo-se a proveta, deixando sedimentar por 24 horas. Por sucção foram desprezados 430mL do sobrenadante e adicionados 500mL de água destilada à sílica. Após sedimentação por 5 horas, foram desprezados 440mL do sobrenadante. O pH (2,0) foi
ajustado adicionando-se 600µL de ácido clorídrico PA 37% (Merck®). A solução foi separada
em frascos de cor âmbar em alíquotas de 10mL e foi autoclavada a 121°C por 20 minutos e estocada a 22°- 25°C.
4.2.3 EDTA 0,2M pH 8,0
EDTA-ácido etilenodiamino tetracético-(SIGMA®) 37,22mg
Água destilada q.s.p. 500mL
Em um bécher de 1000mL foram adicionados EDTA e 300mL de água destilada. Após homogeneização com agitador magnético, o pH (8,0) foi ajustado com NaOH. A solução foi transferida para um balão volumétrico de 500mL e ajustado o volume final. A solução foi tranferida para um frasco com tampa e conservada a 22°- 25°C.
4.2.4 Tris-HCl 0,1M pH 6,4
Tris (hidroximetil-tris-aminometano) (SIGMA®) 12,11g
Água destilada q.s.p. 1000mL
Em um bécher de 1000mL foram adicionados os reagentes, homogeneizados com
agitador magnético e ajustado o pH (6,4) com ácido clorídrico PA (Merck®). O conteúdo foi
transferido para um balão volumétrico de 1000mL, e completado o volume final. A solução foi acondicionada em frasco com tampa e conservada a 22°- 25°C.
4.2.5 Tampão L6
Isotiocianato de guanidina (Invitrogen®) 120g
Triton X-100 (SIGMA®) 2,6g
EDTA 0,2M pH 8,0 (SIGMA®) 22mL
Tris-HCl 0,1M pH 6,4 (SIGMA®) q.s.p 100mL
Em um bécher de 250mL foram adicionados os reagentes e homogeneizados com agitador magnético. A solução foi transferida para balão volumétrico de 100mL, o volume final completado e transferido para frasco âmbar, que foi conservado a 22°- 25°C.
4.2.6 Tampão L2
Isotiocianato de guanidina (Invitrogen®) 120g
Tris-HCl 0,1M pH 6,4 (SIGMA®) q.s.p. 100mL
Em um bécher de 250mL foram adicionados os reagentes e homogeneizados com agitador magnético. O conteúdo foi transferido para balão volumétrico de 100mL e o volume final completado. A solução final foi transferida para frasco âmbar e conservada a 22°- 25°C.
4.2.7 Tampão tris-boro-EDTA 10X pH 8,4 (TBE)
Tris-base (Invitrogen®) 108g
Ácido bórico (Reagen®) 55g
EDTA 0,5M pH 8, 8 (Sigma®) 40mL
Água Milli-Q q.s.p. 1000mL
Em um bécher de 2000mL foram adicionados os reagentes e homogeneizados com agitador magnético. O conteúdo foi transferido para um balão volumétrico de 1000mL, completado o volume final e transferido para frasco com vedação. A solução final foi conservada entre 2 - 4ºC.
4.2.8 Gel de agarose a 1,5%
Agarose (Invitrogen®) 1,2g
Tampão TBE 0,5 X pH 8,4 (Invitrogen®) 80mL
A agarose foi pesada e colocada em um erlenmeyer adicionados 80mL de tampão TBE 0,5X. O erlenmeyer foi levado ao forno de microondas por 1minuto (em potência alta) até que a agarose fosse dissolvida, deixando resfriar até +/- 50°C. A seguir, a agarose foi colocada na cuba de eletroforese, tendo sido evitada a formação de bolhas.
4.2.9 Solução de brometo de etídio
Brometo de etídio 10mg/mL (Invitrogen®) 15µL
Água destilada 300mL
A solução de brometo de etídio foi dissolvida em água em recipiente plástico com tampa, homogeneizada suavemente, em agitador magnético e conservada a 22°- 25°C. A incidência direta da luz foi evitada.
4.2.10 Etanol 75%
Etanol PA 75mL
Água destilada 25mL
Em uma proveta de 100mL foram adicionados 75mL de álcool e o volume final completado com a água destilada para 100mL. O conteúdo foi homogeneizado por inversão, transferido para frasco com vedação e conservado a temperatura entre 2 - 4ºC.
PREPARO DA SUSPENSÃO FECAL A 10%(Tris-HCl-Ca++) EXTRAÇÃO RNA PCR SÍNTESE DE cDNA Iniciador randômico pd(N)6 EIARA RV – AdV AMOSTRA DE FEZES PCR - AdV HAstV Genotipagem NoV (reg. D) Seqüenciamento RV-A Detecção NoV (reg. B) EGPA – RV Árvore filogenética - Seqüências no “GeneBank” qPCR TaqMan NoV
4.3 MÉTODOS
4.3.1 Fluxograma da rotina do laboratório e deste estudo.
No fluxograma 1 estão descritos a rotina dos procedimentos do LVC-LRRR e os procedimentos deste estudo.
Fluxograma 1. Fluxograma dos procedimentos laboratoriais na rotina do LVC-LRRR e os
procedimentos para as amostras do estudo.
4.3.2 Preparo da suspensão fecal
As suspensões fecais foram preparadas a 10% em tampão Tris-Ca++ 0,01 M pH 7,2,
homogeneizadas e clarificadas a 3000xg por 10 minutos a 4°C e estocados à - 20°C.
4.3.3 Extração do genoma viral
Para obtenção do RNA viral foi utilizado o método de Boom modificado (Boom et al., 1990), como descrito a seguir:
Em um tubo tipo Eppendorf® foram adicionados 800µL de tampão L6 e 400µL de
suspensão fecal a 10%. Após homogeneização em vórtex por 10 segundos, o conteúdo foi incubado a 56°C por 10 min. Foram acrescentados ao tubo 15µL de sílica, homogeneizado em vórtex por 10 segundos e o tubo foi colocado em plataforma orbital com agitação lenta por 20 minutos. A seguir, o tubo foi centrifugado a 16.000 x g por 1 minuto e o sobrenadante descartado em solução de NaOH 10N. O tubo foi vertido em papel de filtro, para secar. Foram adicionados ao tubo 500µL de tampão L2, feita homogeneização em vórtex por 10 segundos e centrifugação a 16.000 x g por 1 minuto. O sobrenadante foi descartado em solução de NaOH 10N e o tubo foi vertido em papel de filtro para secar. Foram adicionados 500 µL de etanol 70% gelado, feita homogeneização em vórtex por 10 segundos e o tubo centrifugado a 16.000 x g por 1 minuto, sendo o sobrenadante descartado e o tubo vertido em papel de filtro para secar. Foram adicionados 500µL de acetona PA gelada, feita homogeneização em vórtex por 10 segundos e o tubo centrifugado a 16.000 x g por 1 minuto, sendo o sobrenadante descartado e o tubo vertido em papel de filtro para secar. A seguir, o tubo foi levado em banho-maria a 56°C por 15 minutos, com as tampas do banho-maria e do microtubo abertas para que a sílica ficasse completamente seca. Foram adicionados ao tubo 60µL de água livre
incubado a 56°C por 15 minutos. Finalmente foi acrescentado ao tubo 1µL (40U) de inibidor
de Rnase (Invitrogen®), feita a homogeneização em vórtex por 10 segundos e o tubo foi
centrifugado a 16.000 x g por 4 min. Foram coletados 45µL do sobrenadante e o ácido nucléico viral foi estocado a -70°C.
4.3.4 Reação de transcrição reversa (RT)
A síntese do cDNA a partir do RNA extraído foi realizada utilizando-se o iniciador
randômico pd(N)6 (Amersham Biosciences®, USA). Em um Eppendorf® de 200µL foram
adicionados 4µL de dimetil sulfóxido (DMSO) a 10µL de RNA extraído. Após incubação a 97°C por 7 minutos, o tubo foi mantido em banho de gelo por 2 minutos. A seguir, foram adicionados 36µL da mistura de reagentes (Quadro 2), e o tubo foi incubado a 42°C por 1 hora, seguido de 10 minutos a 95°C. O produto foi estocado a – 20°C até o momento da PCR.
Quadro 2. Reagentes utilizados na reação da transcrição reversa para a obtenção do cDNA a
partir do RNA viral extraído.
Reagentes Concentração Volume/Reação
H2O livre de Dnase/Rnase (Invitrogen®) - 20,5µL
Tampão de PCR sem MgCl2 (Invitrogen®) 10X 5,0µL
dxtp: dATP, dTTP, dGTP, dCTP ( Invitrogen®) 2,5 mM 4,0µL
MgCl2 (Invitrogen®) 50 mM 1,5µL
RT Superscript IIITM (Invitrogen®) 200U/µL 1µL
4.3.5 Reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detecção do norovírus (região B)
O protocolo utilizado tem sido descrito como adequado para triagem das infecções por NoV, uma vez que utiliza quatro iniciadores que detectam simultaneamente os GI e GII ao amplificarem um fragmento da região conservada do gene que codifica a RpRd, denominada região B (Beuret et al., 2002; Zheng et al., 2006), como descrito a seguir:
Em um Eppendorf® de 200µL foram adicionados 5µL de cDNA em 20µL da mistura,
(Quadro 3), para volume final de 25µL. As amostras foram submetidas à desnaturação inicial
a 94ºC por 3 minutos e 40 ciclos subseqüentes de desnaturação (94oC/30 segundos),
anelamento (50oC/1 minuto), extensão (60oC/1 minuto) e um ciclo de extensão final (72oC/7
minutos), mantendo temperatura de 4°C por até 24horas. Os tubos foram colocados em
Termociclador, (Termocicler Applied Biosystems®, Foster City, CA, USA – modelo 2400).
Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese (100 volts por 1 hora) em gel de
agarose a 1,5% (Invitrogen®) conforme descrito no item 4.3.7.
Quadro 3: Reagentes utilizados na reação em cadeia da polimerase para amplificação da
região B do norovírus.
Reagentes Concentração Volume/Reação
H2O livre de Dnase/Rnase (Invitrogen®) - 14,1µL
Tampão de PCR sem MgCl2 (Invitrogen®) 10X 2,5µL
dxtp: dATP, dTTP, dGTP, dCTP ( Invitrogen®) 2,5 mM 2,0µL
MgCl2 (Invitrogen®) 50 mM 0,8µL
Taq DNA polimerase platinum (Invitrogen®) 5 U/µL 0,3µL
4.3.6 Determinação dos genótipos de norovírus pela reação em cadeia pela polimerase (PCR - região D)
Foram utilizados iniciadores (Quadro 1) para amplificação de um fragmento da região do genoma que codifica para a proteína do capsídeo (região D), segundo Vinjé etal. (2004), descrita como adequada para a posterior caracterização dos GG pelo sequenciamento desta região (Zheng et al., 2006). Como descrito a seguir:
Em um Eppendorf® de 200µL foram adicionados 10µL de cDNA em 40µL da mistura,
(Quadro 4), para volume final de 50µL. As amostras foram submetidas à desnaturação inicial à 95ºC por 3 minutos e 40 ciclos subseqüentes de desnaturação (94°C/1 minuto), anelamento
(44°C/1 minuto), extensão (72oC/1 minuto) e um ciclo de extensão final (72°C/10 minutos)
mantendo temperatura de 4°C por até 24 horas. Os tubos foram colocados no termociclador -
Termocicler Applied Biosystems®, Foster City, CA, USA – modelo 2400.
Quadro 4. Reagentes utilizados na reação em cadeia pela polimerase para amplificação da
região D do norovírus.
Reagentes Concentração Volume/Reação
H2O livre de Dnase/Rnase (Invitrogen®) - 26,20µL
Tampão de PCR sem MgCl2 (Invitrogen®) 10X 5,0µL
dXTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP ( Invitrogen®) 2,5mM 4,0µL
MgCl2 (Invitrogen®) 50mM 1,5µL
Taq DNA polimerase platinum (Invitrogen®) 5U/µL 0,3µL
Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese (100 volts por 1 hora) em
gel de agarose a 1,5% (Invitrogen®) conforme descrito no item 4.3.7. Quatro produtos
representando uma amostra do município Rio Claro, uma amostra de Piraí e duas amostras do município de Resende foram posteriormente purificadas para seqüenciamento nucleotídico.
4.3.7 Análise do produto da reação em cadeia pela polimerase
Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese (100 volts por 1 hora) em
gel de agarose a 1,5% (Invitrogen®) utilizando-se cuba Horizon 11.14 9 Life Technologies®
em tampão TBE 1X (Invitrogen®) pH 8,4. Foram aplicados em cada poço 10µL do produto da
reação somando-se a 2µL do corante azul de bromofenol (Invitrogen®). Como referência para
o tamanho do amplicon utilizou-se um padrão de tamanho molecular de 100pb ou 50pb
(Invitrogen®). O gel foi submerso em solução de brometo de etídio (Sigma Chemical
Company®) 0,5µg/ml por 20 minutos. Os “amplicons” foram visualizados em
transiluminador de luz ultravioleta (Labnet®). A imagem foi registrada em sistema de captura
de imagem “BioImaging Systems®”utilizando o programa Labworks 4.0. Foram consideradas
positivas as amostras que apresentaram fragmentos amplificados de 213 pares de bases para região B e 253 pares de base para região D.
4.3.8 Purificação do amplicon obtido
Os produtos amplificados foram purificados com o kit comercial “QIAquick® PCR
Purification Kit” (QIAGEN®, Valencia, CA, USA), seguindo as recomendações do fabricante.
Após a purificação, os “amplicons” foram quantificados em gel de agarose a 2% por
4.3.9 Reação de seqüênciamento e purificação da reação
Para o seqüenciamento direto dos produtos amplificados e purificados foi utilizado o
kit comercial “Big Dye Terminator® v 3.1 Cycle Sequencing Kit” (Applied Biosystems®, CA,
USA), conforme recomendado pelo fabricante (Quadro 5). Foram utilizados os mesmos iniciadores da reação de amplificação genômica da região D. Os produtos da reação de
seqüência foram purificados com as colunas CENTRI-SEP® (Princeton Separations®, CA,
USA) conforme orientação do fabricante. O seqüenciador automático ABI Prism 3100
(Applied Biosystems®) foi utilizado e os eletroferogramas obtidos foram analisados.
Quadro 5. Reagentes utilizados na reação de seqüenciamento.
Reagente Volume/Reação
DNA (25ng) 2-10µL
Tampão de seqüenciamento (Invitrogen®) (5X) 2µL
Big Dye (Invitrogen®) 2µL
Iniciadores CAP C /D1/D3 (1 iniciador por tubo de reação) 2µL
H2O livre de Dnase/Rnase (Invitrogen®) q.s.p. 10 - 20µL
4.3.10 Análise filogenética das seqüências da região D
O “BioEdit Sequence Alignment Editor” (Hall, 1999) foi o programa utilizado para edição e alinhamento das seqüências obtidas.
A análise filogenética das seqüências foi realizada utilizando o programa MEGA2 versão 2.1 (Kumar et al., 2001) e a distância genética calculada pelo modelo Kimura 2-parâmetros, utilizando o método “neighbor-joining” com “bootstrap” de 2000 réplicas. Para
esta análise foram utilizadas as seqüências dos protótipos dos diferentes genótipos GII NoV, as quatro seqüências representando os municípios do estudo, as duas seqüências do município
de Carmo, pertencente ao estado do Rio de Janeiro. (Portal Entrez Pubmed – GenBank
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db =Nucleotide&itool=toolbar)
4.3.11 Reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qPCR)
Foi utilizado o protocolo descrito por Kageyama et al.(2003) adaptado para o aparelho
ABI 7500 (Applied Biosystems®, USA). O protocolo utiliza iniciadores específicos para NoV
GII, amplificando a seqüência da junção da ORF1-ORF2, região mais conservada do genoma entre os NoVs (Quadro 1).
As amostras foram aplicadas em duplicatas em uma microplaca de 96 cavidades
(MicroAmp®, Applied Biosystem, Foster City, Califórnia, EUA), contendo 20µL da mistura
e 5 µL do cDNA (Quadro 6) para volume final de 25µL. Inicialmente as amostras foram submetidas à temperatura de 50ºC por 2 minutos e posteriormente seguido por desnaturação à 95ºC por 10 minutos e 45 ciclos subseqüentes de desnaturação (95°C/15 segundos) e ciclo de anelamento e extensão (56°C/1 minuto).
Os dados de amplificação e quantificação foram coletados e analisados no software
Sequence Detector versão 1.6 (Applied Biosystems®). Em cada reação, foi gerada uma curva
padrão especifica para NoV GII pela adição de 5 µL da diluíção seriada (1:10) do plasmídeo
recombinante purificado contendo o inserto de NoV GII nas concentrações de 107 a 101
cópias cDNA/reação. A curva apresentou “threshold cycle” (Ct) 36.88 para a diluição 101 e o
método apresentou um limite de detecção de 10 cópias de cDNA por reação.
Quadro 6: Reagentes utilizados na reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qPCR).
Reagente Volume/Reação
H2O livre de Dnase/Rnase (Invitrogen®) 3,875µL
Taq Man ® Universal PCR Master MIX(Invitrogen®) 12,5µL
Iniciadores COG 2F [10µM] 1,5µL
Iniciadores COG 2R [10µM] 1,5µL
Sonda RING2 [10µM] 0,625µL
