Imunologia 2ª parte. Aplicações práticas (alguns exemplos) Técnicas laboratoriais para diagnóstico e monitorização. das imunodeficiências primárias:

Imunologia – 2ª parte

• Aplicações práticas (alguns exemplos)

– Técnicas laboratoriais para diagnóstico e

monitorização

• da doença alérgica

• da doença alérgica

• das imunodeficiências primárias:

– Técnicas que avaliam as proteínas antigénicas

(alergenos) na doença alérgica

Testes que avaliam os componentes

humoral e celular do SI

Imunologia – 2ª parte

– Avaliação da resposta humoral:

• Doseamento de imunoglobulinas

– IgE total e IgE específicas

– IgG e subclasses: IgG

₁

, IgG

₂

, IgG

₃

, IgG

₄

– IgA

– IgM

Interacção

– IgM

– Avaliação da resposta celular:

• Subpopulações linfocitárias

• Proliferação linfocitária (TTL)

• Basotest

• CAST

Interacção antigénio-anticorpo Anticorpos monoclonais Imunofluorescência

Interacção antigénio-anticorpo

Base dos métodos imunoquímicos para quantificação de Ag/Ac.

Baseia-se na lei de acção das massas – em que o Ag livre e o Ac livre interagem reversivelmente para formar complexo ag-ac.

Constante de equilíbrio ou afinidade - Ka Constante de equilíbrio ou afinidade - Ka

Ka=k1/k2= (Ag-Ac)/(Ag)(Ac)

Aumento das concentrações de antigénio adicionadas a uma quantidade fixa de anticorpo

Anticorpos monoclonais

•

Anticorpos produzidos apenas por um

clone de células

– Especificidade – Reprodutibilidade

•

Identificação e doseamentos

•

Identificação e doseamentos

– Diagnóstico

• Humoral

• Fenotipagem celular / contagem

– Quantificação de proteínas em amostras

•

Terapêutica

– Anti-neoplásica

– Anti-inflamatória

– Outras

Imunofluorescência directa e indirecta

Extensivamente utilizada para

detecção de anticorpos e

antigénios

Anticorpos

proteínas estáveis, facilmente

marcadas com radioisótopos,

Avaliação da resposta humoral:

• 1º Immunoassay:

RIA – radioimmunoassay

Berson and Yalow

Prémio Nobel da Medicina, 1960

•

Immunometric assays

•

Immunometric assays

• enzime-coupled (detection) antibody

• solid-phase (capture) antibody

Minimiza as ligações não específicas

pelas lavagens consecutivas e

maximiza a especificidade pela

utilização dos anticorpos de captura e

detecção específicos para a

Teste

O que mede

Cut-off

IgE Total

Totalidade da IgE sérica

Varia com a idade

Avaliação da resposta humoral:

Testes Laboratoriais IgE

IgE Específica Rast

Totalidade da IgE específica a

um alergénio

>0,35KUa/l

Multi-Rast

IgE específica a cinco

alergénios do mesmo grupo

>0,35KUa/l

Phadiatop

IgE específica a alergénios de

IgE Total

Ac anti-IgE

marcado

IgE sérica

IgE Específica

Rast

Fase sólida com Ac anti-IgE

Multi-Rast

Phadiatop

Técnicas que avaliam as proteínas antigénicas

(alergenos) na doença alérgica

Amostras separadas em gel

↓

Transferência para membrana de nitrocelulose

↓

Incubação com anticorpo especifico Incubação com anticorpo especifico

↓

Conjugação com marcador radioactivo

para detecção do anticorpo

↓

Bandas com anticorpo são visíveis após

Rabo de Gato

Phleum Pratense

Extracção

Rabo de Gato

Phleum Pratense

Extracção

Phleum Pratense

Evolução no diagnóstico em alergologia

Tecnologia de DNA recombinante Caracteriza alergenos importantes

a nível molecular

Diagnóstico baseado nos extractos • Identifica a fonte alergénica

• Não revela as moléculas relevantes para expressão da doença

Clin Exp. Allergy 2003; 7-13

para expressão da doença

Os alergenos major das fontes alergénicas mais frequentes

foram identificadas e produzidas de forma recombinante

Ex. pólenes, ácaros, epitélios, fungos e venenos

•poly-(A) Allergy-eliciting biological material mRNA extraction •poly-(A) •poly-(A) •poly-(A) •poly-(A) •poly-(A)

cDNA synthesis, cloning and selection of cDNA clones encoding

individual allergenic proteins

Alergénios recombinantes - técnica

Standard Allergen ImmunoCAP Extraction, Immobilization on solid phase Recombinant Allergen ImmunoCAP

Production of recombinant allergens, Immobilization on solid phase

Standardization and research reagents

Allergograma (Phleum pratense)

A l l e r g o g r a m g 6 A 11 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 3 0 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 3 7 3 8 3 9 4 0 4 1 4 2 4 3 4 4 4 5 L a n e N a m e - > M a t c h N a m e 27 6 1 3 , 1 / 4 1 5 1 7 4 1 8 6 7 4 2 0 0 9 7 2 3 4 7 1 2 3 4 7 4 2 5 7 3 0 2 7 3 6 1 1 4 3 3 8 , ½ 1 5 1 7 3 , ½ 2 0 1 1 1 , ½ 2 3 3 6 5 , ½ 2 3 9 9 1 , ½ 2 6 5 8 9 , ½ 2 7 2 6 6 , ½ 2 7 7 0 3 , ½ 2 8 5 3 8 , ½ 2 0 2 2 8 , 1 / 3 2 3 3 6 4 , 1 / 3 2 5 5 8 5 , 1 / 3 2 7 0 6 4 , 1 / 3 2 8 5 4 3 , 1 / 3 2 3 3 6 6 ,l 1 /4 2 7 4 1 6 , 1 / 4 9 7 1 3 , 1 /5 1 1 5 6 8 , 1 /5 1 4 3 3 0 , 1 / 5 1 4 3 4 7 , 1 / 5 1 5 8 3 9 , 1 / 5 1 8 0 1 3 , 1 / 5 2 5 9 8 6 , 1 / 5 2 5 5 8 2 , 1 / 7 2 7 7 3 0 , 1 / 7 2 1 7 5 7 , 1 / 8 2 7 2 6 7 , 1 / 8 1 5 1 4 5 , 1 / 1 0 2 0 2 0 4 , 1 / 1 0 2 7 8 4 7 , 1 / 1 1 2 7 8 2 1 , 1 / 1 2 2 7 6 6 4 , 1 / 1 3 2 8 5 3 7 , 1 / 1 3 2 7 3 6 6 , 1 / 1 5 2 7 3 9 4 , 1 / 1 5 1 2 8 1 6 , 1 / 2 0 2 3 6 2 1 0 1 8 1 1 7 6 1 6 8 1 5 7 1 4 7 1 2 6 1 2 0 1 1 7 1 1 5 1 0 4 1 0 0 8 7 , 2 8 3 8 0 7 7 7 3 , 8

Rabo de Gato

Phleum Pratense

7 3 , 8 7 2 6 8 , 6 6 3 , 1 5 6 , 4 5 4 , 1 5 3 4 5 4 3 3 9 3 8 , 1 3 5 , 7 3 3 , 6 3 2 2 9 2 7 , 3 2 5 , 4 2 3 2 2 , 4 2 1 , 3 1 8 , 8 1 7 1 6 , 3 1 5 1 4 1 2 , 8 1 2 1 0 c o u n t 1 2 6 9 1 1 1 1 5 5 1 4 9 7 5 1 2 3 3 8 3 4 3 1 2 4 5 3 9 5 6 1 0 1 1 7 6 5 6 6 1 3 1 4 5 7 1 5 6 4 4 7 5 7 6 % 2 7 1 3 2 0 2 4 2 4 1 1 1 1 3 1 2 0 1 6 1 1 2 7 7 7 1 8 7 9 7 2 7 9 1 1 7 2 0 1 1 1 3 2 2 2 4 1 6 1 3 1 1 1 3 1 3 2 9 3 1 1 1 1 6 3 3 1 3 9 9 1 6 1 1 1 6 1 3

•Phl p1

•Phl p5

Phleum Pratense

Diagnóstico in vitro de alergia

Diagnóstico in vitro da alergia (Presente)

GAILL-2003

Diagnóstico in vitro de alergia

alergénios recombinantes

kU /lA kU /lA kU /lA kU /lA kU /lA kU /lA GAILL-2003

Valenta,R. et all, Clinical Experimental Allergy, 1999, vol 29, 896-904

“MICROARRAY” de alergénos: técnica

• Cada placa apresenta 800 de spots para diferentes alergenos

• Até 12 soros diferentes podem ser testados simultaneamente, com 15µL de soro diluído • IgE é detectada com anti-IgE marcada com fluorocromo

Clin Exp. Allergy 2003; 7-13

• Microarray scanner

↓

• Microarray software analysis

↓

Perfil de reactividade do

doente atópico

Imunologia – 2ª parte

– Avaliação da resposta humoral:

• Doseamento de imunoglobulinas

Interacção antigénio-anticorpo

Anticorpos

– Avaliação da resposta celular:

• Subpopulações linfocitárias

• Proliferação linfocitária (TTL)

• Basotest

• CAST

Anticorpos monoclonais Imunofluorescência Citometria de fluxo

Avaliação da resposta celular:

Leucócitos do sangue periférico

Avaliação da resposta celular:

Avaliação da resposta celular:

Avaliação da resposta celular:

Avaliação da resposta celular:

Avaliação da resposta celular:

Avaliação da resposta celular:

Subpopulações linfocitárias – citometria de fluxo

M1

Estudo da proliferação linfocitária:

Teste de transformação linfocitária (TTL)

•

Detecção de linfócitos sensibilizados a um antigénio, avaliando a

sua resposta proliferativa quando em presença desse antigénio

•

Aplicações:

•

Aplicações:

– Avaliação da resposta imunitária a um antigénio

• Estudo de imunodeficiências

– Mitogénios

– Candida albicans

– Avaliação de reacções de hipersensibilidade

• Fármacos

•

Técnica:

– Separação de células mononucleadas (gradiente de densidade - ficoll) – Distribuição por poços

– Estimulação com o antigénio em estudo (fármacos – várias concentrações) – Controlos positivo e negativo

Estudo da proliferação linfocitária:

Teste de transformação linfocitária (TTL)

– Controlos positivo e negativo – Cultura vários dias

– Adição de radionuclido (timidina tritiada) – Avaliação da resposta proliferativa –

incorporação do radionuclido (contador de cintilações)

– Cálculo do indice de estimulação – razão entre a resposta das culturas estimuladas e não estimuladas (controlo negativo)

TESTE DE ACTIVAÇÃO DE BASÓFILOS

marcador directo de

activação celular

Após exposição

CD 63 /

CD 203c

marcador indirecto

de libertação de histamina

Apresenta boa sensibilidade e especificidade

B

Dupla marcação Anti-IgE/CD203c Após exposição ao alergeno a expressão aumenta até 300%

TESTE DE ACTIVAÇÃO DE BASÓFILOS

CITOMETRIA DE FLUXO

•

Apreciação de reacções IgE mediadas

• Determinação da percentagem de

basófilos activados

• Estimulação “in vitro” com alergénios • Estimulação “in vitro” com alergénios

específicos

• Boa correlação com outros testes “in

vitro” e “in vivo”

• Sangue heparinizado, CN e CP,

incubação com o alergeno (diferentes concentrações), incubação com ac monoclonais, leitura no citómetro

TESTE DE ACTIVAÇÃO DE BASÓFILOS

•

Limitações

– Utilização de fármacos em forma injectável ou liofilizados solúveis em solução tampão

•

É sempre necessária a correlação com os dados clínicos para uma

interpretação correcta dos resultados e apreciação critica e

SPAIC-OUTUBRO /2003

interpretação correcta dos resultados e apreciação critica e

objectiva dos mesmos

•

Pode ser útil como diagnóstico complementar em doentes com

história de HS a fármacos

TESTE CELULAR DE ESTIMULAÇÃO

ANTIGÉNICA - CAST

•

São quantificados os sulfidoleucotrienos: LTC

₄

, LTD

₄

, LTE

₄

nos

leucócitos após contacto destes com o alergénio

•

A libertação destes mediadores pode ser devida a mecanismos

mediados ou não por IgE

• Disponível para – Antibióticos: – Antibióticos:

• Penicilina, Ampicilina /Amoxicilina • Cefalosporina, Cefuroxime

• Trimethoprim, Sulfametoxazol • Tetraciclina

• Ciprofloxacina

– Analgésicos:

• Aspirina, Diclofenac, Ibuprofeno, Indometacina • Paracetamol, Metamizol

– Anestésicos – Miorelaxantes

1. Antigen Stimulation

Whole-blood Dextran sedimentation Transfer leukocytes, centrifuge,

Cellular Antigen Stimulation Test

Cellular Antigen Stimulation Test

A A A sLT sLT sLT A A A Whole-blood EDTA Dextran sedimentation and 90 minutes incubation

Transfer leukocytes, centrifuge, remove/discard upper phase

+ stimulation buffer (IL-3)

Leukocyte suspension, +

antigen (40 min incubation) Supernatants can be harvested,

after centrifugation store at - 20 °C until ELISA test

A

A A

+ Antigen

2. ELISA-Procedure

2 h incubation, wash 3 times sLT sLT _Enzym Enzym sLT

Cellular Antigen Stimulation Test

Cellular Antigen Stimulation Test

Supernatant + monoclonal antibody wash 3 times + substrate + stop-solution Reading at 405 nm sLT Enzym Color 30 min incubation, wash 3 times

Imunologia – 2ª parte

– Avaliação da resposta humoral:

• Doseamento de imunoglobulinas

– IgE total e IgE específicas

– Técnicas que avaliam as proteínas

Interacção antigénio-anticorpo

Anticorpos – Técnicas que avaliam as proteínas

antigénicas (alergenos) na doença alérgica

– Avaliação da resposta celular:

• Subpopulações linfocitárias • Proliferação linfocitária (TTL) • Basotest • CAST Anticorpos monoclonais Imunofluorescência Citometria de fluxo