UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
LARISSA RODRIGUES SANTANA
PAPEL DA HIPERPROLACTINEMIA E CLORIDRATO DE PIRIDOXINA NA EXPRESSÃO DE MEDIADORES HORMONAIS NO ÚTERO DE CADELAS COM
PSEUDOCIESE
ILHÉUS – BAHIA 2021
LARISSA RODRIGUES SANTANA
PAPEL DA HIPERPROLACTINEMIA E CLORIDRATO DE PIRIDOXINA NA EXPRESSÃO DE MEDIADORES HORMONAIS NO ÚTERO DE CADELAS COM
PSEUDOCIESE
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal
Área de concentração: Clínica e Sanidade Animal
Orientador(a): Profª. Drª. Paola Pereira das Neves Snoeck
Co-Orientador: Profº Drº Juneo Freitas Silva
ILHÉUS – BAHIA 2021
III LARISSA RODRIGUES SANTANA
PAPEL DA HIPERPROLACTINEMIA E CLORIDRATO DE PIRIDOXINA NA EXPRESSÃO DE MEDIADORES HORMONAIS NO ÚTERO DE CADELAS COM
PSEUDOCIESE
Ilhéus – BA, 25/02/2021
___________________________________ Paola Pereira das Neves Snoeck – DSc
UESC/DCAA (Orientador)
___________________________________ Juneo Freitas Silva – DSc
UESC/DCAA (Co-Orientador)
___________________________________ Renata Santiago Alberto Carlos - DSc
UESC
___________________________________ Marcelo Rezende Luz - DSc
UFMG
ILHÉUS – BAHIA 2021
AGRADECIMENTOS
À Deus, por ser a força maior que rege minha vida, me guiando e dando forças em todos os momentos.
A minha família, em especial minha mãe Simone, por ser o meu porto seguro, sempre de prontidão para dar incentivos e bons conselhos, ao meu pai Jailton, por apoiar meu objetivo, aos meus avós Nilza e William, que sempre acreditaram na força dos estudos e por todo carinho que sentem por mim, a minha prima Laís, que enfrentou o mestrado junto comigo e passou por todas alegrias e tristezas de uma pós-graduação, foi meu ombro amigo, presente nas horas de estudos, nas renúncias de finais de semana, mas vencemos. A minha irmã, que mesmo longe esteve comigo nessa caminhada, comemorando cada progresso. Aos tios e primos, pela paciência e compreensão de minha ausência em certos momentos, mas sempre tinham palavras de motivação, sou grata a cada um de vocês.
A minha orientadora, Profa. Paola Snoeck, primeiramente pela confiança e pela oportunidade em buscar conhecimento sobre a reprodução animal desde a época de iniciação científica, pelos conselhos, por toda a paciência, pelos ensinamentos sobre a vida acadêmica, por incentivar e dar sempre o melhor naquilo que faz, é para mim uma fonte de inspiração e determinação.
Ao meu co-orientador Prof. Juneo, por ser tão solícito e por transmitir tantos conhecimentos durante todo esse período, por toda paciência durante a fase experimental, agradeço imensamente pela orientação. É um grande exemplo de profissional.
Ao meu colega de equipe William Morais Machado, uma pessoa incrível sempre a postos para ajudar, foi de grande importância sua participação nesse processo, obrigada pelas horas de estudo, por todos os artigos lidos, pelas palavras que mesmo duras eram sinceras, pela companhia dos trabalhos desenvolvidos, sou muita grata por sua amizade. A minha outra colega de equipe Maíra Kersul, por ser parceira de disciplinas e seminários e por ter enfrentado esses momentos junto comigo.
Agradeço de forma muito especial, aos meus colegas Raquel Viera Niella e Luciano Cardoso, por serem meu ponto de apoio desde o primeiro ano do mestrado, pelos estudos nas provas de estatística, as avaliações dos seminários e as horas
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incomputáveis de padronização da nossa amada imunohistoquímica, com certeza vocês tornaram tudo isso mais leve, serei eternamente grata por tudo que aprendi. Agradeço aos funcionários do Hospital Veterinário da UESC, em especial Ivo do Laboratório de Patologia Animal, por sua disponibilidade em ajudar com a confecção de lâminas e a Jamile, do Centro de Microscopia Eletrônica, auxiliando na utilização de equipamentos e preparo de reagentes.
Por fim, agradeço ao Programa de Pós-graduação em Ciência Animal da Universidade Estadual de Santa Cruz pela oportunidade em desenvolver a pesquisa e a FAPESB pelo financiamento de bolsa de estudo.
PAPEL DA HIPERPROLACTINEMIA E CLORIDRATO DE PIRIDOXINA NA EXPRESSÃO DE MEDIADORES HORMONAIS NO ÚTERO DE CADELAS COM
PSEUDOCIESE
RESUMO
A pseudociese, também conhecida como pseudogestação é caracterizada como uma síndrome, em que cadelas não castradas apresentam sinais clássicos de peri e pós-parto. Os sinais clínicos vão desde alterações comportamentais, perda de apetite, perda de peso, vômito até o sinal mais evidente que é o aumento das glândulas mamárias e secreção de leite. A secreção láctea está relacionada com a redução dos níveis de progesterona plasmática associada ao aumento de prolactina. A prolactina exerce importante papel nas funções reprodutivas, no entanto, o excesso dessa substância está associado a alterações na fertilidade tanto em animais quanto em humanos, pela inibição da kisspeptina, peptídeo essencial para a reprodução, bloqueando o eixo hipotalâmico-hipofisário-gonadal (HPG). Para o tratamento farmacológico, as substâncias mais indicadas são os inibidores de prolactina, agonistas dopaminérgicos, a cabergolina e a bromocriptina. Uma alternativa terapêutica segura, capaz de reduzir os quadros de hiperprolactinemia em cadelas pseudogestantes é a vitamina B6 (cloridrato de piridoxina). Tanto os efeitos da hiperprolactinemia quanto do cloridrato de piridoxina sobre a expressão de mediadores hormonais no útero ainda é desconhecido. Acredita-se que a infertilidade causada pela hiperprolactinemia seja, além de origem central, no eixo HPG, como também de ação periférica, particularmente no útero. Nesse sentido, objetivou-se avaliar o efeito da hiperprolactinemia e do cloridrato de piridoxina na expressão de receptores de progesterona, estrógeno, andrógeno, hormônio tireoidiano, kisspeptina e KISS-1R, através da imunohistoquímica pela técnica da estreptavidina-biotina-peroxidase no útero de cadelas pseudogestantes. Foram utilizados fragmentos uterinos de 18 cadelas, divididos em três grupos: 1) controle não tratado, 2) tratado com cloridrato de piridoxina (50 mg/kg/dia; n=6) e 3) tratado com cabergolina (5µg/kg/dia; n=6). As cadelas com pseudogestação foram tratadas por 20 dias, submetidas a cirurgia de ovário-salpingo-histerectomia e os fragmentos uterinos foram fixados em formaldeído a 10% por 24 horas e depois processados pela técnica de inclusão em parafina. Avaliou-se a expressão de marcação nas regiões de epitélio endometrial, glândulas profundas e miométrio. A expressão de receptores de progesterona é maior em glândula profunda e miométrio nos grupos tratados (P <0,05). A expressão de receptores de estrógeno e KISS-1R é fraca nas regiões uterinas em todos grupos estudados (P > 0,05). Percebe-se expressão fraca ou nula de receptores de andrógeno em glândula profunda e miométrio nos grupos tratados (P < 0,001), resposta inversa a observada para progesterona. Nota-se expressão fraca de TRα no grupo tratado com piridoxina em todas as regiões uterinas (P < 0,001) e expressão fraca de kisspeptina na superfície epitelial no grupo tratado com cabergolina.
Palavras-chave: Imunohistoquímica. Prolactina. Pseudogestação. Vitamina B6. Canis familiaris.
ROLE OF HYPERPROLACTINEMIA AND PYRIDOXINE HYDROCHLORATE IN THE EXPRESSION OF HORMONAL MEDIATORS IN THE UTERUS OF CANINE
FEMALE WITH PSEUDOCIESE.
ABSTRACT
Pseudocyesis, also known as pseudogestation, is characterized as a syndrome, in which non-castrated bitches show classic signs of peri and postpartum. The signs range from behavioral changes, loss of appetite, weight loss, vomiting to the most obvious sign that the mammary glands are enlarged and milk is secreted. Milk secretion is related to the reduction in plasma progesterone levels associated with increased prolactin. Prolactin plays an important role in reproductive functions, however, the excess of this substance is associated with changes in fertility in both animals and humans, by inhibiting kisspeptin, a peptide essential for reproduction, blocking the hypothalamic-pituitary-gonadal axis (HPG ) For pharmacological treatment, the most suitable substances are prolactin inhibitors, dopaminergic agonists, cabergoline and bromocriptine. A safe therapeutic alternative capable of reducing hyperprolactinemia in pseudo-pregnant dogs is a vitamin B6 (pyridoxine hydrochloride). Both the effects of hyperprolactinemia and pyridoxine hydrochloride on the expression of hormonal mediators in the uterus are still unknown. It is believed that the infertility caused by hyperprolactinemia is not only central in the HPG axis, but also of peripheral action, particularly in the uterus. In this sense, the objective was to evaluate the effect of hyperprolactinemia and pyridoxine hydrochloride on the expression of progesterone, estrogen, androgen receptors, thyroid hormone, kisspeptin and KISS-1R, through immunohistochemistry by streptavidin-biotin-peroxidase in the uterus in pseudostatic bitches. Uterine fragments of 18 dogs were used, divided into three groups: 1) untreated control, 2) treated with pyridoxine hydrochloride (50 mg / kg / day; n = 6) and 3) treated with cabergoline (5µg / kg / day ; n = 6). Pseudogestation bitches were treated for 20 days, submitted to ovarian-salpingo-hysterectomy surgery and the uterine fragments were fixed in 10% formaldehyde for 24 hours and then processed using the paraffin inclusion technique. Marking expression is frequent in the regions of endometrial epithelium, deep glands and myometrium. The expression of progesterone receptors is greater in the deep gland and myometrium in the treated groups (P <0.05). An expression of estrogen receptors and KISS-1R is weak in the uterine regions in all groups studied (P> 0.05). The perception of weak or null expression of androgen receptors in the deep gland and myometrium in the treated groups (P <0.001), an inverse response to that observed for progesterone. There is a weak expression of TRα in the group treated with pyridoxine in all uterine regions (P <0.001) and a weak expression of kisspeptin on the epithelial surface in the group treated with cabergoline.
Keywords: Immunohistochemistry. Prolactin. Pseudogestation. Vitamin B6. Canis familiaris.
IX LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Expressão proteica de PR no útero de cadela com pseudogestação em
diferentes regiões ... 21
Figura 2 - Expressão proteica de ERα no útero de cadela com pseudogestação em
diferentes regiões ... 22
Figura 3 - Expressão proteica de AR no útero de cadela com pseudogestação em
diferentes regiões ... 23
Figura 4 - Expressão proteica de TRα no útero de cadela com pseudogestação em
diferentes regiões ... 24
Figura 5 - Expressão proteica de kisspeptina no útero de cadela com
pseudogestação em diferentes regiões ... 25
Figura 6 - Expressão proteica de KISS1R no útero de cadela com pseudogestação
LISTA DE TABELAS
XI SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 12 2.1 OBJETIVOS ... 13 2.1.1 GERAL ... 13 2.1.2 ESPECÍFICOS... 13 3.1 Histologia Uterina ... 14
3.2 Ciclo estral das fêmeas caninas ... 15
3.3 Pseudogestação ... 16 3.4 Mediadores hormonais ... 17 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 19 4.1 Processamento histopatológico ... 19 4.2 Imunohistoquímica ... 19 5 RESULTADOS ... 21
5.1 Perfil de PR no útero de cadelas com pseudogestação ... 21
5.2 Perfil de ER no útero de cadelas com pseudogestação ... 22
5.3 Perfil de AR no útero de cadelas com pseudogestação ... 22
5.4 Perfil de TRα no útero de cadelas com pseudogestação ... 23
5.5 Perfil de kisspeptina no útero de cadelas com pseudogestação ... 24
5.6 Perfil de KISS1R no útero de cadelas com pseudogestação ... 25
6 DISCUSSÃO ... 27
6.1 Receptor de progesterona ... 27
6.2 Receptor de Estrógeno alfa ... 28
6.3 Receptor de Andrógeno ... 28
6.4 Receptor de Hormônio Tireoidiano alfa ... 30
6.5 Kisspeptina/KISS1R ... 31
7 CONCLUSÕES ... 33
1 INTRODUÇÃO
Alterações na fertilidade das cadelas geralmente estão associadas a falha na monta, alterações morfológicas, desordens ovarianas e/ou uterinas (Cardoso. 2012).
Um dos distúrbios que acometem cadelas adultas não castradas é a pseudogestação. Segundo Martins e Lopes (2005), essa é uma condição fisiológica apresentada por toda cadela não prenha, porém quando há presença de sintomas ou alterações físicas semelhantes as que acontecem em cadelas gestantes é denominada pseudogestação clínica ou manisfesta.
Os sinais iniciais são alterações do comportamento da fêmea, como inquietação, agressividade, preparação de ninho e adotar objetos (Gobello et al., 2001). Vômito, diarreia, poliúria, polidipsia, contrações abdominais também podem ser relatados, no entanto o sinal mais evidente é a hiperplasia mamária e a produção de leite (Root et al., 2018). Estudos indicam que é necessário um período longo de exposição de progesterona para que ocorra sensibilidade da glândula mamária e posteriormente uma queda nos níveis de progesterona com aumento nas concentrações de prolactina para resultar na pseudogestação.
Os esteróides sexuais (estrogênios, progestágenos e androgênios) têm sido tradicionalmente usados para tratar a pseudogestação, mas os efeitos colaterais geralmente superam os benefícios desses medicamentos (Gobello et al., 2002). Os tratamentos com agonistas seletivos (cabergolina) e não-seletivos (bromocriptina) de dopamina e antagonistas serotoninérgicos (metergolina) são os mais indicados (Martins e Lopes, 2015). Foi demonstrado por Silva (2017) que a utilização de cloridrato de piridoxina (50mg/kg/dia) foi capaz reduzir os níveis de prolactina e de reverter quadros de secreção láctea em cadelas pseudogestantes, sendo uma substância segura e viável como tratamento alternativo.
Sabe-se que o cloridrato de piridoxina possui um efeito dopaminérgico a nível de sistema nervoso central, sobre o hipotálamo, inibindo a síntese e/ou secreção de prolactina, no entanto seu efeito a nível periférico principalmente em útero ainda é pouco conhecido.
Além de progesterona e estrógeno, outro hormônio que desempenha papel de grande importância na reprodução é a kisspeptina. A kisspeptina é bem conhecida por seu papel indispensável na regulação da reprodução, principalmente por
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controlar a liberação de GnRH no nível hipotalâmico. As pesquisas recentes demonstraram que a kisspeptina e o receptor da kisspeptina são expressos no ovário e útero, indicando uma função local adicional na reprodução no nível extra-hipotalâmico (TANYAPANYACHON et al., 2018).
A partir disso, o estudo da expressão de mediadores hormonais uterinos pode ser de grande importância para elucidar outros mecanismos de ação da vitamina B6, assim como a hiperprolactinemia no útero de cadelas pseudogestantes.
2.1 OBJETIVOS
2.1.1 GERAL
Avaliar o efeito da hiperprolactinemia e do cloridrato de piridoxina na expressão de receptores hormonais no útero de cadelas com pseudociece.
2.1.2 ESPECÍFICOS
Avaliar a expressão proteica de receptores de progesterona, estrógeno, andrógeno, hormônio tireoidiano, kisspeptina e Kiss1R em cadelas com pseudociese e aumento nas concentrações séricas de prolactina, tratadas com cloridrato de piridoxina e cabergolina.
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Histologia Uterina
O sistema reprodutor feminino é formado pelos ovários, tubas uterinas, útero, cérvix, vestíbulo e vagina.O útero é um órgão tubular responsável pelo desenvolvimento embrionário e gestação. Possui três camadas distintas, endométrio, miométrio e periométrio (Apparício e Vicente, 2015).
O endométrio é constituído por uma mucosa e possui epitélio prismático simples. São secretadas substâncias como muco, lipídios, glicogênio e proteínas, oriundos dos epitélios de revestimento e glandular. As glândulas se estendem para a lâmina própria submucosa, compostas por tecido conectivo frouxo hiperplásico onde estão presentes grande quantidade de células de defesa, as mononucleares e polimorfonucleares (BANKS, 1992).
Um estudo investigando alterações morfológicas no epitélio endometrial de cadelas, concluiu que no diestro em estágios iniciais e intermediários, devido aos altos níveis de progesterona, ocorre formação de criptas por protrusões no lúmen uterino e são revestidas por epitélio colunar simples (Galabova et al 2003). O útero das cadelas é desprovido de glândulas endometriais ao nascimento, seu desenvolvimento ocorre o período pós natal até os seis meses de vida. Foi observada a presença de glândulas endometriais aos 15 dias após o nascimento e após 60 dias o útero canino apresenta conformação de um animal adulto (Ramos et al., 2015).
O miométrio tem a função de contratilidade e expansão uterina no período gestacional. Possui uma espessa camada de fibras musculares lisas, e se divide em uma camada circular interna e uma camada longitudinal externa que sofrem hipertrofia e hiperplasia durante a gestação. (MARTINS, 2013).
O perimétrio é formado por tecido conectivo frouxo e possui uma cobertura com mesotélio peritoneal. Estão presentes também, células musculares lisas, fibras nervosas além de inúmeros vasos linfáticos e sangüíneos nesta camada (PRIEDKALNS, 1982).
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3.2 Ciclo estral das fêmeas caninas
O ciclo estral é mediado por mecanismos hormonais e neuroendócrinos, em especial pelos hormônios hipotalâmicos, esteróides de origem ovariana e hipofisária. (DIAGONE, 2005). O ciclo estral canino é dividido em fase folicular (proestro), fase luteínica (estro/diestro) e quiescência (anestro)(SILVA, 2017).
O proestro possui duração média de 9 dias, podendo variar entre 3 a 21 dias. Neste período pode ou não ocorrer o aparecimento de uma descarga vaginal hemorrágica, ocasionada pela diapedese eritrocitária por meio do endométrio e rompimento capilar subepitelial (CONCANNON, 2011).
Nesta fase, a fêmea apresenta a edema e hipertrofia de vulva, a cérvice dilatada, o endométrio espessado, além de ocorrer aumento na atividade glandular e no crescimento dos ductos e túbulos da glândula mamária. Nesta fase, a sinalização endócrina mais importante é constante aumento dos níveis de estradiol sérico (Oliveira et al., 2003). O aumento dos níveis de progesterona ocorre em torno de quatro dias antes do início do estro, coincidindo com a queda de estrógeno devido à luteinização pré-ovulatória, ocorrendo um intenso aumento mais intenso de progesterona após a ovulação (Carvalho et al., 2020).
O estro é caracterizado pela mudança comportamental da cadela, tornando-se mais receptiva ao macho. Este é o período em que as concentrações plasmáticas de estrógeno reduzem e de progesterona aumentam, atingindo a níveis acima de 1 a 3 ng/mL durante o pico préovulatório de LH. A duração dessa fase varia de 5 a 9 dias, ocorre redução no edema e na secreção vaginal (CONCANNON, 2011).
A ovulação ocorre de 24 a 48 horas após pico pré-ovulatório de LH. Nas cadelas, diferente de outras espécies, os ovócitos são liberados ainda imaturos, sendo necessário de 24 a 96 horas para realizarem a maturação completa. Outra particularidade das caninas é a formação do corpo lúteo iniciada antes da ovulação, com o processo de luteinização das células foliculares (CONCANNON, 2011). Após a ovulação e o início da formação do corpo lúteo a concentração de progesterona se eleva, atingindo 10 a 20 ng/mL (FELDMAN e NELSON, 2004).
O diestro tem duração de 60 a 100 dias caso a cadela não desenvolva gestação (Carvalho et al., 2020). Nesta fase, a fêmea perde a receptividade e reduz a atração pelo (CONCANNON, 2011). A progesterona é o hormônio dominante deste período e as mudanças fisiológicas que acontecem por sua influência
(Apparício e Vicente, 2015). Em resposta ao estímulo gerado pela progesterona, ocorrem alterações uterinas, mantendo a estrutura glandular e vascularização adequadas para uma possível a gestação, independe da cadela está gestante ou não (Oliveira et al., 2003).
Ainda que não esteja presente uma possível de gestação, o endométrio apresenta todas as mudanças e permanece cerca de 30 dias após a regressão do corpo lúteo para retornar ao seu estado basal, já nas cadelas gestantes isto ocorre cerca de 60 dias após o parto. Durante esse período pode ocorrer o desenvolvimento exacerbado de glândulas mamárias mesmo nas cadelas não gestantes. O início da lactação está associado com a redução dos níveis de progesterona e aumento da prolactina (Apparício e Vicente, 2015). A similaridade dessas mudanças que ocorrem durante a fase gestacional, é uma sugestão para explicar a alta incidência de pseudociese em cadelas (Gobello et al., 2002).
Por fim, a ultima fase do ciclo estral é o anestro. Esse período é caracterizado por uma fase de quiescência e involução uterina, com duração média de 125 dias, podendo variar entre dois a dez meses (Carvalho et al., 2020). Os níveis de estrógeno, progesterona e FSH apresentam valores basais, no início e meio do anestro, ocorrendo aumento do estradiol e FSH no fim dessa fase (Oliveira et al., 2003).
3.3 Pseudogestação
Por apresentarem um período de diestro semelhante à fêmeas gestantes cadelas não gestantes podem desenvolver uma síndrome denominada de pseudogestação (Feldman e Nelson, 1996). É caracterizada pela manifestação de sinais clínicos e comportamentais semelhantes aos observados durante o período pré, peri e pós-parto (Apparício e Vicente, 2015). Também pode ser denominada como pseudogestação clínica ou manifesta ou pseudoprenhez, falsa gestação, falsa prenhez, gestação psicológica ou lactação nervosa (Gobello et al., 2001). O desenvolvimento da pseudogestação é atribuído ao aumento nas concentrações e/ou na sensibilidade à prolactina, aliada a uma redução abrupta dos níveis séricos de progesterona (Martins e Lopes, 2015).
Nos casos mais graves, em que a exacerbação dos sinais pode ser realizado o tratamento farmacológicos utilizando agentes dopaminérgicos (Gobello et al.,
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2001). A cabergolina é o agonista dopaminérgico mais utilizado para inibir a secreção de prolactina em cadelas, pois possui ação direta sobre os receptores D2-dopaminérgicos das células lactotróficas da adenohipófise (JANSSENS, 1986). O cloridrato de piridoxina demonstrou ser uma alternativa viável e segura para o tratamento de cadelas com pseudogestação, promovendo redução da hiperprolactinemia em um período de sete dias, sem causar nenhum efeito colateral ou alteração da fertilidade (SILVA, 2017).
Sabe que a nível central o cloridrato de piridoxina atua interferindo a síntese de dopamina e consequentemente reduzindo a secreção de prolactina, no entanto a nível periférico, especialmente sua ação no útero ainda é desconhecida.
3.4 Mediadores hormonais
3.4.1Receptores nucleares ou intracelulares
Estes receptores são proteínas solúveis que se ligam ao DNA para regular a transcrição de genes específicos. São membros de uma grande família de fatores de transcrição que podem ser regulados por fosforilação e/ou associação com outras proteínas celulares (Montezano e Torres, 2005). Os receptores nucleares constituem uma superfamília de fatores de transcrição regulados pela interação com hormônios. Esta superfamília inclui, por exemplo, os receptores de progesterona, estrogênio,andrógeno, hormônio tireoidiano, glicocorticoide e mineralocorticoide (NASCIMENTO, 2009).
3.4.2 Kisspeptina e seu receptor
A Kisspeptina, um polipeptídeo de 145 aminoácidos, é clivada por enzimas proteolíticas e transformadas em em peptídeos mais curtos com 54 aminoácidos (KP ‐ 54; metastina), 14 aminoácidos (KP ‐ 14), 13 aminoácidos (KP ‐ 13) ou 10 aminoácidos (KP ‐ 10) (Schäfer ‐ Som et al., 2016.) Sua atuação é fundamental no sistema reprodutor, sendo considerada um hormônio chave na reprodução e sua expressão pode ser encontrada em diversos tecidos (Kotani et al., 2001). Foi demonstrado que a kisspeptina e o receptor da kisspeptina são expressos no ovário
e no útero, indicando uma ação periférica local adicional na reprodução em nível extra-hipotalâmico (Tanyapanyachon et al., 2018).
Dessa forma, o objetivo deste experimento foi elucidar ação da hiperprolactinemia e do cloridrato de piridoxina no útero de cadelas pseudogestantes através de mediadores hormonais.
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4 MATERIAL E MÉTODOS
Para este estudo foram utilizados fragmentos uterinos de cadelas sem raça definida, entre dois e seis anos de idade, obtidos por ovário-salpingo-histerectomia (OSH) após passarem por 20 dias de tratamento: 1) Grupo controle (placebo) recebeu cápsulas vazias; 2) Grupo cloridrato de piridoxina recebeu cápsulas com 50 mg/kg/dia de vitamina B6 e 3) Grupo cabergolina recebeu 5µg/kg/dia. Os fragmentos uterinos foram coletados por meio de secção transversal do terço médio de ambos os cornos uterinos e armazenados em formal a 10% até o processamento. A realização dos procedimentos laboratoriais foi feita mediante aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UESC (Processo nº031/19).
4.1 Processamento histopatológico
Os fragmentos uterinos dos 18 cornos foram blocados e fixados em formaldeído a 10% por 24 horas e depois processados pela técnica rotineira de inclusão em parafina. Cortes histológicos de 4µm foram obtidos em lâminas gelatinizadas para a imunohistoquímica.
4.2 Imunohistoquímica
Para a técnica de imunohistoquímica foram realizados cortes histológicos de 4 µm de espessura, através de um micrótomo, confeccionados em lâminas gelatinizadas, utilizando os anticorpos anti-PR (sc - 130071 – Santa Cruz Biotechnology. CA,USA), anti-ERα (6f11 - Thermo Fisher Scientific), anti-AR (PG-21
EMD Millipore Corp,USA), hormônio tireoidiano (434800 - Invitrogen Corporation),
anti-Kiss1 (sc - 101246, Santa Cruz Biotechnology. CA,USA), anti-KISS1R (HPA 071913, Sigma-Aldrich, Missouri,USA).
Foi utilizada a técnica da estreptavidina-biotina-peroxidase (Streptavidin Peroxidase, Lab Vision Corp., Fremont, CA, USA) e a recuperação antigênica foi realizada pelo calor em banho-maria a 98 oC utilizando solução de ácido cítrico com pH 6,0. As lâminas foram incubadas em câmara úmida overnight (40h) com o anticorpo primário nas respectivas diluições: receptor de progesterona (PR 1:2000), receptor de estrógeno (ERα 1:50), receptor de andrógeno (AR 1:200), receptor de
hormônio tireoidiano (TRA 1:300), receptor de kisspeptina (KISSR 1:200) e receptor anti-kisspeptina (Kiss1R 1:100) e por 30 minutos nas etapas de bloqueio da peroxidase endógena, soro de bloqueio (Ultra vision Block, Lab Vision Corp., Fremont, CA. USA) e estreptavidina peroxidase. O cromógeno utilizado foi a diaminobenzidina (DAB Substrate system, Lab Vision Corp., Fremont, CA. USA). As secções foram contracoradas com hematoxilina. Foi realizada uma avaliação descritiva e quantitativa da expressão imunohistoquímica dos receptores de progesterona, estrógeno, andrógeno, hormônio tireoidiano, kisspeptina e Kiss1R no útero de cadelas com hiperprolactinemia (controle), tratadas com cloridrato de piridoxina e cabergolina. A avaliação quantitativa foi realizada em três regiões do útero: superfície endometrial, glândulas profundas e miométrio em cada corte histológico/animal/tratamento. Para determinar a intensidade e área de imunomarcação, imagens foram fotografadas com um microscópio Olympus® BX-40 e a câmera digital Spot Color Insight (SPOTTM, Sterling Heights, Michigan, USA). A intensidade e área de imunomarcação foram determinadas por meio do WCIF ImageJ® (Media Cybernetics Manufacturing, Rockville, MD, USA). Color
deconvolution e thresholding das imagens foram realizados. Os dados de cada
tecido foram arquivados, analisados e expressos como intensidade e área de imunomarcação em pixels (SILVA, 2014).
Tabela 1 - Lista de anticorpos utilizados na imunohistoquímica
Anticorpo Espécie/clone Diluição Tempo de
revelação no DAB Anti-PR Camundongo/monoclonal 1:2000 20s
Anti-ERα Camundongo/monoclonal 1:50 1h
Anti-AR Camundongo/policlonal 1:200 20min
Anti-TRα Coelho/Policlonal 1:300 7min
Anti-Kiss1 Camundongo/monoclonal 1:200 5min
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5 RESULTADOS
5.1 Perfil de PR no útero de cadelas com pseudogestação
A expressão de receptores de progesterona foi moderada na região de superfície epitelial entre os grupos estudados (P > 0,05; Figura 1A, B, C, D;). Já sua expressão na região de glândulas profundas e miométrio foi moderada nos grupos tratados diferente da fraca ou nula marcação observada no grupo controle (P <0,05; Figura 1E, F, G, H, I, J, K L).
Figura 1 - Expressão proteica de PR no útero de cadela com pseudogestação em
diferentes regiões
Fonte: Próprio autor
Legenda: Fotomicrografias da expressão imunohistoquímica do receptor de progesterona na superfície epitelial (A, B, C) e na intensidade de marcação (D) (mediana P > 0,05, n=6); nas glândulas profundas (E ,F ,G) e na intensidade de marcação (H) (mediana, *P < 0,05, n=6); no miométrio (I, J, K) e na intensidade de marcação (L) (mediana, *P < 0,05, n=6); no útero de cadelas pseudogestantes tratadas. (Estreptavidina-biotina-peroxidase; Hematoxilina de Harris; Barra = 50 µm ). Aumento de 40x.
5.2 Perfil de ER no útero de cadelas com pseudogestação
A expressão de receptor de estrógeno foi fraca ou nula nas regiões uterinas estudadas em todos os grupos, tratados ou não (P > 0,05; Figura 2).
Figura 2 - Expressão proteica de ERα no útero de cadela com pseudogestação em
diferentes regiões
Fonte: Próprio autor
Legenda: Fotomicrografias da expressão imunohistoquímica do receptor de estrógeno na superfície epitelial (A, B, C) e na intensidade de marcação (D); nas glândulas profundas (E, F, G) e na intensidade de marcação (H); no miométrio (I, J, K e na intensidade de marcação (L) no útero de cadelas pseudogestantes tratadas . (Estreptavidina-biotina-peroxidase; Hematoxilina de Harris; Barra = 50 µm ). Aumento de 40x.
5.3 Perfil de AR no útero de cadelas com pseudogestação
A expressão de receptores de andrógeno entre os grupos estudados foi moderada na região de superfície epitelial (P > 0,05; Figura 3 A, B, C, D). Já nas glândulas profundas foi fraca ou nula nos grupos tratados quando comparada a
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moderada expressão observada no grupo controle (P < 0,001; Figura 3 E, F, G, H). No miométrio também foi observada expressão fraca ou nula nos grupos tratados, sendo evidenciado diferença significativa na intensidade de marcação entre o grupo tratado com cabergolina e o controle (P < 0,001; Figura 3 I, J, K. L).
Figura 3 - Expressão proteica de AR no útero de cadela com pseudogestação em
diferentes regiões
Fonte: Próprio autor
Legenda: Fotomicrografias da expressão imunohistoquímica do receptor de andrógeno na superfície epitelial (A, B, C), e na intensidade de marcação (D); nas glândulas profundas (E, F, G), e na intensidade de marcação (H) (mediana, **P<0,001, n=6); no miométrio (I, J, K) e na intensidade de marcação (L) (mediana P < 0,05, n=6) no útero de cadelas pseudogestantes tratadas. (Estreptavidina-biotina-peroxidase; Hematoxilina de Harris; Barra = 50 µm). Aumento de 40x.
5.4 Perfil de TRα no útero de cadelas com pseudogestação
A expressão do receptor de hormônio tireoidiano em todas as regiões do útero estudadas foi fraca a nula no grupo tratado com cloridrato de piridoxina (P < 0,001, Figura 4). Nota-se a intensa marcação e expressão desses receptores em glândulas profundas no grupo controle não tratado (P < 0,001; Figura 4E).
Figura 4 - Expressão proteica de TRα no útero de cadela com pseudogestação em
diferentes regiões
Fonte: Próprio autor
Legenda: Fotomicrografias da expressão imunohistoquímica do receptor de hormônio tireoidiano na superfície epitelial (A, B, C) e na intensidade de marcação (D); nas glândulas profundas (E, F, G) e na intensidade de marcação (H); no miométrio (I, J, K) e na intensidade de marcação (L) no útero de cadelas pseudogestantes tratadas (mediana, *P < 0,001, n=6).(Estreptavidina-biotina-peroxidase; Hematoxilina de Harris; Barra = 50 µm ). Aumento de 40x.
5.5 Perfil de kisspeptina no útero de cadelas com pseudogestação
Somente na superfície epitelial do útero nota-se diferença na expressão de receptores de Kisspeptina que foi fraca no grupo tratado com cabergolina comparado ao controle (P < 0,05; Figura 5).
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Figura 5 - Expressão proteica de kisspeptina no útero de cadela com
pseudogestação em diferentes regiões
Fonte: Próprio autor
Legenda: Fotomicrografias da expressão imunohistoquimica de kisspeptina na superfície epitelial (A, B, C) e Área de imunomarcação em pixels da expressão kisspeptina nesta região (D) (média ±SEM; *P<0,05 n=6); nas glândulas profundas (E, F, G) e Área de imunomarcação em pixels da expressão kisspeptina nesta região (H); no miométrio (I, J, K) e Área de imunomarcação em pixels da expressão kisspeptina nesta região (L). (Estreptavidina-biotina-peroxidase; Hematoxilina de Harris; Barra = 50 µm). Aumento de 40x.
5.6 Perfil de KISS1R no útero de cadelas com pseudogestação
A expressão de KISS1R em todas as regiões do útero estudadas foi fraca a nula, tendo uma resposta semelhante a expressão de ERα para todos os grupos (P > 0,05; Figura 6).
Figura 6 - Expressão proteica de KISS1R no útero de cadela com pseudogestação
em diferentes regiões
Fonte: Próprio autor
Legenda: Fotomicrografias da expressão imunohistoquímica de KISS1R na superfície epitelial (A, B, C) e Área de imunomarcação em pixels da expressão KISS1R nesta região (D) (média±SEM; *P>0,05 n=6); nas glândulas profundas (E, F, G) e Área de imunomarcação em pixels da expressão kisspeptina nesta região (H); , Fotomicrografias da expressão imunohistoquímica de KISS1R no miométrio(I,J,K) e Área de imunomarcação em pixels da expressão KISS1R nesta região (L) (média±SEM; *P > 0,05; n=6/grupo). (Estreptavidina-biotina-peroxidase; Hematoxilina de Harris; Barra = 50 µm). Aumento de 40x.
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6 DISCUSSÃO
6.1 Receptor de progesterona
Houve uma expressão moderada dos receptores de progesterona na superfície epitelial em todos os grupos e alta expressão do receptor de progesterona em glândulas profundas e miométrio nos grupos tratados, enquanto no grupo controle houve baixa expressão. Segundo Bole-Feysot et al, (1998) e Grosdemoug et al,(2003) em estudos com macacos, a prolactina influencia a secreção de progesterona e seus receptores no epitélio uterino, promovendo um ambiente favorável para a implantação. Levando em consideração esta informação, esperava-se que o grupo controle, em que apreesperava-senta-esperava-se hiperprolactinemia, houvesesperava-se maior expressão de receptores de progesterona em todos os segmentos uterinos e os animais tratados, houvesse redução acentuado pela ação dos medicamentos. Haralabos et al,(2004) observaram que cadelas em diestro fisiológico apresentaram concentrações significativamente maiores de receptores de progesterona comparado com cadelas que apresentaram piometra. Acreditamos que a pseudogestação, por se tratar de evento fisiológico os receptores de progesterona se comportem de forma semelhante em cadelas com diestro fisiológico.
Os níveis de progesterona são crescentes durante o estro até as primeiras semanas do diestro, atingindo um limite nas suas concentrações e retornando de forma gradual para valores basais após esse período (Oliveira et al., 2003). Durante o diestro, os níveis de progesterona se mantem elevados nas primeiras semanas, após seu declínio os níveis de prolactina aumentam (Apparício e Vicente, 2015). O útero responde ao aumento da concentração de progesterona mantendo a estrutura glandular e vascularização adequadas para cadelas estando gestantes ou não. (Oliveira et al., 2003). Tanto cabergolina quanto piridoxina, possui ações dopaminérgicas sobre o sistema nervoso central, bloqueando a prolactina (Silva e Snoeck, 2020), fazendo com que os níveis de progesterona se mantenham altos nos casos de pseudogestação. Essa fato explicaria o padrão de marcação revelado no presente trabalho. Silva e Meira,(2014) relatam que a expressão protéica dos receptores de progesterona e estrógeno são diferentes dentro dos tecidos que compõe o útero (endométrio, miométrio). Apesar de não estarem totalmente esclarecidas as funções do receptor de progesterona, sua parte B, se comporta
como um potente ativador de genes-alvo da progesterona, enquanto a parte A, promove atuação como repressor dominante do RP-B, reduzindo a resposta de outros hormônios esteroidais, como os andrógenos e os estrógenos(Sampaio et al., 2020).
6.2 Receptor de Estrógeno alfa
Sobre a expressão do receptor de estrógeno, os resultados encontrados no presente estudo, demonstram expressão fraca a nula em todas as regiões do útero para todos os grupos experimentais. Isso pode ser atribuído ao fato que, durante o diestro, a concentração de progesterona se eleva e consequentemente ocorre diminuição dos receptores de estradiol (Silva e Meira, 2014). Haralabos et al, (2004), avaliaram o efeito do estradiol sobre os receptores de estrógeno em cadelas acometidas com piometra e normais e foi observado que durante o diestro, a progesterona regula negativamente os receptores de estradiol no útero.
Os níveis de estrógeno durante a fase inicial do diestro são baixos (Gossler, 2019), justificando a baixa expressão de receptores de estrógeno no útero das cadelas pseudogestantes, tratadas ou não. Ainda não está bem esclarecido os mecanismos envolvidos na supressão de receptores de estrógeno pela progesterona (Spencer e Bazer, 2002). Com base nos nossos resultados, acreditamos que, a hiperprolactinemia assim como as drogas cabergolina e cloridrato de piridoxina, possuem efeito antagônico sobre o estrógeno, promovendo supressão sobre seus receptores no ambiente uterino. Com isso, as cadelas que apresentem quadros de pseudogestação, tratada ou não, irá apresentar baixa expressão para receptores de estrógeno devido ao período em que se encontra.
6.3 Receptor de Andrógeno
Em relação a expressão do receptor de andrógeno, o estudo revelou maior expressão pelo grupo controle (hiperprolactêmico) e moderada a fraca para os grupos tratados. A maior expressão de AR pelo grupo controle poderia ser correlacionada pela interação endócrina, em que maiores concentrações de andrógenos resultam em maior produção de prolactina (Narukawa et al.,1994).
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Outro fator que pode contribuir para esse resultado de alta expressão de AR no grupo controle, é descrito por (Slayden et al.,2001) em que macacos tratados com associação de estrógeno e progesterona reduziram a expressão de receptores de andrógeno. No caso do grupo controle, tanto receptores de progesterona quanto receptores de estrógeno se encontram baixos, sugerindo que os níveis séricos poderiam está reduzidos, sustentando a hipótese da redução dos receptores de andrógeno no presente estudo.
De acordo com a fisiologia, durante a pseudogestação os níveis de prolactina apresentam-se altos e estrógeno baixos. (Vermirsch et al., 1999) demonstram que a correlação positiva entre os níveis de estradiol com testosterona, levando em consideração que a testosterona pode ser um subproduto da metabolização estrogênica.
Tanto cabergolina quanto cloridrato de pirodoxina, atuam de forma dopaminérgica, bloqueando a síntese e liberação da prolactina (Silva, 2017). Nos grupos tratados, tanto cabegolina quanto piridoxina bloqueio a ação de prolactina e consequentemente aumentam os níveis e progesterona, resultando em baixa expressão de receptores de andrógeno, como encontrados nos grupos tratados, uma vez que o progesterona tem a capacidade de suprimir a expressão dos mesmos.
O feto e placenta tornam-se uma fonte adicional de produção de andrógenos, durante a gestação. (Makieva et al., 2014). Na estrutura ovariana, os andrógenos são produzidos pelas células do corpo lúteo . (Sanders et al., 1996). A prolactina exerce um papel luteotrófico , dessa forma o grupo que apresenta-se hiperprolactêmico, possui uma maior expressão de receptores de andrógeno. A piridoxina, por apresentar efeito doparminégico, não possui estímulo luteotrófico, apresentando menor produção de andrógenos e consequentemente menor expressão de seus receptores. Além disso, os grupos não possuíam feto nem placenta, que serviriam como uma fonte extra na produção de andrógenos. No miométrio houve uma expressão moderado para o grupo controle. Acredita-se que os andrógenos são eficientes para as contrações miometriais (Makieva et al., 2014). Nos casos de pseudogestação em cadelas, as modificações endócrinas são semelhantes à gestação fisiológica, ocorrendo eventos semelhantes ao pré-parto.
6.4 Receptor de Hormônio Tireoidiano alfa
O grupo controle (hiperprolactêmico) apresentou maior expressão para o receptor de hormônio tireoidiano em todas as regiões do útero, com maior intensidade de marcação na região de glândulas profundas, enquanto os grupos tratados com cabergolina e cloridrato de piridoxina apresentam marcação moderada à fraca e nula, respectivamente. Em humanos, o endométrio tem demonstrado ser um produtor extratiroidiano de hormônio como, T3 e T4 (Detti et al., 2013).
Nossos resultados sugerem que a hiperprolactinemia nos casos de pseudogestação não tratados, apresentaram alterações endócrinas semelhantes ao hipotireoidismo. Foi observado que ratos com hipotireoidismo desenvolvem pseudogestação devido o aumento nas concentrações séricas de progesterona e prolactina. Em cadelas, o hipotireoidismo causa aumento da concentração de prolactina sérica e anormalidades reprodutivas. Isso ocorre por que os hormônios tireoidianos estão relacionados com a secreção dos hormônios luteinizantes e folículo estimulante, através de feed back negativo (Silva, 2017).
Alterações nos níveis de T3 e T4 afetam a morfofisiologia uterina por ativar de forma inadequada seus receptores ao longo do ciclo estral, assim como, influencia as concentrações plasmáticas de esteroides sexuais, afetando a ação trófica desses hormônios no trata genital. A elevação dos níveis de progesterona afeta negativamente a secreção de gonadotrofinas pelo hipotálamo e hipófise, promovendo de forma associada aos altos níveis de prolactina, reduzindo os níveis de gonodotrofinas basal (LH e FSH) (Grattan et al., 2007).
O papel do TRα ainda não está elucidado, no entanto acredita-se que essa isoforma seja mais abundante na fase secretora do ciclo, em humanos (Aghajanova et al., 2011). Um estudo com coelhos demonstrou a presença de receptores de hormônio tireoidiano alfa no útero, nas regiões de endométrio e miométrio no período de gestação. (Rodríguez-Castelán et al., 2017). Além disso, o receptor de hormônio tireoidiano já foi descrito no miométrio e endométrio de macacos (Hulchiy et al., 2012). Em outro estudo com coelhos, foi observado que fêmeas com hipotireoidismo apresentaram alta expressão de TRα no útero. (Rodríguez-Castelán et al.,2019).
Nossos resultados revelaram baixa expressão de TRα em animais pseudogestantes tratados. A dopamina e o hormônio liberador de tireotropina (TRH)
31
são importantes na homeostase de prolactina (Kolster et al., 2010).Com isso acreditamos que, por atuarem como agonistas dopaminérgicos no sistema nervoso central, bloqueiam a síntese e liberação de prolactina na circulação, revertendo de maneira direta os quadros de hiperprolactinemia e de forma indireta modificando a expressão no útero.
6.5 Kisspeptina/KISS1R
Na expressão de kisspeptina, foi demonstrado maior reatividade na superfície epitelial do grupo controle, enquanto KISS1R apresentou expressão fraca a nula em todos os grupos. Nas regiões de glândulas profundas e miométrio, a kisspeptina foi expressa de forma moderada igualmente em todos os grupos enquanto Kiss1R apresentou marcação nula a fraca em todos os grupos.
Em humanos, a expressão de KISS1 / KISS1R está localizada principalmente em células epiteliais e estromais do útero, mas não do miométrio (Cejudo et al., 2012). Em felinos, foi observado maior expressão de Kiss1 no útero em diestro enquanto KISS1R apresentou maior expressão durante o período de proestro/estro (Santos et al., 2020). Em cães foi demonstrada expressão de Kiss/Kiss1R em células ovarianas (Cielesh et al., 2016).
Além de seu papel essencial na secreção de LH, a kisspeptina também está envolvida no controle da secreção de prolactina (Aquino et al., 2019).A kisspeptina aumenta a secreção de prolactina através da inibição de neurônios dopaminérgicos tuberoinfundibulares, no entanto essa ação exige níveis elevados de estradiol (Ribeiro et al., 2014). Em um estudo utilizando células luteais de ratos demosntrou que a kisspeptina promove a secreção de progesterona das células luteais por meio do aumento de enzimas esteroidogênicas (Peng et al., 2013).
Na cadela, a luteinização das células começa antes da ovulação, juntamente com um aumento no nível de secreção de progesterona (Chastant-Maillard et al., 2011 ). Alguns autores sugerem que a kisspeptina tem um papel importante na secreção de progesterona (Gaytán et al., 2009) . Acredita-se que a kisspeptina produzida possa atuar nas células da granulosa agindo para síntese e secreção de progesterona também em caninos. (Cielesh et al., 2017).
A nível central, estudos indicam que neurônios kisspeptinérgicos participem do controle da secreção de prolactina, pois durante a lactação há uma redução da
expressão de KiSS1, período de maior secreção de prolactina(Yamada et al., 2012). A nível local, a expressão da kisspeptina e do seu receptor nos ovários e útero em diferentes estágios ovarianos, indicam possíveis ações locais na função oocitária, esteroidogênese , remodelação ovariana dentro do ovário e adenogênese dentro do útero (Tanyapanyachon et al., 2018).
Foi observado no útero de cadelas não gestantes após ovulação alta expressão de kisspeptina enquanto que no útero de cadelas gestante alta expressão de Kiss1R. ( Schäfer‐Som et al., 2016). Dessa forma, sugere-se que o sistema Kiss/Kiss1R exerce um papel importante no processo de decidualização (Zhang et al., 2014).
A expressão de KISS1R foi fracamente expressa em todas as regiões uterinas, independente dos grupos tratados. A expressão de KISS1R é modulada pela atuação do estrógeno, devido sua ação direta sobre os neurônios dopaminérgicos. Foi observado que a kisspeptina estimula a secreção de prolactina, mediante suplementação estrogênica. (Szawkaet al., 2010.)
Podemos correlacionar essas informações ao período estral em que as cadelas se encontravam, levando em consideração que no diestro os níveis de estrógeno são mais baixos. Além disso, outro dado do nosso trabalho que chama atenção foi à baixa expressão dos receptores de estrógeno semelhantes aos resultados de KISS1R, reafirmando então as interações endócrinas entre estrógeno
33
7 CONCLUSÕES
Os altos níveis de prolactina, causados pelo quadro de hiperprolactinemia, ainda que fisiológico, nos quadros de pseudogestação em cadelas modificam a expressão de mediadores hormonais no útero, favorecendo um ambiente uterino impróprio para a fertilidade.
A ação do Cloridrato de Piridoxina controla as alterações provocadas pela hiperprolactinemia, modulando de forma benéfica a expressão de mediadores hormonais no útero de cadelas, preservando assim a fertilidade dessas fêmeas.
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