Il est également possible de faire une simulation de dynamique moléculaire dans l’espace des angles dièdres. Pour cela, on calcule l’énergie cinétique
E
cin et l’énergie potentielleE
potpour former le lagrangien du système,
L = Ecin - Epot
et on applique les équations de Lagrange :On obtient ainsi un jeu de N équations du mouvement (N correspond aux nombres d’angles dièdres). Ces équations sont intégrées de façon numérique comme dans le cas d’une dynamique cartésienne. Dans le cas du formalisme de Lagrange, on obtient un système à N équations reliant les accélérations entre elles qu’il faut résoudre à chaque pas, ce qui rend ce type de calcul très lourd. Pour éviter ce problème, on calcule de proche en proche chaque accélération par rapport à l’accélération de l’angle dièdre voisin. Cette méthode de calcul est intégrée dans les logiciel CNS et XPLOR (version 3.851).
Comme dans toute dynamique, le pas d’intégration doit être inférieur au temps correspondant au mouvement le plus rapide. Dans le cas d’une dynamique cartésienne, le mouvement le plus rapide correspond généralement à la vibration d’un atome d’hydrogène le long de la liaison covalente qui le lie à un atome lourd. Alors que dans le cas d’une dynamique dans l’espace des angles dièdres, tous ces mouvements rapides (élongation des liaisons, distorsion des angles dièdres) sont supprimés au profit de mouvements de rotation d’atomes ou de groupes d’atomes autour d’une liaison covalente, ce qui permet d’augmenter les temps de dynamique.
Le recuit simulé dans l’espace des angles dièdres apparaît comme la méthode la plus efficace pour obtenir une structure tridimensionnelle en RMN. L’équipe de Brünger (Stein et al. 1997) a comparé les trois méthodes d’obtention de structures (recuit simulé à partir de géométrie de distance, le recuit simulé dans l’espace cartésien et le recuit simulé dans l’espace des angles dièdres) avec cinq molécules d’intérêt biologique. Que ce soit pour un peptide, une protéine ou un acide nucléique, le recuit simulé dans l’espace des angles dièdres surpasse les deux autres formes de recuit .
qi L i
q L dt
d ⎟ = ∂ ∂
⎠
⎜ ⎞
⎝
⎛ ∂ ∂
&
RESULTATS
PROBLEMATIQUE
Dans l’introduction, nous avons remarqué que la tige boucle SL1 du domaine d’encapsidation était impliquée dans le phénomène d’initiation de la dimérisation de l’ARN génomique (Clever et al. 1996; Laughrea and Jette 1994; Muriaux et al. 1996b; Muriaux et al.
1995). Ces travaux, réalisés sur des fragments d’une centaine de nucléotides, ont montré que la séquence apicale auto-complémentaire de la tige boucle SL1 était nécessaire à la propriété d’initiation de la dimérisation. De plus, ces études ont permis de mettre en évidence deux types de dimère : un dimère instable et un dimère stable.
Plus récemment, les travaux de (Theilleux-Delalande 1998) rapportent que des séquences tronquées de la tige boucle SL1 de 23 nucléotides possédaient les même propriétés que celles décrites sur de plus longs fragments à savoir la même température de fusion ou la présence de 2 types de dimères (Figure 17). Cette séquence de 23 nucléotides est particulièrement appropriée pour une étude structurale en Résonance Magnétique Nucléaire du fait de sa taille réduite.
Figure 17. Courbe de dénaturation / renaturation du complexe boucle-boucle de SL1-23mer VIH-1Lai, d'après (Theilleux-Delalande et al. 2000). La force ionique et le pH sont fixés avec NaCl (100mM) et TrisHCl (50mM, pH 7,5). La variation de température repose sur un cycle de 15°C/heure, avec 5min d'attente après la phase de dénaturation.
Absorbance à 258nm
Température (°C)
A partir de ces travaux, la séquence SL1 de l’ARN génomique peut se présenter sous 3 conformations différentes:
- Une forme monomèrique qui est à l’origine du phénomène de dimérisation.
- Une première forme dimèrique dite en ‘kissing’ complexe qui résulte de l’appariement de deux monomères. Cette structure correspondrait à la forme immature dans le virion.
- Une deuxième forme dimèrique dite en dimère étendu qui résulte du réarrangement de la forme en ‘kissing’ complexe et correspondrait à la forme mature du virion. Ce passage d’une forme à l’autre s’effectue grâce à la NCp7 (Feng et al. 1996b; Fu et al.
1994).
Le mécanisme de passage classiquement décrit pour le passage entre les différentes formes est représenté ci-dessous (Figure 18) (Girard et al. 1999; Muriaux et al. 1996a; Rist and Marino 2002):
Figure 18. Représentation des différentes structures possibles de la séquence 23mer de la tige boucle SL1.
La dimérisation des ARN génomiques est une étape clé du cycle rétroviral et n’est pas à l’heure actuelle une cible thérapeutique dans le traitement de la maladie. Afin d’élaborer de nouveaux traitements anti-viraux, il est important de mieux comprendre les différents
phénomènes et interactions qui régissent ce phénomène de dimérisation notamment d’un point de vue structural. Au cours de ce travail de thèse, nous avons donc étudié la forme monomérique et la forme dimérique instable, la forme dimérique stable ayant déjà été étudiée dans notre laboratoire (Girard et al. 1999).
ETUDE DE LA FORME MONOMERIQUE DE LA TIGE BOUCLE SL1
La tige boucle SL1 est la première entité rencontrée lors du phénomène de dimérisation. En effet, c’est l’appariement de deux de ces tiges boucles qui va permettre la formation de la première forme dimérique : le ‘kissing’ complexe. Son étude structurale est donc essentielle pour permettre la compréhension de l’interaction boucle-boucle. La séquence sauvage (Figure 19B) présente la particularité de dimériser spontanément en solution, nous avons donc choisi de modifier la séquence auto-complémentaire en remplaçant la guanine 12 par une adénine afin de réaliser l’étude de la forme monomèrique. Cette mutation présente le double avantage d’empêcher la dimérisation et de conserver la nature purique de la base.
Cette nouvelle séquence est appelée SL1* (Figure 19).
Figure 19. A/ Séquence SL123mer* de VIH-1Lai.(la mutation apparaît en vert) B/ Séquence sauvage de VIH-1Lai.