B. 3| Amarrage Assisté par Dynamique Moléculaire (AADM)

Le principe de ce protocole consiste à prendre en compte la flexibilité de la protéine et des peptides engendrée simultanément lors de l’interaction. Le protocole peut être décomposé en trois parties :

- Réalisation d’un amarrage initial sur les différentes grilles de la protéine, décrites précédemment et définition de la zone d’interaction du ligand (site d’action).

- Réalisation d’une DM de Langevin avec les meilleures conformations du complexe protéine Fur-peptide (meilleure énergie libre de liaison lors de l’amarrage initial précédent), pour prendre en compte la flexibilité des deux

partenaires simultanément. La dynamique moléculaire de 5 ns à 289 K, générant 5000 conformations est précédée et suivie par une minimisation (100 pas de SD et 1000 pas d’ABNR) en solvatation implicite (EEF1) est appliquée. Pendant cette dynamique, le peptide au complet ainsi que les chaines latérales des résidus de la protéine proches du peptide (distance 5 Å) sont flexibles. Les cinq meilleures conformations du complexe, choisies sur la base de l’énergie d’interaction (Einter) entre peptide et protéine sont utilisées pour d’autres amarrages d’optimisation.

- Réalisation d’amarrage d’optimisation avec des paramètres permettant une évaluation plus poussée des possibilités d’interaction du peptide sur la protéine. A l’issue de ces amarrages d’optimisation, les conformations des complexes sont analysées avec CHARMM (paragraphe suivant).

Cette approche AADM peut être répétée plusieurs fois en veillant toutefois à ce que des contraintes sur les atomes de la protéine éloignés du peptide soient toujours imposées afin de ne pas s’éloigner de la structure initiale de celle-ci.

L’apport de ce processus ADDM combinant la dynamique et l’amarrage moléculaires sera démontré à travers le processus d’optimisation de l’amarrage de pF1 sur le modèle EcFur1Pa donné en exemple dans la suite.

III. B. 4| Identifications des interactions clés à l’amarrage

Après avoir choisi les coordonnées des meilleures conformations du complexe Fur- peptides selon AutoDock, nous avons utilisé CHARMM pour calculer l’énergie d’interaction et les liaisons hydrogènes. La description de l’énergie d’interaction (Einter) est donnée par la fonction suivante :

est l’énergie potentielle totale du système moléculaire, est l’énergie interne du ligand et celle de la protéine (et des ions métalliques si ils sont disponibles). L’énergie d’interaction a été calculée pour les résidus des peptides (ligands).

Elle représente la contribution énergétique du résidu à la liaison à la protéine. L’analyse par CHARMM a également permis d’identifier des liaisons hydrogènes et de quantifier ces liaisons par l’énergie d’interaction des atomes impliqués.

III. B. 5| Exemple du processus d’optimisation de l’amarrage des peptides anti-Fur : Cas du peptide pF1 sur le modèle EcFur 1 Pa.

III. B. 5. a| Amarrage sur EcFur1Pa Apo

Comme nous l’avons évoqué précédemment, les « dockings » ont été réalisés dans un premier temps sur des peptides tronqués (moins de 13 acides aminés), généralement actifs in vitro dans le test d’activité vu dans la partie expérimentale. Dans un second temps, la séquence totale des peptides est construite à partir de la conformation du peptide tronqué issu d’un amarrage optimisé par le processus AADM.

Dans cette section, nous allons voir le processus d’optimisation de l’amarrage du peptide pF1 sur le modèle EcFur1Pa. Nous avons vu sur les Figure III.11 et Figure III.16, respectivement, les modèles optimisés du peptide pF1 et d’EcFur1Pa qui constituent les coordonnées initiales de ce complexe. La séquence des neuf acides aminés Nter de pF1 : pF1(1-9) est extraite de la conformation optimisée du peptide entier pour l’amarrage.

Les grilles FurEcG1 et FurEcG2 (Tableau III.3) ont été utilisées avec les paramètres par défaut d’AutoDock dans le protocole AADM. La Figure III.19, ci-dessous montre l’amarrage de ce peptide sur la protéine. Cet amarrage a été obtenu avec une énergie libre de liaison ∆∆∆∆G de -13.6 kcal/mol et une constante d’inhibition estimée, Ki de 105 pM (pico Molaire) indiquant une affinité très favorable. Rappelons que les valeurs d’énergie libre de liaison ∆G ne sont pas directement comparables aux IC50 des tests d’activité car elles reposent sur une calibration empirique à partir d’une base de complexes de structure connue. Par contre, elles permettront de comparer les amarrages des divers peptides sur les diverses protéines Fur présentés par la suite dans ce rapport.

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Figure III.19: Amarrage du peptide pF1(1-9) sur EcFur obtenu par AutoDock4.

En vert la sous-unité A, en rouge la sous-unité B de la protéine et en bleu le peptide.

Le peptide interagit à la fois avec les domaines Nter et Cter de la protéine. Cette information est cohérente avec les résultats des tests double-hybride antérieurs (Abed et al., 2007), rappelés dans la chapitre II.

Il est à noter que le peptide forme un feuillet β avec le brin β2 de la sous-unité B de la protéine. Nous détaillerons ci-dessous ces interactions une fois l’étape d’optimisation de l’amarrage réalisé. En utilisant une nouvelle version du programme de « docking » : AutoDock4.2, apparue en cours de thèse, et avec les mêmes paramètres par défaut, nous obtenons un ∆∆∆∆G de -15.8 kcal/mol et un Ki de 2.7 pM (Figure III.20), plus favorables que ceux d’AutoDock4 (Figure III.19).

Figure III.20: Amarrage du peptide pF1 (1-9) sur EcFur obtenu par AutoDock4.2. Ici les chaines latérales du peptide sont montrées

Sur les deux figures le peptide est amarré dans la même zone et de la même façon.

L’affinité a été bien améliorée par la nouvelle version d’AutoDock. En effet, la nouvelle version d’AutoDock (version 4.2) contient de nouveaux paramètres optimisés pour les calculs des termes de désolvatation basés sur les charges, des liaisons hydrogènes et l’état non lié du complexe, probablement à l’origine de cette amélioration de l’énergie libre de liaison.

Cette version AutoDock4.2 a été utilisée pour la suite.

Partant de la conformation de pF1(1-9) obtenu ici sur la Figure III.20, le peptide de 13 acides aminés est construit avec CHARMM en ajoutant les quatre résidus Cter grâce aux coordonnées internes correspondant à leur conformation la plus stable. Le peptide entier est ensuite raffiné par minimisation d’énergie (100 pas de SD et 1000 pas ABNR) en fixant les neuf acides aminés Nter, issus de l’amarrage précèdent. Une nouvelle grille combinant les grilles FurEcG1 et FurEcG2 : FurEcG3 (Tableau III.3), plus adaptée à la taille du peptide de 13 acides aminés a été utilisée. Le protocole AADM est appliqué pour obtenir l’amarrage du peptide pF1(1-13). Les paramètres d’amarrage d’optimisation utilisés sont les suivants : 50 pour la taille de la population initiale, 60000000 pour le nombre maximal d’évaluations d’énergie avec 50 conformations finales. La meilleure conformation du complexe obtenu (∆∆∆∆G

= - 17,5 kcal/mol et Ki = 160 fM : femto Molaire) est présentée sur la Figure III.21.

Figure III.21 : Amarrage du peptide pF1 sur EcFur1111Pa

Dans cette configuration, le peptide a une meilleure affinité pour la protéine comparé au peptide pF1(1-9). Ce qui va dans le sens des tests d’activités où on a vu que pF1(1-13) a un

IC₅₀ plus faible que pF1(1-9). L’ensemble des interactions du peptide a été évalué par CHARMM via le calcul de l’énergie d’interaction, décrite auparavant. Le Tableau III.5, ci- dessous présente l’énergie d’interaction des résidus du peptide avec la protéine pour des valeurs d’Einter -8 kcal/mol.

Résidus pF1 Einter(kcal/mol)

R1 -15,3

W3 -19,1

R5 -18,2

Y6 -18,8

D13 -8

Tableau III.5: Énergies d'interaction des acides aminés de pF1 interagissant fortement avec EcFur1111Pa.

Les résidus R1, W3, R5, Y6 et D13 du peptide sont donc ceux qui interagissent le plus favorablement avec la protéine. Ces résidus et ceux de la protéine, sont représentés avec une vue plus détaillée (Figure III.22).

Figure III.22: Zoom sur les interactions de pF1 et de la protéine Fur. Les résidus du peptide en bleu sont marqués en gros caractères, ceux de la protéine en rouge et vert, sont notés en petits caractères.

III. B. 5. b| Amarrage sur EcFur1Pa « métallée »

Une analyse approfondie de cet amarrage montre que certains acides aminés du peptide pF1 interagissent avec des résidus importants, probables ligands des métaux du site structural et/ou de régulation de la protéine. C’est le cas des résidus His125 et Asp88 de la protéine. Il est alors apparu nécessaire de prendre en compte les sites métalliques de la

Asn72

protéine, jusqu’ici ignorés. Comme nous l’avons expliqué dans l’introduction, nous allons construire avec CHARMM trois sites métalliques par monomère au lieu de deux, comme décrit dans la littérature sur EcFur, notamment en tenant compte entre autres des données récentes sur HpFur (Dian et al. 2011). Les ions métalliques sont dans ce cas des atomes de fer, considérés comme des boules avec une charge +2. La nouvelle conformation de la protéine (« métallée ») ; contenant les sites métalliques, a ensuite été optimisée par une minimisation (SD 100 pas, ABNR 1000 pas ou gradient 2 0,1 kcal/mol/Å) dans un solvant implicite (méthode EEF1) avec des contraintes harmoniques sur l’ensemble de la protéine, sauf les atomes se trouvant à 8 Å de rayon autour de fer. La nouvelle conformation de la protéine « métallée » et ces sites métalliques sont présentés sur la Figure III.23. Notons que ces sites métalliques ont été construits dans l’unique but d’orienter les chaines latérales des ligands du site métallique vers l’atome de fer et qu’il faudra améliorer ces constructions pour avoir de meilleurs modèles prenant en compte les propriétés électronique des ions Fe(II).

L’amarrage de peptide pF1 sera repris afin de vérifier dans la suite s’il peut interagir avec des résidus ligands du site métallique.

Figure III.23: Vue d’ensembles des sites métalliques construits dans le modèle EcFur1111Pa et zoom sur ces sites Site 1 ; le M²⁺ est chelaté par les cystéines C93 et C96 (annotation EcFur)

Site 2 ; les ligands sont D89, H125, H87 et E108.

Site 3 ; le M²⁺ est coordonné ici par les histidines H33, 88 et 90 et la glutamine E81.

Le protocole d’AADM est appliqué comme précédemment avec la conformation du peptide pF1 et la nouvelle conformation optimisée de la protéine « métallée ». Les paramètres d’amarrage d’optimisation utilisés sont les suivants : 40 pour la taille de la population initiale, 15000000 pour le nombre maximal d’évaluations d’énergie avec 30 conformations finales sur la grille EcFurG3 (Tableau III.3). La meilleure conformation, obtenue avec un ∆∆∆∆G de - 20,2 kcal/mol et une constante Ki = 2 fM (femto molaire) est montrée sur la Figure III.24.

Figure III.24: Amarrage du peptide pF1 sur EcFur1111Pa « métallée ». Les ions métalliques ne sont pas montrés sur cette figure

De façon intéressante, le peptide s’amarre sur la protéine lorsque celle-ci est

« métallée » avec une meilleure affinité qu’il ne le faisait sur la protéine Apo.

Pour comprendre pourquoi cette affinité est meilleure que celle trouvée avec la conformation précédente, non « métallée », il faut observer les énergies d’interaction des deux amarrages (Tableau III.5et Tableau III.6 ci-dessous.

Résidus pF1 E inter (kcal/mo

R1 -15

W3 -21,5

R5 -19,2

Y6 -18,2

D13 -17

Tableau III.6: Énergies d'interaction 2 -10 kcal/mol entre les acides aminés de pF1 et la protéine EcFur1111Pa « métallée ».

Les interactions de l’Asp13 du peptide ont été fortement améliorées dans le cas de la protéine métallée. La grande différence viendrait du repositionnement de pF1 qui se rapproche du domaine Nter. Les chaines latérales des résidus-ligands du site métallique de la protéine étant réorientées vers le site à fer, le peptide a trouvé d’autres résidus de la protéine vers le domaine Nter pour interagir. La construction des sites métalliques a donc permis de réaliser un modèle plus réaliste de la protéine qui donne des amarrages encore plus favorables.

Nous venons de mettre en évidence l’apport de notre approche AADM avec l’amarrage de pF1 sur le modèle EcFur1Pa.