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73VecteurNom des amorcesSéquences des amorces

pNS2

6646-PCR5-HdIII : F 5’ ACCCAAGCTTGACGCGTCCGTCGTCGAAACG 3’

6646-PCR3-XhoI : R 5’ACCGCTCGAGTTACCTCCCT GAGAACACTCG 3’

pNS4 et pNS7

CARMI-PCR5-BamHI : F 5’ GGATCCGACGCGTCCGTCGTCGAAACGTAC 3’

6646-PCR3-XhoI : R 5’ ACCGCTCGAG TTACCTCCCT GAGAACACTCG 3’

pMAH2

TgPRMT1-PCR5-SSS-HindIII F 5’ CCCAAGCTTAGTTCCAGCAGCCCCAACTC 3’

TgPRMT1-PCR3-RLR-XhoI R 5’ CCGCTCGAGCTATCGGAGTCTGTAGAACTGG 3’

pNS14 à pNS18

TgTBL1-PCR5-BglII F 5’ GAGATCTCGGATCCACTTGTCTTCGGACGAAGTG 3'

TgTBL1- PCR3-HindIII F 5’ CAAGCTTCGTTCACGCAGAGTCTTCCAGCTTCGC 3'

pNS9 à pNS12

TgGCN5-PCR5-BamHI F 5’ GGATCCGGCGCTCCAACAGGTCTGGGGCTCG 3'

TgGCN5-PCR3-HindIII F 5’ AAGCTTCGTTCAGAAACTCCCGAGAGCCTCG 3'

pNS25, 29, 32 et 33

PCR5-CARM1(VMD-AAA) F 5' GAAGGAAAAACTGCCGCCGCCGTCGGAGCCGG 3'

PCR3-CARM1(VMD-AAA) F 5' CCGGCTCCGACGGCGGCGGCAGTTTTTCCTTC 3'

pMAH21

TgHDAC3-PCR5-BamHI F 5' CGGGATCCGCGCTCAGTGCGCTGCGCAAGC 3'

TgHDAC3-PCR3-PstI F 5' CAGAGACCAAAAGGTTCCGATCCTGCAG 3'

pNS19, 26 et 29

TgHDAC3-PCR5-BamHI F 5' GGATCCGCGAAGAAGCTGAATCACCAC 3'

TgHDAC3-PCR3-HidIII F 5' AAGCTTGATCGGAACCTTTTGGTCTCTG 3'

pNS14 à 18

TgTBL1-PCR5-BglII F 5' GAGATCTCGGATCCACTTGTCTTCGGACGAAGTG 3'

TgTBL1-PCR3-HindIII F 5' CAAGCTTCGTCCACGCAGAGTCTTCCAGCTTCGC 3'

pNS43 à 46

TgTBL1-PCR5-BglII F 5' GAGATCTCGGATCCACTTGTCTTCGGACGAAGTG 3'

TgLISH-PCR-HindIII F 5' AAGCTTCAACGCGACTTATTCTTGGCATG 3'

pNS34, 35, 47, 55

TgWD40-PCR-BglII F 5' AGATCTCTTCCTTCTGTGGAGATCGTTGGC 3'

et 104

TgTBL1-PCR3-HindIII F 5' CAAGCTTCGTCCACGCAGAGTCTTCCAGCTTCGC 3'

pNS36, 38 et 54

TgKELCH-PCR5-BamHI F 5' GGATCCGATGAGGTCGTGAAGGCGTTGCGG 3'

TgKELCH-PCR3-XbaI F 5' TCTAGAGAAATGCCACATGTCATCGAGGAG 3'

pNS13

TgHDAC2-PCR5-BamHI F 5' CGGGATCCCTGGGGAGGAGGAAGAGCGTTC 3'

TgHDAC2-PCR3-EcoRI F 5' CGGAATTCCCCACGATTCCTGTTCGAGATC 3'

pNS88 et 90

HD2-PCR5-BamHI F 5' GGATCCACTAGTAACGGCCGCCAG 3'

HD2-fusion-PCR5 F 5' CAATCGCGTCTCGAACTGGCGGATCAAATG 3' HD2-Fusion6PCR3 F 5' CATTTGATCCGCCAGTTCGAGACGCGATTG 3'

Matériel et méthode

74

HD2-PCR3-HindIII F 5' GATAAGCTTCTATCAAGATCTCTTGTCG 3'

pNS39 à 42, 49 à

TgHDAC4-PCR5-BamHI F 5' GGATCCGACAGCACACGAGCGACTTTGGGC 3'

52, 102 et 103

TgHDAC4-PCR3-EcoRI F 5' GTGTGCTGGAATTCCGCCCTTGAC 3'

pNS70, 71, 74 et 75

TgHDAC5-ATN-BglII F 5' GAAGATCTGCCACCAACAACATTTCGGGCGTC 3'

TgHDAC5-GTD-PCR3-EcoRI F 5' ACGGAATTCATCGGTTCCGCGGCACAAAGCTCG 3' TgHDAC5-THV-BglII F 5' AGATCTACTCATGTCCGAAATATCGTGAATG 3'

pNS31

TgSIR2-PCR5-XmaI F 5' CCCGGGCACTCAGTTTATGGGAGTGAAGTAG 3'

TgSIR2-PCR3-EcoRI F 5' GAATTCGTTGCCTTGCCTTACCTCAACAAC 3'

Tableau 1 : Liste des amorces utilisées pour les clonages (cf.   : tableau 2). Les sites de restrictions sont soulignés sur les séquences des amorces.

Plasmide Vecteur Insert

Taille en pb

Poids moléc

ulaire

Enzymes de restriction pour le clonage

pNS2

pET28b+ TgCARM1 1491 pb 54.61 KDa HindIII + XhoI

pNS4

pMAH12 TgCARM1 1509 pb 55.57 KDa BglII/BamHI +XhoI

pNS7

pET41a+ TgCARM1 2220 pb 82.45 KDa BglII/BamHI +XhoI

pNS25

pTOPO TgCARM1 (VMD_AAA) 1384 pb BamHI & XhoI

pNS29

pMAH12 TgCARM1 (VMD_AAA) 1509 pb 55,4 KDa BglII/BamHI+XhoI

pNS32

pET28a+ TgCARM1 (VMD_AAA) 1467 pb 53,6 KDa BamHI+XhoI

pNS33

pET41a+ TgCARM1 (VMD_AAA) 2220 pb 82,3 KDa BamHI+XhoI

pMAH2

pET28b+ TgPRMT1 1182 pb 44 KDa HindIII + XhoI

pNS14

pTOPO TgTBL1 2399 pb BglII & HindIII

pNS15

pMAH14 TgTBL1 2472 pb 88,163 KDa BglII + HindIII

pNS16

pET28a+ TgTBL1 2481 pb 88,111 KDa BglII + HindIII

pNS17

pET41a+ TgTBL1 3234 pb 117 KDa BglII + HindIII

pNS18

pET28a+ TgTBL1 1749 pb 61,6 KDa pNS16+Not1

pNS35

pTOPO TgWD40 de TBLI 1414 pb BglII & HindIII

Matériel et méthode

75 pNS34

pMAH14 TgWD40 de TBLI 1488 pb 53,37 Kda BglII + HindIII

pNS47

pET28a+ TgWD40 de TBLI 1494 pb 53,32 KDa BamHI&BglII+HindIII

pNS55

pET41a+ TgWD40 de TBLI 2250 pb 82 KDa BamHI&BglII+HindIII

pNS104

pNS85 TgWD40 de TBLI 1494 pb 53,56 KDa BglII + HindIII

pNS43

pTOPO TgLISH de TBLI 1414 pb BglII & HindIII

pNS44

pMAH14 TgLISH de TBLI 942 pb 33,54 KDa BglII + HindIII

pNS45

pET28a+ TgLISH de TBLI 951 pb 33,48 KDa BamHI&BglII+HindIII

pNS46

pET41a+ TgLISH de TBLI 1704 pb 62,23 KDa BamHI&BglII+HindIII

pNS36

pTOPO TgKELCH 822 pb BamHI & XbaI

pNS38

pMAH14 TgKELCH 933 pb 34,88 KDa BamHI+ClaI

pNS54

pET28a+ TgKELCH 753 pb 27,7 KDa BamHI+XhoI

pNS19

pTOPO TgHDAC1trq 1002 pb BamHI & HindIII

pNS26

pET28a+ TgHDAC1trq 1131 pb 41,7 KDa BamHI + HindIII

pNS27

pET41a+ TgHDAC1trq 1890 pb 70,7 KDa BamHI + HindIII

pMAH21

pMAH14 TgHDAC1 1425 pb 53,37 KDa BamHI + PstI

pNS30

pMAH14 TgHDAC2trq 1176 pb 41,78 KDa BamHI+EcoRI

pNS13

pMAH14 TgHDAC2 1989 pb 71,95 KDa BamHI + Pst1 + EcoRI

pNS88

pTOPO TgHDAC2trq(2) 1435 pb BamHI & EcoRI

pNS90

pMAH14 TgHDAC2trq(2) 1542 pb 55 KDa BamHI&BglII+HindIII

pNS31

pMAH14 TgSIR2 876pb 32,3 KDa XmaI+ EcoRI

pNS39

pTOPO TgHDAC4 V#2 957 pb BamHI & EcoRI

pNS41

pMAH14 TgHDAC4 V#2 1026 pb 37,65 KDa BamHI+ EcoRI

pNS49

pET28a+ TgHDAC4 V#2 1119 pb 40,67 KDa BamHI+ EcoRI

pNS51

pET41a+ TgHDAC4 V#2 1899 pb 70 KDa BamHI+ EcoRI

pNS103

pNS85 TgHDAC4 V#2 1020 pb 37,44 KDa BamHI+ EcoRI

pNS40

pTOPO TgHDAC4 V#1 912 pb BamHI & EcoRI

pNS42

pMAH14 TgHDAC4 V#1 981 pb 36 KDa BamHI+ EcoRI

pNS50

pET28a+ TgHDAC4 V#1 1074 pb 39 KDa BamHI+ EcoRI

pNS52

pET41a+ TgHDAC4 V#1 1854 pb 68,55 KDa BamHI+ EcoRI

Matériel et méthode

76 pNS102

pNS85 TgHDAC4 V#1 975 pb 35,8 KDa BamHI+ EcoRI

pNS70

pTOPO TgHDAC5 (PRC55) 3814 pb BglII & HindIII

pNS74

pMAH14 TgHDAC5 (PRC55) 3882 pb 137 KDa BglII/BamHI+HindIII

pNS71

pTOPO TgHDAC5 (PRC60) 3814 pb BglII & HindIII

pNS75

pMAH14 TgHDAC5 (PRC60) 3882 pb 137 KDa BglII/BamHI+HindIII

pNS9

pTOPO TgGCN5 1431 pb amHI & HindIII

pNS10

pMAH14 TgGCN5 1416 pb 52,5 KDa BglII/BamHI +HindIII

pNS11

pET28a+ TgGCN5 1515 pb 55,94 KDa BamHI +HindIII

pNS12

pET41a+ Tg:GCN5 2268 pb 84,4 KDa BamHI +HindIII

Tableau 2   : Les clonages réalisés ainsi que la taille et le poids moléculaire des inserts avec leur(s) étiquette(s) sont inscrits dans ce tableau.

1.6. Souches bactériennes :

TOP10F’ : F´{lacI

q

, Tn10(Tet

R

)} mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZ M15 lacX74 recA1 araD139 (ara-leu)7697 galU galK rpsL (Str

R

) endA1 nupG

BL21 (DE3) : F

-

ompT hsdS

B

(r

B-

m

B-

) gal dcm (DE3)

Les souches bactériennes sont rendues compétentes et transformées par choc thermique selon Sambrook and Russell.

1.7. Les anticorps :

Immunofluorescence :

_-HA monoclonal

(Roche)

_-49(TgCARM1)

polyclonal de lapin

(Eurogentec)

_-TgHDAC1-polyclonal de lapin

(Eurogentec)

Western blot :

_-49(TgCARM1)

polyclonal de lapin

(Eurogentec)

_-TgHDAC1-polyclonal de lapin

(Eurogentec)

_ - F l a g m o n o c l o n a l

(SIGMA)

Immunoprécipitation:

_-Flag monoclonal

(SIGMA.)

_-H3 (K4)

diMe

, _-

AcH4 (K5, K8,

K12, K16)

Acetyl

, _-

H3 (R17)

Me

, _-H4

Matériel et méthode

77

_-TgGCN5-A polyclonal de lapin

(Bhatti & sullivan, 2005)

_-H3 (K4)

diMe

, _-AcH4 (K5, K8, K12, K16)

Acetyl

, _-H3 (R17)

Me

, _-H4 (R3)

Me

(Upstate)

_-HA monoclonal

(Roche)

_-TgGCN5-A polyclonal de lapin

(Bhatti & sullivan, 2005)

_-H3 (K4)

diMe

, _-AcH4 (K5, K8, K12, K16)

Acetyl

, _-H3 (R17)

Me

, _-H4 (R3)

Me

(Upstate)

H3 (R17)

Me

, _-H4 (R3)

Me

(Upstate)

2. METHODES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

2.1. Conditions de culture et de stockage des bactéries :

Les bactéries sont cultivées selon la méthodes de Sambrook et al., 1989 et son stockées dans 20 % de glycérol à -80 °C.

2.2. Préparation de E.Coli compétentes :

La méthode utilisée est la méthode classique au chlorure de calcium (cohen, 1972 et Erlich, 1979).Les bactéries de la souche hôte sont mises en culture en milieu LB et sont collectées en phase exponentielle de croissance (absorbance de 0.3 à 600 nm), car dans les cellules en division, les membranes en cours d’allongement sont plus fragiles. Le traitement consiste placer les cellules dans une solution concentrée de Chlorure de Calcium à 4 °C : les ions Ca

2+

altèrent les structures membranaires en créant des microperforations dans la double couche phospholipidique. Pour 40ml de culture, les cellules sont remises en suspension dans 20 ml de CaCl

2

100 mM glacé, centrifugées à 3000 rpm, à 4 °C pendant 10 minutes et remises en suspension dans 1 ml de CaCl2 100 mM.

Pour congeler les cellules compétentes, la dernière remise en suspension se fait en ajoutant

15 % de glycérol au CaCl

2

. Lors de la transformation faut incuber les cellules avec l’ADN à

4°C pendant au moins 30 minutes.

Matériel et méthode

78

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