Le système enzymatique de formation de ponts disulfures est extrêmement variable chez les bactéries et le système Dsb décrit chez E. coli (Figure 19a) n’est pas un modèle standard pour toutes les bactéries. Une analyse récente, portant sur les systèmes Dsb de 375 génomes de bactéries montre que la plupart des Protéobactéries possèderaient un système Dsb avec une DsbA et une DsbB, mais qu’une grande diversité de systèmes Dsb existe également parmi les bactéries (Dutton et al. 2008).
Par exemple, Staphylococcus aureus qui est une bactérie à Gram-positif, possède une DsbA mais pas de DsbB (Figure 19b). DsbA de S. aureus serait aussi stable sous forme réduite qu’oxydée (Heras et al. 2008) contrairement à son homologue chez E. coli, suggérant qu’un environnement oxydant maintiendrait DsbA de S. aureus sous sa forme oxydée au lieu d’une enzyme homologue à DsbB d’E. coli.
Streptococcus pyogènes est un cas extrême et ne possèderait ni DsbA ni DsbB. Chez cet organisme, des liaisons isopeptides remplaceraient les liaisons disulfures et stabiliseraient les structures de certaines protéines sécrétées (Kang et al. 2007). (Dutton et al. 2008) ont également décrit certaines bactéries comme Streptomyces coelicolor, qui possèderaient une DsbA et une réductase de la vitamine K époxide (VKOR) qui jouerait le rôle d’un analogue à
DsbB d’E. coli (Figure 19c). Dans quelques cas DsbA et VKOR sont fusionnées et forment un unique système Dsb (Dutton et al. 2008; Singh et al. 2008).
De nombreux pathogènes à Gram-négatif ont un arsenal étendu de protéines Dsb, qui faciliterait la production de facteurs de virulence (Sinha et al. 2004). Par exemple, la souche UPEC CFT073 possède, en plus du système classique DsbA-DsbB, similaire à celui d’E. coli, deux autres protéines Dsb, DsbL et DsbI, qui partagent 19 et 24 % d’identité de séquence avec DsbA et DsbB (Grimshaw et al. 2008) (Figure 19d). La caractérisation de DsbL et DsbI montre que ces enzymes ont des propriétés redox similaires à leurs analogues chez E. coli (DsbA et DsbB) et qu’elles catalysent la formation d’un pont disulfure sur l’aryl-sulphate sulphotransférase (ASST). La production d’une ASST active est nécessaire pour l’interaction hôte-pathogène (Grimshaw et al. 2008). Ce type de voie de formation de ponts disulfures est également présent chez d’autres souches comme certaines E. coli responsables d’infections intestinales (par exemple E. coli 536, UT189 et F11), ou des souches de Salmonella, Shewanella et Campylobacter.
En plus du système de Dsb retrouvé chez E. coli et de la paire DsbL-DsbI décrite ci- dessus, Salmonella enterica serovars possède un autre homologue à DsbA: SrgA (Figure 19e). Les trois paralogues de DsbA de cette bactérie, nommés DsbA, DsbL et SrgA, partagent un faible pourcentage d’identité entre elles et ont des séquences CXXC différentes, ce qui suggère que ces enzymes auraient des spécificités de substrats et des activités in vivo différents.
Enfin, Neisseria meningitidis a également un système Dsb plus complexe qu’E. coli.
Son génome code en fait pour trois homologues à DsbA (Figure 19f): DsbA1 et DsbA2 qui sont des lipoprotéines et DsbA3, une enzyme soluble périplasmique. Les deux lipoprotéines sont nécessaires pour la formation d’un pilus fonctionnel, essentiel pour l’adhésion de la bactérie avec l’hôte (Tinsley et al. 2004) et pour le repliement de PilQ, une protéine impliquée dans la compétence des bactéries (Sinha et al. 2008). La troisième enzyme, DsbA3, n’est impliquée dans aucune de ces fonctions et à ce jour n’est pas reliée à un phénotype connu.
Bien que N. meningitidis ait trois DsbA, elle ne possède qu’une seule DsbB.
Figure 19 : Schématisation des différentes voies oxydatives chez les bactéries. (Heras et al. 2009)
III. Connaissances actuelles sur les DsbA de Neisseria meningitidis
Pour distinguer plus facilement les enzymes d’Escherichia coli et de Neisseria meningitidis, nous utiliserons les notations suivantes : EcDsbA et EcDsbB pour les enzymes d’E. coli et NmDsbA et NmDsbB pour les homologues chez N. meningitdis.
III.1. La découverte du système Dsb chez Neisseria meningitidis
L’équipe de Xavier Nassif à l’hopital Necker à Paris, est à la base de la caractérisation du système Dsb chez N. meningitidis en 2004 (Tinsley et al. 2004).
Le gène nmb0294 a été identifié en premier à la suite d’une analyse comparative des génomes des deux Neisseria pathogènes: N. meningitidis et N. gonorrhoaea (Tinsley et al.
1996; Klee et al. 2000). Le gène nmb0294 est spécifique du méningocoque et est localisé dans un îlot génétique absent du génome de N. gonorrhoaea. Il code pour une protéine NMB0294 qui possède les motifs caractéristiques des enzymes de la famille des thiorédoxines à savoir le motif CPHC (identique à celui d’EcDsbA) et une Proline située plus en C-terminal (cis- Proline conservée chez les TRX) (Figure 20). La séquence en acides aminés de NMB0294 contient un peptide signal relativement court et hydrophobe se terminant par la séquence consensus LAA(S)C (la Lipobox) qui est reconnue par la « lipoprotein-specific signal peptidase II ». Ceci indique que cette DsbA serait une lipoprotéine ancrée dans la membrane externe après lipidation de son résidu N-terminal. Ceci laissait supposer que NMB0294 pourrait constituer une cible antigénique.
(Tinsley et al. 2004) ont ainsi montré que NMB0294 avait bien une activité oxydoréductase comparable à celle d’EcDsbA, et était bien une lipoprotéine, mais que l’inactivation du gène nmb0294 ne confèrait pas à la bactérie un phénotype dsbA- et n’affectait pas sa virulence.
Ce dernier résultat, concernant l’absence de phénotypes associés à l’inactivation de nmb0294, a poussé l’équipe de X. Nassif à revenir au génome du méningocoque et à identifier deux autres gènes codant potentiellement pour des homologues à NMB0294 et à DsbA. Ceux-
contient donc trois gènes nmb0278, nmb0294 et nmb0407 qui seront notés dsbA1, dsbA2 et dsbA3, par la suite. Bien que N. meningitidis ait trois gènes dsbA, il n’a été trouvé qu’un seul gène codant pour une hypothétique DsbB.
Figure 20 : Comparaison des séquences protéiques des DsbA de N. meningitidis et d’E. coli.
DsbA1 (NMB0278), DsbA2 (NMB0294), DsbA3 (NMB0407) avec DsbA d’E. coli. Les acides aminés identiques entre les quatre DsbA sont surlignés en rouge et ceux qui sont conservés chez trois des quatre DsbA sont en rouge. Le motif actif CXXC et la cis-Proline sont indiqués par des cadres verts. Les séquences signal lipoprotéiques sont encadrées en bleu.
Figure 21 : Comparaison graphique des séquences des protéines Dsb.
Toutes les séquences sont issues de GenBank.
L’équipe de J. S. Kroll a confirmé, sur la base de leurs séquences protéiques, que les trois gènes identifiés chez N.meningitidis codaient bien pour des homologues à EcDsbA. Pour cela, ils ont représenté les pourcentages d’identités entre chacune des séquences protéiques graphiquement (Figure 21).
Les séquences des NmDsbA sont proches entre elles et avec celle de EcDsbA.
III.2. Comparaison et analyse des séquences protéiques des trois NmDsbA
L’alignement des séquences des trois NmDsbA avec leur homologue EcDsbA est représenté Figure 20.
Les cadres ouverts de lecture des NmDsbA commencent toutes par une séquence N- terminale caractéristique d’un peptide signal pour le périplasme. DsbA1 et DsbA2 possèderaient en plus un ancrage membranaire alors que DsbA3 serait soluble dans le périplasme. Ces localisations ont été confirmées par X. Nassif et al (2004).
L’identité de séquences entre les trois NmDsbA et EcDsbA est d’environ 20 % et concerne essentiellement la région du site actif.
DsbA1 et DsbA2 ont la séquence catalytique de EcDsbA : CPHC. Les deux lipoprotéines partagent 73% d’identités de séquence et sont composées de 230 acides aminés environ ce qui suggère que ces deux gènes résulteraient d’une duplication. Ceci est en accord avec le contenu en (G+C) des gènes dsbA1 et dsbA2 qui est identique (56.47 %) et plus élevé que le contenu moyen en (G+C) du génome entier de N. meningitidis (53.7 % pour la souche MC58) et considérablement plus élevé que celui de dsbA3 (49.22 %). La séquence protéique de DsbA3 est composé de 214 acides aminés seulement et a un site catalytique légèrement différent, CVHC. DsbA3 partage 50 % d’identité de séquence avec les deux autres NmDsbA.
La région du site actif est également similaire avec celles de DsbA1 et DsbA2.