Afin d’étudier l’expression tissulaire de JMJ24, deux lignées de fusion transcriptionnelle du promoteur endogène avec le gène rapporteur GUS ont été construites (figure 2.16). Pour la première construction, nommée proJMJ24:GUS, seul le
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promoteur endogène a été utilisé, tandis que pour la deuxième construction, nommée proJMJ24:intron1:GUS, la séquence de la région 5’UTR a été ajoutée en plus du promoteur endogène. En effet, pour le mutant jmj24-1 l’insertion de l’ADN-T dans le premier intron contenu dans cette région est associée à une abolition complète de l’expression du gène, suggérant un rôle potentiel de cette séquence dans la régulation de l’expression de JMJ24 (figure 2.3). En effet, la présence de séquences régulatrices dans le premier intron d’un gène a déjà été observée chez plusieurs espèces : eukaryotic initiation factor (eIF) 2 alpha chez l’humain (Silverman et al., 1992), apolipoproteinAI (apoAI) chez le poulet (Bhattacharyya and Banerjee, 1999) ainsi que RHD3 et AGL13 chez Arabidopsis thaliana (Wang et al., 2002; Schauer et al., 2009). Dans le but de voir s’il existe une différence d’activité du promoteur de JMJ24 entre les deux écotypes, des plantes sauvages Ws et Col-0 ont été transformées.
Pour la construction proJMJ24:GUS, l’analyse tout au long du développement de la plante, du stade plantule aux fleurs, révèle un patron d’expression de JMJ24 similaire pour les deux écotypes, avec une présence de la coloration bleue dans les cellules du système vasculaire (figure 2.17a-g et j,-l), ainsi que dans les ovules de jeunes fleurs (figure 2.17k), mais qui disparait à des stades plus tardifs du développement de la fleur (figure 2.17l) et les cellules de la coiffe dans les premiers jours post-germination (figure 2.17i). Le promoteur JMJ24 est donc actif dans le système vasculaire et plus précisément au niveau du phloème (figure 2.17g et j). En effet, la discontinuité de la coloration des faisceaux vasculaires, observée notamment au niveau des racines (figure 2.17h), est caractéristique du phloème en différenciation (Bauby et al., 2007). De
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plus, la coloration des pôles de phloème primaire, révélée en coupe transversale de hampe, confirme cette première observation (figure 2.17j).
La construction avec le premier intron, proJMJ24:intron1:GUS, présente un patron d’expression de JMJ24 similaire à celui observé pour la construction proJMJ24:GUS, avec une présence de la coloration dans les cellules du système vasculaire de la plantule à la fleur (figure 2.18) et les cellules de la coiffe dans les premiers jours post-germination (figure 2.18g). De nouveau, le tissu dans lequel le promoteur est actif est le phloème, comme en attestent la présence de coloration bleue au niveau des pôles de phloème primaires en coupe transversale de hampe (figure 2.18h-i) et l’agencement dans la racine en deux faisceaux parallèles encadrant le xylème (figure 2.18f). Cependant la présence du premier intron a pour conséquence une extension du territoire d’expression
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de JMJ24 aux cellules initiales de la racine (figure 2.18g), aux cellules du cortex de la hampe (figure 2.18h), aux grains de pollen (figure 2.18k). L’expression du gène JMJ24 dans le système vasculaire dès les stades précoces du développement jusqu’aux organes floraux semble indiquer une fonction du gène associée au développement et/ou au fonctionnement des faisceaux conducteurs. De plus, une activité du promoteur et donc la présence de transcrits, au niveau du phloème est cohérente avec les phénotypes pléiotropes observés pour jmj24-1. Néanmoins, la localisation cellulaire de la protéine sera nécessaire pour savoir si celle-ci est également localisée dans le phloème ou si elle est présente dans les cellules adjacentes.
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Nous avons également voulu savoir si la protéine JMJ24 peut avoir un effet sur sa propre expression. Pour cela, des plantes jmj24-2 et jmj24-3 ont été transformées avec les deux différentes constructions. Les mutants jmj24-1 et jmj24-2 portent déjà le gène de résistance à la kanamycine, cependant cette résistance est réprimée pour jmj24-2 mais pas jmj24-1. Par conséquent, seule la transformation de plantes jmj24-2, mais pas de plantes jmj24-1, a été tentée (figure 2.1 et figure 2.16). Sur cette base nous avons assumé qu’une sélection avec le même antibiotique pourrait donc être possible en T1, voire en T2, avant que le mécanisme de répression ne s’étende à l’ADN-T nouvellement inséré. Il a été assez difficile finalement d’obtenir des transformants pour jmj24-2 et seule une lignée possédant la construction proJMJ24:GUS a été identifiée. La transformation des mutants jmj24-3 ne posait pas de problème sachant que le gène de résistance porté par l’ADN-T utilisé pour générer la collection de mutants d’insertion GABI est différent (figure 2.1). Plusieurs lignées ont pu être obtenues pour chacune des deux constructions.
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Que ce soit pour les lignées jmj24-2proJMJ24:GUS ou jmj24-3proJMJ24:GUS, le patron d’expression est identique à celui obtenu pour les sauvages Ws et Col-0, à savoir une coloration au niveau du système vasculaire (figure 2.19a-e), plus précisément du phloème (figure 2.19d), et des ovules à des stades précoces du développement floral (figure 2.19e). Quant aux lignées jmj24-3proJMJ24:intron1:GUS, elles aussi présentent un patron d’expression identique à celui des plantes sauvages, avec toujours une coloration au niveau du phloème (figure 2.19f-g), des ovules à des stades précoces du développement floral (figure 2.19j), et, par la présence du premier intron, dans les cellules du centre quiescent (figure 2.19h) et les cellules du cortex de la hampe (figure 2.19i). L’ensemble de ces résultats nous permettent de déduire que JMJ24 n’a donc pas effet sur l’activité de son propre promoteur.